Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Fluorescerende måling i realtid af synaptiske funktioner i modeller af amyotrofisk lateral sklerose

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
* These authors contributed equally

Summary

To relaterede metoder er beskrevet for at visualisere subcellulære hændelser, der kræves til synaptisk transmission. Disse protokoller muliggør realtidsovervågning af dynamikken i præsynaptisk calciumtilstrømning og synaptisk vesikelmembranfusion ved hjælp af levende cellebilleddannelse af in vitro-dyrkede neuroner.

Abstract

Før neuronal degeneration er årsagen til motoriske og kognitive underskud hos patienter med amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og / eller frontotemporal lobe demens (FTLD) dysfunktion af kommunikation mellem neuroner og motorneuroner og muskler. Den underliggende proces med synaptisk transmission involverer membrandepolariseringsafhængig synaptisk vesikelfusion og frigivelse af neurotransmittere i synapsen. Denne proces sker gennem lokaliseret calciumtilstrømning til de præsynaptiske terminaler, hvor synaptiske vesikel befinder sig. Her beskriver protokollen fluorescensbaserede levende billeddannelsesmetoder, der pålideligt rapporterer depolariseringsmedieret synaptisk vesikelekocytose og præsynaptisk terminal calciumtilstrømningsdynamik i dyrkede neuroner.

Ved hjælp af et styrylfarvestof, der er inkorporeret i synaptiske vesikelmembraner, belyses den synaptiske vesiclefrigivelse. På den anden side anvendes Gcamp6m til at studere calciumindgang, en genetisk kodet fluorescerende reporter. Vi anvender høj kaliumchloridmedieret depolarisering til at efterligne neuronal aktivitet. For at kvantificere synaptisk vesicle exocytose entydigt måler vi tabet af normaliseret styrylfarvestoffluorescens som en funktion af tiden. Under lignende stimuleringsbetingelser øges Gcamp6m fluorescens i tilfælde af calciumtilstrømning. Normalisering og kvantificering af denne fluorescensændring udføres på samme måde som styrylfarvestofprotokollen. Disse metoder kan multiplexeres med transfektionsbaseret overekspression af fluorescerende mærkede mutante proteiner. Disse protokoller er blevet flittigt brugt til at studere synaptisk dysfunktion i modeller af FUS-ALS og C9ORF72-ALS, ved hjælp af primære gnaverkortikale og motorneuroner. Disse protokoller giver let mulighed for hurtig screening af forbindelser, der kan forbedre neuronal kommunikation. Som sådan er disse metoder værdifulde ikke kun for undersøgelsen af ALS, men for alle områder af neurodegenerativ og udviklingsmæssig neurovidenskabelig forskning.

Introduction

Modellering af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i laboratoriet gøres unikt udfordrende på grund af den overvældende sporadiske karakter af over 80% af tilfældene1 kombineret med det store antal genetiske mutationer, der vides at være sygdomsfremkaldende2. På trods af dette deler alle tilfælde af ALS det samlende træk, at der før direkte neuronal degeneration er dysfunktionel kommunikation mellem præsynaptiske motorneuroner og postsynaptiske muskelceller3,4. Klinisk, når patienter mister forbindelsen mellem de resterende øvre og nedre motorneuroner, præsenterer de med træk ved neuronal hyper- og hypoexcitabilitet gennem hele sygdommen5,6,7,8,9, hvilket afspejler komplekse underliggende molekylære ændringer i disse synapser, som vi som ALS-forskere søger at forstå.

Flere transgene modeller har illustreret, at forringelse og desorganisering af det neuromuskulære kryds forekommer med ekspression af ALS-forårsagende genetiske mutationer, herunder SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 og TDP4317,18,19 gennem morfologiske vurderinger, herunder evaluering af synaptiske boutoner, rygsøjletætheder og præ/postsynaptisk organisation. Mekanisk har det siden Coles, Hodgkins og Huxleys skelsættende papirer i 1930'erne også været muligt at evaluere synaptiske responser gennem elektrofysiologiske teknikker i enten in vitro-cellekultur eller vævsskivepræparater20. Gennem disse strategier har mange modeller af ALS vist synaptiske transmissionsunderskud. For eksempel forårsager en mutant variant af TDP43 forbedret affyringsfrekvens og reducerer aktionspotentialetærsklen i NSC-34 (rygmarv x neuroblastom hybrid cellelinje 34) motorneuronlignende celler21. Den samme variant forårsager også dysfunktionel synaptisk transmission ved det neuromuskulære kryds (NMJ) før begyndelsen af adfærdsmæssige motoriske underskud i en musemodel22. Det er tidligere blevet påvist, at mutant FUS-ekspression resulterer i reduceret synaptisk transmission ved NMJ i en drosophila-model af FUS-ALS før lokomotoriske defekter11. En nylig rapport ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller afledt af C9orf72-ekspansionsbærere afslørede en reduktion i den let releasable pulje af synaptiske vesikler23. Alt i alt fremhæver disse undersøgelser og andre vigtigheden af at opbygge en mere omfattende forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for synaptisk signalering i sygdomsrelevante modeller af ALS. Dette vil være afgørende for at forstå ALS patobiologi og udvikle potentielle terapeutiske mål for patienter.

Metoder til strøm- og spændingsklemmeceller har været uvurderlige til bestemmelse af membranegenskaber såsom konduktans, hvilemembranpotentiale og kvantalt indhold af individuelle synapser20,24. En af de væsentlige begrænsninger ved elektrofysiologi er imidlertid, at det er teknisk udfordrende og kun giver indsigt fra en enkelt neuron ad gangen. Levende celle konfokal mikroskopi kombineret med specifikke fluorescerende sonder giver mulighed for at undersøge den synaptiske transmission af neuroner på en spatiotemporal måde25,26,27. Selvom det ikke er et direkte mål for neuronal excitabilitet, kan denne fluorescensmetode give en relativ måling af to molekylære korrelationer af synaptisk funktion: synaptisk vesikelfrigivelse og calciumtransienter ved synaptiske terminaler.

Når et handlingspotentiale når den præsynaptiske terminalregion af neuroner, udløses calciumtransienter, hvilket letter overgangen fra et elektrisk signal til processen med frigivelse af neurotransmitter28. Spændingsgated calciumkanaler lokaliseret til disse områder regulerer calciumsignalering tæt for at modulere kinetikken af neurotransmitterfrigivelse29. De første rapporterede fluorescensbaserede optagelser af calciumtransienter blev udført ved anvendelse af enten dobbeltbølgelængdeindikatoren Fura-2 AM eller det enkelte bølgelængdefarvestof Fluo-3 AM30,31,32. Mens disse farvestoffer gav stor ny indsigt på det tidspunkt, lider de af flere begrænsninger såsom ikke-specifik opdeling i celler, aktivt eller passivt farvestoftab fra mærkede celler, fotoblegelse og toksicitet, hvis de afbildes over længere tid33. I det sidste årti er genetisk kodede calciumindikatorer blevet arbejdsheste til billeddannelse af forskellige former for neuronal aktivitet. Disse indikatorer kombinerer et modificeret fluorescerende protein med et calciumchelatorprotein, der hurtigt skifter fluorescensintensitet efter bindingen af Ca2+ ioner34. Anvendelsen af disse nye indikatorer er enorm, hvilket giver mulighed for meget lettere visualisering af intracellulære calciumtransienter både in vitro- og in vivo-indstillinger. En familie af disse genetisk kodede journalister, kendt som GCaMP, bruges nu bredt. Disse indikatorer indeholder et C-terminalt calmodulindomæne efterfulgt af grønt fluorescerende protein (GFP) og er dækket af et N-terminalt calmodulinbindende område35,36. Calciumbinding til calmodulindomænet udløser en interaktion med det calmodulinbindende område, hvilket resulterer i en konformationsændring i den samlede proteinstruktur og en betydelig stigning i fluorescensen af GFP-moiety35,36. I årenes løb har denne familie af journalister gennemgået flere udviklinger for at muliggøre forskellige udlæsninger for bestemte calciumtransienter med specifik kinetik (langsom, medium og hurtig), hver med lidt forskellige egenskaber37,38. Her er brugen af reporteren GcaMP6 blevet fremhævet, som tidligere har vist sig at detektere enkeltaktionspotentialer og dendritiske calciumtransienter i neuroner både in vivo og in vitro37.

Calciumtransienter i den præsynaptiske region udløser synaptiske vesikelfusionshændelser, hvilket forårsager frigivelse af neurotransmitter i synapsen og initiering af signalhændelser i den postsynaptiske celle28,39. Synaptiske vesikler frigives og genanvendes både hurtigt, da cellen homeostatisk opretholder et stabilt cellemembranoverfladeareal og let releasable pool af fusionsdygtige membranbundne vesikler40. Det her anvendte styrylfarvestof har en affinitet over for lipidmembraner og ændrer specifikt dets emissionsegenskaber baseret på rækkefølgen af det omgivende lipidmiljø41,42. Det er således et ideelt værktøj til mærkning af genbrug af synaptiske vesikler og efterfølgende sporing af disse vesikler, da de senere frigives efter neuronal stimulering41,42. Protokollen, der er genereret og optimeret, er en tilpasning af de begreber, der oprindeligt blev beskrevet af Gaffield og kolleger, hvilket giver os mulighed for kontinuerligt at visualisere styrylfarvestofmærket synaptisk vesicle puncta over tid41.

Her beskrives to relaterede fluorescensbaserede metoder, der pålideligt rapporterer specifikke cellulære hændelser involveret i synaptisk transmission. Protokoller er blevet defineret for at undersøge dynamikken i depolariseringsmedieret præsynaptisk terminal calciumtilstrømning og synaptisk vesikelekocytose i dyrkede neuroner. Her er metoder og repræsentative resultater fokuseret på at bruge primære gnaverkortikale eller motorneuroner som in vitro-modelsystem, da der er offentliggjort undersøgelser ved hjælp af disse celletyper43,44. Disse metoder er dog også anvendelige på differentierede humane i3 kortikale neuroner45, da vi også har haft succes med begge protokoller i igangværende eksperimenter i vores laboratorium. Den generelle protokol er skitseret i et trinvist lineært format, vist i figur 1. Kort sagt, for at studere calciumdynamik i neuritter transfekter transfekteres modne neuroner med plasmid-DNA for at udtrykke den fluorescerende reporter GCaMP6m under en Cytomegalovirus (CMV) promotor37,46. Transfekterede celler har et lavt niveau af basal grøn fluorescens, hvilket stiger i nærvær af calcium. Regioner af interesse er specificeret til at overvåge fluorescensændringer under hele vores manipulation. Dette gør det muligt at måle stærkt rumligt og tidsmæssigt lokaliserede udsving i calcium37,46. Til evaluering af synaptisk vesikelfusion og frigivelse er modne neuroner fyldt med styrylfarvestof inkorporeret i synaptiske vesikkelmembraner, når de genbruges, reformeres og genindlæses med neurotransmittere i præsynaptiske celler41,42,43,47,48. De nuværende farvestoffer, der anvendes til dette formål, mærker synaptiske vesikler langs neuritter og anvendes som proxy for disse regioner i levende billeddannelsesforsøg, som det blev vist ved co-farvning af styrylfarvestof og synaptotagmin af Kraszewski og kolleger49. Inkluderet her er repræsentative billeder af lignende farvning, der også er udført (figur 2A). Tidligere efterforskere har i vid udstrækning brugt sådanne farvestoffer til at rapportere synaptisk vesikeldynamik ved det neuromuskulære kryds og hippocampale neuroner48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Ved at vælge punkterede områder af farvestofbelastede vesikler og ved at overvåge fald i fluorescensintensiteten efter vesikelfrigivelse kan funktionel synaptisk transmissionskapacitet og tidsmæssig dynamik i frigivelsen undersøges efter stimulering43. Til begge metoder anvendes et medium indeholdende en høj koncentration af kaliumchlorid til at depolarisere celler for at efterligne neuronal aktivitet. Billeddannelsesparametre er specificeret til at fange intervaller på under et sekund, der spænder over en baseline normalisering efterfulgt af vores stimuleringsoptagelsesperiode. Fluorescensmålinger på hvert tidspunkt bestemmes, normaliseres til baggrunden og kvantificeres over den eksperimentelle tidsperiode. Calcium-tilstrømning medieret GCaMP6m fluorescensforøgelse eller effektiv synaptisk vesikel exocytose styrylfarvestof frigivelse fluorescens fald kan detekteres gennem denne strategi. Detaljeret metodologisk opsætning og parametre for disse to protokoller og en diskussion om deres fordele og begrænsninger er beskrevet nedenfor.

Figure 1
Figur 1: Visuel gengivelse af den samlede generelle protokolproces. (1) Isoler og dyrkning af primære gnaverneuroner in vitro til det valgte modningstidspunkt. (2) Indfør GCaMP DNA eller styrylfarvestof som indberettere af synaptisk aktivitet. (3) Opsætning af billeddannelsesparadigme ved hjælp af konfokalmikroskop med levende billeddannelse og tilhørende software. Begynd den oprindelige optagelsesperiode. (4) Mens celler stadig gennemgår live-image capture, stimuleres neuroner via høj KCl-badperfusion. (5) Vurder fluorescensintensitetsmålinger over tid for at måle calciumtransienter eller synaptisk vesikelfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Jefferson University.

1. Primær kultur af neuroner fra embryonal rottecortex

BEMÆRK: Primære kortikale neuroner isoleres fra E17.5 rotteembryoner som tidligere beskrevet57,58. Ingen stamme bias synes at eksistere med succesen med denne dyrkningsprotokol. Denne metode er beskrevet kort nedenfor. De tidligere angivne artikler bør refereres til for fuldstændige detaljer.

  1. Aflivning af gravide hunrotter ved CO2-indånding efterfulgt af sekundær bekræftelse ved cervikal dislokation.
  2. Høst embryoner og isoler hjerner i iskold 20 mM HEPES-bufferet Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS). Fra den ydre cortexskal skal du adskille og derefter kassere striatum og hippocampi. Saml kortikater.
  3. Brug fine tang til at fjerne meninges fra kortikater. For at gøre dette skal du holde cortex på plads med et par lukkede tang ved hjælp af blidt tryk.
    BEMÆRK: Med det andet par tang i den anden hånd skal du klemme meninges. Skræl meninges væk ved hjælp af rullende bevægelse med klemt par. Flyt igen med den lukkede tang og gentag efter behov, indtil meninges er helt fjernet.
  4. Inkubere kortikater med 10 μg/ml papain i HBSS i 4 minutter ved 37 °C.
  5. Vask tre gange i HBSS, og triturer derefter forsigtigt 5-10 gange med en brandpoleret pasteurpipette af glas for at opnå en homogen cellesuspension.
    BEMÆRK: Undgå bobler; opretholde pipetten i cellesuspensionen.
  6. Pladeneuroner på 100 μg/ml poly-D-lysinbelagte 35 mm glasbundsfade med en tæthed på 75.000 celler/fad i neurobasalt medium med B27-tilskud (2%) og penicillin-streptomycin.

2. Primær kultur af motorneuroner fra embryonal rotte rygmarv

BEMÆRK: Primære motorneuroner fremstilles ud fra E13,5 rotteembryoner som tidligere beskrevet, med få modifikationer59,60. Ingen stamme bias synes at eksistere med succesen med denne dyrkningsprotokol. Denne metode er beskrevet kort nedenfor. De foregående artikler, der er angivet, bør refereres til for fuldstændige detaljer.

  1. Aflive drægtige hunrotter som i trin 1.1.
  2. Disseker 10-20 rygmarv fra embryoner og bryde i små fragmenter mekanisk ved hjælp af to par tang til henholdsvis at klemme og trække.
  3. Inkuber i 0,025 % trypsin i 8 minutter efterfulgt af tilsætning af DNase ved 1 mg/ml.
  4. Centrifuge gennem en 4% w/v BSA pude ved 470 x g i 5 min ved 4 °C uden brud.
  5. Centrifugepillede celler i 55 minutter ved 830 x g ved 4 °C uden bremse gennem en 10,4 % (v/v) densitetsgradientmedium (se materialetabel). Fremfør motorneuronbåndet ved den visuelle grænseflade.
    BEMÆRK: For at sikre indfangning af alle celler skal du bruge phenolfrie medier til densitetsgradienttrinnet og phenolholdige medier til alle de andre trin. Grænsefladen mellem densitetsgradienten og dissociationsmediet er let at identificere baseret på farveforskellen.
  6. Spin indsamlede bånd gennem yderligere 4% w/v BSA pude ved 470 x g i 5 min ved 4 °C uden pause.
  7. Resuspend oprensede motorneuroner i komplet neurobasalt medium med B27-supplement (2%), glutamin (0,25%), 2-mercaptoethanol (0,1%), hesteserum (2%) og penicillin-streptomycin.
  8. Pladeneuroner på 100 μg/ml polylysin og 3 μg/ml lamininbelagte dæksler med en densitet på 50.000 celler/35 mm glasbundsfad.

3. Neuronale transfektioner

BEMÆRK: Dette trin udføres for neuroner, der vil gennemgå GCaMP-calciumbilleddannelse og / eller neuroner, hvor et eksogent DNA-plasmid eller RNA af interesse introduceres forud for synaptisk evaluering. I modsætning hertil indlæses styrylfarvestof lige før billeddannelsessessionen og behandles i afsnit 6. Resuméet nedenfor er transfektionsprotokollen, der anvendes til primære gnaverneuroner i de præsenterede eksempler, men den kan let tilpasses og optimeres til brugerens behov.

  1. Transfektioner for dyrkede primære kortikale neuroner forekommer på dag 12 in vitro (DIV 12), mens motorneuroner transfekteres på dag 7 in vitro (DIV 7).
    BEMÆRK: Alle følgende trin forekommer i et aseptisk biosikkerhedsskab.
  2. Transfekt 500 ng GCaMP6m ved anvendelse af transfektionsreagens i et forhold på 1:2 volumen. For co-transfektioner tilsættes i alt 1,25 μg af det samlede DNA / skål, hvilket opretholder dette DNA til reagensforhold.
    BEMÆRK: I de viste eksperimentelle eksempler er 750 ng ALS / FTD-relateret plasmid af interesse blevet transfekteret for at udtrykke C9orf72-ALS-bundne dipeptider, mutant FUS-protein osv. Sørg for, at det fluorescerende tag af det co-transfekterede plasmid ikke vil være i konflikt med FITC-kanalen for GCaMP-billeddannelse. Ligeledes, hvis du udfører billeddannelse af styrylfarvestof, skal du sikre dig, at det co-transfekterede plasmid ikke kommer i konflikt med TRITC-billeddannelseskanalen. Brug af synaptophysin-GCaMP3 er lige så effektiv i denne protokol. Transfekter derfor den samme mængde af dette plasmid og følg alle trin som normalt i afsnit 7.
  3. Inkuber DNA-transfektionsreagenskomplekset ved stuetemperatur i 10 minutter.
  4. Tilsæt forsigtigt det inkuberede kompleks til neuroner dråbevis med hvirvlende. Returner fadet til CO2-inkubator ved 37 °C i 45-60 min.
  5. Fjern hele kulturmediet, der indeholder DNA-transfektionsreagenskomplekset, og erstat det med et 50-50 volumen præparat af prækonditionerede og friske neuronale medier. Sæt derefter celler tilbage i CO2-inkubatoren i 48 timer indtil billeddannelse.

4. Fremstilling af bufferopløsninger og stamopløsning af styrylfarvestof

  1. Lav lave og høje aCSF-opløsninger friske, før du billedbehandling ved hjælp af ingredienserne i tabel 1. Filtrer begge bufferopløsninger inden brug.
    BEMÆRK: CaCl2-dihydrat kan danne Ca(OH)2 ved opbevaring. For maksimal effektivitet skal du altid bruge en nyligt åbnet beholder. Hvis dette ikke er muligt, kan opløsninger kulsyreholdigt med gasformig CO2 for at fjerne Ca(OH)2 fra den ydre overflade og sikre maksimal opløselighed kulsyreholdigt CO2 i 5 minutter før CaCl2-tilsætning. Hvis dette trin tages, skal du justere pH-værdien i den resulterende opløsning for at opretholde en pH-værdi på 7,4, da overdreven kulsyredannelse vil resultere i ca(HCO3)2-dannelse.
Lav KCL aCSF-buffer (pH 7,40 til 7,45)
Reagens Koncentration
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
KCl 5 mM
Glukose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
Høj KCL aCSF-buffer (pH 7,40 til 7,45)
Reagens Koncentration
HEPES 10 mM
NaCl 95 mM
KCl 50 mM
Glukose 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

Tabel 1: Sammensætning af buffere af kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Denne tabel indeholder ingredienserne til fremstilling af kunstige cerebrospinalvæskebuffere med lav og høj KCl, der anvendes under billeddannelse og stimulering af neuroner. Se afsnit 4 for forberedelsesinstruktioner.

  1. Styrylfarvestofopløsning fremstilles ved at tage et 100 μg hætteglas med farvestof og rekonstituere det til en lagerkoncentration på 10 mM med destilleret vand eller neurobasalt medium.

5. Opsætning af mikroskop og perfusionssystem

BEMÆRK: Til billeddannelse af petriskåle med glasbund foretrækkes et omvendt konfokalt fluorescensmikroskop på grund af fleksibiliteten ved perfusion og til brug af et mål om nedsænkning af olie med høj numerisk blændeåbning. Se tabellen over materialer for det konfokale mikroskop, kamera og mål, der bruges til billeddannelse af eksempler, der er beskrevet i afsnittet Repræsentative resultater .

  1. Udfør alle eksperimenterne ved 37 °C med konstante 5 % CO2-niveauer ved hjælp af et inkubatorsystemkoblet trinbeslag.
  2. Styr billedoptagelse ved hjælp af konfokal software. Optimer anskaffelsesindstillingerne i starten af billedbehandlingen for at vælge excitationseffekt og forstærkning for at sikre optimal visualisering af signaler uden fotoblegning.
    1. Hold excitationseffekt, eksponeringstid, detektorforstærkning og billedhastighed konstant på tværs af alle prøver. Udfør timelapse-billeddannelse ved hjælp af et billedformat på 512 x 512 og billedhastighed på 2 billeder / s for at minimere farveblegning.
      BEMÆRK: Mens puncta skal være tydeligt synlig, skal laserintensiteten indstilles til det mindst mulige for at undgå blegning og fototoksicitet. Indstil den konfokale blænde til den snævreste indstilling for at opnå optimal opløsning af fluorescerende puncta inden for neuritter. Eksponeringstiden er indstillet til 200 ms eller mindre, konsistent på tværs af prøver. Den maksimale billedhastighed for det anvendte kamera var 2 billeder/s. Hvis du bruger et hurtigere kamera, kan der tages flere billeder. Tidsmæssige billedindstillinger bør vælges, hvis det er muligt.
  3. Vælg følgende kombinationer af fluorescensexcitation/dichroic/emission filter til billeddannelse ved hjælp af konfokal software: Gcamp6m/Gcamp3 med FITC og styrylfarvestof med TRITC.
  4. Brug den perfekte fokusfunktion i softwaren til erhvervelse af konfokal billeddannelse under timelapse-billeddannelse for at undgå z-drift.
    BEMÆRK: På grund af den hurtige billedhastighed afbildes et enkelt plan. Det er meget vigtigt at sikre manglen på z-drift under eksperimentet.
  5. Vælg fanen Tid i panelet billedoptagelse for at indstille optagelsesperioder og intervaller.
    1. Indstil fase #1 til Interval 500 ms, Varighed 3 - 5 min.
    2. Indstil fase #2 til Interval 500 ms, Varighed 5 min.
      BEMÆRK: Fase #1 svarer til baseline-optagelse, henholdsvis fase #2 til stimuleringsperioden.
  6. Saml tyngdekraftsperfusionsapparater til aCSF ved hjælp af et ventilstyringssystem og en kanalmanifold.
    1. Læg høj KCl (se tabel 1) i en 50 ml sprøjte øverst på apparatet, hvor slangen løber gennem systemet. Indstil strømningshastigheden til 1 ml/min.
  7. Læg en 35 mm glasskål indeholdende neuroner på det konfokale billeddannelsestrin, med enden af perfusionsslangen placeret ved skålkanten. Vælg feltet til billeddannelse.

6. Billeddannelse af styrylfarvestof af synaptisk vesikelfrigivelse

  1. Inkubere celler i lav KCl aCSF (se tabel 1) i 10 minutter ved 37 °C, 48 timer efter transfektion.
  2. Læg primære kortikale eller motorneuroner på glasbundede petriskåle med styrylfarvestof.
    1. Fjern lav KCl aCSF ved aspiration.
    2. Brug en pipette til at indlæse neuroner i mørke med 10 μM styrylfarvestof i aCSF indeholdende 50 mM KCl i 5 minutter.
    3. Fjern belastningsopløsningen og badeneuronerne i lav KCl aCSF i 10 minutter for at eliminere ikke-specifik farvestofbelastning.
  3. Placer 35 mm glasbundsfadet på billeddannelsestrinnet, og observer derefter enten under et 20x luftmål eller 40x olienedsænkningsmål for et omvendt konfokalmikroskop.
    BEMÆRK: Brug GFP-fluorescens til at lokalisere transfekterede celler i tilfælde af celler, der er co-transfekteret med et GFP-mærket plasmid.
  4. Excite styrylfarvestof ved hjælp af en 546 nm laser, opsaml emission ved hjælp af et 630-730 nm (TRITC) båndpasfilter.
  5. Vælg billedfeltet, og få det perfekte fokus. Tag derefter et enkelt stillbillede med brightfield-, TRITC- og fluorescensmarkørkanaler for at markere neuronale grænser.
  6. Start Kør nu i anskaffelsessoftwaren. Udfør basaloptagelsen i 3-5 minutter for at udelukke eventuelle variationer i farvestofintensiteten (fase #1).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at sikre, at ethvert fald i farvestofintensiteten skyldes synaptisk vesiclefrigivelse og ikke passiv farvestofdiffusion eller fotoblegning. Denne 3-5 minutters præstimuleringsperiode skal resultere i et stabilt og vedligeholdt farvestofintensitetsniveau. De sidste 30 s af denne optagelse vil blive brugt til at bestemme en gennemsnitlig baseline fluorescensværdi for hver ROI. Før eksperimentelle forhold evalueres, kan der også udføres en yderligere ikke-stimuleringstilstand på ca. 10 minutters kontinuerlig optagelse ved hjælp af de tilsigtede anskaffelsesindstillinger for at sikre stabile fluorescensværdier ved hjælp af laserindstillingerne i en længere periode.
  7. Ved overgangen til fase #2 skal du udløse knappen til perfusionssystemet. Derefter perfuser konstant 50 mM KCl til neuroner for at lette farvestofaflæsning (fase # 2).
    1. Udfør optagelser i 300 s efter KCl-tilføjelse. Herefter stopper erhvervelsen; udløs sluk-kontakten til perfusionssystemet.
  8. Gem eksperimentet, og analysér data ved hjælp af konfokal software som beskrevet i afsnit 8 nedenfor.
    BEMÆRK: Eksperimentet kan stoppes på dette tidspunkt, og analysen kan udføres senere. I tilfælde, hvor celler ikke kræver transfektion for at udtrykke proteiner af interesse, kan denne protokol udføres på et hvilket som helst tidspunkt in vitro, når det søges at undersøge funktionaliteten af synaptisk losning. Efter en test af kontrolceller for at sikre korrekt synaptisk losning skal eksperimentatoren blindes for de genetiske eller farmakologiske betingelser for hver skål, der testes for at minimere bias.

7. Fluorescensbilleddannelse af Gcamp6m calciumtransienter

  1. Transfekte primære gnaverkortikale neuroner dyrket på 35 mm glasbundsfade med 500 ng Gcamp6m som angivet i punkt 3.
    BEMÆRK: Hvis det ønskes, co-transfekt neuroner med et plasmid af interesse, der indeholder et fluorescerende mærke i det røde eller langt røde område.
  2. Inkuber neuroner med lav KCl aCSF i 15 min 48 timer efter transfektion og monter derefter skålen på billeddannelsesplatformen.
  3. Visualiser GCaMP6m fluorescens ved hjælp af et FITC-filter (488 nm) og et 20x eller 40x mål.
  4. Vælg billedfeltet, og få det perfekte fokus. Tag derefter et enkelt stillbillede med brightfield-, FITC- og fluorescensmarkørkanaler for at markere neuronale grænser.
  5. Start Kør nu i anskaffelsessoftwaren. Baseline-optagelsen udføres i 5 minutter, og perfuseres derefter med aCSF indeholdende 50 mM KCL på samme måde som beskrevet i punkt 6 for styrylfarvestofforsøg.
    BEMÆRK: Målet med denne billeddannelse er at måle fremkaldte calciumtransienter. Hvis en neuron har basal fyringsaktivitet og calciumfluxer i præstimuleringsperioden, anvendes den ikke til dataanalyse. I stedet anvendes kun celler med stabil baggrundsfluorescens. Poststimuleringsperioder kan også forlænges til 60 minutter for calciumtransienter, med eller uden yderligere kontinuerlig høj KCl-perfusion.
  6. Gem eksperimentet, og analysér data ved hjælp af konfokal software som beskrevet i afsnit 8 nedenfor. Eksperimentet kan stoppes på dette tidspunkt, og analysen kan udføres senere.
    BEMÆRK: Hvis cellerne ikke kræver transfektion for at udtrykke proteiner af interesse, kan denne protokol udføres på et hvilket som helst tidspunkt in vitro , når man søger at undersøge calciumtransienter. Efter en test af kontrolceller for at sikre måling af calciumtransienter skal eksperimentatoren blindes for de genetiske eller farmakologiske betingelser for hver skål, der testes for at minimere bias.

8. Billedanalyse

  1. Åbn timelapse-billeder med konfokal software.
  2. Juster billeder i timelapse-serier efter kommandoserien : | Behandling af | Juster det aktuelle dokument. Vælg Juster til den første ramme.
  3. Vælg områder af interesse (ROI'er) langs neuritter ved hjælp af ROI-markeringsværktøjet, et bønneformet ikon til højre for billedrammen (figur 3B). Marker også et investeringsafkast, der repræsenterer baggrundsfluorescensintensitet.
    BEMÆRK: ROI'er vælges ved at vælge områder med tydeligt adskilt puncta langs neuronale spor, der er angivet med lysfeltstidet. Mindst fem ROI'er pr. neuron vælges til analyse. Baggrundsafkastet vælges i et område af synsfeltet, der ikke indeholder neuritter.
  4. Mål rå fluorescens over tid for udvalgte ROI'er ved hjælp af følgende kommandoserie: Mål | Tidsmåling.
    1. Start funktionen Måling i den øverste del af panelet Tidsmåling . En grafisk repræsentation af rå fluorescens over tid (figur 3C) og kvantitative data genereres begge.
      BEMÆRK: Hvert datapunkt repræsenterer den rå fluorescens for det pågældende investeringsafkast for den ramme, der er knyttet til det specifikke målte tidspunkt.
  5. Eksporter rå fluorescensintensiteter til regnearkssoftwaren.
  6. Analyser hver ROI uafhængigt. Først skal du normalisere data ved at trække baggrunds-ROI-intensiteten fra ROI for renteintensitet på hvert tidspunkt.
    1. Tag den rå fluorescensværdi fra baggrunds-ROI på hvert specifikt tidspunkt, og træk dette fra ROI af interesse rå intensitetsværdi på det pågældende tidspunkt.
      BEMÆRK: Dette gøres for hele optagelsesperioden, både basal- og stimuleringsfaser.
  7. Bestem det gennemsnitlige investeringsafkast for renteintensitet for de sidste 30 s af basislinjen.
    1. Gennemsnit de normaliserede rå basale værdier genereret i trin 8,6 fra de sidste 30 s af den 3-5 minutters basale optagelsesperiode.
      BEMÆRK: Hele perioden med basal optagelse kan bruges til at generere denne værdi. Men da denne værdi stabiliseres og opretholdes, er 60-tidspunkterne i de sidste 30 s af tilstrækkelig prøveudtagningsstørrelse til at repræsentere helheden.
  8. Sammenlign denne basisværdi med den normaliserede intensitetsværdi på hvert tidspunkt, hvilket genererer en ændring i fluorescensværdien (ΔF).
    1. Tag værdien fra trin 8.7, og træk den gennemsnitlige baseline fluorescerende værdi fra. Gør dette og efterfølgende trin for hele optagelsesperioden, både basale og stimuleringsfaser.
  9. Denne ændring beregnes for basislinjefluorescensværdien, hvilket genererer en ændring i fluorescens/baselinefluorescens (ΔF/F). For at gøre dette skal du tage værdien fra trin 8.8 og dividere den med den gennemsnitlige baseline fluorescerende værdi.
  10. Til sidst skal du indstille startpunktsværdien til 1, så stigninger eller fald let kan visualiseres grafisk over tid.
    1. Tag den værdi, der genereres i trin 8.9, og tilføj 1.
      BEMÆRK: Når dette er gjort korrekt, skal værdierne for den oprindelige periode på 30 s svæve nær værdien 1. I celler, der effektivt frigiver synaptisk indhold, bør denne værdi udvikle sig fra 1 til 0 efter stimuleringens start. Et eksempel på trin 6-9 er vist i figur 3E.

9. Analyse af data

BEMÆRK: Eksperimentatoren kan afblindes for eksperimentelle forhold for at samle data til analyse korrekt. Brug en prøvestørrelse på mindst 10 neuroner pr. Tilstand fra hvert af tre uafhængige eksperimenter. Overvej kun neuroner til inklusion, hvis mindst fem ROI-regioner kan udpeges. Dette niveau af eksperimentel replikation var tilstrækkeligt i offentliggjorte undersøgelser til at demonstrere et dybtgående tab af synaptisk losning i ALS-relaterede poly-GA-holdige celler versus GFP-kontroller (se Repræsentative resultater). Men hvis der observeres en mere subtil fænotype, kan antallet af biologiske og/eller tekniske replikater kræve optimering af brugeren.

  1. Ved hjælp af alle beregnede ΔF/F-værdier over tid fra ROI'er af en given eksperimentel tilstand bestemmes en gennemsnitlig ΔF/F-værdi for hvert tidspunkt sammen med en SEM.
  2. Plot data ved hjælp af et graf- og statistiksoftwareprogram i xy-format, hvor x er den forløbne tid, og y er ΔF/F-værdien beregnet i trin 9.1. Præsenter alle værdierne som middelværdi ± SEM.
  3. For at bestemme statistisk signifikans skal du bruge den studerendes t-test til at sammenligne to grupper og envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukeys posthoc-analyse til sammenligning af tre eller flere grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter den vellykkede implementering af ovennævnte protokol vises repræsentative resultater for et typisk styrylfarvestofsynaptisk vesikelfrigivelseseksperiment. Dyrkede rotte primære kortikale neuroner blev fyldt med farvestof ved hjælp af metoden beskrevet i afsnit 6. Specificiteten af farvestofbelastning blev bestemt ved co-mærkning med synaptisk vesikelmarkør synaptophysin. Et flertal af styrylfarvestof positiv puncta er co-positive for denne markør (figur 2A). For at afgøre, om de indstillinger, der anvendes til billeddannelse af styrylfarvestof, forårsager fotobleaching, er en ubehandlet brønd typisk fyldt med farvestof og afbildet i en længere periode på 10 minutter uden stimulering for at sikre, at fluorescensværdierne forbliver konstante.

Derudover vises resultaterne igen ved hjælp af co-mærkning af synaptophysin og styrylfarvestof som i figur 2A. Disse fluoroforer blev co-afbildet ved hjælp af paradigmet angivet i afsnit 6 for TRITC styrylfarvestofbilleddannelse plus dobbelt optagelse af synaptophysinfluorescens ved hjælp af højintensitetslasereffekt på DAPI-kanalen for at visualisere mTurquoise-synaptophysin. Vist er repræsentative billeder af synaptiske regioner før og efter stimulering (figur 2B). Mens denne metode er en indirekte slutning på grund af manglende fotoblege, afslører analyse af de rå intensitetsværdier over hele billeddannelsesperioden, at synaptofysinintensiteten forbliver konstant, mens styrylfarvestofintensiteten falder efter stimulering (figur 2C). Ved at tage dette eksperiment og vores andre kontroller af stabil fluorescens før stimulering og over længere perioder i ikke-stimuleringsbrønde har vi således fastslået, at fald i styrylfluorescens kan tilskrives synaptisk losning gennem KCl-depolarisering snarere end fotoblegningseffekter.

Figure 2
Figur 2: Vurdering af specificitet og billeddannelsesparametre for mærkning af styrylfarvestof. (A) Et repræsentativt 40x billede af en styrylfarvestofmærket rottekortikal neuron (rød), som tidligere blev transfekteret 24 timer med et plasmid til at udtrykke mTurquoise2-synaptophysin61 drevet af synapsinpromotoren (grøn). Colokalisering af disse to fluoroforer indikerer, at et stort flertal af styrylfarvestof positiv puncta er co-farvet med synaptisk vesikelmarkør synaptophysin. Skalabjælke angiver 5 μm. (B) Kortikale neuroner blev transfekteret og styrylfarvestof indlæst som i (A) og afbildet i henhold til styrylfarvestofparadigmet sammen med dobbelt fluorescensindfangning af mTurquoise-synaptophysin på DAPI-kanalen. Repræsentative billeder viser synaptophysin og styrylfarvestof puncta regioner før og efter stimulering. Skalabjælke angiver 5 μm. (C) Fluorescens blev overvåget over tid for synaptophysin (DAPI-kanaltop) og styrylfarvestof (FITC-kanalbund). Synaptophysinintensiteten blev opretholdt ved en stabil fluorescens i løbet af billeddannelses- og stimuleringsperioden, mens fluorescensen af styrylfarvestof faldt, da farvestoffet blev losset ved stimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Repræsentative billeder viser indlæsning af styrylfarvestof under billeddannelse med valg af ROI'er (figur 3A-B). Den rå fluorescensintensitet for udvalgte ROI'er og et baggrunds-ROI afbildes ved hjælp af den konfokale software (figur 3C). De neuroner, der er vist her, blev også transfekterede med plasmider for at studere virkningerne af dipeptidproteiner produceret i forbindelse med C9ORF72-ALS, nemlig FLAG-eGFP og FLAG-GA50-eGFP drevet ud af T7-promotoren. Vellykket synaptisk vesikelfrigivelse resulterer i slående tab af farvestoffluorescens ved høj KCl-depolarisering (figur 3D, top to paneler) for en GFP-transfekteret kontrolneuron. En repræsentativ video, der er inkluderet her, viser, hvordan dette ser ud under billeddannelse. Derudover aflæser en neuron selektivt styrylfarvestof i en neuritregion efter stimulering (Video 1).

På den anden side er nedsat synaptisk transmission repræsenteret ved tilbageholdt farvestoffluorescens, selv efter høj KCl-depolarisering i neuroner transfekteret med en C9ORF72-bundet dipeptidgentagelseskonstruktion (GA50) (figur 3D, nederste to paneler)43. Efter kvantitativ dataanalyse (figur 3E) er data repræsenteret som farvestofintensitet i hele billeddannelsen for kontrolgrupperne (GFP) og ALS/FTD (GA50) (figur 3F)43. Denne metode kan også analysere mellemliggende effekter og er ikke blot en "alt eller intet" binær foranstaltning. I eksperimenter designet til at redde de synaptiske underskud medieret af GA50 blev eksogent synaptisk vesiklassiceret protein 2 (SV2) introduceret ved lentiviral transduktion ved anvendelse af rSV2a-eGFP-pRRL-plasmidet drevet ud af den humane PGK-promotor. Efter billeddannelse og analyse som beskrevet ovenfor blev synaptisk affyring reddet i neuroner, der samtidig udtrykte GA50 og SV2 (figur 3G).

Figure 3
Figur 3: Evaluering af synaptisk vesikelfrigivelse gennem mærkning af styrylfarvestof. (A) Et repræsentativt 40x billede af en styrylfarvestofmærket neuron i lavt KCl aCSF-medie i starten af et billeddannelseseksperiment. Skalabjælke angiver 20 μm. (B) Afbildning af ROI-generering på billedet fra (A). Specifikke puncta-regioner langs neuritter (# 1-4) vælges ved hjælp af ROI-værktøjet, den bønneformede knap fremhævet til højre. Et endeligt investeringsafkast vælges i et tomt område for at registrere baggrundssignalintensiteten. Områder med ikke-specifikke, ikke-neuronale lyspunkter undgås. Skalabjælke angiver 20 μm. (C) Repræsentation af signalintensiteterne for ROI'er #1-5 fra (B) over tid som graferet/afbildet af konfokal software. (D) Visuelle repræsentationer af ROI-regioner før/efter stimulering for en neuron, der effektivt gennemgår synaptisk transmission (top to paneler). De to nederste paneler er zoomede billeder med en upartisk tærskel, der anvendes til at isolere puncta fra baggrunden for at vise forskellige regioner visuelt. GFP-holdige neuroner gennemgår effektivt synaptisk frigivelse, mens ekspression af C9ORF2-ALS-relateret peptid GA50 forhindrer denne effekt. Skalabjælker angiver 10 μm-Genoptrykt fra Jensen et al. 202043. (E) Eksempel på en kvantificeringsfil ved hjælp af regnearkssoftware, der viser normalisering af værdier til baseline og generering af ΔF/F-værdier over tid. Data normaliseres først til baggrundsværdien for ROI-intensitet på hvert tidspunkt. Denne værdi sammenlignes derefter med den gennemsnitlige ROI for rentebasislinjeværdi for de sidste 30 s pre-stimulation (vist her som 10 s i 1 s intervaller for enkelhed) (ΔF). Denne ændring beregnes derefter som en brøkdel af baselinefluorescensen (ΔF/F). Endelig er startpunktsværdien sat til 1, så stigninger eller fald let kan visualiseres grafisk over tid. Mindst fem puncta-regioner pr. Neuron og mindst ti neuroner pr. Eksperimentel tilstand indsamles, med data som denne kombineret for at generere gennemsnitlige målinger på hvert tidspunkt. (F) Data fra en regnearksfil som i (E) flyttes til et graf- og statistiksoftwareprogram. For grafen, der er vist her, afbildes ΔF/F-værdien på hvert tidspunkt i gennemsnit over alle puncta-regioner i en eksperimentel tilstand sammen med dens standardfejl i gennemsnittet. Grafen her er data fra GFP versus GA50 eksperimenterne angivet i (D), hvor de sidste 10 s af baseline og de første 10 s af stimuleringsperioden er vist-genoptrykt fra Jensen et al. 202043. (G) Dette assay kan producere kurver for mellemliggende synaptisk frigivelse og er ikke blot et "alt eller intet" svar. GA50 blev co-udtrykt med eksogent synaptisk protein SV2 (synaptisk vesicle-associeret protein 2), og styrylfarvestofbilleddannelse og analyse blev udført som angivet i de foregående trin. Som i figur 3F repræsenterer grafen vist her ΔF/F-værdien ved hvert tidspunkt, hvor gennemsnittet over alle punkter i en eksperimentel tilstand er afbildet sammen med dens standardfejl i gennemsnittet. Grafen viser det sidste minut af baseline og det første minut af stimuleringsperioden fra Jensen et al. 202043. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Repræsentativ video af styrylfarvestofbilleddannelseseksperiment. Vist er en repræsentativ video af en kortikal neuron fyldt med styrylfarvestof. Videoen viser perioden, der begynder på tidspunktet for badeperfusion af høj KCl aCSF. Den boksede region fremhæver neuritterne med observerbart tab af puncta fluorescens over tid. Klik her for at downloade denne video.

Efter den metode, der er beskrevet i pkt. 7, vises repræsentative fluorescensbilleder af kortikale neuroner transfekteret med GcaMP6m før og efter KCl-depolarisering (figur 4A). Råintensitetsgrafer viser øgede fluorescensværdier, der svinger, hvilket indikerer calciumindtrængning i neuritter efter KCl-induceret depolarisering (figur 4B). Denne anden repræsentative video viser neuroner, der udtrykker GcaMP6m med lav fluorescens i slutningen af optagelsesbaselineperioden for at demonstrere denne effekt. I starten af stimuleringen viser neuronerne en dramatisk fluorescensforøgelse (Video 2). Denne tilgang er blevet anvendt med succes til at demonstrere calciumindgangsændringer i en mutant FUS-ALS-model. Astrocytter i denne model blev transduceret med adenovirus indeholdende CMV-promotordrevne eGFP-FUS-plasmider. Når konditioneret medium fra mutante FUS-ekspressionerende astrocytter blev anbragt på motorneuroner, blev der observeret øget calciumtilstrømning sammenlignet med ikke-mutante FUS-betingelser efter α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) +cyclothiazidstimulering (figur 4C)44. Følsomheden af dette assay er blevet testet ved at udføre eksperimenter med og uden calcium inkluderet i perfusionsmediet. I indstillingen af GFP versus GA50 nævnt ovenfor blev der observeret øgede maksimale calciumtransienter i GA50 indeholdende motorneuroner. Dette afhang især af, at calcium kom ind i cellen og ikke frigivelsen af interne calciumlagre. Når calcium blev fjernet fra det stimulerende aCSF-medium, blev der ikke konstateret nogen calciumtransiente reaktioner i nogen af forsøgstilstandene (figur 4D)43.

Figure 4
Figur 4: Observation af calciumtransienter i realtid ved hjælp af GCaMP-reportere. (A) Et 40x billede af en GCaMP6m, der udtrykker neuron, pseudofarvet for at vise intensiteten af GFP-fluorescens (lav i blå til høj i rødt). Venstre paneler viser hele 40x synsfeltet før og efter stimulering. Skalabjælke angiver 20 μm. Billederne til højre er zoomede versioner af de indrammede områder, der er afsløret. Gennem disse billeder er det tydeligt for øjet, at der er en robust stigning i fokale neuritiske calciumniveauer efter stimulering. Skalabjælke angiver 12 μm. B) Valg af investeringsafkast og fluorescensintensitetsovervågning under hele forsøget udføres som i figur 3. De sidste 30 s baseline og 1 min stimulering for to udvalgte ROI'er af en neuron, der gennemgår GCaMP6m fluorescensovervågning, er vist her. I modsætning til billeddannelse af styrylfarvestof øges fluorescensintensiteten efter neuronal stimulering. Derudover, som det bemærkes her, svinger calciumtransienter i neuritter over tid; derfor er resultaterne typisk repræsenteret som den gennemsnitlige maksimale normaliserede fluorescensændringsværdi for hver ROI-region. (C) Repræsentativ kvantificering af et sådant eksperiment er vist, som det blev offentliggjort i Kia-McAvoy et al. 201844, hvor primære motorneuroner, der modtog supernatant afledt af mutante FUS-ALS-astrocytter, viste signifikant øget tilstrømning af calcium efter AMPA-receptorstimulering sammenlignet med neuroner, der modtog supernatant fra vildtype FUS, der udtrykker astrocytter. D) Repræsentativ kvantificering af forbigående calciumbilleddannelse, hvor calcium ikke indgik i den stimulerende aCSF. Vist er betingelser for mCherry versus GA50-mCherry stimuleret med høj KCl aCSF med eller uden calcium som offentliggjort i Jensen et al. 202043. GA50 indeholdende neuroner viste øget maksimal calciumtilstrømning sammenlignet med mCherry indeholdende celler. Der var ingen forhøjelse af interne calciumniveauer i nogen eksperimentel tilstand, når calcium blev fjernet fra stimulerende høj KCL aCSF. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 2: Repræsentativ video af GCaMP calcium forbigående eksperiment. Vist er en repræsentativ video af et felt af kortikale neuroner transfekteret med GCaMP6m. Efter en basisperiode noteres en stor calciumtilstrømning ved 6 s-mærket, når der blev anvendt høj KCl aCSF. Calciumindgang kan måles enten for hele cellen eller ved specifikke neuritområder som beskrevet. Klik her for at downloade denne video.

Potentielle problemer Mulige årsager/løsning
1 Ikke-specifik indlæsning Vær præcis med indlæsningstiden. Længere indlæsningstider resulterer i uspecifik belastning af FM4-64 i endosomer og lysosomer
2 Ingen mærkbar exocytose i kontrolneuroner Kontroller pH-værdien i en høj KCl aCSF-opløsning.
3 Tab af fokus og lateral drift Sørg for, at der er perfekt fokus på. Juster billederne efter billeddannelse ved hjælp af Nikon-software eller ImageJ-plugin.
4 Blegning af FM4-64 fluorescens Kontroller laserintensiteten, der bruges til billeddannelse. Forsøg altid at bruge den lavest mulige intensitet. Bekræft, at den anvendte laserintensitet ikke resulterer i blegning ved at køre prøvekørsler.

Tabel 2: Mulige problemer og fejlfinding for styrylfarvestofeksperimenter. Typiske scenarier for problemer og generel fejlfinding for synaptiske aflæsningseksperimenter.

Potentielle problemer Mulige årsager/løsning
1 Transfektionseffektivitet for lav Tjek neuronal sundhed. Hvis neuroner er svære at transfektere, kan man skifte til AAV eller lentiviral transduktion af GCaMP.
2 Akkumulering af GCaMP6 fluorescens i kernen Kompromitteret neuronal sundhed. Kontroller transfektionsprotokollen.
3 Tab af fokus og lateral billeddrift Sørg for, at der er perfekt fokus på. Juster billederne efter billeddannelse ved hjælp af Nikon-software eller ImageJ-plugin.
4 Intet calciumrespons ved KCL-stimulering Sørg for, at pH-værdien i aCSF er korrekt.
5 Blegning af GCaMP6 fluorescens Kontroller laserintensiteten, der bruges til billeddannelse. Forsøg altid at bruge den lavest mulige intensitet. Bekræft, at den anvendte laserintensitet ikke resulterer i blegning ved at køre prøvekørsler.
6 Blebbing af neuritter Kompromitteret neuronal sundhed på grund af transfektion. Brug et nyt parti neuronale kulturer.

Tabel 3: Mulige problemer og fejlfinding til billeddannelse af calciumtransienter i neuritter. Typiske scenarier for problemer og generel fejlfinding for GCaMP calcium forbigående eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tre trin, der er fælles for begge beskrevne metoder, er af afgørende betydning for eksperimentel succes og kvantificerbare resultater. For det første er forberedelse af frisk aCSF før hver runde af eksperimenter afgørende efter vedlagte instruktioner. Undladelse af at gøre dette kan forhindre passende neuronal depolarisering. En prøve af ubehandlede kontrolneuroner bør konstant testes før stimulering af eksperimentelle grupper for at sikre korrekt cellulær depolarisering og give et benchmark for positive resultater opnået i den billeddannelsessession. For det andet skal der for at spore fluorescens over tid for specifikke synaptiske regioner også udvises særlig forsigtighed ved opsætning af billeddannelsesparametre og områder af ROI'er til overvågning. Registreringen af basisperioden bør straks overgå til perioden for registrering af stimulering. En tilstrækkelig hurtig billedhastighed (2 billeder / s) er nødvendig for at fange enkelthenfaldsdynamikken i styrylfarvestoffrigivelse. Endelig er et kritisk trin i analysen af eksperimenter normalisering af fluorescensmålinger først til billeddannelsesbaggrunden og derefter til den forstimulerede baseline. Som med andre billeddannelsesprotokoller udføres subtraktion af et tomt billeddannelsesområde først på tværs af alle parrede tidsfluorescensmålinger for at fjerne enhver baggrundsautofluorescens, som tilføjelsen af KCl-medier kan introducere. Det er også vigtigt at måle og beregne den gennemsnitlige fluorescensaflæsning for hver ROI fra de sidste 30 s baseline før stimulering. Denne gennemsnitlige startværdi bruges derefter på tværs af alle tidsmålinger for det pågældende investeringsafkast som et defineret udgangspunkt for at kvantificere intensiteten "skift fra basislinje".

Primær neuronal kultur er notorisk vanskelig at transfektere med eksogent DNA, og selv optimerede protokoller giver ofte lav effektivitet af samlede celler i kultur. 20%-25% af transfektionseffektiviteten opnås almindeligvis i vores neuronale kulturer, uden tegn på transfektionsinduceret toksicitet. Mens der ses ret konsistente udtryk på tværs af celler, der indeholder GCaMP, betragtes subtilt forskellige niveauer af sondeekspression i individuelle celler baseret på metoden til individuel regionskvantificering af ændring i baselinefluorescens sammenlignet med denne baseline. Med denne relativt lave effektivitet er anvendelsen af transfektionsbaserede metoder til introduktion af GCaMP-indberetteren imidlertid ikke tilstrækkelig robusthed til store biologiske replikater til screeningsundersøgelser med høj kapacitet. For at overvinde dette er flere variantkonstruktioner kommercielt tilgængelige til lentiviral eller adenoviral emballage eller celleafstamningsspecifik ekspression, hvilket vil give mulighed for højere transduktionseffektivitet. En primær modifikation, der kan ønskes, når man bruger disse protokoller, er at anvende optogenetisk stimulering af neuroner i stedet for badpåføring af KCl62. Transduktion med lentivirale konstruktioner designet til at udtrykke en af familierne af nu tilgængelige kanaliserhodopsiner, efterfulgt af aktivering med specifikke bølgelængder af lys, muliggør rumlig kontrol til depolarisering af delmængder af neuroner og også til evaluering af effekten af aktionspotentialer på gentagne calciumtilstrømningsniveauer og udtømning af synaptiske vesikelbutikker63 . Det er dog vigtigt at huske på, at brugen af denne metode i øjeblikket er noget begrænset, da brugeren skal sikre, at deres optogenetiske reporter, synaptiske reporter og eventuelle yderligere eksogent indførte proteiner ikke har spektral overlapning mellem anvendte fluoroforer. Et almindeligt fejlfindingsproblem ved hjælp af styrylfarvestoffet er passiv intensitetsreduktion i basisoptagelsesperioden. Før eksperimentelle undersøgelser er det afgørende at optimere laserintensitet og fotooptagelsesintervaller for at minimere fotobleachingeffekter. For at forsøg kan overvejes, er stabilisering af intensiteten i mindst de sidste 30 s af basisperioden nødvendig. Se tabel 2 og tabel 3 for almindelige problemer og deres løsninger til henholdsvis styrylfarvestof og calciumtransiente eksperimenter.

Den primære begrænsning ved disse to metoder er, at kulturer kun kan stimuleres og undersøges i et enkelt tilfælde. Da badapplikation bruges til at introducere det depolariserende middel KCl, skal alle neuroner, der skal undersøges ud fra denne tilstand i den pågældende skål, være inden for mikroskopets oprindelige synsfelt. Hvis funktionalitet over tid er af interesse, kræves parrede kulturer. Den ovennævnte optogenetiske metode vil imidlertid gøre det muligt at observere calciumdynamik over tid, hvis det ønskes. Derudover, hvis neuroner har en defekt i genanvendelsen af synaptiske vesikler, vil den oprindelige belastning af styrylfarvestoffet blive svækket. Mens normalisering af intern intensitet giver mulighed for sammenligning på tværs af forhold, kan små forskelle i størrelsen af svarene være vanskelige at opdage. Endelig er nye iterationer af disse indberettere hurtigt blevet tilgængelige og kan skiftes ud for hurtigere detektionstider eller mere robuste resultater. For eksempel betragtes GCaMP6m ikke længere som den hurtigste reporter af calciumtransienter ved synaptiske terminaler. I stedet kan man bruge den nyeste generation jGCaMP864.

De her beskrevne metoder er en hurtig og pålidelig måde at afgøre, om genetisk eller farmakologisk manipulation af neuroner forstyrres funktionel synaptisk signalering og frigivelse. De detaljerede eksperimenter er mindre teknisk udfordrende og billigere end traditionel spændings- / strømklemmeelektrofysiologi og elektronmikroskopi. Derudover, mens elektrofysiologi af natur er lav gennemstrømning og på det enkelte celleniveau, er de her beskrevne protokoller højere gennemstrømning og hurtige, hvilket gør det muligt at afbilde flere neuroner samtidigt og mange iterationer udføres i en enkelt billeddannelsessession. Det foreslås, at disse calciumdynamikker og synaptiske frigivelsesparadigmer anvendes som den første indikator for synaptiske transmissionsændringer i ALS-modeller og undersøgelsen af andre former for neuronal degeneration. Selvom konklusionerne fra Gcamp6m og styrylfarvestofbilleddannelse ikke præcist kan drille en specifik mekanisme for synaptisk dysfunktion, baseret på sådanne resultater, kan forskere derefter foretage målrettede, evidensbaserede komplementære undersøgelser ved hjælp af traditionelle metoder til at bestemme involverede kanaler, synaptisk vesikeltal eller kvantalt indhold.

Nytten i disse protokoller er den hurtige og ligetil vurdering af ændringer i korrekt depolariseringsmedieret calciumtilstrømning og / eller synaptisk vesikelfusion i specifikke ALS-modeller. Vi har for nylig demonstreret dette i en publikation, der viser øget calciumtilstrømning og ophævelse af synaptisk losning i kortikale neuroner, der udtrykker dipeptidproteinet (glycin-alanin)50 som følge af C9ORF72 hexanukleotid-gentagelsesudvidelsen43. Som det fremgår af vores offentliggjorte arbejde, kan disse metoder let udføres sammen med co-transfektion af mutante RNA'er eller proteiner af interesse eller i celler dyrket direkte fra transgene dyremodeller43. Derudover har pålideligheden og robustheden af disse protokoller med succes testet i neuronalt differentierede humane inducerede pluripotente stamceller45, hvilket gør det muligt at udføre fremtidige undersøgelser direkte i patientafledte sygdomsrelevante celler. I et andet nyligt manuskript fremlægger vi bevis for, at vildtypemotorneuroner gennemgår høj calciumtilstrømning efter stimulering, når de er i nærvær af en opløselig faktor frigivet fra mutant FUS, der udtrykker astrocytter44. Astrocytiske calciumsignaleringshændelser er også dybt sammenflettet med den synaptiske transmission i naboneuroner65. Calciumdynamikprotokol er blevet anvendt til at undersøge helcelle calciumtransienter i modeller af astrocytisk kultur, hvilket har vist sig effektivt i både gnavere primære og humane IPS-afledte celler. Yderligere forståelse af astrocytisk calciumdynamik og signalering i ALS-modeller vil give værdifuld indsigt i, hvordan synaptisk transmission kan påvirkes. I sidste ende vil anvendelse af celletypespecifikke GCaMP-journalister også være et kraftfuldt værktøj til at undersøge neuronal og astrocytisk calciumdynamik i blandede co-kulturindstillinger og specifikt evaluere ikke-celle-autonome effekter, der stammer fra hver cellepopulation.

Endelig strækker den potentielle anvendelse af disse metoder sig ikke kun ud over undersøgelsen af ALS, men også til de bredere områder af neurodegenerativ og endda udviklingsmæssig neurovidenskab. Detaljerede oplysninger om de specifikke plasmider, der anvendes til at generere de repræsentative resultater, tilvejebringes og har succes med at transfektere plasmider, der indeholder mange forskellige genetiske varianter af FUS,SOD1 og C9ORF72 hexanukleotidgentagelser og dipeptider43,44,66,67,68. Forudsat at plasmider indeholder en promotor, der anvendes i neuroner, er der ingen begrænsning på, hvilke modeller af ALS eller degenerativ sygdom der kan undersøges ved hjælp af disse metoder. Desuden er transfektion til ekspression af mutante proteiner et helt valgfrit trin. Kulturer genereret fra transgene dyr eller humane patientafledte celler eliminerer behovet for at identificere celler, der indeholder det mutante protein af interesse. I øjeblikket er disse systemer begrænset på den måde, at hvis styrylfarvestof vil blive brugt, er TRITC-kanalen optaget, og hvis GcaMP6 anvendes, er FITC-kanalen optaget. Teknikker, der gør det muligt at undersøge neuronal og astrocytisk aktivitet i realtid, udvider mulighederne for at forstå tidsforløbsanalyse for synaptisk modning / degeneration samt hurtige tests for effektiviteten af farmakologiske forbindelser til fremme eller undertrykkelse af neuronal kommunikation. Disse to metoder er modtagelige for skalering med høj kapacitet til screening. I stedet for at belægge neuroner i individuelle 35 mm fade, kunne billeddannelsesparametrene for disse to protokoller anvendes på en automatiseret måde på tværs af 96-brønds plader. Ved hjælp af en sådan platform kan sammensatte biblioteker hurtigt testes for terapi, som modulerer calciumindgang eller forbedrer synaptisk frigivelse ved hjælp af en genetisk sygdomsmodel eller endda celler afledt direkte fra patienter. Denne metode kunne fremskynde muligheden for undergruppespecifikke eller endda personaliserede terapier ved hurtigt at identificere kandidatmolekyler til yderligere undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende de nuværende og tidligere medlemmer af Jefferson Weinberg ALS Center for kritisk feedback og forslag til optimering af disse teknikker og deres analyser. Dette arbejde blev støttet af finansiering fra NIH (RF1-AG057882-01 og R21-NS0103118 til D.T.), NINDS (R56-NS092572 og R01-NS109150 til P.P),Muscular Dystrophy Association (D.T.), Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), Family Strong 4 ALS Foundation og Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. og P.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

Neurovidenskab udgave 173
Fluorescerende måling i realtid af synaptiske funktioner i modeller af amyotrofisk lateral sklerose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter