Summary

Automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution med hjälp av mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC)

Published: February 18, 2022
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att genomföra automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution. MMC kan odla och subkultivera mikroorganismer automatiskt och kontinuerligt och övervaka online deras tillväxt med relativt hög genomströmning och god parallellisering, vilket minskar arbetskrafts- och reagensförbrukningen.

Abstract

Konventionella mikrobiella odlingsmetoder har vanligtvis besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagens. Dessutom har mikroplattbaserade odlingsmetoder med hög genomströmning som utvecklats under de senaste åren dålig mikrobiell tillväxtstatus och experimentparallellisering på grund av deras låga upplösta syre, dåliga blandning och allvarliga avdunstning och termiska effekt. På grund av många fördelar med mikrodroppar, såsom liten volym, hög genomströmning och stark kontrollerbarhet, kan den droppbaserade mikrofluidiska tekniken övervinna dessa problem, som har använts i många typer av forskning om mikrobiell odling, screening och evolution med hög genomströmning. De flesta tidigare studier förblir dock på scenen för laboratoriekonstruktion och tillämpning. Några viktiga frågor, såsom höga operativa krav, höga konstruktionssvårigheter och brist på automatiserad integrationsteknik, begränsar den breda tillämpningen av droppmikrofluidisk teknik i mikrobiell forskning. Här utvecklades ett automatiserat mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik, vilket uppnådde integration av funktioner som ympning, odling, onlineövervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. I detta protokoll togs vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 och en metanol-essentiell E. coli-stam (MeSV2.2) som exempel för att introducera hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och relativt högkapacitets mikrobiell odling och adaptiv utveckling i detalj. Denna metod är lätt att använda, förbrukar mindre arbetskraft och reagens och har hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har stora fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och resultatsäker experimentell plattform för vetenskapliga forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.

Introduction

Mikrobiell odling är en viktig grund för mikrobiologisk vetenskaplig forskning och industriella tillämpningar, som används i stor utsträckning vid isolering, identifiering, rekonstruktion, screening och utveckling av mikroorganismer 1,2,3. Konventionella mikrobiella odlingsmetoder använder huvudsakligen provrör, skakkolvar och fasta plattor som odlingsbehållare, i kombination med skakinkubatorer, spektrofotometrar, mikroplattläsare och annan utrustning för mikrobiell odling, detektion och screening. Dessa metoder har emellertid många problem, såsom besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagenser. De odlingsmetoder med hög kapacitet som utvecklats under de senaste åren är huvudsakligen baserade på mikroplattan. Men mikroplattan har en låg nivå av upplöst syre, dålig blandningsegenskap och svår avdunstning och termisk effekt, vilket ofta leder till dålig tillväxtstatus och experimentparallellisering av mikroorganismer 4,5,6,7; å andra sidan måste den vara utrustad med dyr utrustning, såsom vätskehanteringsarbetsstationer och mikroplattläsare, för att uppnå automatiserad odling och processdetektering 8,9.

Som en viktig gren av mikrofluidisk teknik har droppmikrofluidik utvecklats under de senaste åren baserat på traditionella mikrofluidiska system med kontinuerligt flöde. Det är en diskret flödesmikrofluidisk teknik som använder två oblandbara vätskefaser (vanligtvis oljevatten) för att generera dispergerade mikrodroppar och arbeta med dem10. Eftersom mikrodroppar har egenskaperna hos liten volym, stor specifik ytarea, hög intern massöverföringshastighet och ingen korskontaminering orsakad av fackbildning, och fördelarna med stark kontrollerbarhet och hög genomströmning av droppar, har det funnits många typer av forskning som tillämpar droppmikrofluidisk teknik vid odling, screening och utveckling av mikroorganismer med hög genomströmning11 . Det finns dock fortfarande en rad viktiga frågor för att göra droppmikrofluidisk teknik populariserad och allmänt tillämpad. För det första är driften av droppmikrofluidik besvärlig och invecklad, vilket resulterar i höga tekniska krav för operatörer. För det andra kombinerar droppmikrofluidisk teknik optiska, mekaniska och elektriska komponenter och måste associeras med biotekniska applikationsscenarier. Det är svårt för ett enda laboratorium eller team att bygga effektiva droppmikrofluidiska styrsystem om det inte finns något tvärvetenskapligt samarbete. För det tredje, på grund av den lilla volymen mikrodroppe (från picoliter (pL) till mikroliter (μL)), krävs det mycket svårigheter att förverkliga den exakta automatiserade kontrollen och realtidsdetekteringen av droppar för vissa grundläggande mikrobiella operationer som subodling, sortering och provtagning, och det är också svårt att konstruera ett integrerat utrustningssystem12.

För att ta itu med ovanstående problem utvecklades ett automatiskt mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik13. MMC består av fyra funktionella moduler: en droppigenkänningsmodul, en droppspektrumdetekteringsmodul, en mikrofluidisk chipmodul och en provtagningsmodul. Genom systemintegration och kontroll av alla moduler fastställs automatiserat operativsystem inklusive generering, odling, mätning (optisk densitet (OD) och fluorescens), splittring, fusion, sortering av droppar exakt, vilket uppnår integrationen av funktioner som inokulering, odling, övervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. MMC kan rymma upp till 200 replikerade droppodlingsenheter med en volym på 2-3 μl, vilket motsvarar 200 odlingsenheter för skakkolvar. Odlingssystemet för mikrodroppar kan uppfylla kraven på icke-kontaminering, upplöst syre, blandning och massenergiutbyte under tillväxten av mikroorganismer och tillgodose de olika behoven hos mikrobiell forskning genom flera integrerade funktioner, till exempel tillväxtkurvmätning, adaptiv evolution, enfaktoranalys på flera nivåer och metabolitforskning och analys (baserat på fluorescensdetektering)13,14.

Här introducerar protokollet hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och mikrobiell odling och adaptiv evolution i detalj (Figur 1). Vi tog vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 som ett exempel för att demonstrera mätningen av tillväxtkurvan och en metanol-essentiell E. coli-stam MeSV2.215 för att demonstrera den adaptiva utvecklingen i MMC. En operationsprogramvara för MMC utvecklades, vilket gör operationen mycket enkel och tydlig. I hela processen måste användaren förbereda den ursprungliga bakterielösningen, ställa in villkoren för MMC och sedan injicera bakterielösningen och relaterade reagenser i MMC. Därefter kommer MMC automatiskt att utföra operationer som droppgenerering, igenkänning och numrering, odling och adaptiv evolution. Det kommer också att utföra online-detektering (OD och fluorescens) av dropparna med hög tidsupplösning och visa relaterade data (som kan exporteras) i programvaran. Operatören kan stoppa odlingsprocessen när som helst enligt resultaten och extrahera måldropparna för efterföljande experiment. MMC är lätt att använda, förbrukar mindre arbete och reagenser och har relativt hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har betydande fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och robust experimentell plattform för forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.

Protocol

1. Installation av instrument och programvara Välj en ren och steril miljö (t.ex. en ren bänk) som ett dedikerat permanent utrymme för MMC. Installera MMC stadigt i utrymmet.OBS: Håll MMC borta från störningar från starka elektriska fält, magnetfält och starka värmestrålningskällor. Undvik att allvarliga vibrationer påverkar de optiska detekteringskomponenterna. Ge strömförsörjningen på AC220 V, 50 HZ till MMC. Mer information om MMC finns i materialförteckningen<…

Representative Results

Detta protokoll använder E. coli MG1655 och en MeSV2.2-stam som exempel för att demonstrera den mikrobiella odlingen och metanol-essentiell adaptiv utveckling med en automatiserad och relativt hög genomströmningsstrategi i MMC. Tillväxtkurvmätningen användes främst för att karakterisera mikrobiell odling. Den adaptiva evolutionen genomfördes genom automatiserad kontinuerlig subodling och tillsats av en hög koncentration av metanol som selektivt tryck under varje delodling. Huruvida adaptiv evolution h…

Discussion

Detta protokoll presenterar hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att utföra automatiserad mikrobiell odling och långsiktig adaptiv evolution. MMC är ett miniatyriserat, automatiserat och mikrobiellt odlingssystem med hög genomströmning. Jämfört med konventionella mikrobiella odlingsmetoder och instrument med hög genomströmning har MMC många fördelar som låg arbets- och reagensförbrukning, enkel drift, onlinedetektering (OD och fluorescens), datainsamling med hög tidsupplö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project från National Natural Science Foundation of China (21627812) och Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi tackar också prof. Julia A. Vorholt (Institute of Microbiology, Institutionen för biologi, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) för tillhandahållandet av den metanol-essentiella E. coli-stammen version 2.2 (MeSV2.2).

Materials

0.22 μm PVDF filter membrane Merck Millipore Ltd. SLGPR33RB Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator Haier BCD-289BSW For reagent storage
Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For solid plate preparation
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20011160 Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. DL-CJ-INDII For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10007216 Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer Lenovo E450 Software installation and MMC control
Constant temperature incubator Shanghai qixin scientific instrument co., LTD LRH 250 For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10008218 Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance OHAUS AR 3130 For reagent weighing
EP tube Thermo Fisher 1.5 mL For droplet collection
FeCl3·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10011928 Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube Thermo Fisher 2.0 mL For strain preservation
Gluconate Sigma-Aldrich S2054 Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol GENERAL-REAGENT G66258A For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot SANYO Electric MLS3020 For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) Biotopped 420322 Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate Solarbio K8020 Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4 MACKLIN P815661 Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol MACKLIN M813895 Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O BIOBYING 1305715 Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-ALE-OD For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-M/S-OD The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20026118 Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl GENERAL-REAGENT G81793J Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O GENERAL-REAGENT G10267B Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10001518 Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish Corning Incorporated 90 mm For the preparation of solid medium
Pipette eppendorf 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL For liquid handling
Quick connector A Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-PCB Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask Union-Biotech 50 mL For microbial cultivation
Shaking incubator Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. SKY-210 2B For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate Solarbio S8290 Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD 10 mL Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle OUBEL Hardware Store 22G Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042 Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator SANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer General Electric Company Ultrospec 3100 pro For the measurement of OD values
Vitamin B1 Solarbio SV8080 Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021 Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10024018 Component of the special medium for MeSV2.2.

References

  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
  16. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  17. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  18. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  19. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  20. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  21. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
  22. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  23. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  24. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).

Play Video

Cite This Article
Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. L., Xing, X., Wang, L., Zhang, C. Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (180), e62800, doi:10.3791/62800 (2022).

View Video