Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Abstract

Vor der neuronalen Degeneration ist die Ursache für motorische und kognitive Defizite bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) und/oder Frontotemporallappendemenz (FTLD) eine Dysfunktion der Kommunikation zwischen Neuronen und Motoneuronen und Muskeln. Der zugrunde liegende Prozess der synaptischen Übertragung beinhaltet die membrandepolarisationsabhängige synaptische Vesikelfusion und die Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse. Dieser Prozess geschieht durch lokalisierten Kalziumeinstrom in die präsynaptischen Terminals, in denen sich synaptische Vesikel befinden. Hier beschreibt das Protokoll fluoreszenzbasierte Live-Imaging-Methoden, die zuverlässig depolarisationsvermittelte synaptische Vesikelexozytose und präsynaptische terminale Kalziumeinflussdynamik in kultivierten Neuronen melden.

Mit einem Styrylfarbstoff, der in synaptische Vesikelmembranen eingearbeitet wird, wird die synaptische Vesikelfreisetzung aufgeklärt. Auf der anderen Seite, um den Eintritt von Kalzium zu untersuchen, wird Gcamp6m verwendet, ein genetisch kodierter fluoreszierender Reporter. Wir verwenden eine hohe Kaliumchlorid-vermittelte Depolarisation, um die neuronale Aktivität nachzuahmen. Um die synaptische Vesikelexozytose eindeutig zu quantifizieren, messen wir den Verlust der normalisierten Styrylfarbstofffluoreszenz als Funktion der Zeit. Unter ähnlichen Stimulationsbedingungen, im Falle eines Kalziumeinflusses, nimmt die Gcamp6m-Fluoreszenz zu. Die Normalisierung und Quantifizierung dieser Fluoreszenzänderung erfolgt ähnlich wie das Styrylfarbstoffprotokoll. Diese Methoden können mit transfektionsbasierter Überexpression fluoreszenzmarkierter mutierter Proteine gemultiplext werden. Diese Protokolle wurden ausgiebig verwendet, um synaptische Dysfunktion in Modellen von FUS-ALS und C9ORF72-ALS unter Verwendung von primären kortikalen und motorischen Neuronen von Nagetieren zu untersuchen. Diese Protokolle ermöglichen ein schnelles Screening von Verbindungen, die die neuronale Kommunikation verbessern können. Daher sind diese Methoden nicht nur für das Studium von ALS, sondern für alle Bereiche der neurodegenerativen und entwicklungsneurowissenschaftlichen Forschung wertvoll.

Introduction

Die Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im Labor ist aufgrund der überwiegend sporadischen Natur von über 80 % der Fälle1 in Verbindung mit der großen Anzahl genetischer Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie krankheitserregend sind2, eine einzigartige Herausforderung2. Trotzdem haben alle Fälle von ALS das verbindende Merkmal gemeinsam, dass es vor der vollständigen neuronalen Degeneration zu einer dysfunktionalen Kommunikation zwischen präsynaptischen Motoneuronen und postsynaptischen Muskelzellen kommt3,4. Klinisch, wenn Patienten die Konnektivität der verbleibenden oberen und unteren Motoneuronen verlieren, weisen sie während der gesamten Krankheit Merkmale der neuronalen Hyper- und Hypoerregbarkeit auf5,6,7,8,9, die komplexe zugrunde liegende molekulare Veränderungen dieser Synapsen widerspiegeln, die wir als ALS-Forscher zu verstehen versuchen.

Mehrere transgene Modelle haben gezeigt, dass Verschlechterung und Desorganisation der neuromuskulären Verbindung mit der Expression von ALS-verursachenden genetischen Mutationen auftreten, einschließlich SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 und TDP4317,18,19 durch morphologische Bewertungen, einschließlich der Bewertung von synaptischen Boutons, Wirbelsäulendichten und prä- / postsynaptischer Organisation. Mechanistisch war es seit den bahnbrechenden Arbeiten von Cole, Hodgkin und Huxley in den 1930er Jahren auch möglich, synaptische Reaktionen durch elektrophysiologische Techniken entweder in vitro-Zellkultur oder in Gewebeschnittpräparaten zu bewerten20. Durch diese Strategien haben viele ALS-Modelle synaptische Übertragungsdefizite gezeigt. Zum Beispiel verursacht eine mutierte Variante von TDP43 eine erhöhte Feuerfrequenz und verringert die Aktionspotentialschwelle in NSC-34 (Rückenmark x Neuroblastom Hybridzelllinie 34) motorisch-neuronenähnlichen Zellen21. Dieselbe Variante verursacht auch eine dysfunktionale synaptische Übertragung an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) vor dem Auftreten von verhaltensbedingten motorischen Defiziten in einem Mausmodell22. Es wurde zuvor gezeigt, dass die mutierte FUS-Expression in einem Drosophila-Modell von FUS-ALS vor lokomotorischen Defekten zu einer reduzierten synaptischen Übertragung am NMJ führt11. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht unter Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen, die aus C9orf72-Expansionsträgern gewonnen wurden, zeigte eine Verringerung des leicht freisetzbaren Pools synaptischer Vesikel23. Insgesamt unterstreichen diese und andere Studien, wie wichtig es ist, ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen aufzubauen, die der synaptischen Signalübertragung in krankheitsrelevanten Modellen der ALS zugrunde liegen. Dies wird entscheidend sein, um die Pathobiologie von ALS zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele für Patienten zu entwickeln.

Methoden der Strom- und Spannungsspannzellen waren von unschätzbarem Wert bei der Bestimmung von Membraneigenschaften wie Leitwert, Ruhemembranpotential und Quantengehalt einzelner Synapsen20,24. Eine der wesentlichen Einschränkungen der Elektrophysiologie besteht jedoch darin, dass sie technisch anspruchsvoll ist und nur Erkenntnisse von einem einzelnen Neuron gleichzeitig liefert. Die konfokale Lebendzellmikroskopie, gekoppelt mit spezifischen fluoreszierenden Sonden, bietet die Möglichkeit, die synaptische Übertragung von Neuronen räumlich-zeitlich zu untersuchen25,26,27. Obwohl dieser Fluoreszenzansatz kein direktes Maß für die neuronale Erregbarkeit ist, kann er eine relative Messung von zwei molekularen Korrelationen der synaptischen Funktion liefern: synaptische Vesikelfreisetzung und Calciumtransienten an synaptischen Terminals.

Wenn ein Aktionspotential die präsynaptische terminale Region von Neuronen erreicht, werden Calciumtransienten ausgelöst, was den Übergang von einem elektrischen Signal zum Prozess der Neurotransmitterfreisetzung erleichtert28. Spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die in diesen Bereichen lokalisiert sind, regulieren die Kalziumsignalisierung streng, um die Kinetik der Neurotransmitterfreisetzung zu modulieren29. Die ersten berichteten fluoreszenzbasierten Aufzeichnungen von Calciumtransienten wurden entweder mit dem Zweiwellenlängenindikator Fura-2 AM oder dem Einzelwellenlängenfarbstoff Fluo-3 AM30,31,32 durchgeführt. Während diese Farbstoffe zu dieser Zeit großartige neue Erkenntnisse boten, leiden sie unter mehreren Einschränkungen wie unspezifischer Kompartimentierung innerhalb von Zellen, aktivem oder passivem Farbstoffverlust aus markierten Zellen, Photobleichen und Toxizität, wenn sie über längere Zeiträume abgebildet werden33. In den letzten zehn Jahren sind genetisch kodierte Kalziumindikatoren zu den Arbeitspferden für die Abbildung verschiedener Formen neuronaler Aktivität geworden. Diese Indikatoren kombinieren ein modifiziertes fluoreszierendes Protein mit einem Calciumchelatorprotein, das nach der Bindung von Ca2+-Ionen schnell die Fluoreszenzintensität wechselt34. Die Anwendung dieser neuen Indikatoren ist enorm und ermöglicht eine viel einfachere Visualisierung intrazellulärer Calciumtransienten sowohl in vitro- als auch in vivo-Umgebungen. Eine Familie dieser genetisch kodierten Reporter, bekannt als GCaMP, wird jetzt breit genutzt. Diese Indikatoren enthalten eine C-terminale Calmodulindomäne, gefolgt von grün fluoreszierendem Protein (GFP), und sind durch eine N-terminale Calmodulin-Bindungsregion begrenzt35,36. Die Calciumbindung an die Calmodulindomäne löst eine Wechselwirkung mit der Calmodulin-bindenden Region aus, was zu einer Konformationsänderung der gesamten Proteinstruktur und einer erheblichen Erhöhung der Fluoreszenz der GFP-Einheit führt35,36. Im Laufe der Jahre hat diese Reporterfamilie mehrere Entwicklungen durchlaufen, um unterschiedliche Auslesungen für bestimmte Kalziumtransienten mit spezifischer Kinetik (langsam, mittel und schnell) mit jeweils leicht unterschiedlichen Eigenschaften zu ermöglichen37,38. Hier wurde die Verwendung des Reporters GcaMP6 hervorgehoben, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er einzelne Aktionspotentiale und dendritische Calciumtransienten in Neuronen sowohl in vivo als auch in vitro nachweist37.

Calciumtransienten in der präsynaptischen Region lösen synaptische Vesikelfusionsereignisse aus, die eine Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse und die Initiierung von Signalereignissen in der postsynaptischen Zelle verursachen28,39. Synaptische Vesikel werden sowohl schnell freigesetzt als auch recycelt, da die Zelle homöostatisch eine stabile Zellmembranoberfläche und einen leicht lösbaren Pool fusionsfähiger membrangebundener Vesikel beibehält40. Der hier verwendete Styrylfarbstoff hat eine Affinität zu Lipidmembranen und verändert seine Emissionseigenschaften spezifisch anhand der Ordnung der umgebenden Lipidumgebung41,42. Somit ist es ein ideales Werkzeug für die Markierung von synaptischen Recyclingvesikeln und die anschließende Verfolgung dieser Vesikel, da sie später nach neuronaler Stimulation freigesetzt werden41,42. Das Protokoll, das generiert und optimiert wurde, ist eine Adaption der ursprünglich von Gaffield und Kollegen beschriebenen Konzepte, die es uns ermöglicht, styrylfarbstoffmarkierte synaptische Vesikelpunkta im Laufe der Zeit kontinuierlich zu visualisieren41.

Hier werden zwei verwandte fluoreszenzbasierte Methoden beschrieben, die zuverlässig über spezifische zelluläre Ereignisse berichten, die an der synaptischen Übertragung beteiligt sind. Protokolle wurden definiert, um die Dynamik des depolarisationsvermittelten präsynaptischen terminalen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelexozytose in kultivierten Neuronen zu untersuchen. Hier konzentrieren sich Methoden und repräsentative Ergebnisse auf die Verwendung primärer kortikaler oder motorischer Neuronen von Nagetieren als In-vitro-Modellsystem, da es veröffentlichte Studien mit diesen Zelltypen gibt43,44. Diese Methoden sind jedoch auch auf differenzierte humane i3-kortikal-ähnliche Neuronen anwendbar45, da wir auch mit beiden Protokollen in derzeit laufenden Experimenten in unserem Labor erfolgreich waren. Das allgemeine Protokoll ist in einem schrittweisen linearen Format dargestellt (siehe Abbildung 1). Kurz gesagt, um die Kalziumdynamik in Neuriten zu untersuchen, werden reife Neuronen mit Plasmid-DNA transfiziert, um den fluoreszierenden Reporter GCaMP6m unter einem Cytomegalovirus (CMV) -Promotor zu exprimieren37,46. Transfizierte Zellen haben eine geringe basale grüne Fluoreszenz, die in Gegenwart von Kalzium zunimmt. Interessante Regionen werden angegeben, um Fluoreszenzänderungen während unserer Manipulation zu überwachen. Damit lassen sich stark räumlich und zeitlich begrenzte Schwankungen des Calciums messen37,46. Zur Beurteilung der synaptischen Vesikelfusion und -freisetzung werden reife Neuronen mit Styrylfarbstoff beladen, der in synaptische Vesikelmembranen eingebaut wird, während sie in präsynaptischen Zellen recycelt, reformiert und mit Neurotransmittern wieder geladen werden41,42,43,47,48. Die aktuellen Farbstoffe, die zu diesem Zweck verwendet werden, markieren synaptische Vesikel entlang von Neuriten und werden als Proxy für diese Regionen in Live-Imaging-Experimenten verwendet, wie die gemeinsame Färbung von Styrylfarbstoff und Synaptotagmin durch Kraszewski und Kollegen gezeigt wurde49. Hier sind repräsentative Bilder ähnlicher Färbungen enthalten, die ebenfalls durchgeführt wurden (Abbildung 2A). Frühere Forscher haben solche Farbstoffe ausgiebig verwendet, um die Dynamik synaptischer Vesikel an der neuromuskulären Verbindung und den Hippocampus-Neuronen zu melden48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Durch die Auswahl punktueller Regionen von farbstoffbeladenen Vesikeln und durch die Überwachung der Abnahme der Fluoreszenzintensität nach der Vesikelfreisetzung können die funktionelle synaptische Übertragungskapazität und die zeitliche Dynamik der Freisetzung nach Stimulation untersucht werden43. Für beide Methoden wird ein Medium verwendet, das eine hohe Konzentration an Kaliumchlorid enthält, um Zellen zu depolarisieren, um neuronale Aktivität nachzuahmen. Bildgebungsparameter werden angegeben, um Intervalle von unter einer Sekunde zu erfassen, die sich über eine Basisnormalisierung erstrecken, gefolgt von unserer Stimulationserfassungsperiode. Fluoreszenzmessungen zu jedem Zeitpunkt werden bestimmt, auf den Hintergrund normalisiert und über den experimentellen Zeitraum quantifiziert. Calcium-Influx-vermittelte GCaMP6m-Fluoreszenzerhöhung oder effektive synaptische Vesikel-Exozytose-Styryl-Farbstofffreisetzungsfluoreszenzabnahme kann durch diese Strategie nachgewiesen werden. Detaillierter methodischer Aufbau und Parameter für diese beiden Protokolle und eine Diskussion über ihre Vorteile und Grenzen werden im Folgenden beschrieben.

Figure 1
Abbildung 1: Visuelles Rendering des allgemeinen Protokollprozesses. (1) Isolieren und kultivieren Sie primäre Nagetierneuronen in vitro zum gewählten Reifungszeitpunkt. (2) Einführung von GCaMP-DNA oder Styrylfarbstoff als Reporter der synaptischen Aktivität. (3) Richten Sie das Bildgebungsparadigma mit einem mit Live-Imaging ausgestatteten Konfokalmikroskop und der zugehörigen Software ein. Beginnen Sie mit dem Baseline-Aufzeichnungszeitraum. (4) Während Zellen noch live aufgenommen werden, stimulieren sie Neuronen durch hohe KCl-Badperfusion. (5) Bewertung von Fluoreszenzintensitätsmessungen im Laufe der Zeit, um Calciumtransienten oder synaptische Vesikelfusion zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Jefferson University genehmigt.

1. Primärkultur von Neuronen aus dem embryonalen Rattenkortex

HINWEIS: Primäre kortikale Neuronen werden aus E17.5-Rattenembryonen isoliert, wie zuvor beschrieben57,58. Mit dem Erfolg dieses Kultivierungsprotokolls scheint es keine Dehnungsverzerrung zu geben. Diese Methode wird im Folgenden kurz beschrieben. Die zuvor angegebenen Artikel sollten für vollständige Details referenziert werden.

  1. Euthanasieren Sie trächtige weibliche Ratten durch CO2-Inhalation , gefolgt von einer sekundären Bestätigung durch Zervixdislokation.
  2. Ernten Sie Embryonen und isolieren Sie Gehirne in eiskalter 20 mM HEPES-gepufferter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Von der äußeren Kortexhülle trennen und dann Striatum und Hippocampi verwerfen. Sammeln Sie Kortexe.
  3. Verwenden Sie feine Pinzetten, um Hirnhäute von Kortexen zu entfernen. Halten Sie dazu den Kortex mit einem Paar geschlossener Pinzetten unter sanftem Druck an Ort und Stelle.
    HINWEIS: Mit dem zweiten Paar Pinzetten in der zweiten Hand, kneifen Sie Meninges. Schälen Sie Hirnhäute mit rollender Bewegung mit eingeklemmtem Paar ab. Mit der geschlossenen Pinzette neu positionieren und bei Bedarf wiederholen, bis Meninges vollständig entfernt ist.
  4. Inkubieren Sie Kortexe mit 10 μg/ml Papain in HBSS für 4 min bei 37 °C.
  5. Dreimal in HBSS waschen und dann 5-10 Mal vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette aus Glas ritutieren, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen; Halten Sie die Pipette innerhalb der Zellsuspension aufrecht.
  6. Plattenneuronen auf 100 μg/ml Poly-D-Lysin-beschichteten 35-mm-Glasbodenschalen mit einer Dichte von 75.000 Zellen/Schale in neurobasalem Medium mit B27-Präparat (2%) und Penicillin-Streptomycin.

2. Primärkultur von Motoneuronen aus embryonalem Rattenrückenmark

HINWEIS: Primäre Motoneuronen werden aus E13.5-Rattenembryonen wie zuvor beschrieben mit wenigen Modifikationen hergestellt59,60. Mit dem Erfolg dieses Kultivierungsprotokolls scheint es keine Dehnungsverzerrung zu geben. Diese Methode wird im Folgenden kurz beschrieben. Die oben genannten Artikel sollten für vollständige Details referenziert werden.

  1. Trächtige weibliche Ratten wie in Schritt 1.1 einschläfern.
  2. Sezieren Sie 10-20 Rückenmark von Embryonen und brechen Sie mechanisch in kleine Fragmente ein, indem Sie zwei Pinzettenpaare verwenden, um sie zu kneifen bzw. zu ziehen.
  3. Inkubation in 0,025% Trypsin für 8 min, gefolgt von Zugabe von DNase bei 1 mg / ml.
  4. Zentrifieren Sie durch ein 4% w/v BSA-Kissen bei 470 x g für 5 min bei 4 °C ohne Pause.
  5. Zentrifugenpelletierte Zellen für 55 min bei 830 x g bei 4 °C ohne Bremse durch ein 10,4% (v/v) Dichtegradientenmedium (siehe Materialtabelle) Kissen. Übertragen Sie das Motoneuronband an der visuellen Schnittstelle weiter.
    HINWEIS: Um die Erfassung aller Zellen sicherzustellen, verwenden Sie phenolfreie Medien für den Dichtegradientenschritt und phenolhaltige Medien für alle anderen Schritte. Die Grenzfläche des Dichtegradienten- und Dissoziationsmediums ist anhand der Farbdifferenz leicht zu identifizieren.
  6. Drehen Sie gesammelte Bänder durch ein weiteres 4% w / v BSA-Kissen bei 470 x g für 5 min bei 4 ° C ohne Pause.
  7. Resuspendieren Sie gereinigte Motoneuronen in vollständigem neurobasalem Medium mit B27-Ergänzung (2%), Glutamin (0,25%), 2-Mercaptoethanol (0,1%), Pferdeserum (2%) und Penicillin-Streptomycin.
  8. Plattenneuronen auf 100 μg/ml Polylysin und 3 μg/ml lamininbeschichteten Deckgläsern bei einer Dichte von 50.000 Zellen/35 mm Glasbodenschale.

3. Neuronale Transfektionen

HINWEIS: Dieser Schritt wird für Neuronen durchgeführt, die eine GCaMP-Kalziumbildgebung durchlaufen und/oder für Neuronen, in die vor der synaptischen Auswertung ein exogenes DNA-Plasmid oder eine interessante RNA eingeführt wird. Im Gegensatz dazu wird Styrylfarbstoff kurz vor der Bildgebungssitzung geladen und in Abschnitt 6 behandelt. Die folgende Zusammenfassung ist das Transfektionsprotokoll, das in den vorgestellten Beispielen für primäre Nagetierneuronen verwendet wird, aber es kann leicht an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst und optimiert werden.

  1. Transfektionen für kultivierte primäre kortikale Neuronen treten am Tag 12 in vitro auf (DIV 12), während Motoneuronen am Tag 7 in vitro transfiziert werden (DIV 7).
    HINWEIS: Alle folgenden Schritte finden in einer aseptischen Biosicherheitskabine statt.
  2. Transfect 500 ng GCaMP6m unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes in einem Volumenverhältnis von 1:2. Für Co-Transfektionen fügen Sie insgesamt 1,25 μg Gesamt-DNA / -Schale hinzu, wobei dieses Verhältnis von DNA zu Reagenz beibehalten wird.
    HINWEIS: In den gezeigten experimentellen Beispielen wurden 750 ng ALS/FTD-bezogenes Plasmid von Interesse transfiziert, um C9orf72-ALS-verknüpfte Dipeptide, mutiertes FUS-Protein usw. zu exprimieren. Stellen Sie sicher, dass der fluoreszierende Tag des co-transfizierten Plasmids nicht mit dem FITC-Kanal der GCaMP-Bildgebung in Konflikt gerät. Stellen Sie bei der Styrylfarbstoffbildgebung sicher, dass das co-transfizierte Plasmid nicht mit dem TRITC-Bildgebungskanal in Konflikt gerät. Die Verwendung von Synaptophysin-GCaMP3 ist in diesem Protokoll ebenso effektiv. Transfizieren Sie daher die gleiche Menge dieses Plasmids und befolgen Sie alle Schritte wie in Abschnitt 7 üblich.
  3. Inkubieren Sie den DNA-Transfektionsreagenzienkomplex bei Raumtemperatur für 10 min.
  4. Fügen Sie den inkubierten Komplex vorsichtig zu Neuronen tropfenweise mit Wirbeln hinzu. Die Schale für 45-60 min bei 37 °C in den CO2-Inkubator zurückgeben.
  5. Entfernen Sie das gesamte Kulturmedium, das den DNA-Transfektionsreagenz-Komplex enthält, und ersetzen Sie es durch eine 50-50 x Volumen-Präparation von vorkonditionierten und frischen neuronalen Medien. Legen Sie dann die Zellen für 48 Stunden bis zur Bildgebung wieder in den CO2-Inkubator.

4. Herstellung von Pufferlösungen und Styrylfarbstoff-Stammlösung

  1. Machen Sie Lösungen mit niedrigem und hohem aCSF-Gehalt vor der Bildgebung mit den in Tabelle 1 aufgeführten Inhaltsstoffen frisch. Filtern Sie beide Pufferlösungen vor der Verwendung.
    HINWEIS: CaCl2-Dihydrat kann bei der Lagerung Ca (OH) 2 bilden. Für maximale Wirksamkeit verwenden Sie immer einen kürzlich geöffneten Behälter. Wenn dies nicht möglich ist, können Lösungen vor der CaCl2-Zugabe 5 Minuten lang mit gasförmigem CO2 kohlensäurehaltig gemacht werden, um Ca(OH)2 von der Außenfläche zu entfernen und eine maximale Löslichkeit zu gewährleisten. Wenn dieser Schritt unternommen wird, passen Sie den pH-Wert der resultierenden Lösung an, um einen pH-Wert von 7,4 aufrechtzuerhalten, da eine übermäßige Karbonisierung zur Bildung von Ca (HCO3) 2 führt.
Niedriger KCL aCSF-Puffer (pH 7,40 bis 7,45)
Reagenz Konzentration
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
Kcl 5 mM
Traubenzucker 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
Hoher KCL aCSF-Puffer (pH 7,40 bis 7,45)
Reagenz Konzentration
HEPES 10 mM
NaCl 95 mM
Kcl 50 mM
Traubenzucker 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

Tabelle 1: Zusammensetzung der Puffer für künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF). Diese Tabelle enthält die Inhaltsstoffe für die Herstellung von künstlichen Zerebrospinalflüssigkeitspuffern mit niedrigem und hohem KCl-Gehalt, die bei der Bildgebung und Stimulation von Neuronen verwendet werden. Siehe Abschnitt 4 für Zubereitungsanweisungen.

  1. Bereiten Sie die Styrylfarbstoff-Stammlösung vor, indem Sie eine 100 μg große Durchstechflasche mit Farbstoff nehmen und sie mit destilliertem Wasser oder neurobasalem Medium auf eine Stammkonzentration von 10 mM rekonstituieren.

5. Einrichtung des Mikroskops und des Perfusionssystems

HINWEIS: Für die Abbildung von Petrischalen mit Glasboden wird ein inverses konfokales Fluoreszenzmikroskop aufgrund der Flexibilität der Perfusion und für die Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs mit hoher numerischer Apertur bevorzugt. In der Materialtabelle finden Sie das konfokale Mikroskop, die Kamera und die Objektive, die für die Bildgebung von Beispielen verwendet werden, die im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse aufgeführt sind.

  1. Führen Sie alle Experimente bei 37 °C mit konstantem CO2-Gehalt von 5 % mit einer systemgekoppelten Inkubator-Bühnenhalterung durch.
  2. Steuern Sie die Bilderfassung mit konfokaler Software. Optimieren Sie die Erfassungseinstellungen zu Beginn der Bildgebungssitzung, um die Anregungsleistung und -verstärkung zu wählen und eine optimale Visualisierung der Signale ohne Photobleichen zu gewährleisten.
    1. Halten Sie die Anregungsleistung, die Belichtungszeit, die Detektorverstärkung und die Bildrate über alle Proben hinweg konstant. Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung mit einem Seitenverhältnis von 512 x 512 und einer Bildrate von 2 Bildern / s durch, um das Ausbleichen von Farbstoffen zu minimieren.
      HINWEIS: Während Puncta deutlich sichtbar sein sollte, sollte die Laserintensität auf das Minimum eingestellt werden, um Bleichen und Phototoxizität zu vermeiden. Stellen Sie die konfokale Apertur auf die engste Einstellung ein, um eine optimale Auflösung der fluoreszierenden Puncta in Neuriten zu erreichen. Die Belichtungszeit ist auf 200 ms oder weniger eingestellt, konsistent über Proben hinweg. Die maximale Abbildungsgeschwindigkeit der verwendeten Kamera betrug 2 Bilder/s. Bei Verwendung einer schnelleren Kamera können mehr Bilder aufgenommen werden. Zeitliche Bildgebungseinstellungen sollten nach Möglichkeit gewählt werden.
  3. Wählen Sie die folgenden Kombinationen aus Fluoreszenzanregung/dichroitischem / Emissionsfilter für die Bildgebung mit konfokaler Software: Gcamp6m/Gcamp3 mit FITC bzw. Styrylfarbstoff mit TRITC.
  4. Verwenden Sie die perfekte Fokusfunktion der konfokalen Bilderfassungssoftware während der Zeitraffer-Bildgebung, um Z-Drift zu vermeiden.
    HINWEIS: Aufgrund der schnellen Bildgebungsgeschwindigkeit wird eine einzelne Ebene abgebildet. Es ist sehr wichtig, dass während des Experiments keine Z-Drift vorhanden ist.
  5. Wählen Sie im Bildaufnahmefenster die Registerkarte Zeit aus, um die Aufnahmezeiträume und -intervalle festzulegen.
    1. Stellen Sie Phase #1 auf Intervall 500 ms, Dauer 3 - 5 min.
    2. Stellen Sie Phase #2 auf Intervall 500 ms, Dauer 5 min.
      HINWEIS: Phase #1 entspricht der Baseline-Aufzeichnung, Phase #2 der Stimulationsperiode.
  6. Montieren Sie Schwerkraftperfusionsgeräte für aCSF mit einem Ventilsteuerungssystem und einem Kanalverteiler.
    1. Laden Sie hohe KCl (siehe Tabelle 1) in eine 50-ml-Spritze an der Oberseite des Geräts, wobei der Schlauch durch das System verläuft. Stellen Sie die Durchflussrate auf 1 ml/min ein.
  7. Laden Sie eine 35 mm große Glasschale mit Neuronen auf die konfokale Bildgebungsstufe, wobei das Ende des Perfusionsschlauchs am Tellerrand platziert wird. Wählen Sie das Feld für die Bildgebung aus.

6. Styryl-Farbstoff-Bildgebung der synaptischen Vesikelfreisetzung

  1. Inkubieren Sie Zellen in aCSF mit niedrigem KCl (siehe Tabelle 1) für 10 min bei 37 °C, 48 h nach der Transfektion.
  2. Laden Sie primäre kortikale oder motorische Neuronen mit Styrylfarbstoff auf Petrischalen mit Glasboden.
    1. Entfernen Sie niedrige KCl aCSF durch Aspiration.
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um Neuronen im Dunkeln mit 10 μM Styrylfarbstoff in aCSF mit 50 mM KCl für 5 min zu laden.
    3. Entfernen Sie die Belastungslösung und die Badneuronen in niedrigem KCl aCSF für 10 Minuten, um unspezifische Farbstoffbelastungen zu vermeiden.
  3. Legen Sie die 35-mm-Glasbodenschale auf die Bildgebungsstufe und beobachten Sie dann entweder unter einem 20-fachen Luftobjektiv oder einem 40-fachen Öl-Tauchobjektiv eines invertierten konfokalen Mikroskops.
    HINWEIS: Verwenden Sie GFP-Fluoreszenz, um transfizierte Zellen im Falle von Zellen zu lokalisieren, die mit einem GFP-markierten Plasmid koinziert wurden.
  4. Erregen Sie Styrylfarbstoff mit einem 546-nm-Laser, sammeln Sie die Emission mit einem 630-730 nm (TRITC) Bandpassfilter.
  5. Wählen Sie das Bildfeld aus und konzentrieren Sie sich perfekt. Nehmen Sie als Nächstes ein einzelnes Standbild mit Hellfeld-, TRITC- und Fluoreszenzmarkerkanälen auf, um neuronale Grenzen zu markieren.
  6. Initiieren Sie Run Now in der Erfassungssoftware. Führen Sie die Basalaufzeichnung für 3-5 Minuten durch, um gegebenenfalls Schwankungen der Farbstoffintensität auszuschließen (Phase #1).
    HINWEIS: Es ist wichtig sicherzustellen, dass jede Abnahme der Farbstoffintensität auf die Freisetzung synaptischer Vesikel und nicht auf passive Farbstoffdiffusion oder Photobleiche zurückzuführen ist. Diese 3-5-minütige Phase vor der Stimulation sollte zu einer konstanten und konstanten Farbintensität führen. Die letzten 30 s dieser Aufzeichnung werden verwendet, um einen mittleren Basisfluoreszenzwert für jeden ROI zu bestimmen. Vor der Bewertung der Versuchsbedingungen kann auch ein zusätzlicher Nichtstimulationszustand von ca. 10 min kontinuierlicher Aufzeichnung unter Verwendung der beabsichtigten Erfassungseinstellungen durchgeführt werden, um konstante Fluoreszenzwerte unter Verwendung der Lasereinstellungen für einen längeren Zeitraum sicherzustellen.
  7. Lösen Sie am Schalter zu Phase #2 die Taste für das Perfusionssystem aus. Perfundiert dann ständig 50 mM KCl zu Neuronen, um das Entladen von Farbstoffen zu erleichtern (Phase #2).
    1. Führen Sie Aufnahmen für 300 s nach KCl-Addition durch. Danach hört die Akquisition auf; Lösen Sie den Ausschalter für das Perfusionssystem aus.
  8. Speichern Sie das Experiment und analysieren Sie die Daten mit konfokaler Software, wie in Abschnitt 8 unten beschrieben.
    HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle gestoppt werden, und die Analyse kann später durchgeführt werden. Für den Fall, dass Zellen keine Transfektion für die Expression von Proteinen von Interesse benötigen, kann dieses Protokoll zu jedem Zeitpunkt in vitro durchgeführt werden, wenn die Funktionalität der synaptischen Entladung untersucht werden soll. Nach einem Test der Kontrollzellen, um eine ordnungsgemäße synaptische Entladung sicherzustellen, sollte der Experimentator für die genetischen oder pharmakologischen Bedingungen jeder getesteten Schale blind gemacht werden, um die Verzerrung zu minimieren.

7. Fluoreszenzbildgebung von Gcamp6m Calciumtransienten

  1. Transfekte kortikale Nagetierneuronen, die auf 35 mm Glasbodenschalen mit 500 ng Gcamp6m kultiviert sind, wie in Abschnitt 3 angegeben.
    HINWEIS: Falls gewünscht, transfizieren Sie Neuronen mit einem Plasmid von Interesse, das ein fluoreszierendes Tag im roten oder fernroten Bereich enthält.
  2. Inkubieren Sie Neuronen mit niedrigem KCl aCSF für 15 min 48 h nach der Transfektion und montieren Sie dann die Schüssel auf der Bildgebungsplattform.
  3. Visualisieren Sie die GCaMP6m-Fluoreszenz mit einem FITC-Filter (488 nm) und einem 20- oder 40-fachen Objektiv.
  4. Wählen Sie das Bildfeld aus und konzentrieren Sie sich perfekt. Als nächstes nehmen Sie ein einzelnes Standbild mit Hellfeld-, FITC- und Fluoreszenzmarkerkanälen auf, um neuronale Grenzen zu markieren.
  5. Initiieren Sie Run Now in der Erfassungssoftware. Führen Sie die Baseline-Aufzeichnung für 5 min durch und perfusionieren Sie dann mit aCSF mit 50 mM KCL in der gleichen Weise, wie in Abschnitt 6 für Styrylfarbstoffexperimente beschrieben.
    HINWEIS: Das Ziel dieser Bildgebung ist es, evozierte Kalziumtransienten zu messen. Sollte ein Neuron während der Vorstimulationsphase eine basale Feuerungsaktivität und Kalziumflüsse aufweisen, wird es nicht in der Datenanalyse verwendet. Stattdessen werden nur Zellen mit stabiler Hintergrundfluoreszenz verwendet. Die Nachstimulationsperioden können auch auf 60 Minuten für Calciumtransienten verlängert werden, mit oder ohne zusätzliche kontinuierliche Perfusion mit hohem KCl-Gehalt.
  6. Speichern Sie das Experiment und analysieren Sie die Daten mit konfokaler Software, wie in Abschnitt 8 unten beschrieben. Das Experiment kann an dieser Stelle gestoppt werden, und die Analyse kann später durchgeführt werden.
    HINWEIS: Wenn die Zellen keine Transfektion für die Expression von Proteinen von Interesse benötigen, kann dieses Protokoll zu jedem Zeitpunkt in vitro durchgeführt werden, wenn Calciumtransienten untersucht werden sollen. Nach einem Test von Kontrollzellen, um die Messung von Calciumtransienten sicherzustellen, sollte der Experimentator für die genetischen oder pharmakologischen Bedingungen jeder getesteten Schale verblindet werden, um Verzerrungen zu minimieren.

8. Bildanalyse

  1. Öffnen Sie Zeitrafferbilder mit konfokaler Software.
  2. Richten Sie Bilder in Zeitrafferserien nach der Befehlsreihe aus: Bild | Verarbeitung | Aktuelles Dokument ausrichten. Wählen Sie "Am ersten Rahmen ausrichten".
  3. Wählen Sie Regionen von Interesse (ROIs) entlang von Neuriten mithilfe des ROI-Auswahlwerkzeugs aus, einem bohnenförmigen Symbol rechts neben dem Bildrahmen (Abbildung 3B). Markieren Sie auch einen ROI, der die Hintergrundfluoreszenzintensität darstellt.
    HINWEIS: ROIs werden ausgewählt, indem Bereiche mit deutlich getrennten Puncta entlang neuronaler Spuren ausgewählt werden, die durch das Hellfeld-Standbild angezeigt werden. Mindestens fünf ROIs pro Neuron werden für die Analyse ausgewählt. Der Hintergrund-ROI wird in einer Region des Sichtfelds gewählt, die keine Neuriten enthält.
  4. Messen Sie die Rohfluoreszenz im Zeitverlauf für ausgewählte ROIs mithilfe der folgenden Befehlsreihe: | messen Zeitmessung.
    1. Initiieren Sie die Messfunktion im oberen Bereich des Bedienfelds "Zeitmessung ". Es werden sowohl eine grafische Darstellung der Rohfluoreszenz im Zeitverlauf (Abbildung 3C) als auch quantitative Daten generiert.
      HINWEIS: Jeder Datenpunkt stellt die Rohfluoreszenz für diesen ROI für den Frame dar, der diesem bestimmten gemessenen Zeitpunkt zugeordnet ist.
  5. Exportieren Sie rohe Fluoreszenzintensitäten in die Tabellenkalkulationssoftware.
  6. Analysieren Sie jeden ROI unabhängig. Normalisieren Sie zunächst die Daten, indem Sie die ROI-Intensität im Hintergrund von der ROI der Zinsintensität zu jedem Zeitpunkt subtrahieren.
    1. Nehmen Sie den rohen Fluoreszenzwert aus dem Hintergrund-ROI zu jedem bestimmten Zeitpunkt und subtrahieren Sie ihn vom ROI-Wert der rohen Intensität zu diesem Zeitpunkt.
      HINWEIS: Dies geschieht für den gesamten Aufnahmezeitraum, sowohl für die Basal- als auch für die Stimulationsphase.
  7. Bestimmen Sie den durchschnittlichen ROI der Zinsintensität für die letzten 30 s des Ausgangswerts.
    1. Berechnen Sie den Durchschnitt der normalisierten basalen Rohwerte, die in Schritt 8.6 aus den letzten 30 s der 3-5-minütigen Basalaufzeichnungsperiode generiert wurden.
      HINWEIS: Der gesamte Zeitraum der basalen Aufzeichnung könnte verwendet werden, um diesen Wert zu generieren. Da sich dieser Wert jedoch stabilisiert und beibehalten wird, sind die 60-maligen Punkte der letzten 30 s von ausreichender Stichprobengröße, um das Ganze darzustellen.
  8. Vergleichen Sie diesen Basiswert mit dem normierten Intensitätswert zu jedem Zeitpunkt, wodurch eine Änderung des Fluoreszenzwerts (ΔF) erzeugt wird.
    1. Nehmen Sie den Wert aus Schritt 8.7 und subtrahieren Sie den durchschnittlichen Ausgangsfluoreszenzwert. Führen Sie dies und die nachfolgenden Schritte für den gesamten Aufnahmezeitraum durch, sowohl für die Basal- als auch für die Stimulationsphase.
  9. Berechnen Sie diese Änderung in Bezug auf den Basisfluoreszenzwert, wodurch eine Änderung der Fluoreszenz/Baseline-Fluoreszenz (ΔF/F) erzeugt wird. Nehmen Sie dazu den Wert aus Schritt 8.8 und dividieren Sie ihn durch den durchschnittlichen Basis-Fluoreszenzwert.
  10. Setzen Sie schließlich den Startpunktwert auf 1, damit Zu- oder Abnahmen im Laufe der Zeit leicht grafisch visualisiert werden können.
    1. Nehmen Sie den in Schritt 8.9 generierten Wert und fügen Sie 1 hinzu.
      HINWEIS: Wenn dies richtig gemacht wird, sollten die 30 s der Basisperiodenwerte in der Nähe des Wertes 1 schweben. In Zellen, die effektiv synaptischen Inhalt freisetzen, sollte dieser Wert nach Beginn der Stimulation von 1 auf 0 tendieren. Ein Beispiel für die Schritte 6 bis 9 ist in Abbildung 3E dargestellt.

9. Datenanalyse

HINWEIS: Der Experimentator kann für experimentelle Bedingungen entblindet werden, um Daten für die Analyse angemessen zu sammeln. Verwenden Sie eine Stichprobengröße von mindestens 10 Neuronen pro Bedingung aus jedem der drei unabhängigen Experimente. Betrachten Sie Neuronen nur dann für die Aufnahme, wenn mindestens fünf ROI-Regionen ausgewiesen werden können. Dieses Niveau der experimentellen Replikation war in veröffentlichten Studien ausreichend, um einen tiefgreifenden Verlust der synaptischen Entladung in ALS-assoziierten poly-GA-haltigen Zellen im Vergleich zu GFP-Kontrollen nachzuweisen (siehe Repräsentative Ergebnisse). Wenn jedoch ein subtilerer Phänotyp beobachtet wird, kann die Anzahl der biologischen und/oder technischen Replikate eine Optimierung durch den Benutzer erfordern.

  1. Bestimmen Sie unter Verwendung aller berechneten ΔF/F-Werte im Zeitverlauf aus den ROIs einer gegebenen experimentellen Bedingung einen mittleren ΔF/F-Wert für jeden Zeitpunkt zusammen mit einem SEM.
  2. Plotten Sie Daten mit einem Grafik- und Statistikprogramm im xy-Format, wobei x die verstrichene Zeit und y der in Schritt 9.1 berechnete ΔF/F-Wert ist. Präsentieren Sie alle Werte als Mittelwert ± SEM.
  3. Um die statistische Signifikanz zu bestimmen, verwenden Sie den Student's t-Test für den Vergleich von zwei Gruppen und die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Analyse zum Vergleich von drei oder mehr Gruppen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nach der erfolgreichen Implementierung des oben genannten Protokolls werden repräsentative Ergebnisse für ein typisches Synapikelfreisetzungsexperiment mit Styrylfarbstoff gezeigt. Kultivierte kortikale Neuronen von Ratten wurden mit der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode mit Farbstoff beladen. Die Spezifität der Farbstoffbelastung wurde durch Co-Markierung mit dem synaptischen Vesikelmarker Synaptophysin bestimmt. Ein Großteil der Styrylfarbstoff-positiven Puncta ist für diesen Marker co-positiv (Abbildung 2A). Um festzustellen, ob die für die Styrylfarbstoffbildgebung verwendeten Einstellungen Photobleaching verursachen, wird typischerweise ein unbehandelter Brunnen mit Farbstoff beladen und für einen längeren Zeitraum von 10 Minuten ohne Stimulation abgebildet, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzwerte konstant bleiben.

Zusätzlich werden die Ergebnisse erneut durch Co-Labeling von Synaptophysin und Styrylfarbstoff wie in Abbildung 2A gezeigt. Diese Fluorophore wurden unter Verwendung des in Abschnitt 6 angegebenen Paradigmas für die TRITC-Styrylfarbstoff-Bildgebung sowie der dualen Erfassung der Synaptophysinfluoreszenz unter Verwendung hochintensiver Laserleistung auf dem DAPI-Kanal zur Visualisierung des mTurquoise-Synaptophysins co-abgebildet. Gezeigt werden repräsentative Bilder von synaptischen Regionen vor und nach der Stimulation (Abbildung 2B). Während diese Methode eine indirekte Schlussfolgerung für das Fehlen von Photobleaching ist, zeigt die Analyse der rohen Intensitätswerte über den gesamten Bildgebungszeitraum, dass die Synaptophysinintensität konstant bleibt, während die Intensität des Styrylfarbstoffs nach der Stimulation abnimmt (Abbildung 2C). Wenn wir dieses Experiment und unsere anderen Kontrollen der stabilen Fluoreszenz vor der Stimulation und über längere Zeiträume in Nicht-Stimulationsbohrungen durchführen, haben wir festgestellt, dass eine Abnahme der Styrylfluoreszenz eher auf die synaptische Entladung durch KCl-Depolarisation als auf Photobleicheffekte zurückzuführen ist.

Figure 2
Abbildung 2: Bewertung der Spezifität und der Bildgebungsparameter der Styrylfarbstoffmarkierung. (A) Ein repräsentatives 40-faches Bild eines mit Styrylfarbstoff markierten kortikalen Rattenneurons (rot), das 24 h zuvor mit einem Plasmid transfiziert wurde, um mTurquoise2-Synaptophysin61 zu exprimieren, das vom Synapsin-Promotor (grün) angetrieben wurde. Die Kolokalisation dieser beiden Fluorophore zeigt, dass eine große Mehrheit der Styrylfarbstoff-positiven Puncta mit dem synaptischen Vesikelmarker Synaptophysin co-gefärbt ist. Der Maßstabsbalken zeigt 5 μm an. (B) Kortikale Neuronen wurden wie in (A) transfiziert und mit Styrylfarbstoff geladen und nach dem Styrylfarbstoffparadigma zusammen mit der dualen Fluoreszenzerfassung des mTurquoise-Synaptophysins auf dem DAPI-Kanal abgebildet. Repräsentative Bilder zeigen Synaptophysin- und Styrylfarbstoff-Puncta-Regionen vor und nach der Stimulation. Der Maßstabsbalken zeigt 5 μm an. (C) Die Fluoreszenz wurde im Laufe der Zeit auf Synaptophysin (DAPI-Kanal oben) und Styrylfarbstoff (FITC-Kanalunterseite) überwacht. Die Synaptophysin-Intensität wurde während der Bildgebungs- und Stimulationsphase auf einer stetigen Fluoreszenz gehalten, während die Fluoreszenz des Styrylfarbstoffs abnahm, als der Farbstoff bei der Stimulation entladen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Repräsentative Bilder zeigen die Belastung von Styrylfarbstoff während der Bildgebung mit der Auswahl von ROIs (Abbildung 3A-B). Die Rohfluoreszenzintensität ausgewählter ROIs und ein Hintergrund-ROI werden mit der konfokalen Software dargestellt (Abbildung 3C). Die hier gezeigten Neuronen wurden auch mit Plasmiden transfiziert, um die Auswirkungen von Dipeptidproteinen zu untersuchen, die im Kontext von C9ORF72-ALS produziert wurden, nämlich FLAG-eGFP und FLAG-GA50-eGFP, die vom T7-Promotor angetrieben wurden. Eine erfolgreiche synaptische Vesikelfreisetzung führt zu einem auffälligen Verlust der Farbstofffluoreszenz bei hoher KCl-Depolarisation (Abbildung 3D, obere zwei Panels) für ein GFP-transfiziertes Kontrollneuron. Ein repräsentatives Video, das hier enthalten ist, zeigt, wie dies während der Bildgebung auftritt. Darüber hinaus entlädt ein Neuron nach der Stimulation selektiv Styrylfarbstoff in einer Neuritenregion (Video 1).

Auf der anderen Seite wird die gestörte synaptische Übertragung durch eine zurückgehaltene Farbstofffluoreszenz auch nach hoher KCl-Depolarisation in Neuronen dargestellt, die mit einem C9ORF72-verknüpften Dipeptid-Wiederholungskonstrukt (GA50) transfiziert wurden (Abbildung 3D, unten zwei Panels)43. Nach quantitativer Datenanalyse (Abbildung 3E) werden die Daten als Farbstoffintensität während der gesamten Bildgebung für die Kontrollgruppen (GFP) und ALS/FTD (GA50) dargestellt (Abbildung 3F)43. Diese Methode kann auch Zwischeneffekte analysieren und ist nicht einfach ein binäres "Alles oder Nichts" -Maß. In Experimenten zur Rettung der durch GA50 vermittelten synaptischen Defizite wurde das exogene synaptische Vesikel-assoziierte Protein 2 (SV2) durch lentivirale Transduktion unter Verwendung des rSV2a-eGFP-pRRL-Plasmids, das vom menschlichen PGK-Promotor angetrieben wird, eingeführt. Nach der Bildgebung und Analyse, wie oben beschrieben, wurde das synaptische Feuern in Neuronen gerettet, die GA50 und SV2 koexprimierten (Abbildung 3G).

Figure 3
Abbildung 3: Auswertung der synaptischen Vesikelfreisetzung durch Styrylfarbstoffmarkierung. (A) Ein repräsentatives 40-faches Bild eines mit Styrylfarbstoffen markierten Neurons in aCSF-Medien mit niedrigem KCl zu Beginn eines bildgebenden Experiments. Der Maßstabsbalken zeigt 20 μm an. (B) Darstellung der ROI-Generierung auf dem Bild von (A). Spezifische Puncta-Regionen entlang der Neuriten (# 1-4) werden mit dem ROI-Tool ausgewählt, wobei der bohnenförmige Knopf rechts hervorgehoben ist. Ein endgültiger ROI wird in einem leeren Bereich ausgewählt, um die Intensität des Hintergrundsignals zu erfassen. Bereiche mit unspezifischen, nicht-neuronalen Lichtblicken werden vermieden. Der Maßstabsbalken zeigt 20 μm an. (C) Darstellung der Signalintensitäten für ROIs #1-5 von (B) im Zeitverlauf, wie sie von konfokaler Software grafisch/dargestellt werden. (D) Visuelle Darstellungen von ROI-Regionen vor / nach der Stimulation für ein Neuron, das effektiv synaptische Übertragung durchläuft (oben zwei Panels). Die unteren beiden Panels sind gezoomte Bilder mit einem unverzerrten Schwellenwert, der angewendet wird, um Puncta vom Hintergrund zu isolieren, um verschiedene Bereiche visuell zu zeigen. GFP-haltige Neuronen werden effektiv synaptisch freigesetzt, während die Expression des C9ORF2-ALS-verwandten Peptids GA50 diesen Effekt verhindert. Maßstabsbalken zeigen 10 μm-Nachdruck von Jensen et al. 202043. (E) Beispiel einer Quantifizierungsdatei mit Tabellenkalkulationssoftware, die die Normalisierung der Werte auf die Baseline und die Generierung von ΔF/F-Werten im Laufe der Zeit zeigt. Die Daten werden zunächst zu jedem Zeitpunkt auf den ROI-Intensitätswert im Hintergrund normalisiert. Dieser Wert wird dann mit dem durchschnittlichen ROI of Interest-Basiswert für die letzten 30 s vor der Stimulation verglichen (hier der Einfachheit halber als 10 s in 1 s Intervallen dargestellt) (ΔF). Diese Änderung wird als nächstes als Bruchteil der Basisfluoreszenz (ΔF/F) berechnet. Schließlich wird der Startpunktwert auf 1 gesetzt, so dass Zu- oder Abnahmen im Laufe der Zeit leicht grafisch visualisiert werden können. Mindestens fünf Puncta-Regionen pro Neuron und mindestens zehn Neuronen pro experimenteller Bedingung werden gesammelt, wobei Daten wie diese kombiniert werden, um zu jedem Zeitpunkt durchschnittliche Messungen zu erzeugen. (F) Daten aus einer Tabellenkalkulationsdatei wie in (E) werden in eine Grafik- und Statistiksoftware verschoben. Für die hier gezeigte Grafik wird der ΔF/F-Wert zu jedem Zeitpunkt, gemittelt über alle Punctabereiche einer experimentellen Bedingung, zusammen mit dem Standardfehler des Mittelwerts aufgetragen. Die Grafik hier sind Daten aus den GFP-gegen-GA50-Experimenten, die in (D) angegeben sind, wobei die letzten 10 s der Baseline und die ersten 10 s der Stimulationsperiode aus Jensen et al. 202043 abgedruckt sind. (G) Dieser Assay kann Kurven für eine intermediäre synaptische Freisetzung erzeugen und ist nicht einfach eine "Alles oder Nichts"-Antwort. GA50 wurde zusammen mit dem exogenen synaptischen Protein SV2 (synaptisches Vesikel-assoziiertes Protein 2) exprimiert, und die Bildgebung und Analyse von Styrylfarbstoffen wurde wie in den vorherigen Schritten angegeben durchgeführt. Wie in Abbildung 3F stellt die hier gezeigte Grafik den ΔF/F-Wert zu jedem Zeitpunkt dar, der über alle Punctabereiche einer experimentellen Bedingung gemittelt wird, zusammen mit ihrem Standardfehler des Mittelwerts. Die Grafik zeigt die letzte Minute der Baseline und die erste Minute der Stimulationsperiode von Jensen et al. 202043. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Repräsentatives Video des Styrylfarbstoff-Bildgebungsexperiments. Gezeigt wird ein repräsentatives Video eines kortikalen Neurons, das mit Styrylfarbstoff beladen ist. Das Video zeigt die Periode, die zum Zeitpunkt der Badperfusion von hohem KCl aCSF beginnt. Die Box-Region hebt die Neuriten hervor, mit beobachtbarem Verlust der Puncta-Fluoreszenz im Laufe der Zeit. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Nach der in Abschnitt 7 beschriebenen Methode sind repräsentative Fluoreszenzbilder von kortikalen Neuronen gezeigt, die vor und nach der KCl-Depolarisation mit GcaMP6m transfiziert wurden (Abbildung 4A). Rohintensitätsdiagramme zeigen erhöhte Fluoreszenzwerte, die schwanken, was auf den Eintritt von Kalzium in Neuriten nach KCl-induzierter Depolarisation hinweist (Abbildung 4B). Dieses zweite repräsentative Video zeigt Neuronen, die GcaMP6m mit geringer Fluoreszenz am Ende der Aufnahme-Baseline-Periode exprimieren, um diesen Effekt zu demonstrieren. Zu Beginn der Stimulation zeigen die Neuronen einen dramatischen Fluoreszenzanstieg (Video 2). Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um Veränderungen des Kalziumeintritts in einem mutierten FUS-ALS-Modell nachzuweisen. Astrozyten in diesem Modell wurden mit Adenovirus transduziert, das CMV-Promotor-getriebene eGFP-FUS-Plasmide enthielt. Wenn konditioniertes Medium aus mutierten FUS-exprimierenden Astrozyten auf Motoneuronen platziert wurde, wurde ein erhöhter Kalziumeinstrom im Vergleich zu nicht-mutierten FUS-Bedingungen nach α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA) + Cyclothiazid-Stimulation beobachtet (Abbildung 4C)44. Die Empfindlichkeit dieses Assays wurde durch die Durchführung von Experimenten mit und ohne Kalzium im Perfusionsmedium getestet. Im Rahmen von GFP gegenüber GA50 wurde oben erwähnt, wurden erhöhte Peak-Calciumtransienten in GA50-haltigen Motoneuronen beobachtet. Dies hing insbesondere davon ab, dass Kalzium in die Zelle gelangte und nicht von der Freisetzung interner Kalziumspeicher. Wenn Calcium aus dem stimulierenden aCSF-Medium entfernt wurde, wurden in beiden experimentellen Bedingungen keine Calciumtransientenreaktionen beobachtet (Abbildung 4D)43.

Figure 4
Abbildung 4: Beobachtung von Calciumtransienten in Echtzeit mit GCaMP-Reportern. (A) Ein 40-faches Bild eines GCaMP6m-exprimierenden Neurons, pseudogefärbt, um die Intensität der GFP-Fluoreszenz zu zeigen (niedrig in Blau bis hoch in Rot). Die linken Blenden zeigen das gesamte 40-fache Sichtfeld vor und nach der Stimulation. Der Maßstabsbalken zeigt 20 μm an. Bei den Bildern auf der rechten Seite handelt es sich um gezoomte Versionen der freigelegten Box-Bereiche. Durch diese Bilder wird mit dem Auge deutlich, dass es nach der Stimulation zu einem robusten Anstieg des fokalen neuritischen Kalziumspiegels kommt. Der Maßstabsbalken zeigt 12 μm an. (B) Die ROI-Auswahl und die Überwachung der Fluoreszenzintensität während des gesamten Experiments werden wie in Abbildung 3 dargestellt. Die letzten 30 s Baseline und 1 min Stimulation für zwei ausgewählte ROIs eines Neurons, das einer GCaMP6m-Fluoreszenzüberwachung unterzogen wird, sind hier dargestellt. Im Gegensatz zur Styrylfarbstoff-Bildgebung nimmt die Fluoreszenzintensität nach neuronaler Stimulation zu. Darüber hinaus, wie hier erwähnt, schwanken Calciumtransienten in Neuriten im Laufe der Zeit; Daher werden die Ergebnisse in der Regel als gemittelter Wert für die normalisierte Peak-Fluoreszenzänderung für jede ROI-Region dargestellt. (C) Eine repräsentative Quantifizierung eines solchen Experiments ist gezeigt, wie in Kia-McAvoy et al. 201844 veröffentlicht, wo primäre Motoneuronen, die einen Überstand von mutierten FUS-ALS-Astrozyten erhielten, einen signifikant erhöhten Zustrom von Kalzium nach AMPA-Rezeptorstimulation aufwiesen, verglichen mit Neuronen, die Überstände von Wildtyp-FUS-exprimierenden Astrozyten erhielten. (D) Repräsentative Quantifizierung der transienten Kalziumbildgebung, bei der Calcium nicht in das stimulierende aCSF einbezogen wurde. Gezeigt werden Bedingungen von mCherry gegenüber GA50-mCherry, stimuliert mit hohem KCl aCSF mit oder ohne Kalzium, wie in Jensen et al. 202043 veröffentlicht. GA50-enthaltende Neuronen zeigten im Vergleich zu mCherry-haltigen Zellen einen erhöhten Spitzenkalziumzufluss. Es gab keine Erhöhung des internen Kalziumspiegels in beiden experimentellen Bedingungen, wenn Kalzium aus stimulierendem aCSF mit hohem KCL entfernt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 2: Repräsentatives Video des GCaMP-Calcium-Transienten-Experiments. Gezeigt wird ein repräsentatives Video eines Feldes kortikaler Neuronen, die mit GCaMP6m transfiziert wurden. Nach einer Baseline-Periode wird ein großer Kalziumzufluss an der 6-s-Marke festgestellt, wenn ein hoher KCl-aCSF angewendet wurde. Der Kalziumeintrag kann entweder für die gesamte Zelle oder wie beschrieben an bestimmten Neuritenregionen gemessen werden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Mögliche Probleme Mögliche Gründe/Lösung
1 Unspezifisches Laden Seien Sie präzise mit der Ladezeit. Längere Ladezeiten führen zu unspezifischer Belastung von FM4-64 in Endosomen und Lysosomen
2 Keine nennenswerte Exozytose in Kontrollneuronen Überprüfen Sie den pH-Wert der aCSF-Lösung mit hohem KCl.
3 Verlust des Fokus und seitliche Drift Stellen Sie sicher, dass der perfekte Fokus darauf liegt. Richten Sie die Bilder nach der Bildgebung mit der Nikon-Software oder dem ImageJ-Plugin aus.
4 Bleichen der FM4-64-Fluoreszenz Überprüfen Sie die für die Bildgebung verwendete Laserintensität. Versuchen Sie immer, die geringstmögliche Intensität zu verwenden. Vergewissern Sie sich, dass die verwendete Laserintensität nicht zum Bleichen führt, indem Sie Probeläufe durchführen.

Tabelle 2: Mögliche Probleme und Fehlerbehebung bei Styrylfarbstoffexperimenten. Typische Szenarien für Probleme und allgemeine Fehlerbehebung für synaptische Entladeexperimente.

Mögliche Probleme Mögliche Gründe/Lösung
1 Transfektionseffizienz zu niedrig Überprüfen Sie die neuronale Gesundheit. Wenn Neuronen schwer zu transfizieren sind, kann man auf AAV oder lentivirale Transduktion von GCaMP umsteigen.
2 Akkumulation der GCaMP6-Fluoreszenz im Zellkern Beeinträchtigte neuronale Gesundheit. Überprüfen Sie das Transfektionsprotokoll.
3 Verlust des Fokus und seitliche Bilddrift Stellen Sie sicher, dass der perfekte Fokus darauf liegt. Richten Sie die Bilder nach der Bildgebung mit der Nikon-Software oder dem ImageJ-Plugin aus.
4 Keine Kalziumreaktion bei KCL-Stimulation Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert von aCSF korrekt ist.
5 Bleichen der GCaMP6-Fluoreszenz Überprüfen Sie die für die Bildgebung verwendete Laserintensität. Versuchen Sie immer, die geringstmögliche Intensität zu verwenden. Vergewissern Sie sich, dass die verwendete Laserintensität nicht zum Bleichen führt, indem Sie Probeläufe durchführen.
6 Blobing von Neuriten Beeinträchtigte neuronale Gesundheit durch Transfektion. Verwenden Sie eine neue Charge neuronaler Kulturen.

Tabelle 3: Mögliche Probleme und Fehlerbehebung bei der Bildgebung von Calciumtransienten in Neuriten. Typische Szenarien für Probleme und allgemeine Fehlerbehebung für GCaMP-Calciumtransientenexperimente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drei Schritte, die beiden beschriebenen Methoden gemeinsam sind, sind von entscheidender Bedeutung für den experimentellen Erfolg und quantifizierbare Ergebnisse. Erstens ist die Vorbereitung von frischem aCSF vor jeder Experimentierrunde unter Einhaltung der beigefügten Anweisungen unerlässlich. Andernfalls kann eine angemessene neuronale Depolarisation verhindert werden. Eine Probe unbehandelter Kontrollneuronen sollte vor der Stimulation von Versuchsgruppen ständig getestet werden, um eine ordnungsgemäße zelluläre Depolarisation sicherzustellen und einen Maßstab für positive Ergebnisse in dieser Bildgebungssitzung zu liefern. Zweitens, um die Fluoreszenz im Laufe der Zeit für bestimmte synaptische Regionen erfolgreich zu verfolgen, sollte auch bei der Festlegung von Bildgebungsparametern und ROI-Bereichen für die Überwachung besondere Vorsicht geboten werden. Die Aufzeichnung der Basisperiode sollte sofort in die Aufzeichnungsperiode der Stimulation übergehen. Eine ausreichend schnelle Bildrate (2 Bilder/s) ist erforderlich, um die Single-Decay-Dynamik der Styrylfarbstofffreisetzung zu erfassen. Schließlich ist ein kritischer Schritt in der Analyse von Experimenten die Normalisierung von Fluoreszenzmessungen zuerst auf den bildgebenden Hintergrund und dann auf die vorstimulierte Baseline. Wie bei anderen Bildgebungsprotokollen wird die Subtraktion eines leeren Bildbereichs zuerst bei allen gepaarten Zeitfluoreszenzmessungen durchgeführt, um jegliche Hintergrundautofluoreszenz zu entfernen, die durch die Zugabe von KCl-Medien eingeführt werden kann. Es ist auch wichtig, den durchschnittlichen Fluoreszenzwert für jeden ROI aus der Baseline der letzten 30 vor der Stimulation zu messen und zu berechnen. Dieser durchschnittliche Startwert wird dann über alle Zeitmessungen für diesen ROI als definierten Ausgangspunkt verwendet, um die Intensität der "Änderung gegenüber dem Ausgangswert" zu quantifizieren.

Die primäre neuronale Kultur ist notorisch schwer mit exogener DNA zu transfizieren, und selbst optimierte Protokolle führen häufig zu geringen Wirkungsgraden der Gesamtzellen in Kultur. 20% -25% der Transfektionseffizienz werden üblicherweise in unseren neuronalen Kulturen erreicht, ohne dass eine transfektionsinduzierte Toxizität nachgewiesen wird. Während in Zellen, die GCaMP enthalten, ziemlich konsistente Expressionen beobachtet werden, werden subtil unterschiedliche Niveaus der Sondenexpression innerhalb einzelner Zellen auf der Grundlage der Methode der Quantifizierung der Veränderung der Basisfluoreszenz im Vergleich zu dieser Baseline betrachtet. Bei dieser relativ geringen Effizienz ist die Verwendung transfektionsbasierter Methoden zur Einführung des GCaMP-Reporters jedoch nicht von ausreichender Robustheit für groß angelegte biologische Replikate für Hochdurchsatz-Screening-Studien. Um dies zu überwinden, sind mehrere Variantenkonstrukte für lentivirale oder adenovirale Verpackungen oder zelllinienspezifische Expression kommerziell erhältlich, die höhere Transduktionseffizienzen ermöglichen. Eine primäre Modifikation, die bei der Verwendung dieser Protokolle gewünscht werden kann, ist die Verwendung der optogenetischen Stimulation von Neuronen anstelle der Badanwendung von KCl62. Die Transduktion mit lentiviralen Konstrukten, die eine der Familien der jetzt verfügbaren Kanalrhodopsine exprimieren sollen, gefolgt von einer Aktivierung mit spezifischen Wellenlängen des Lichts, ermöglicht eine räumliche Kontrolle für die Depolarisation von Teilmengen von Neuronen und auch für die Bewertung der Wirkung von Zügen von Aktionspotentialen auf sich wiederholende Kalziumzuflussniveaus und die Erschöpfung der synaptischen Vesikelspeicher63 . Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die Verwendung dieser Methode derzeit etwas eingeschränkt ist, da der Benutzer sicherstellen muss, dass sein optogenetischer Reporter, synaptischer Reporter und alle zusätzlichen exogen eingeführten Proteine keine spektrale Überlappung zwischen den verwendeten Fluorophoren aufweisen. Ein häufiges Problem bei der Fehlerbehebung bei der Verwendung des Styrylfarbstoffs ist die passive Intensitätsreduzierung während des Basisaufnahmezeitraums. Vor experimentellen Studien ist es wichtig, die Laserintensität und die Fotoaufnahmeintervalle zu optimieren, um Fotobleicheffekte zu minimieren. Damit Experimente in Betracht gezogen werden können, ist eine Stabilisierung der Intensität für mindestens die letzten 30 s der Basisperiode erforderlich. In den Tabellen 2 und 3 finden Sie häufige Probleme und deren Lösungen für Styrylfarbstoff- bzw. Calciumtransientenexperimente.

Die primäre Einschränkung dieser beiden Methoden besteht darin, dass Kulturen nur in einem einzigen Fall stimuliert und untersucht werden können. Da die Anwendung des Bades zur Einführung des Depolarisationsmittels KCl verwendet wird, müssen sich alle Neuronen, die von diesem Zustand in dieser Schale untersucht werden sollen, innerhalb des anfänglichen Sichtfeldes des Mikroskopobjektivs befinden. Wenn die Funktionalität im Laufe der Zeit von Interesse ist, sind gepaarte Kulturen erforderlich. Die oben erwähnte optogenetische Methode wird es jedoch ermöglichen, die Kalziumdynamik auf Wunsch im Laufe der Zeit zu beobachten. Wenn Neuronen einen Defekt beim Recycling von synaptischen Vesikeln aufweisen, wird die anfängliche Belastung des Styrylfarbstoffs beeinträchtigt. Während die interne Intensitätsnormalisierung einen Vergleich zwischen den Bedingungen ermöglicht, können geringfügige Unterschiede in der Größenordnung der Antworten schwierig zu erkennen sein. Schließlich sind neue Iterationen dieser Reporter schnell verfügbar und können für schnellere Erkennungszeiten oder robustere Ergebnisse ausgetauscht werden. Zum Beispiel gilt GCaMP6m nicht mehr als der schnellste Reporter von Calciumtransienten an synaptischen Terminals. Stattdessen kann man die neueste Generation von jGCaMP864 verwenden.

Die hier beschriebenen Methoden sind ein schneller und zuverlässiger Weg, um festzustellen, ob die genetische oder pharmakologische Manipulation von Neuronen die funktionelle synaptische Signalgebung und Freisetzung stört. Die detaillierten Experimente sind technisch weniger anspruchsvoll und kostengünstiger als die traditionelle Spannungs-Strom-Klemmelektrophysiologie und Elektronenmikroskopie. Während die Elektrophysiologie von Natur aus einen niedrigen Durchsatz und auf der Ebene der einzelnen Zellen aufweist, sind die hier beschriebenen Protokolle ein höherer Durchsatz und schnell, so dass mehrere Neuronen gleichzeitig abgebildet und viele Iterationen in einer einzigen Bildgebungssitzung durchgeführt werden können. Es wird vorgeschlagen, dass diese Calciumdynamik- und synaptischen Freisetzungsparadigmen als erster Indikator für synaptische Übertragungsänderungen in ALS-Modellen und die Untersuchung anderer Formen der neuronalen Degeneration verwendet werden. Obwohl die Schlussfolgerungen, die aus der Gcamp6m- und Styrylfarbstoffbildgebung abgeleitet wurden, einen spezifischen Mechanismus der synaptischen Dysfunktion nicht genau herauskitzeln können, können Forscher auf der Grundlage solcher Ergebnisse gezielte, evidenzbasierte ergänzende Studien mit traditionellen Methoden durchführen, um beteiligte Kanäle, synaptische Vesikelzahl oder Quantengehalt zu bestimmen.

Der Nutzen in diesen Protokollen ist die schnelle und unkomplizierte Beurteilung von Veränderungen des richtigen depolarisationsvermittelten Kalziumeinflusses und/oder der synaptischen Vesikelfusion in spezifischen ALS-Modellen. Wir haben dies kürzlich in einer Publikation gezeigt, die einen erhöhten Kalziumeinstrom und eine Aufhebung der synaptischen Entladung in kortikalen Neuronen zeigt, die das Dipeptidprotein (Glycin-Alanin)50 exprimieren, das aus der C9ORF72-Hexanukleotid-Wiederholungsexpansion resultiert43. Wie in unserer veröffentlichten Arbeit gezeigt, können diese Methoden leicht zusammen mit der Co-Transfektion von mutierten RNAs oder Proteinen von Interesse oder in Zellen durchgeführt werden, die direkt aus transgenen Tiermodellen kultiviert wurden43. Darüber hinaus wurden die Zuverlässigkeit und Robustheit dieser Protokolle erfolgreich in neuronal differenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzellen getestet45, so dass zukünftige Studien direkt in patientenabgeleiteten krankheitsrelevanten Zellen durchgeführt werden können. In einem anderen kürzlich erschienenen Manuskript liefern wir Beweise dafür, dass Wildtyp-Motoneuronen nach Stimulation einen hohen Kalziumeinstrom erfahren, wenn ein löslicher Faktor vorhanden ist, der von mutierten FUS freigesetzt wird, die Astrozyten exprimieren44. Astrozytäre Calcium-Signalisierungsereignisse sind auch tief mit der synaptischen Übertragung in benachbarten Neuronen verflochten65. Das Calciumdynamikprotokoll wurde angewendet, um ganzzellige Calciumtransienten in Modellen astrozytärer Kultur zu untersuchen, was sich sowohl in primären als auch in menschlichen IPS-abgeleiteten Zellen von Nagetieren als wirksam erwiesen hat. Ein weiteres Verständnis der astrozytären Kalziumdynamik und -signalisierung in ALS-Modellen wird wertvolle Erkenntnisse darüber liefern, wie die synaptische Übertragung folglich beeinflusst werden kann. Letztendlich wird der Einsatz von zelltypspezifischen GCaMP-Reportern auch ein leistungsfähiges Werkzeug sein, um die neuronale und astrozytäre Kalziumdynamik in gemischten Kokulturumgebungen zu untersuchen und speziell nicht-zellautonome Effekte zu bewerten, die von jeder Zellpopulation ausgehen.

Schließlich erstreckt sich der potenzielle Einsatz dieser Methoden nicht nur über das Studium von ALS hinaus, sondern auch auf die breiteren Bereiche der neurodegenerativen und sogar der Entwicklungsneurowissenschaften. Detaillierte Informationen über die spezifischen Plasmide, die zur Erzeugung der repräsentativen Ergebnisse verwendet werden, werden bereitgestellt und sind erfolgreich bei der Transfizierung von Plasmiden, die viele verschiedene genetische Varianten von FUS-, SOD1- und C9ORF72-Hexanukleotidwiederholungen und Dipeptiden43,44,66,67,68 enthalten. Vorausgesetzt, dass Plasmide einen Promotor enthalten, der in Neuronen verwendet wird, gibt es keine Einschränkung, welche Modelle von ALS oder degenerativen Erkrankungen mit diesen Methoden untersucht werden könnten. Darüber hinaus ist die Transfektion zur Expression mutierter Proteine ein völlig optionaler Schritt. Kulturen, die aus transgenen Tieren oder von menschlichen Patienten stammenden Zellen erzeugt werden, machen es überflüssig, Zellen zu identifizieren, die das mutierte Protein von Interesse enthalten. Gegenwärtig sind diese Systeme so eingeschränkt, dass, wenn Styrylfarbstoff verwendet wird, der TRITC-Kanal besetzt ist und wenn GcaMP6 verwendet wird, der FITC-Kanal belegt ist. Techniken, die die Untersuchung neuronaler und astrozytischer Aktivität in Echtzeit ermöglichen, erweitern die Möglichkeiten zum Verständnis der Zeitverlaufsanalyse für synaptische Reifung / Degeneration sowie Schnelltests für die Wirksamkeit pharmakologischer Verbindungen bei der Förderung oder Unterdrückung der neuronalen Kommunikation. Diese beiden Methoden sind für die Hochdurchsatzskalierung für das Screening geeignet. Anstatt Neuronen in einzelnen 35-mm-Schalen zu plattieren, könnten die Bildgebungsparameter dieser beiden Protokolle automatisiert auf 96-Well-Platten angewendet werden. Mit einer solchen Plattform können Substanzbibliotheken schnell auf Therapeutika getestet werden, die den Kalziumeintrag modulieren oder die synaptische Freisetzung verbessern, indem ein genetisches Krankheitsmodell oder sogar Zellen, die direkt von Patienten stammen, verwendet werden. Diese Methode könnte die Möglichkeit von subgruppenspezifischen oder sogar personalisierten Therapeutika beschleunigen, indem sie schnell Kandidatenmoleküle für weitere Untersuchungen identifiziert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Wir danken den anwesenden und ehemaligen Mitgliedern des Jefferson Weinberg ALS Center für kritisches Feedback und Anregungen zur Optimierung dieser Techniken und deren Analysen. Diese Arbeit wurde durch Mittel des NIH (RF1-AG057882-01 und R21-NS0103118 bis D.T.), der NINDS (R56-NS092572 und R01-NS109150 bis P.P.), der Muscular Dystrophy Association (D.T.), des Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), der Family Strong 4 ALS Foundation und der Farber Family Foundation (B.K.J., K.K, und P.P.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

Neuroscience Ausgabe 173
Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter