Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

Abstract

לפני ניוון עצבי, הגורם לליקויים מוטוריים וקוגניטיביים בחולים עם טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) ו/או דמנציה של אונה פרונטוטמפוראלית (FTLD) הוא תפקוד לקוי של תקשורת בין נוירונים נוירונים נוירונים מוטוריים ושרירים. התהליך הבסיסי של שידור סינפטי כרוך היתוך שלפוחית סינפטית תלוי depolarization ממברנה ושחרור של נוירוטרנסמיטורים לתוך הסינפסה. תהליך זה מתרחש באמצעות זרם סידן מקומי לתוך מסופים presynaptic שבו שלפוחיות סינפטיות שוכנות. כאן, הפרוטוקול מתאר מתודולוגיות הדמיה חיה מבוססות פלואורסצנטיות המדווחות באופן אמין על אקסוציטוזיס שלפוחית סינפטי בתיווך דה-פולאריזציה ודינמיקה של זרם סידן מסוף פרזינפטי בתאי עצב מתורבתים.

באמצעות צבע סטיירל המשולב בקרומי שלפוחית סינפטיים, שחרור השלפוחית הסינפטי מובהק. מצד שני, כדי לחקור את כניסת הסידן, Gcamp6m משמש, כתב פלואורסצנטי מקודד גנטית. אנו משתמשים בדה-פולאריזציה בתיווך אשלגן כלורי גבוה כדי לחקות פעילות עצבית. כדי לכמת אקסוציטוזה שלפוחית סינפטית חד משמעית, אנו מודדים את אובדן פלואורסצנטיות צבע סטיירל מנורמלת כפונקציה של זמן. תחת תנאי גירוי דומים, במקרה של זרם סידן, Gcamp6m פלואורסצנטיות עולה. נורמליזציה וכימות של שינוי פלואורסצנטי זה מבוצעים באופן דומה לפרוטוקול צבע סטיירל. שיטות אלה יכולות להיות מולטיפלקס עם ביטוי יתר מבוסס טרנספקטיה של חלבונים מוטנטיים מתויגים פלואורסצנטיים. פרוטוקולים אלה שימשו בהרחבה כדי ללמוד תפקוד סינפטי במודלים של FUS-ALS ו - C9ORF72-ALS, תוך שימוש בנוירונים קליפת המוח והמוטוריים העיקריים של מכרסמים. פרוטוקולים אלה מאפשרים בקלות סינון מהיר של תרכובות שעשויות לשפר את התקשורת העצבית. ככזה, שיטות אלה הן ערך לא רק עבור המחקר של ALS אלא עבור כל התחומים של מחקר מדעי המוח neurodegenerative והתפתחותי.

Introduction

מידול טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) במעבדה הופך למאתגר באופן ייחודי בשל האופי הלא סדיר באופן גורף של מעל 80% מהמקרים1, יחד עם המספר העצום של מוטציות גנטיות הידועות כסובטיביות למחלה2. למרות זאת, כל המקרים של ALS חולקים את התכונה המאחדת שלפני ניוון עצבי גלוי, יש תקשורת לא מתפקדת בין נוירונים מוטוריים presynaptic ותאי שריר פוסט-סינפטיים3,4. מבחינה קלינית, כאשר חולים מאבדים את הקישוריות של הנוירונים המוטוריים העליונים והתחתונים הנותרים, הם מציגים תכונות של היפר-רגישות עצבית והיבועות לאורך המחלה 5,6,7,8,9, המשקפים שינויים מולקולריים מורכבים בסיסיים בסינפסות אלה, שאנו, כחוקרי ALS, מבקשים להבין.

מודלים מהונדסים מרובים המחישו כי הידרדרות וחוסר ארגון של הצומת הנוירו-שרירי מתרחשים עם הביטוי של מוטציות גנטיות סיבתיות ALS, כולל SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16, ו- TDP4317,18,19 באמצעות הערכות מורפולוגיות, כולל הערכה של זרי פרחים סינפטיים, צפיפות עמוד שדרה, וארגון טרום/פוסט-סינפטי. מבחינה מכאניסטית, מאז ניירות ציון הדרך של קול, הודג'קין, האקסלי בשנות ה -30, ניתן היה גם להעריך תגובות סינפטיות באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות בתרבית תאים במבחנה או בהכנות פרוסת רקמות20. באמצעות אסטרטגיות אלה, מודלים רבים של ALS הוכיחו ליקויי שידור סינפטיים. לדוגמה, גרסה מוטנטית של TDP43 גורמת לתדירות ירי משופרת ומפחיתה את סף פוטנציאל הפעולה ב- NSC-34 (חוט השדרה x קו תאים היברידי נוירובלסטומה 34) תאים דמויי נוירון מנוע21. אותה גרסה גורמת גם להעברת סינפטית לא מתפקדת בצומת הנוירו-שרירית (NMJ) לפני הופעת ליקויים מוטוריים התנהגותיים במודל עכבר22. בעבר הוכח כי ביטוי FUS מוטנטי גורם שידור סינפטי מופחת ב NMJ במודל drosophila של FUS-ALS לפני פגמים locomotor11. דו"ח שנערך לאחרונה באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה נגזר נשאי התרחבות C9orf72 חשף ירידה במאגר לשחרור בקלות של שלפוחיות סינפטי23. בסך הכל, מחקרים אלה ואחרים מדגישים את החשיבות של בניית הבנה מקיפה יותר של המנגנונים שבבסיס האיתות הסינפטי במודלים רלוונטיים למחלות של ALS. זה יהיה מרכזי בהבנת הפתוביולוגיה של ALS ופיתוח יעדים טיפוליים פוטנציאליים עבור חולים.

שיטות של תאי הידוק זרם ומתח היו לא יסולא בפז בקביעת תכונות הממברנה כגון מוליכות, פוטנציאל ממברנה מנוחה, ותוכן קוונטי של סינפסות בודדות20,24. עם זאת, אחת המגבלות המשמעותיות של אלקטרופיזיולוגיה היא שזה מאתגר מבחינה טכנית ומספק רק תובנות מתא עצב יחיד בכל פעם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים, יחד עם בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, מציעה את ההזדמנות לחקור את ההעברה הסינפטית של נוירונים באופן מרחבי25,26,27. אמנם לא מידה ישירה של עירור עצבי, גישה פלואורסצנטית זו יכולה לספק מדידה יחסית של שני קורלציות מולקולריות של תפקוד סינפטי: שחרור שלפוחית סינפטית וחולפים סידן במסופים סינפטיים.

כאשר פוטנציאל פעולה מגיע לאזור המסוף presynaptic של נוירונים, ארעי סידן מופעלים, להקל על המעבר מאות חשמלי לתהליך של שחרור נוירוטרנסמיטר28. תעלות סידן מגודרות מתח מקומי לאזורים אלה לווסת היטב את איתות הסידן כדי לווסת את הקינטיקה של שחרור נוירוטרנסמיטר29. ההקלטות הראשונות המבוססות על פלואורסצנטיות של ארעי סידן בוצעו באמצעות מחוון אורך גל כפול Fura-2 AM או צבע אורך גל יחיד Fluo-3 AM30,31,32. בעוד צבעים אלה הציעו תובנה חדשה נהדרת באותו זמן, הם סובלים ממספר מגבלות כגון מידור לא ספציפי בתוך תאים, אובדן צבע פעיל או פסיבי מתאים מסומנים, הלבנת פוטוגר ורעילות אם הם מצולמים על פני פרקי זמן ממושכים של זמן33. בעשור האחרון, אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית הפכו סוסי העבודה להדמיית צורות שונות של פעילות עצבית. אינדיקטורים אלה משלבים חלבון פלואורסצנטי שונה עם חלבון כלאטור סידן המחליף במהירות את עוצמת הפלואורסצנטיות לאחר הכריכה של Ca2 + יונים 34. היישום של אינדיקטורים חדשים אלה הוא עצום, המאפשר הדמיה הרבה יותר קלה של ארעי סידן תאיים הן במבחנה והן בהגדרות vivo. משפחה אחת של כתבים מקודדים גנטית אלה, המכונה GCaMP, נמצאים כעת בשימוש נרחב. אינדיקטורים אלה מכילים תחום קלומודולין C-מסוף, ואחריו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), והם מכוסים על ידי אזור מחייב N-מסוף calmodulin35,36. סידן מחייב לתחום calmodulin מפעיל אינטראקציה עם האזור מחייב calmodulin, וכתוצאה מכך שינוי קונפורמציה במבנה החלבון הכולל ועלייה משמעותית פלואורסצנטיות של moiety GFP 35,36. במהלך השנים, משפחה זו של כתבים עברה מספר התפתחויות כדי לאפשר קריאות ברורות עבור ארעי סידן מסוימים עם קינטיקה ספציפית (איטי, בינוני ומהיר), כל אחד עם תכונות שונות במקצת37,38. כאן, השימוש של הכתב GcaMP6 הודגש, אשר הוכח בעבר לזהות פוטנציאל פעולה יחיד ו ארעי סידן דנדריטי בנוירונים הן ויוו והן במבחנה37.

סידן ארעי באזור presynaptic לעורר אירועי היתוך שלפוחית סינפטי, גרימת שחרור נוירוטרנסמיטר לתוך הסינפרסה וייזום של אירועי איתות בתא postsynaptic 28,39. שלפוחיות סינפטיות משתחררות וממומחזרות במהירות, שכן התא שומר באופן הומיוסטאטי על שטח פנים יציב של קרום התא ובריכה הניתנת לשחרור בקלות של שלפוחיות בעלות יכולת היתוך הכרוכות בממברנה40. צבע סטיירל המשמש כאן יש זיקה כלפי קרום השומנים, במיוחד משנה את תכונות הפליטה שלה בהתבסס על ההזמנה של סביבת השומנים שמסביב41,42. לכן, זהו כלי אידיאלי עבור תיוג שלפוחיות סינפטיות מיחזור ומעקב אחר המעקב הבא של שלפוחיות אלה כפי שהם שוחררו מאוחר יותר בעקבות גירוי עצבי41,42. הפרוטוקול שנוצר ואופטימיזציה הוא הסתגלות של המושגים שתוארו בתחילה על ידי גפילד ועמיתיו, המאפשר לנו לדמיין styryl צבע מסומן שלפוחית סינפטית puncta לאורך זמן ברציפות41.

כאן מתוארות שתי מתודולוגיות מבוססות פלואורסצנטיות קשורות, המדווחות באופן אמין על אירועים תאיים ספציפיים המעורבים בשידור סינפטי. פרוטוקולים הוגדרו כדי לחקור את הדינמיקה של זרם סידן מסוף presynaptic בתיווך דה-פולאריזציה ואקסוציטוזיס שלפוחית סינפטית בתאי עצב מתורבתים. כאן, שיטות ותוצאות מייצגות מתמקדות בשימוש במכרסמים ראשוניים קליפת המוח או נוירונים מוטוריים כמערכת מודל הפריה חוץ גופית, שכן ישנם מחקרים שפורסמו באמצעות סוגי תאים אלה43,44. עם זאת, שיטות אלה חלות גם על נוירונים אנושיים מובחנים דמויי קליפת המוח i345, שכן יש לנו גם הצלחה עם שני הפרוטוקולים בניסויים המתמשכים כיום במעבדה שלנו. הפרוטוקול הכללי מתואר בתבנית ליניארית צעדית, המוצגת באיור 1. בקצרה, כדי לחקור את דינמיקת הסידן בנוריטים, נוירונים בוגרים מועברים עם DNA פלסמיד כדי לבטא את הכתב הפלואורסצנטי GCaMP6m תחת מקדם Cytomegalovirus (CMV) 37,46. תאים שעברו זיהום יש רמה נמוכה של פלואורסצנטיות ירוקה בסיסית, אשר מגביר בנוכחות סידן. אזורי עניין מפורטים כדי לפקח על שינויים פלואורסצנטיים לאורך המניפולציה שלנו. זה מאפשר תנודות מקומיות מאוד מרחבית וזמן בסידן להימדד 37,46. להערכת היתוך ושחרור שלפוחית סינפטית, נוירונים בוגרים עמוסים בצבע סטיירל המשולב בממברנות שלפוחית סינפטית כפי שהם ממוחזרים, רפורמה, ונטען מחדש עם נוירוטרנסמיטורים בתאים presynaptic41,42,43,43,47,48. הצבעים הנוכחיים המשמשים למטרה זו תווית שלפוחיות סינפטיות לאורך neurites ומשמשים פרוקסי עבור אזורים אלה בניסויים הדמיה חיה, כפי שמוצג על ידי הכתמה משותפת של צבע סטיירל ו synaptotagmin על ידי Kraszewski ועמיתים49. להלן תמונות מייצגות של כתמים דומים שבוצעו גם הם (איור 2A). חוקרים קודמים השתמשו בהרחבה בצבעים כאלה כדי לדווח על דינמיקת שלפוחית סינפטית בצומת neuromuscular ו נוירונים ההיפוקמפוס48,49,50,51,52,53,54,55,56 . על ידי בחירת אזורים דקדקאטים של שלפוחיות טעונות צבע ועל ידי ניטור ירידות בעוצמת הפלואורסצנטיות לאחר שחרור שלפוחית, ניתן ללמוד את יכולת ההולכה הסינפטית התפקודית ואת הדינמיקה הזמנית של שחרור לאחר גירוי43. עבור שתי השיטות, מדיום המכיל ריכוז גבוה של אשלגן כלורי משמש כדי depolarize תאים כדי לחקות את הפעילות העצבית. פרמטרי הדמיה מצוינים כדי ללכוד מרווחי זמן תת-שניים המשתרעים על פני נורמליזציה בסיסית ואחריה תקופת לכידת הגירוי שלנו. מדידות פלואורסצנטיות בכל נקודת זמן נקבעות, מנורמלות לרקע ומכומתות לאורך פרק הזמן הניסיוני. סידן-זרם מתווך GCaMP6m פלואורסצנטי להגדיל או יעיל אקסוציטוזיס שלפוחית סינפטית styocytosis styryl צבע לשחרר ירידה פלואורסצנטית ניתן לזהות באמצעות אסטרטגיה זו. התקנה מתודולוגית מפורטת ופרמטרים עבור שני פרוטוקולים אלה ודיון על היתרונות והמגבלות שלהם מתוארים להלן.

Figure 1
איור 1: עיבוד חזותי של תהליך הפרוטוקול הכללי הכולל. (1) לבודד ותרבות נוירונים מכרסמים ראשוניים במבחנה לנקודת זמן התבגרות שנבחרה. (2) להציג GCaMP DNA או צבע סטיירל ככתבים של פעילות סינפטית. (3) הגדרת פרדיגמת הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בהדמיה חיה ותוכנות משויכות. התחל תקופת הקלטה בסיסית. (4) בעוד תאים עדיין עוברים לכידת תמונה חיה, לעורר נוירונים באמצעות זלוף אמבט KCl גבוה. (5) להעריך מדידות עוצמת פלואורסצנטיות לאורך זמן כדי למדוד סידן ארעי או היתוך שלפוחית סינפטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של אוניברסיטת ג'פרסון.

1. התרבות העיקרית של נוירונים מקליפת המוח החולדה העוברית

הערה: נוירונים קליפת המוח העיקריים מבודדים מעוברי חולדה E17.5 כפי שתואר בעבר57,58. לא נראה שקיימת הטיית מתח עם ההצלחה של פרוטוקול פולחן זה. שיטה זו מתוארת בקצרה להלן. יש להפנות את המאמרים הקודמים שצוינו לקבלת פרטים מלאים.

  1. המתת חסד חולדות נקבה בהריון על ידי שאיפת CO2 ואחריו אישור משני על ידי נקע צוואר הרחם.
  2. לקצור עוברים ולבודד מוחות בקרח קר 20 מ"מ HEPES-buffered פתרון המלח המאוזן של האנק (HBSS). מקליפת המוח החיצונית, נפרדים ואז משליכים סטריאטום והיפוקמפי. לאסוף קליפת ריאות.
  3. השתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר קרום המוח מקליפת המוח. כדי לעשות זאת, להחזיק את קליפת המוח במקום עם זוג אחד של מלקחיים סגורים באמצעות לחץ עדין.
    הערה: עם זוג המלקחיים השני ביד השנייה, צבוט קרום המוח. לקלף את קרום המוח באמצעות תנועה מתגלגלת עם זוג צבט. מקם מחדש עם המלקחיים הסגורים וחוזר על הפעולה לפי הצורך עד שקרום המוח מוסר לחלוטין.
  4. קליפות קליפת המוח מדגרות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של פפאין ב- HBSS למשך 4 דקות ב 37 °C (37 °F).
  5. לשטוף שלוש פעמים ב HBSS, ולאחר מכן triturate בעדינות 5-10 פעמים עם פיפטה פסטר זכוכית מלוטשת אש כדי לקבל השעיית תא הומוגני.
    הערה: הימנע בועות; לשמור על פיפטה בתוך ההשעיה התא.
  6. נוירונים צלחת על 100 מיקרוגרם / מ"ל poly-D-ליזין מצופה 35 מ"מ מכותכות תחתון כלים בצפיפות של 75,000 תאים / צלחת במדיום neurobasal עם תוספת B27 (2%), ו פניצילין-סטרפטומיצין.

2. התרבות העיקרית של נוירונים מוטוריים מחוט השדרה החולדה העוברי

הערה: נוירונים מוטוריים ראשוניים מוכנים מעוברי חולדות E13.5 כפי שתואר בעבר, עם מעט שינויים59,60. לא נראה שקיימת הטיית מתח עם ההצלחה של פרוטוקול פולחן זה. שיטה זו מתוארת בקצרה להלן. יש להפנות למאמרים הקודמים שצוינו לקבלת פרטים מלאים.

  1. המתת חסד של חולדות בהריון כמו בשלב 1.1.
  2. לנתח 10-20 חוטי שדרה מעוברים ולפרוץ לרסיסים קטנים באופן מכני באמצעות שני זוגות של מלקחיים כדי לצבוט ולמשוך, בהתאמה.
  3. דגירה ב 0.025% טריפסין במשך 8 דקות, ואחריו תוספת של DNase ב 1 מ"ג / מ"ל.
  4. צנטריפוגה דרך כרית BSA 4% w / v ב 470 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) ללא הפסקה.
  5. תאים כדוריים צנטריפוגה במשך 55 דקות ב 830 x g ב 4 °C (4 °F) ללא בלם דרך 10.4% (v/ v) צפיפות הדרגתית בינונית (ראה טבלת חומרים) כרית. לשאת קדימה את רצועת הנוירונים המוטוריים בממשק החזותי.
    הערה: כדי להבטיח לכידה של כל התאים, השתמש במדיה נטולת פנול עבור שלב שיפוע הצפיפות ומדיה המכילה פנול עבור כל השלבים האחרים. הממשק של מדיית מעבר הצבע והדיסוציאציה של הצפיפות ניתן לזיהוי בקלות בהתבסס על הפרש הצבעים.
  6. ספין אסף רצועות דרך עוד 4% w / v כרית BSA ב 470 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (65 °F) ללא הפסקה.
  7. Resuspend נוירונים מוטוריים מטוהרים במדיום נוירובסל מלא עם תוסף B27 (2%), גלוטמין (0.25%), 2-mercaptoethanol (0.1%), סרום סוס (2%), פניצילין-סטרפטומיצין.
  8. נוירוני צלחת על 100 מיקרוגרם / מ"ל של פולי-ליזין ו 3 מיקרוגרם / מ"ל של כיסוי מצופה למינין בצפיפות של 50,000 תאים / צלחת 35 מ"מ זכוכית תחתונה.

3. טרנספקטים עצביים

הערה: שלב זה מתבצע עבור נוירונים שיעברו הדמיית סידן GCaMP ו / או נוירונים שבהם פלסמיד DNA אקסוגני או RNA של עניין הוא הציג לקראת הערכה סינפטית. לעומת זאת, צבע סטירל נטען ממש לפני מפגש ההדמיה ומטופל בסעיף 6. הסיכום שלהלן הוא פרוטוקול הטרנספקטיה המשמש לנוירונים מכרסמים ראשוניים בדוגמאות המוצגות, אך ניתן להתאים אותו בקלות ואופטימיזציה לצרכי המשתמש.

  1. טרנספקטים עבור נוירונים קליפת המוח העיקריים בתרבית מתרחשים ביום 12 במבחנה (DIV 12), ואילו נוירונים מוטוריים מועברים ביום 7 במבחנה (DIV 7).
    הערה: כל השלבים הבאים מתרחשים בתוך ארון בטיחות ביולוגית אספטי.
  2. Transfect 500 ng של GCaMP6m באמצעות ריאגנט transfection ביחס של 1:2 לפי נפח. עבור טרנספקטים משותפים, להוסיף סך של 1.25 מיקרוגרם של DNA הכולל / צלחת, שמירה על DNA זה ליחס ריאגנט.
    הערה: בדוגמאות הניסיוניות המוצגות, 750 ng של פלסמיד הקשור ל- ALS / FTD של עניין כבר transfected להביע C9orf72-ALS מקושר dipeptides, חלבון FUS מוטציה, וכו '. ודא שהתג הפלואורסצנטי של הפלסמיד המשותף לא יתנגש עם ערוץ FITC של הדמיית GCaMP. כמו כן, אם עושים הדמיית צבע סטיירל, ודא כי plasmid interfectd משותף לא יתנגש עם ערוץ TRITC של הדמיה. השימוש בסינפטופיסין-GCaMP3 יעיל באותה מידה בפרוטוקול זה. לכן, להעביר את אותה כמות של plasmid זה בצע את כל השלבים כרגיל בסעיף 7.
  3. דגירה את מתחם ריאגנט ה- DNA-transfection בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  4. הוסיפו בעדינות את הקומפלקס המדגר לנוירונים עם מערבולת. מחזירים את המנה לחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות.
  5. הסר את כל המדיה התרבותית המכילה את קומפלקס ריאגנט ה- DNA-transfection והחלף אותו ב- 50-50 על ידי הכנת נפח של מדיה עצבית מותנית ורעננה. לאחר מכן, להחזיר תאים לתוך אינקובטור CO2 במשך 48 שעות עד הדמיה.

4. הכנת פתרונות חוצץ ופתרון מלאי צבע סטיירל

  1. הפוך פתרונות ACSF נמוכים וגבוהים טריים לפני הדמיה באמצעות החומרים המפורטים בטבלה 1. סנן את שני פתרונות המאגר לפני השימוש.
    הערה: CaCl2 דיהידרט יכול ליצור Ca(OH)2 בעת האחסון. לקבלת יעילות מרבית, השתמש תמיד בגורם מכיל שנפתח לאחרונה. אם זה לא אפשרי, כדי להסיר Ca(OH)2 מהמשטח החיצוני ולהבטיח מסיסות מקסימלית, פתרונות עשויים להיות מוגזים עם CO2 גזי במשך 5 דקות לפני תוספת CaCl2 . אם צעד זה ננקט, התאם את ה- pH של הפתרון המתקבל כדי לשמור על ערך pH של 7.4, שכן פחמתיות מופרזת תגרום להיווצרות Ca(HCO3)2 .
מאגר ACSF נמוך של KCL (pH 7.40 עד 7.45)
מגיב ריכוז
HEPES 10 מ"מ
NaCl 140 מ"מ
KCl 5 מ"מ
גלוקוז 10 מ"מ
CaCl2 2H2O 2 מ"מ
MgCl2 4H2O 1 מ"מ
מאגר ACSF גבוה של KCL (pH 7.40 עד 7.45)
מגיב ריכוז
HEPES 10 מ"מ
NaCl 95 מ"מ
KCl 50 מ"מ
גלוקוז 10 מ"מ
CaCl2 2H2O 2 מ"מ
MgCl2 4H2O 1 מ"מ

טבלה 1: הרכב של מאגרי נוזל שדרתי מלאכותי (aCSF). טבלה זו כוללת את המרכיבים להכנת מאגרי נוזל השדרתיים המלאכותיים KCl נמוכים וגבוהים המשמשים תוך הדמיה וגירוי נוירונים. ראה סעיף 4 להוראות הכנה.

  1. הכן פתרון מלאי צבע styryl על ידי לקיחת בקבוקון 100 מיקרוגרם של צבע והחזרתו לריכוז מלאי של 10 מ"מ עם מים מזוקקים או מדיום neurobasal.

5. התקנת מערכת מיקרוסקופ וזלוף

הערה: להדמיית מנות פטרי עם תחתית זכוכית, מיקרוסקופ פלואורסצנטיות קונפוקלי הפוך עדיף בשל הגמישות של זלוף ושימוש במטרה טבילה בשמן צמצם מספרי גבוה. עיין בטבלת החומרים עבור המיקרוסקופ הקונפוקלי, המצלמה והיעדים המשמשים להדמיה של דוגמאות המפורטות בסעיף תוצאות מייצגות .

  1. בצע את כל הניסויים בטמפרטורה של 37 °C (6 °F) עם רמות קבועות של 5% CO2 באמצעות הרכבה בימתית משולבת של מערכת אינקובטור.
  2. שלוט ברכישת תמונה באמצעות תוכנה קונפוקלית. מטב את הגדרות הרכישה בתחילת מפגש ההדמיה כדי לבחור כוח עירור ולהשיג כדי להבטיח תצוגה חזותית אופטימלית של אותות ללא הלבנת פוטולינג.
    1. שמור על עוצמת עירור, זמן חשיפה, רווח גלאי וקצב פריימים קבוע על פני כל הדגימות. בצע הדמיה של זמן לשגות באמצעות יחס גובה-רוחב של 512 x 512 וקצב פריימים של 2 תמונות/s כדי למזער הלבנת צבע.
      הערה: בעוד puncta צריך להיות גלוי בבירור, עוצמת לייזר צריך להיות מוגדר למינימום האפשרי כדי למנוע הלבנה פוטוטוקסיה. הגדר את פתח הקונפוקלי להגדרה הצרה ביותר כדי להשיג רזולוציה אופטימלית של פונקטה פלואורסצנטית בתוך נוריטים. זמן החשיפה מוגדר ל-200 אלפיות השנייה או פחות, עקבי בין דגימות. מהירות ההדמיה המרבית של המצלמה שבה נעשה שימוש הייתה 2 תמונות/שניה. אם אתם משתמשים במצלמה מהירה יותר, ניתן לצלם תמונות/ים נוספים. יש לבחור הגדרות הדמיה זמנית במידת האפשר.
  3. בחר את השילובים הבאים של מסנני עירור פלואורסצנטיות/דיכרויקה/פליטה להדמיה באמצעות תוכנה קונפוקלית: Gcamp6m/Gcamp3 עם FITC וצבע סטיירל עם TRITC, בהתאמה.
  4. השתמש בתכונת המיקוד המושלמת של תוכנת רכישת ההדמיה הקונפוקלית במהלך הדמיה בזמן ההדמיה כדי למנוע z-drift.
    הערה: בשל המהירות המהירה של הדמיה, מישור יחיד הוא בתמונה. הבטחת חוסר z-drift במהלך הניסוי חשוב מאוד.
  5. בחרו בכרטיסיה 'זמן ' בחלונית 'רכישת תמונה' לקביעת תקופות ההקלטה ומרווחי הזמן.
    1. הגדר שלב #1 למרווח של 500 אלפיות השנייה, משך 3 - 5 דקות.
    2. הגדר שלב #2 למרווח של 500 אלפיות השנייה, משך 5 דקות.
      הערה: שלב #1 מתאים להקלטה בסיסית, שלב #2 לתקופת הגירוי, בהתאמה.
  6. להרכיב מנגנון זלוף כבידה עבור ACSF באמצעות מערכת בקרת שסתום וסעפת ערוץ.
    1. טען KCl גבוה (ראה טבלה 1) לתוך מזרק 50 מ"ל בחלק העליון של המנגנון, עם צינורות פועלים דרך המערכת. הגדר את קצב הזרימה ל- 1 מ"ל / דקה.
  7. טען צלחת זכוכית 35 מ"מ המכילה נוירונים על שלב הדמיה קונפוקלית, עם סוף צינורות זלוף להציב בקצה המנה. בחר את השדה להדמיה.

6. הדמיית צבע סטיל של שחרור שלפוחית סינפטית

  1. תאי דגירה ב- KCl aCSF נמוך (ראה טבלה 1) במשך 10 דקות ב 37 °C (37 °F), 48 שעות לאחר ההעברה.
  2. טען נוירונים קליפת המוח העיקריים או מוטוריים על צלחות פטרי תחתית זכוכית עם צבע styryl.
    1. הסר KCl aCSF נמוך על ידי שאיפה.
    2. השתמש פיפטה לטעון נוירונים בחושך עם 10 מיקרומטר של צבע סטירל ב ACSF המכיל 50 mM KCl במשך 5 דקות.
    3. הסר את פתרון הטעינה ואת נוירוני האמבטיה ב- KCl aCSF נמוך למשך 10 דקות כדי למנוע טעינת צבע לא ספציפית.
  3. מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה 35 מ"מ על במת ההדמיה, ולאחר מכן להתבונן או תחת מטרה אוויר 20x או 40x שמן טבילה המטרה של מיקרוסקופ קונפוקל הפוך.
    הערה: השתמש בפלואורסצנטיות GFP כדי לאתר תאים שעברו שינוי במקרה של תאים שעברו שיתוף פעולה עם פלסמיד מתויג GFP.
  4. לרגש צבע סטיירל באמצעות לייזר 546 ננומטר, לאסוף פליטה באמצעות מסנן bandpass 630-730 ננומטר (TRITC).
  5. בחר את שדה ההדמיה ובצע מיקוד מושלם. לאחר מכן, צלם תמונת סטילס אחת עם ערוצי סמן ברייטפילד, TRITC ופלואורסצנטיות כדי לסמן גבולות עצביים.
  6. הפעל הפעל כעת בתוכנת הרכישה. בצע את ההקלטה הבסיסית במשך 3-5 דקות כדי לא לכלול וריאציות בעוצמת הצבע, אם בכלל (שלב #1).
    הערה: חיוני להבטיח כי כל ירידה בעוצמת הצבע נובעת משחרור שלפוחית סינפטי ולא מפיזור צבע פסיבי או הלבנת פוטולינג. תקופה זו של 3-5 דקות טרום גירוי אמורה לגרום לרמת עוצמת צבע יציבה ומתוחזקת. 30 s האחרונים של הקלטה זו ישמשו לקביעת ערך פלואורסצנטיות בסיסי ממוצע עבור כל החזר השקעה. לפני הערכת התנאים הניסיוניים, ניתן לבצע גם מצב נוסף של אי גירוי של כ-10 דקות של הקלטה רציפה באמצעות הגדרות הרכישה המיועדות כדי להבטיח ערכי פלואורסצנטיות יציבים באמצעות הגדרות הלייזר לתקופה ממושכת.
  7. בעת המעבר לשלב #2 , הפעל את הלחצן עבור מערכת הזלוף. לאחר מכן, כל הזמן perfuse 50 mM KCl לנוירונים כדי להקל על פריקת צבע (שלב #2).
    1. בצע הקלטות עבור 300 s לאחר תוספת KCl. לאחר מכן, הרכישה מפסיקה; הפעל את מתג הכיבוי עבור מערכת הזלוף.
  8. שמור את הניסוי וניתח נתונים באמצעות תוכנה קונפוקלית כמתואר בסעיף 8 להלן.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי בשלב זה, וניתן לבצע ניתוח מאוחר יותר. במקרה שבו תאים אינם דורשים transfection לביטוי של חלבונים של עניין, פרוטוקול זה עשוי להתבצע בכל נקודת זמן במבחנה כאשר מבקשים לבחון את הפונקציונליות של פריקה סינפטית. לאחר בדיקה של תאי בקרה כדי להבטיח פריקה סינפטית נכונה, הנסיין צריך להיות עיוור לתנאים הגנטיים או הפרמקולוגיים של כל מנה שנבדקה כדי למזער את ההטיה.

7. הדמיה פלואורסצנטית של ארעי סידן Gcamp6m

  1. נוירונים קליפת המוח מכרסמים העיקריים Transfect תרבית על מנות 35 מ"מ זכוכית התחתון עם 500 ng של Gcamp6m כפי שצוין בסעיף 3.
    הערה: אם תרצה, שיתוף transfect נוירונים עם plasmid של עניין המכיל תג פלואורסצנטי בטווח האדום או האדום הרחוק.
  2. נוירונים דגירה עם ACSF KCl נמוך במשך 15 דקות 48 שעות לאחר טרנספקטion ולאחר מכן להרכיב את המנה על פלטפורמת ההדמיה.
  3. דמיין את הפלואורסצנטיות GCaMP6m באמצעות מסנן FITC (488 ננומטר) ומטרה של 20x או 40x.
  4. בחר את שדה ההדמיה ובצע מיקוד מושלם. לאחר מכן, צלם תמונת סטילס אחת עם ערוצי סמן Brightfield, FITC ו- fluorescence כדי לסמן גבולות עצביים.
  5. הפעל הפעל כעת בתוכנת הרכישה. בצע את ההקלטה הבסיסית במשך 5 דקות, ולאחר מכן perf עם ACSF המכיל 50 mM KCL באותו אופן כפי שמתואר בסעיף 6 לניסויי צבע סטיל.
    הערה: המטרה של הדמיה זו היא למדוד חולפים סידן עורר. אם נוירון יש פעילות ירי בסיסית ושטף סידן במהלך התקופה שלפני הגירוי, הוא אינו משמש בניתוח נתונים. במקום זאת, נעשה שימוש רק בתאים עם פלואורסצנטיות רקע יציבה. תקופות לאחר גירוי ניתן גם להאריך עד 60 דקות עבור ארעי סידן, עם או בלי זלוף KCl גבוה מתמשך נוסף.
  6. שמור את הניסוי וניתח נתונים באמצעות תוכנה קונפוקלית כמתואר בסעיף 8 להלן. ניתן לעצור את הניסוי בשלב זה, ואת הניתוח ניתן לבצע מאוחר יותר.
    הערה: אם התאים אינם דורשים טרנספקטיה לביטוי חלבונים מעניינים, פרוטוקול זה עשוי להתבצע בכל נקודת זמן במבחנה כאשר מבקשים לבחון את הסידן ארעי. לאחר בדיקה של תאי בקרה כדי להבטיח מדידה של סידן ארעיים, הנסיין צריך להיות עיוור לתנאים הגנטיים או הפרמקולוגיים של כל מנה שנבדקה כדי למזער את ההטיה.

8. ניתוח תמונה

  1. פתח תמונות לשגות זמן עם תוכנה קונפוקלית.
  2. יישור תמונות בסידרה של זמן לשגות לפי סידרת הפקודות : image | עיבוד | ישר מסמך נוכחי. בחרו 'ישר למסגרת הראשונה'.
  3. בחרו אזורי עניין (ROIs) לאורך נוריטים באמצעות הכלי בחירת החזר השקעה, סמל בצורת שעועית מימין למסגרת התמונה (איור 3B). כמו כן, סמן החזר השקעה המייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע.
    הערה: החזרי ההשקעה נבחרים על-ידי בחירת אזורים של פונקטה מופרדת באופן מובהק לאורך מסלולים עצביים המצוינים על-ידי תמונת הסטילס של Brightfield. לפחות חמישה החזרי השקעה לכל נוירון נבחרים לניתוח. החזר ההשקעה ברקע נבחר באזור של שדה הראייה שאינו מכיל נויטריטים.
  4. מדידת פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן עבור החזרי השקעה נבחרים באמצעות סדרת הפקודות הבאה: מדידת | מדידת זמן.
    1. הפעילו את הפונקציה 'מדידה ' בחלק העליון של החלונית 'מדידת זמן '. ייצוג גרפי של פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן (איור 3C) ונתונים כמותיים נוצרים שניהם.
      הערה: כל נקודת נתונים מייצגת את הפלואורסצנטיות הגולמית עבור החזר השקעה זה עבור המסגרת המשויכת לנקודת זמן ספציפית זו שנמדדה.
  5. יצא עוצמות פלואורסצנטיות גולמיות לתוכנת הגיליון האלקטרוני.
  6. נתח כל החזר השקעה באופן עצמאי. ראשית, נרמל נתונים על-ידי הפחתה של עוצמת ההחזר על ההשקעה ברקע מהחזר ההשקעה של עוצמת העניין בכל נקודת זמן.
    1. קח את ערך הפלואורסצנטיות הגולמי מהרקע ROI בכל נקודת זמן ספציפית והפחת זאת מהחזר ההשקעה של ערך העוצמה הגולמית של עניין בנקודת זמן זו.
      הערה: זה נעשה עבור כל תקופת ההקלטה, הן שלבי הבסיס והן של הגירוי.
  7. קבע את ההחזר הממוצע על החזר ההשקעה של עוצמת הריבית עבור 30 s האחרונים של תוכנית הבסיס.
    1. ממוצע הערכים הבסיסיים הגולמיים המנורמלים שנוצרו בשלב 8.6 מתוך 30 s האחרונים של תקופת ההקלטה הבסיסית של 3-5 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש בכל תקופת ההקלטה הבסיסית כדי ליצור ערך זה. עם זאת, ככל שערך זה מתייצב ומתוחזק, 60 נקודות הזמן של 30 s הסופיות הן בגודל דגימה מספיק כדי לייצג את השלם.
  8. השווה ערך בסיסי זה לערך העוצמה המנורמל בכל נקודת זמן, ויצר שינוי בערך הפלואורסצנטיות (ΔF).
    1. קח את הערך משלב 8.7 והפחת את הערך הפלואורסצנטי הבסיסי הממוצע. עשה זאת ואת השלבים הבאים במשך כל תקופת ההקלטה, הן שלבי הבסיס והן של הגירוי.
  9. חשב שינוי זה לגבי ערך הפלואורסצנטיות הבסיסית, ויצר שינוי בפלואורסצנטיות/פלואורסצנטיות בסיסית (ΔF/F). לשם כך, קח את הערך משלב 8.8 וחלק אותו בערך הפלואורסצנטי הבסיסי הממוצע.
  10. לבסוף, הגדר את ערך נקודת ההתחלה ל- 1 כך שניתן יהיה להציג בקלות הגדלות או הקטנות באופן גרפי לאורך זמן.
    1. קח את הערך שנוצר בשלב 8.9 והוסף 1.
      הערה: כאשר פעולה זו נעשית כראוי, 30 s של ערכי תקופה בסיסית צריכים לרחף ליד הערך של 1. בתאים המשחררים ביעילות תוכן סינפטי, ערך זה צריך מגמה מ 1 עד 0 בעקבות תחילת הגירוי. דוגמה לשלבים 6.9 מוצגת באיור 3E.

9. ניתוח נתונים

הערה: הנסיין יכול להיות unblinded לתנאים ניסיוניים כדי לאגור נתונים לניתוח כראוי. השתמש בגודל מדגם של לפחות 10 נוירונים לכל מצב מכל אחד משלושה ניסויים עצמאיים. שקול נוירונים להכללה רק אם ניתן לייעד לפחות חמישה אזורי החזר השקעה. רמה זו של שכפול ניסיוני הספיקה במחקרים שפורסמו כדי להדגים אובדן עמוק של פריקה סינפטית בתאים המכילים פולי-GA הקשורים ל- ALS לעומת פקדי GFP (ראה תוצאות מייצגות). עם זאת, אם פנוטיפ עדין יותר הוא ציין, מספר שכפולים ביולוגיים ו/או טכניים עשוי לדרוש אופטימיזציה על ידי המשתמש.

  1. באמצעות כל ערכי ΔF/F המחושב לאורך זמן מתוך החזרי השקעה של מצב ניסיוני נתון, קבע ערך ΔF/F ממוצע עבור כל נקודת זמן יחד עם SEM.
  2. התווה נתונים באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה בתבנית xy, כאשר x הוא הזמן שחלף, ו- y הוא הערך ΔF/F המחושב בשלב 9.1. הצג את כל הערכים כממוצע ± SEM.
  3. כדי לקבוע את המשמעות הסטטיסטית, השתמש במבחן t של התלמיד להשוואת שתי קבוצות וניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey להשוואת שלוש קבוצות או יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר היישום המוצלח של הפרוטוקול לעיל, תוצאות מייצגות מוצגות עבור ניסוי טיפוסי של שחרור שלפוחית סינפטית של צבע סטיירל. נוירונים קליפת המוח העיקריים חולדה מתורבתת היו טעונים בצבע בשיטה המתוארת בסעיף 6. הספציפיות של טעינת צבע נקבעה על ידי תיוג משותף עם סמן שלפוחית סינפטית סינפטופיזין. רוב הפונקטים החיוביים של צבע סטירל הם חיוביים לסמן זה (איור 2A). כדי לקבוע אם ההגדרות המשמשות להדמיית צבע סטיירל גורמות להלבנה פוטואורסצנטרית, בדרך כלל, באר לא מטופלת נטענת בצבע ומצטלמת לתקופה ממושכת של 10 דקות ללא גירוי כדי לוודא שערכי הפלואורסצנטיות נשארים קבועים.

בנוסף, התוצאות מוצגות שוב באמצעות תיוג משותף של סינפטופיזין וצבע סטיירל כמו באיור 2A. פלואורופורים אלה צולמו במשותף באמצעות הפרדיגמה המצוינת בסעיף 6 להדמיית צבע סטיירל TRITC, בתוספת לכידה כפולה של פלואורסצנטיות סינפטופיזין באמצעות כוח לייזר בעוצמה גבוהה בערוץ DAPI כדי לדמיין את mTurquoise-synaptophysin. מוצגות תמונות מייצגות של אזורים סינפטיים לפני ואחרי הגירוי (איור 2B). בעוד ששיטה זו היא מסקנה עקיפה מחוסר הלבנת פוטו, ניתוח ערכי העוצמה הגולמית לאורך כל תקופת ההדמיה מגלה שעוצמת הסינפטופיצין נשארת קבועה, בעוד שעוצמת הצבע הסטיטריל יורדת בעקבות הגירוי (איור 2C). לכן, לוקח את הניסוי הזה ואת הבקרות האחרות שלנו של פלואורסצנטיות יציבה לפני גירוי ועל פני תקופות ממושכות בארות שאינן גירוי, קבענו כי ירידות פלואורסצנטיות styryl ניתן לייחס פריקה סינפטית באמצעות depolarization KCl ולא אפקטים photo הלבנה.

Figure 2
איור 2: הערכת פרמטרים ספציפיים והדמיה של תיוג צבע סטיירל. (A) תמונה מייצגת של 40x מייצג של נוירון קליפת המוח עכברוש עם תווית צבע סטיירל (אדום), אשר הועבר 24 שעות בעבר עם פלסמיד להביע mTurquoise2-synaptophysin61 מונע את מקדם סינפסין (ירוק). Colocalization של שני פלואורופורים אלה מציין כי רוב גדול של פונקטה חיובית צבע styryl מוכתמים במשותף עם סמן שלפוחית סינפטית סינפטופיזין. סרגל קנה מידה מציין 5 מיקרומטר. (B) נוירונים קליפת המוח היו transfected וצבע styryl נטען כמו (A) ותמונה על פי פרדיגמת צבע styryl יחד עם לכידת פלואורסצנטיות כפולה של mTurquoise-synaptophysin בערוץ DAPI. תמונות מייצגות מציגות סינפטופיזין ו styryl צבע פונקטה אזורים לפני ואחרי גירוי. סרגל קנה מידה מציין 5 מיקרומטר. (C) פלואורסצנטיות הייתה במעקב לאורך זמן עבור סינפטופיזין (ראש ערוץ DAPI) וצבע סטיירל (תחתית ערוץ FITC). עוצמת הסינפטופיסין נשמרה בפלואורסצנטיות יציבה במהלך תקופת ההדמיה והגירוי, בעוד פלואורסצנטיות צבע סטיירל ירדה ככל שהצבע נפרק בגירוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תמונות מייצגות מראות את טעינת צבע הסטיל במהלך ההדמיה, עם בחירת החזרי ההשקעה (איור 3A-B). עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית של החזרי ההשקעה שנבחרו והחזר ההשקעה ברקע משורטטים באמצעות תוכנת הקונפונקט (איור 3C). הנוירונים המוצגים כאן היו גם transfected עם plasmids כדי לחקור את ההשפעות של חלבונים dipeptide המיוצרים בהקשר של C9ORF72-ALS, כלומר, FLAG-eGFP ו FLAG-GA50-eGFP מונע את מקדם T7. שחרור שלפוחית סינפטי מוצלח מביא לאובדן בולט של פלואורסצנטיות צבע עם דה-פולאריזציה גבוהה של KCl (איור 3D, שני לוחות עליונים) עבור נוירון בקרה שעבר שינוי GFP. סרטון מייצג הכלול כאן מדגים כיצד זה נראה במהלך ההדמיה. בנוסף, נוירון פורק באופן סלקטיבי צבע סטירל באזור נויריט בעקבות גירוי (וידאו 1).

מאידך גיסא, שידור סינפטי לקוי מיוצג על ידי פלואורסצנטיות צבע שמורה גם לאחר דה-פולאריזציה גבוהה של KCl בתאי עצב שעברו עם מבנה חוזר של דיפפטיד (GA50) המקושר ל- C9ORF72 (GA50) (איור 3D, שני לוחות תחתון)43. לאחר ניתוח נתונים כמותי (איור 3E), הנתונים מיוצגים כעוצמת צבע לאורך ההדמיה עבור קבוצות הבקרה (GFP) ו- ALS/FTD (GA50) (איור 3F)43. שיטה זו יכולה גם לנתח אפקטי ביניים והיא לא רק אמצעי בינארי "הכל או כלום". בניסויים שנועדו להציל את הגירעונות הסינפטיים בתיווך GA50, חלבון אקסוגני סינפטי הקשור לשלפוחית 2 (SV2) הוצג על ידי transduction lentiviral באמצעות rSV2a-eGFP-pRRL פלסמיד מונע של מקדם PGK האנושי. לאחר הדמיה וניתוח כפי שתואר לעיל, ירי סינפטי חולץ בתאי עצב המביעים במשותף GA50 ו- SV2 (איור 3G).

Figure 3
איור 3: הערכת שחרור שלפוחית סינפטי באמצעות תיוג צבע סטיירל. (A) תמונה מייצגת של נוירון בעל תווית צבע סטיירל במדיה נמוכה של KCl aCSF בתחילת ניסוי הדמיה. סרגל קנה המידה מציין 20 מיקרומטר. (ב) תיאור של יצירת החזר השקעה על התמונה מ- (A). אזורי פונקטה ספציפיים לאורך נוריטים (#1-4) נבחרים באמצעות הכלי החזר ההשקעה, הלחצן בצורת שעועית המסומן מימין. החזר השקעה סופי (#5) נבחר באזור ריק כדי ללכוד את עוצמת אות הרקע. אזורים עם נקודות בהירות לא ספציפיות ולא עצביות נמנעים. סרגל קנה המידה מציין 20 מיקרומטר. (ג) ייצוג עוצמות האות עבור ROIs #1-5 מ- (B) לאורך זמן כפי שמתואר/מתואר על-ידי תוכנת קונפוקלית. (D) ייצוגים חזותיים של אזורי החזר על ההשקעה לפני/לאחר גירוי עבור נוירון שעובר ביעילות שידור סינפטי (שני לוחות עליונים). שתי החלוניות התחתונות הן תמונות מוגדלות עם סף לא משוחד המוחל כדי לבודד את puncta מהרקע כדי להציג אזורים נפרדים באופן חזותי. נוירונים המכילים GFP ביעילות לעבור שחרור סינפטי, בעוד ביטוי של C9ORF2-ALS הקשורים פפטיד GA50 מונע את האפקט הזה. סרגלי קנה מידה מציינים 10 מיקרומטר-הודפס מחדש מג'נסן ואח ' 202043. (ה) דוגמה לקובץ כימות באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני, המציגה נורמליזציה של ערכים לתוכנית בסיסית ויצירת ערכי ΔF/F לאורך זמן. הנתונים מנורמלים תחילה לערך עוצמת ההחזר על ההשקעה ברקע בכל נקודת זמן. ערך זה מושווה לאחר מכן להחזר ההשקעה הממוצע של ערך בסיסי ריבית עבור 30 s האחרונים טרום גירוי (מוצג כאן כמו 10 s במרווחי 1 s עבור פשטות) (ΔF). שינוי זה מחושב לאחר מכן כשבר של הפלואורסצנטיות הבסיסית (ΔF/F). לבסוף, ערך נקודת ההתחלה מוגדר כ- 1 כך שניתן יהיה להציג עליות או הקטנות בקלות באופן גרפי לאורך זמן. לפחות חמישה אזורי פונקטה לכל נוירון ולפחות עשרה נוירונים לכל מצב ניסיוני נאספים, עם נתונים כאלה בשילוב כדי ליצור מדידות ממוצעות בכל נקודת זמן. (ו) נתונים מקובץ גיליון אלקטרוני כגון ב( ה) מועברים לתוכנית גרפים וסטטיסטיקה. עבור הגרף המוצג כאן, הערך ΔF/ F בכל נקודת זמן בממוצע בכל אזורי puncta של מצב ניסיוני הוא התווה, יחד עם השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. הגרף כאן הוא נתונים מניסויי GFP לעומת GA50 המצוינים ב- (D), שם 10 s האחרונים של בסיס ו -10 s הראשונים של תקופת הגירוי מוצגים מחדש מג'נסן ואח '202043. (ז) בדיקה זו יכולה לייצר עקומות לשחרור סינפטי בינוני ואינה רק תגובה של "הכל או כלום". GA50 התבטא בשיתוף עם חלבון סינפטי אקסוגני SV2 (חלבון סינפטי הקשור לשלפוחית הסינפטית 2), והדמיה וניתוח של צבע סטיירל בוצעו כפי שצוין בשלבים הקודמים. כמו באיור 3F, הגרף המוצג כאן מייצג את הערך ΔF/F בכל נקודת זמן בממוצע בכל אזורי פונקטה של מצב ניסיוני, יחד עם השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. הגרף מציג את הדקה האחרונה של קו הבסיס ואת הדקה הראשונה של תקופת הגירוי מג'נסן ואח '202043. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: סרטון מייצג של ניסוי הדמיית צבע סטיירל. מוצג הוא וידאו מייצג של נוירון קליפת המוח טעון עם צבע סטיירל. הסרטון מציג את התקופה שמתחילה בזמן זלוף האמבטיה של ACSF KCl גבוה. האזור בקופסה מדגיש את הנוריטים, עם אובדן ניכר של פלואורסצנטיות puncta לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

בהתאם לשיטה המתוארת בסעיף 7, מוצגות תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של נוירונים קליפתיים שעברו עם GcaMP6m לפני ואחרי depolarization KCl (איור 4A). גרפים בעוצמה גולמית מראים ערכי פלואורסצנטיות מוגברים המשתנים, מה שמצביע על כניסת סידן לנוריטים בעקבות דה-פולאריזציה הנגרמת על-ידי KCl (איור 4B). וידאו מייצג שני זה מראה נוירונים המבטאים GcaMP6m עם פלואורסצנטיות נמוכה בסוף תקופת הבסיס של ההקלטה כדי להדגים את האפקט הזה. בתחילת הגירוי, הנוירונים מציגים עלייה דרמטית בפלואורסצנטיות (וידאו 2). גישה זו נוצלה בהצלחה כדי להדגים שינויים בכניסת סידן במודל FUS-ALS מוטנטי. אסטרוציטים במודל זה הועברו עם אדנווירוס המכיל פלסמידים מונחה CMV-מקדם eGFP-FUS. כאשר מדיום מותנה של אסטרוציטים מבטאי FUS מוטנטיים הונח על נוירונים מוטוריים, נצפתה זרם סידן מוגבר בהשוואה לתנאי FUS שאינם מוטנטיים בעקבות α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסולפרופוני (אמפא) + גירוי ציקלותיאזיד (איור 4C)44. הרגישות של בדיקה זו נבדקה על ידי ביצוע ניסויים עם ובלי סידן הכלול במדיום הזלוף. בהגדרה של GFP לעומת GA50 שהוזכרו לעיל, שיא מוגבר סידן ארעי נצפתה GA50 המכיל נוירונים מוטוריים. ראוי לציין, זה היה תלוי סידן מגיע לתא ולא שחרור של מאגרי סידן פנימיים. כאשר הסידן הוסר ממדיום ה-ACSF הממריץ, לא נרשמו תגובות חולפות של סידן באף אחד מהמצבים הניסיוניים (איור 4D)43.

Figure 4
איור 4: התבוננות בסידן ארעי בזמן אמת באמצעות כתבי GCaMP. (A) תמונה של 40x של נוירון מבטא GCaMP6m, בצבע פסאודו כדי להראות את עוצמת הפלואורסצנטיות GFP (נמוכה בכחול לגבוה באדום). לוחות שמאליים מציגים את כל שדה הראייה של 40x לפני ואחרי הגירוי. סרגל קנה המידה מציין 20 מיקרומטר. התמונות מימין הן גרסאות מוגדלות של האזורים בקופסה שנחשפו. באמצעות תמונות אלה, ניכר על ידי העין כי יש עלייה חזקה ברמות סידן neuritic מוקד בעקבות גירוי. סרגל קנה מידה מציין 12 מיקרומטר. (ב) בחירת החזר השקעה וניטור עוצמת פלואורסצנטיות לאורך כל הניסוי מבוצעים כמו באיור 3. 30 s הסופי של גירוי בסיסי ו 1 דקות עבור שני החזרים נבחרים של נוירון עובר ניטור פלואורסצנטיות GCaMP6m מוצג כאן. בניגוד להדמיית צבע סטיירל, עוצמת הפלואורסצנטיות עולה בעקבות גירוי עצבי. בנוסף, כפי שצוין כאן, סידן ארעי להשתנות neurites לאורך זמן; לכן, התוצאות מיוצגות בדרך כלל כערך שינוי הפלואורסצנטיות הנורמליזציה הממוצע עבור כל אזור החזרה על ההשקעה. (ג) כימות מייצג של ניסוי כזה מוצג כפי שפורסם בקיה-מקאבוי ואח '201844, שבו נוירונים מוטוריים ראשוניים שקיבלו supernatant נגזר אסטרוציטים FUS-ALS מוטציה הציגו זרם מוגבר באופן משמעותי של סידן בעקבות גירוי קולטן אמפא, לעומת נוירונים שקיבלו supernatant מן FUS מסוג פראי ביטוי אסטרוציטים. (D) כימות מייצג של הדמיה חולפת סידן שבו סידן לא נכלל ACSF מגרה. מוצגים הם תנאים של mCherry לעומת GA50-mCherry מגורה עם ACSF KCl גבוה עם או בלי סידן כפי שפורסם ב Jensen ואח '. 202043. GA50 המכיל נוירונים הציג זרם סידן שיא מוגבר בהשוואה mCherry המכיל תאים. לא הייתה עלייה ברמות הסידן הפנימיות באף אחד מהמצבים הניסיוניים כאשר הסידן הוסר מגרה ACSF KCL גבוה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 2: סרטון מייצג של ניסוי ארעי בסידן GCaMP. מוצג הוא וידאו מייצג של שדה של נוירונים קליפת המוח transfected עם GCaMP6m. לאחר תקופה בסיסית, זרם סידן גדול הוא ציין בסימן 6 s כאשר גבוה KCl aCSF הוחל. ניתן למדוד את ערך הסידן עבור התא כולו, או באזורי נויריט ספציפיים כמתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

בעיות פוטנציאליות סיבות/פתרון אפשריים
1 טעינה לא ספציפית להיות מדויק עם זמן הטעינה. זמני טעינה ארוכים יותר גורמים לטעינה לא ספציפית של FM4-64 לאנדוזוזומים וליזוזומים
2 אין אקסוציטוזיס ניכר בתאי עצב שליטה בדוק את ה- pH של פתרון ACSF גבוה של KCl.
3 אובדן מיקוד וסחף רוחבי ודא שההתמקדות המושלמת היא על. יישר את התמונות לאחר הדמיה באמצעות תוכנת ניקון או תוסף ImageJ.
4 הלבנת פלואורסצנטיות FM4-64 בדוק את עוצמת הלייזר המשמשת להדמיה. נסה תמיד להשתמש בעוצמה הנמוכה ביותר האפשרית. אשר את עוצמת הלייזר המשמשת אינה גורמת להלבנה על-ידי הפעלת ריצות ניסיון.

טבלה 2: בעיות אפשריות ופתרון בעיות עבור ניסויי צבע סטיל. תרחישים אופייניים עבור בעיות ופתרון בעיות כללי עבור ניסויי ביטול טעינה סינפטיים.

בעיות פוטנציאליות סיבות/פתרון אפשריים
1 יעילות ההעברה נמוכה מדי בדוק את בריאות העצב. אם נוירונים קשה להעביר אחד יכול לעבור AAV או transduction lentiviral של GCaMP.
2 הצטברות של פלואורסצנטיות GCaMP6 בגרעין בריאות עצבית נפגעת. תבדוק את פרוטוקול ההעברה.
3 אובדן מיקוד וסחף תמונה לרוחב ודא שההתמקדות המושלמת היא על. יישר את התמונות לאחר הדמיה באמצעות תוכנת ניקון או תוסף ImageJ.
4 אין תגובת סידן על גירוי KCL ודא שה- pH של ACSF נכון.
5 הלבנת פלואורסצנטיות GCaMP6 בדוק את עוצמת הלייזר המשמשת להדמיה. נסה תמיד להשתמש בעוצמה הנמוכה ביותר האפשרית. אשר את עוצמת הלייזר המשמשת אינה גורמת להלבנה על-ידי הפעלת ריצות ניסיון.
6 blebbing של נוריטים בריאות עצבית נפגעת עקב טרנספקטוקציה. השתמש אצווה חדשה של תרבויות עצביות.

טבלה 3: בעיות אפשריות ופתרון בעיות להדמיית סידן ארעי בניורייטות. תרחישים אופייניים לבעיות ופתרון בעיות כללי לניסויים ארעיים בסידן GCaMP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלושה שלבים המשותפים לשתי השיטות המתוארות הם בעלי חשיבות מכרעת להצלחה ניסיונית ולתוצאות הניתנות לכימות. ראשית, הכנת ACSF טרי לפני כל סיבוב של ניסויים היא חיונית, בעקבות ההוראות המצורפות. כישלון לעשות זאת עשוי למנוע depolarization עצבי מתאים. מדגם של נוירוני בקרה לא מטופלים צריך להיבדק כל הזמן לפני גירוי של כל קבוצות ניסיוניות כדי להבטיח depolarization הסלולר תקין ולספק אמת מידה לתוצאות חיוביות שהושגו באותו מפגש הדמיה. שנית, כדי לעקוב בהצלחה אחר פלואורסצנטיות לאורך זמן עבור אזורים סינפטיים ספציפיים, יש לנקוט בזהירות מיוחדת גם בעת הגדרת פרמטרי הדמיה ואזורים של החזר השקעה לניטור. הקלטת התקופה הבסיסית צריכה לעבור מיד לתקופת הקלטת הגירוי. קצב פריימים מהיר מספיק (2 תמונות/s) נדרש כדי ללכוד את הדינמיקה של ריקבון יחיד של שחרור צבע סטיירל. לבסוף, צעד קריטי בניתוח הניסויים הוא נרמול מדידות הפלואורסצנטיות תחילה לרקע ההדמיה ולאחר מכן לקו הבסיס המעורר מראש. בדומה לפרוטוקולי הדמיה אחרים, חיסור של אזור הדמיה ריק מבוצע לראשונה בכל מדידות הפלואורסצנטיות המשויכות של זמן כדי להסיר כל זרם אוטומטי ברקע שהתוספת של מדיה KCl עשויה להציג. זה גם חיוני כדי למדוד ולחשב את קריאת פלואורסצנטיות הממוצעת עבור כל החזר על ההשקעה מן הבסיס האחרון 30 s לפני גירוי. ערך התחלתי ממוצע זה משמש לאחר מכן בכל מדידות הזמן עבור החזר השקעה זה כנקודת התחלה מוגדרת כדי לכמת את העוצמה "שינוי מקו הבסיס".

תרבות עצבית ראשונית ידועה לשמצה כקשה להעברה עם DNA אקסוגני, ואפילו פרוטוקולים ממוטבים לעתים קרובות מניבים יעילות נמוכה של תאים כוללים בתרבית. 20%-25% מיעילות הטרנספקטיה מושגת בדרך כלל בתרבויות העצביות שלנו, ללא עדות לרעילות הנגרמת על ידי טרנספקטיה. בעוד ביטויים עקביים למדי נראים על פני תאים המכילים GCaMP, רמות שונות בעדינות של ביטוי בדיקה בתוך תאים בודדים נחשבים בהתבסס על השיטה של כימות אזור בודד של שינוי פלואורסצנטיות בסיסית בהשוואה לקו בסיס זה. עם זאת, עם יעילות נמוכה יחסית זו, באמצעות שיטות מבוססות transfection של הצגת כתב GCaMP אינו של חוסן מספיק עבור שכפולים ביולוגיים בקנה מידה גדול עבור מחקרי סינון תפוקה גבוהה. כדי להתגבר על כך, מספר מבנים וריאנט זמינים מסחרית עבור אריזה lentiviral או adenoviral או ביטוי ספציפי שושלת תאים, אשר יאפשר יעילות transduction גבוהה יותר. שינוי ראשוני שעשוי להיות הרצוי בעת שימוש בפרוטוקולים אלה הוא להשתמש גירוי אופטוגנטי של נוירונים במקום יישום אמבטיה של KCl62. Transduction עם מבנים lentiviral שנועד לבטא את אחת המשפחות של channelrhodopsins זמין כעת, ואחריו הפעלה עם אורכי גל ספציפיים של אור, מאפשר שליטה מרחבית עבור depolarization של תת קבוצות של נוירונים וגם להערכת ההשפעה של רכבות של פוטנציאל פעולה על רמות זרם סידן חוזרות ונשנות דלדול של חנויות שלפוחית סינפטית63 . עם זאת, חיוני לזכור כי השימוש בשיטה זו מוגבל במקצת, שכן המשתמש חייב להבטיח כי הכתב האופטוגנטי שלהם, כתב סינפטי, וכל חלבונים נוספים שהוצגו אקסוגנית אין חפיפה ספקטרלית בין פלואורופורים מנוצלים. בעיה נפוצה בפתרון בעיות באמצעות צבע סטיירל היא הפחתת אינטנסיביות פסיבית במהלך תקופת ההקלטה הבסיסית. לפני מחקרים ניסיוניים, זה קריטי כדי לייעל את עוצמת הלייזר ואת מרווחי לכידת תמונה כדי למזער את ההשפעות של הלבנת פוטו. כדי שניתן יהיה לקחת בחשבון ניסויים, יש צורך בייצוב האינטנסיביות לפחות ב-30 s האחרונים של תקופת הבסיס. עיין בטבלאות 2 ובטבלה 3 לקבלת בעיות נפוצות והפתרונות שלהן לניסויים ארעיים וצבעי סטיירל וסידן ארעיים, בהתאמה.

המגבלה העיקרית של שתי שיטות אלה היא כי תרבויות ניתן לעורר ולבחון רק במקרה אחד. כמו יישום אמבטיה משמש כדי להציג את הסוכן depolarizing KCl, כל הנוירונים להיבדק ממצב זה בצלחת זה חייב להיות בתוך שדה הראייה הראשוני של מטרת המיקרוסקופ. אם פונקציונליות לאורך זמן מעניינת, נדרשות תרבויות משויכות. עם זאת, השיטה האופטוגנטית שהוזכרה לעיל תאפשר דינמיקה סידן להיות נצפה לאורך זמן אם תרצה. בנוסף, אם נוירונים יש פגם במיחזור של שלפוחיות סינפטיות, הטעינה הראשונית של צבע styryl ייפגע. בעוד נורמליזציה בעוצמה פנימית מאפשרת השוואה בין תנאים, הבדלים קלים בסדרי גודל של תגובות עשוי להיות קשה לזהות. לבסוף, איטרציות חדשות של כתבים אלה הפכו במהירות לזמינות וניתן להחליף אותן לזמני זיהוי מהירים יותר או לתוצאות חזקות יותר. לדוגמה, GCaMP6m כבר לא נחשב הכתב המהיר ביותר של סידן ארעי במסופים סינפטיים. במקום זאת, אפשר לנצל את הדור האחרון jGCaMP864.

השיטות המתוארות כאן הן דרך מהירה ואמינה לקבוע אם מניפולציה גנטית או פרמקולוגית של נוירונים מטרידה איתות סינפטי פונקציונלי ושחרור. הניסויים המפורטים פחות מאתגרים מבחינה טכנית ופחות יקרים מאלקטרופיזיולוגיה מסורתית של מהדק מתח/זרם ומיקרוסקופיית אלקטרונים. בנוסף, בעוד אלקטרופיזיולוגיה היא מטבעה תפוקה נמוכה וברמת התא הבודד, הפרוטוקולים המתוארים כאן הם תפוקה גבוהה ומהירה יותר, ומאפשרים כמה נוירונים להיות בתמונה בו זמנית איטרציות רבות להתבצע בהדמיה אחת. מוצע כי אלה דינמיקה סידן פרדיגמות שחרור סינפטי לשמש אינדיקטור הראשון של שינויי שידור סינפטיים במודלים ALS וחקר צורות אחרות של ניוון עצבי. למרות המסקנות הנגזרות Gcamp6m ו styryl צבע הדמיה לא יכול בדיוק להקניט מנגנון מסוים של תפקוד סינפטי, בהתבסס על ממצאים כאלה, החוקרים יכולים לבצע מחקרים משלימים ממוקדים, מבוססי ראיות באמצעות שיטות מסורתיות כדי לקבוע ערוצים המעורבים, מספר שלפוחית סינפטי, או תוכן קוונטי.

התועלת בפרוטוקולים אלה היא הערכה מהירה ופשוטה של שינויים בזרם סידן בתיווך דפולריזציה תקין ו/או היתוך שלפוחית סינפטי במודלים ספציפיים של ALS. לאחרונה הדגמנו זאת בפרסום המציג זרם סידן מוגבר וביטול פריקה סינפטית בנוירונים קליפת המוח המבטאים את חלבון הדיפפטיד (גליצין-אלנין)50 הנובע מהרחבה חוזרת של ההקסנוקלאוטיד C9ORF7243. כפי שניתן לראות בעבודתנו שפורסמה, שיטות אלה יכולות להתבצע בקלות בד בבד עם שיתוף פעולה עם טרנספקטציה משותפת של RNAs מוטנטיים או חלבונים בעלי עניין או בתאים בתרבית ישירות ממודלים מהונדסים של בעלי חיים43. בנוסף, האמינות והחוסן של פרוטוקולים אלה נבדקו בהצלחה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מובחנים עצבית45, ומאפשרים מחקרים עתידיים להיעשות ישירות בתאים רלוונטיים למחלות שמקורם במטופלים. בכתב יד אחר שנערך לאחרונה, אנו מספקים ראיות לכך שנוירונים מוטוריים מסוג בר עוברים זרם סידן גבוה בעקבות גירוי כאשר בנוכחות גורם מסיס המשתחרר מ- FUS מוטנטי המבטא אסטרוציטים44. אירועי איתות סידן אסטרוציטיים שזורים זה בזה עמוקות גם עם השידור הסינפטי בנוירונים השכנים65. פרוטוקול דינמיקה של סידן הוחלו כדי לחקור ארעי סידן שלם תאים במודלים של תרבות אסטרוציטית, אשר הוכיח יעיל הן מכרסמים ראשוניים והן תאים IPS אנושיים. הבנה נוספת של דינמיקת סידן אסטרוציטית ואיתות במודלים של ALS תספק תובנה רבת ערך לגבי האופן שבו שידור סינפטי אולי מושפע כתוצאה מכך. בסופו של דבר, שימוש בכתבי GCaMP ספציפיים לסוג התא יהיה גם כלי רב עוצמה לחקירת דינמיקת סידן עצבית ואסטרוציטית בהגדרות מעורבות של תרבות משותפת והערכה ספציפית של השפעות שאינן אוטונומיות של תאים שמקורן בכל אוכלוסיית תאים.

לבסוף, השימוש הפוטנציאלי בשיטות אלה משתרע לא רק מעבר לחקר ה- ALS, אלא גם לתחומים הרחבים יותר של מדעי המוח הנוירודגנרטיביים ואפילו ההתפתחותיים. מידע מפורט על הפלסמידים הספציפיים המשמשים להפקת התוצאות הייצוגיות מסופק ומוצלח בהעברת פלסמידים המכילים וריאנטים גנטיים רבים ושונים של FUS, SOD1 ו- C9ORF72 hexanucleotide חוזר ודיפפטידים43,44,66,67,68. בתנאי פלסמידים מכילים מקדם המשמש נוירונים, אין הגבלה על אילו מודלים של ALS או מחלה ניוונית ניתן ללמוד באמצעות שיטות אלה. יתר על כן, טרנספקטיה כדי לבטא חלבונים מוטנטיים היא צעד אופציונלי לחלוטין. תרביות הנוצרות מבעלי חיים מהונדסים או תאים שמקורם במטופלים אנושיים מבטלות את הצורך לזהות תאים המכילים את החלבון המוטנטי מעניין. כיום, מערכות אלה מוגבלות באופן שאם צבע סטיירל ישמש, ערוץ TRITC תפוס, ואם נעשה שימוש ב- GcaMP6, ערוץ FITC תפוס. טכניקות המאפשרות בחינה של פעילות עצבית ואסטרוציטית בזמן אמת להרחיב את האפשרויות להבנת ניתוח קורס זמן עבור התבגרות סינפטית / ניוון, כמו גם בדיקות מהירות ליעילות של תרכובות פרמקולוגיות בקידום או דיכוי תקשורת עצבית. שתי שיטות אלה מקובלות על קנה מידה של תפוקה גבוהה להקרנה. במקום ציפוי נוירונים בצלחות בודדות של 35 מ"מ, הפרמטרים הדמיה של שני פרוטוקולים אלה יכולים להיות בשימוש באופן אוטומטי על פני 96-well צלחות. באמצעות פלטפורמה כזו, ספריות מורכבות ניתן לבדוק במהירות עבור טיפולית, אשר לווסת את כניסת הסידן או לשפר את השחרור הסינפטי באמצעות מודל גנטי של מחלה או אפילו תאים נגזר ישירות מחולים. שיטה זו יכולה לזרז את האפשרות של טיפולים ספציפיים לקבוצה או אפילו מותאמים אישית על ידי זיהוי מהיר של מולקולות מועמדים לחקירה נוספת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

ברצוננו להכיר לחברים בהווה ובעבר במרכז ג'פרסון ויינברג ALS למשוב קריטי והצעות למיטוב טכניקות אלה וניתוחיהן. עבודה זו נתמכה על ידי מימון של NIH (RF1-AG057882-01 ו- R21-NS0103118 ל- D.T.), NINDS (R56-NS092572 ו- R01-NS109150 ל- P.P), האגודה לניוון שרירים (D.T.), מרכז רוברט פקארד לחקר ALS (D.T.), קרן המשפחה החזקה 4 ALS וקרן משפחת פרבר (B.K.J., K.K. ו- P.P. ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 173
מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter