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Neuroscience

एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के मॉडल में सिनैप्टिक कार्यों का वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मापन

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के लिए आवश्यक उपकोशिकीय घटनाओं की कल्पना करने के लिए दो संबंधित विधियों का वर्णन किया गया है। ये प्रोटोकॉल इन विट्रो सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करके प्रीसिनैप्टिक कैल्शियम प्रवाह और सिनैप्टिक पुटिका झिल्ली संलयन की गतिशीलता की वास्तविक समय की निगरानी को सक्षम करते हैं।

Abstract

न्यूरोनल अध: पतन से पहले, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) और / या फ्रंटोटेम्पोरल लोब डिमेंशिया (एफटीएलडी) वाले रोगियों में मोटर और संज्ञानात्मक घाटे का कारण न्यूरॉन्स और मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के बीच संचार की शिथिलता है। सिनैप्टिक संचरण की अंतर्निहित प्रक्रिया में झिल्ली विध्रुवीकरण-निर्भर सिनैप्टिक पुटिका संलयन और सिनैप्स में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई शामिल है। यह प्रक्रिया स्थानीयकृत कैल्शियम प्रवाह के माध्यम से प्रीसिनेप्टिक टर्मिनलों में होती है जहां सिनैप्टिक पुटिकाएं रहती हैं। यहां, प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति-आधारित लाइव-इमेजिंग तरीकों का वर्णन करता है जो मज़बूती से विध्रुवीकरण-मध्यस्थता सिनैप्टिक पुटिका एक्सोसाइटोसिस और सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में प्रीसिनेप्टिक टर्मिनल कैल्शियम प्रवाह गतिशीलता की रिपोर्ट करते हैं।

एक स्टायरिल डाई का उपयोग करना जिसे सिनैप्टिक पुटिका झिल्ली में शामिल किया जाता है, सिनैप्टिक पुटिका रिलीज को स्पष्ट किया जाता है। दूसरी ओर, कैल्शियम प्रविष्टि का अध्ययन करने के लिए, Gcamp6m का उपयोग किया जाता है, एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर। हम न्यूरोनल गतिविधि की नकल करने के लिए उच्च पोटेशियम क्लोराइड-मध्यस्थता विध्रुवीकरण को नियोजित करते हैं। सिनैप्टिक पुटिका एक्सोसाइटोसिस को स्पष्ट रूप से मापने के लिए, हम समय के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत स्टाइरिल डाई प्रतिदीप्ति के नुकसान को मापते हैं। इसी तरह की उत्तेजना की स्थिति में, कैल्शियम प्रवाह के मामले में, Gcamp6m प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है। इस प्रतिदीप्ति परिवर्तन का सामान्यीकरण और परिमाणीकरण स्टाइरिल डाई प्रोटोकॉल के समान तरीके से किया जाता है। इन विधियों को फ्लोरोसेंटली टैग किए गए उत्परिवर्ती प्रोटीन के अभिकर्मक-आधारित ओवरएक्सप्रेशन के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल का बड़े पैमाने पर FUS-ALS और C9ORF72-ALS के मॉडल में सिनैप्टिक डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है, जो प्राथमिक कृंतक कॉर्टिकल और मोटर न्यूरॉन्स का उपयोग करता है। ये प्रोटोकॉल आसानी से उन यौगिकों की तेजी से स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं जो न्यूरोनल संचार में सुधार कर सकते हैं। इस प्रकार, ये विधियां न केवल एएलएस के अध्ययन के लिए बल्कि न्यूरोडीजेनेरेटिव और विकासात्मक तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के सभी क्षेत्रों के लिए मूल्यवान हैं।

Introduction

प्रयोगशाला में मॉडलिंग एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) को 80% से अधिक मामलों की भारी छिटपुट प्रकृति के कारण विशिष्ट रूप से चुनौतीपूर्ण बनाया गया है1, जो रोग-प्रेरक 2 के रूप में जाने जाने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन की विशाल संख्या के साथ युग्मित है। इसके बावजूद, एएलएस के सभी मामले एकीकृत विशेषता को साझा करते हैं कि एकमुश्त न्यूरोनल अध: पतन से पहले, प्रीसिनेप्टिक मोटर न्यूरॉन्स और पोस्टसिनेप्टिक मांसपेशी कोशिकाओं के बीच बेकार संचार होता है3,4। नैदानिक रूप से, जैसा कि रोगी शेष ऊपरी और निचले मोटर न्यूरॉन्स की कनेक्टिविटी खो देते हैं, वे पूरे रोग 5,6,7,8,9 में न्यूरोनल हाइपर- और हाइपोएक्साइटबिलिटी की विशेषताओं के साथ पेश करते हैं, जो इन synapses में जटिल अंतर्निहित आणविक परिवर्तनों को दर्शाते हैं, जिसे हम, एएलएस शोधकर्ताओं के रूप में, समझना चाहते हैं।

एकाधिक ट्रांसजेनिक मॉडल ने सचित्र किया है कि न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की गिरावट और अव्यवस्था एएलएस-प्रेरक आनुवंशिक उत्परिवर्तन की अभिव्यक्ति के साथ होती है, जिसमें SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16, और TDP4317,18,19 शामिल हैं। रूपात्मक मूल्यांकन के माध्यम से, जिसमें सिनैप्टिक बाउटन, रीढ़ की हड्डी के घनत्व और पूर्व / पोस्टसिनेप्टिक संगठन का मूल्यांकन शामिल है। यंत्रवत रूप से, 1 9 30 के दशक में कोल, हॉजकिन और हक्सले के ऐतिहासिक कागजात के बाद से, इन विट्रो सेल संस्कृति या ऊतक स्लाइस तैयारी में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों के माध्यम से सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करना भी संभव हो गया है। इन रणनीतियों के माध्यम से, एएलएस के कई मॉडलों ने सिनैप्टिक ट्रांसमिशन घाटे का प्रदर्शन किया है। उदाहरण के लिए, TDP43 का एक उत्परिवर्ती संस्करण बढ़ी हुई फायरिंग आवृत्ति का कारण बनता है और एनएससी -34 (रीढ़ की हड्डी एक्स न्यूरोब्लास्टोमा हाइब्रिड सेल लाइन 34) मोटर-न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं 21 में एक्शन पोटेंशियल थ्रेशोल्ड को कम करता है। यह एक ही संस्करण भी एक माउस model22 में व्यवहार मोटर घाटे की शुरुआत से पहले neuromuscular जंक्शन (NMJ) पर बेकार synaptic संचरण का कारण बनता है। यह पहले दिखाया गया था कि उत्परिवर्ती एफयूएस अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप लोकोमोटर दोष 11 से पहले एफयूएस-एएलएस के ड्रोसोफिला मॉडल में एनएमजे पर कम सिनैप्टिक संचरण होता है। C9orf72-विस्तार वाहक से व्युत्पन्न प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके हाल ही में एक रिपोर्ट ने सिनैप्टिक पुटिकाओं 23 के आसानी से पुनरावृत्ति योग्य पूल में कमी का खुलासा किया। कुल मिलाकर, ये अध्ययन और अन्य एएलएस के रोग-प्रासंगिक मॉडल में सिनैप्टिक सिग्नलिंग के अंतर्निहित तंत्र की अधिक व्यापक समझ के निर्माण के महत्व को उजागर करते हैं। यह एएलएस के पैथोबायोलॉजी को समझने और रोगियों के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को विकसित करने में महत्वपूर्ण होगा।

वर्तमान और वोल्टेज क्लैंपिंग कोशिकाओं के तरीके झिल्ली गुणों को निर्धारित करने में अमूल्य रहे हैं जैसे कि चालकता, आराम झिल्ली क्षमता, और व्यक्तिगत synapses20,24 की क्वांटल सामग्री। हालांकि, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक यह है कि यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और केवल एक समय में एक ही न्यूरॉन से अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। लाइव-सेल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच के साथ युग्मित, न्यूरॉन्स के सिनैप्टिक ट्रांसमिशन की जांच करने का अवसर प्रदान करता है एक स्पैटिओटेम्पोरल तरीके से 25,26,27। हालांकि न्यूरोनल उत्तेजना का एक प्रत्यक्ष उपाय नहीं है, यह प्रतिदीप्ति दृष्टिकोण सिनैप्टिक फ़ंक्शन के दो आणविक सहसंबंधों का एक सापेक्ष माप प्रदान कर सकता है: सिनैप्टिक पुटिका रिलीज और सिनैप्टिक टर्मिनलों पर कैल्शियम क्षणिक।

जब एक कार्रवाई क्षमता न्यूरॉन्स के प्रीसिनेप्टिक टर्मिनल क्षेत्र तक पहुंचती है, तो कैल्शियम क्षणिकों को ट्रिगर किया जाता है, जिससे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 28 की प्रक्रिया में विद्युत संकेत से संक्रमण की सुविधा मिलती है। वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम चैनल इन क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत कसकर कैल्शियम सिग्नलिंग को विनियमित करने के लिए न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 29 के कैनेटीक्स को संशोधित करने के लिए। कैल्शियम transients की पहली रिपोर्ट प्रतिदीप्ति आधारित रिकॉर्डिंग या तो दोहरी तरंग दैर्ध्य संकेतक Fura-2 AM या एकल तरंग दैर्ध्य डाई Fluo-3 AM30,31,32 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था। जबकि इन रंजकों ने उस समय महान नई अंतर्दृष्टि की पेशकश की थी, वे कई सीमाओं से पीड़ित हैं जैसे कि कोशिकाओं के भीतर गैर-विशिष्ट कंपार्टमेंटलाइजेशन, लेबल कोशिकाओं से सक्रिय या निष्क्रिय डाई हानि, फोटोब्लीचिंग और विषाक्तता यदि समय 33 की विस्तारित अवधि में चित्रित किया जाता है। पिछले दशक में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक न्यूरोनल गतिविधि के विभिन्न रूपों की इमेजिंग के लिए वर्कहॉर्स बन गए हैं। ये संकेतक कैल्शियम चेलेटर प्रोटीन के साथ एक संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को जोड़ते हैं जो Ca2 + आयन34 के बंधन के बाद तेजी से प्रतिदीप्ति तीव्रता को स्विच करता है। इन नए संकेतकों का आवेदन विशाल है, जो इन विट्रो और विवो सेटिंग्स दोनों में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिकों के बहुत आसान विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इन आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड पत्रकारों का एक परिवार, जिसे जीसीएएमपी के रूप में जाना जाता है, अब व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इन संकेतकों में एक सी-टर्मिनल कैलमोडुलिन डोमेन होता है, जिसके बाद हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) होते हैं, और एक एन-टर्मिनल कैलमोडुलिन-बाइंडिंग क्षेत्र 35,36 द्वारा कैप किए जाते हैं। कैलमोडुलिन डोमेन के लिए कैल्शियम-बाइंडिंग कैलमोडुलिन-बाइंडिंग क्षेत्र के साथ एक बातचीत को ट्रिगर करता है, जिसके परिणामस्वरूप समग्र प्रोटीन संरचना में एक संरचनात्मक परिवर्तन होता है और जीएफपी समूह 35,36 के प्रतिदीप्ति में पर्याप्त वृद्धि होती है। इन वर्षों में, पत्रकारों के इस परिवार ने विशिष्ट कैनेटीक्स (धीमी गति से, मध्यम और तेज) के साथ विशेष कैल्शियम क्षणिकों के लिए अलग-अलग रीडआउट को सक्षम करने के लिए कई विकास किए हैं, जिनमें से प्रत्येक में थोड़ा अलग गुण हैं37,38। यहां, रिपोर्टर GcaMP6 के उपयोग पर प्रकाश डाला गया है, जिसे पहले विवो और इन विट्रो 37 दोनों में न्यूरॉन्स में एकल एक्शन पोटेंशियल और डेंड्राइटिक कैल्शियम क्षणिकों का पता लगाने के लिए दिखाया गया है।

प्रीसिनेप्टिक क्षेत्र में कैल्शियम क्षणिक सिनैप्टिक पुटिका संलयन घटनाओं को ट्रिगर करते हैं, जिससे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज होता है सिनैप्स में और पोस्टसिनेप्टिक सेल 28,39 में सिग्नलिंग घटनाओं की दीक्षा होती है। सिनैप्टिक पुटिकाओं को तेजी से जारी और पुनर्नवीनीकरण दोनों किया जाता है, क्योंकि सेल होमोस्टैटिक रूप से एक स्थिर कोशिका झिल्ली सतह क्षेत्र को बनाए रखता है और संलयन सक्षम झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं के आसानी से पुन: प्रयोज्य पूल 40 को बनाए रखता है। यहां उपयोग किए जाने वाले स्टायरिल डाई में लिपिड झिल्ली के प्रति एक आत्मीयता है और विशेष रूप से आसपास के लिपिड वातावरण 41,42 के आदेश के आधार पर इसके उत्सर्जन गुणों को बदलता है। इस प्रकार, यह रीसाइक्लिंग सिनैप्टिक पुटिकाओं को लेबल करने और इन पुटिकाओं के बाद के ट्रैकिंग के लिए एक आदर्श उपकरण है क्योंकि वे बाद में न्यूरोनल उत्तेजना 41,42 के बाद जारी किए जाते हैं। प्रोटोकॉल जो उत्पन्न और अनुकूलित किया गया है, वह गफफील्ड और सहकर्मियों द्वारा शुरू में वर्णित अवधारणाओं का एक अनुकूलन है, जो हमें समय के साथ स्टाइरिल डाई-लेबल वाले सिनैप्टिक पुटिका पंक्टा की कल्पना करने की अनुमति देता है।

यहां, दो संबंधित प्रतिदीप्ति-आधारित तरीकों का वर्णन किया गया है, मज़बूती से सिनैप्टिक ट्रांसमिशन में शामिल विशिष्ट सेलुलर घटनाओं की रिपोर्टिंग। सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में विध्रुवीकरण-मध्यस्थता वाले प्रीसिनेप्टिक टर्मिनल कैल्शियम प्रवाह और सिनैप्टिक पुटिका एक्सोसाइटोसिस की गतिशीलता की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल को परिभाषित किया गया है। यहां, विधियों और प्रतिनिधि परिणामों को इन विट्रो मॉडल सिस्टम के रूप में प्राथमिक कृंतक कॉर्टिकल या मोटर न्यूरॉन्स का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया जाता है, क्योंकि इन सेल प्रकारों का उपयोग करके प्रकाशित अध्ययन हैं43,44। हालांकि, ये विधियां विभेदित मानव i3 कॉर्टिकल-जैसे न्यूरॉन्स 45 पर भी लागू होती हैं, क्योंकि हमें अपनी प्रयोगशाला में वर्तमान में चल रहे प्रयोगों में दोनों प्रोटोकॉल के साथ भी सफलता मिली है। सामान्य प्रोटोकॉल को चरणबद्ध रैखिक प्रारूप में रेखांकित किया गया है, जो चित्र 1 में दिखाया गया है। संक्षेप में, न्यूराइट्स में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, परिपक्व न्यूरॉन्स को एक साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर 37,46 के तहत फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीसीएएमपी 6 एम को व्यक्त करने के लिए प्लास्मिड डीएनए के साथ संक्रमित किया जाता है। ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं में बेसल ग्रीन प्रतिदीप्ति का निम्न स्तर होता है, जो कैल्शियम की उपस्थिति में बढ़ता है। ब्याज के क्षेत्रों को हमारे हेरफेर के दौरान प्रतिदीप्ति परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए निर्दिष्ट किया जाता है। यह कैल्शियम में अत्यधिक स्थानिक और अस्थायी रूप से स्थानीयकृत उतार-चढ़ाव को मापा जा सकता है37,46। सिनैप्टिक पुटिका संलयन और रिलीज का मूल्यांकन करने के लिए, परिपक्व न्यूरॉन्स को सिनैप्टिक पुटिका झिल्ली में शामिल स्टाइरिल डाई के साथ लोड किया जाता है क्योंकि वे प्रीसिनेप्टिक कोशिकाओं में न्यूरोट्रांसमीटर के साथ पुनर्नवीनीकरण, सुधार और पुनः लोड किए जाते हैं41,42,43,47,48। इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान रंजक न्यूराइट्स के साथ सिनैप्टिक पुटिकाओं को लेबल करते हैं और लाइव-इमेजिंग प्रयोगों में इन क्षेत्रों के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किए जाते हैं, जैसा कि क्राज़ेवस्की और सहकर्मियों द्वारा स्टाइरिल डाई और सिनैप्टोटाग्मिन के सह-धुंधला द्वारा दिखाया गया था। यहां शामिल हैं इसी तरह के दाग की प्रतिनिधि छवियां जो भी की गई हैं (चित्रा 2 ए)। पिछले जांचकर्ताओं ने न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स 48,49,50,51,52,53,54,55,56 पर सिनैप्टिक पुटिका गतिशीलता की रिपोर्ट करने के लिए बड़े पैमाने पर इस तरह के रंगों का उपयोग किया है . डाई-लोडेड पुटिकाओं के पंक्टेट क्षेत्रों का चयन करके और पुटिका रिलीज के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी की निगरानी करके, कार्यात्मक सिनैप्टिक ट्रांसमिशन क्षमता और रिहाई की अस्थायी गतिशीलता का अध्ययन उत्तेजना 43 के बाद किया जा सकता है। दोनों विधियों के लिए, पोटेशियम क्लोराइड की उच्च सांद्रता वाले एक माध्यम को न्यूरोनल गतिविधि की नकल करने के लिए कोशिकाओं को विध्रुवीकृत करने के लिए नियोजित किया जाता है। इमेजिंग पैरामीटर को हमारे उत्तेजना कैप्चर अवधि के बाद बेसलाइन सामान्यीकरण में फैले उप-दूसरे अंतराल को कैप्चर करने के लिए निर्दिष्ट किया जाता है। प्रत्येक समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति माप निर्धारित किए जाते हैं, पृष्ठभूमि के लिए सामान्यीकृत होते हैं, और प्रयोगात्मक समय अवधि में परिमाणित होते हैं। कैल्शियम-प्रवाह मध्यस्थता GCaMP6m प्रतिदीप्ति वृद्धि या प्रभावी synaptic पुटिका exocytosis styryl डाई रिलीज प्रतिदीप्ति कमी इस रणनीति के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। इन दो प्रोटोकॉल के लिए विस्तृत पद्धतिगत सेटअप और पैरामीटर और उनके लाभों और सीमाओं पर चर्चा नीचे वर्णित हैं।

Figure 1
चित्रा 1: समग्र सामान्य प्रोटोकॉल प्रक्रिया का दृश्य रेंडरिंग। (1) पृथक और संस्कृति प्राथमिक कृंतक न्यूरॉन्स विट्रो में चुना परिपक्वता timepoint करने के लिए. (2) GCaMP डीएनए या स्टाइरिल डाई को सिनैप्टिक गतिविधि के पत्रकारों के रूप में पेश करें। (3) लाइव इमेजिंग सुसज्जित confocal माइक्रोस्कोप और संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सेटअप इमेजिंग प्रतिमान. बेसलाइन रिकॉर्डिंग अवधि प्रारंभ करें. (4) जबकि कोशिकाएं अभी भी लाइव-इमेज कैप्चर से गुजर रही हैं, उच्च केसीएल स्नान परफ्यूजन के माध्यम से न्यूरॉन्स को उत्तेजित करती हैं। (5) कैल्शियम क्षणिक या सिनैप्टिक पुटिका संलयन को मापने के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता माप का आकलन करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

इस अध्ययन में किए गए सभी पशु प्रक्रियाओं को जेफरसन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. भ्रूण चूहा प्रांतस्था से न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति

नोट: प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को E17.5 चूहे के भ्रूण से अलग किया जाता है जैसा कि पहले वर्णित किया गया था57,58। कोई तनाव पूर्वाग्रह इस culturing प्रोटोकॉल की सफलता के साथ मौजूद प्रतीत होता है. इस विधि को नीचे संक्षेप में वर्णित किया गया है। संकेतित पिछले लेखों को पूर्ण विवरण के लिए संदर्भित किया जाना चाहिए।

  1. CO2 साँस लेना द्वारा गर्भवती मादा चूहों euthanize गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा माध्यमिक पुष्टि के बाद.
  2. फसल भ्रूण और बर्फ-ठंडे 20 mM HEPES-buffered हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) में मस्तिष्क को अलग करें। बाहरी प्रांतस्था खोल से, अलग करें और फिर स्ट्रिएटम और हिप्पोकैम्पी को छोड़ दें। cortices ले लीजिए.
  3. cortices से meninges को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, कोमल दबाव का उपयोग करके बंद संदंश की एक जोड़ी के साथ कॉर्टेक्स को जगह में रखें।
    नोट: दूसरे हाथ में संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ, पिंच meninges. चुटकी जोड़ी के साथ रोलिंग गति का उपयोग कर meninges दूर छील. बंद संदंश के साथ reposition और जब तक meninges पूरी तरह से हटा दिया जाता है आवश्यक के रूप में दोहराने.
  4. HBSS में 10 μg / mL पपेन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए cortices इनक्यूबेट करें।
  5. एचबीएसएस में तीन बार धोएं, और फिर एक समरूप सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए आग-पॉलिश ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ धीरे-धीरे 5-10 बार ट्राइट्यूरेट करें।
    नोट: बुलबुले से बचें; सेल निलंबन के भीतर पिपेट को बनाए रखें।
  6. 100 μg / mL पॉली-डी-लाइसिन पर प्लेट न्यूरॉन्स ने B27 पूरक (2%) और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ न्यूरोबेसल माध्यम में 75,000 कोशिकाओं / डिश के घनत्व पर 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश को लेपित किया।

2. भ्रूण चूहे रीढ़ की हड्डी से मोटर न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति

नोट: प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स E13.5 चूहे भ्रूण से तैयार किए जाते हैं जैसा कि पहले वर्णित है, कुछ संशोधनों के साथ 59,60। कोई तनाव पूर्वाग्रह इस culturing प्रोटोकॉल की सफलता के साथ मौजूद प्रतीत होता है. इस विधि को नीचे संक्षेप में वर्णित किया गया है। संकेतित पूर्ववर्ती लेखों को पूर्ण विवरण के लिए संदर्भित किया जाना चाहिए।

  1. चरण 1.1 के रूप में गर्भवती मादा चूहों Euthanize.
  2. भ्रूण से 10-20 रीढ़ की हड्डी को विच्छेदित करें और क्रमशः चुटकी और खींचने के लिए संदंश के दो जोड़े का उपयोग करके यांत्रिक रूप से छोटे टुकड़ों में तोड़ दें।
  3. 8 मिनट के लिए 0.025% ट्रिप्सिन में इनक्यूबेट करें, इसके बाद 1 मिलीग्राम / एमएल पर डीएनएस के अलावा।
  4. 470 x g पर 470 x g पर 4% w / v BSA कुशन के माध्यम से centrifuge 4 °C पर 4 °C पर बिना किसी ब्रेक के।
  5. सेंट्रीफ्यूज पैलेट कोशिकाओं 55 मिनट के लिए 830 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 10.4% (v / v) घनत्व ढाल माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) कुशन के माध्यम से ब्रेक के बिना। दृश्य इंटरफ़ेस पर मोटर न्यूरॉन बैंड को आगे बढ़ाएं।
    नोट:: सभी कक्षों का कैप्चर सुनिश्चित करने के लिए, घनत्व ढाल चरण और अन्य सभी चरणों के लिए फिनोल युक्त मीडिया के लिए फिनोल-मुक्त मीडिया का उपयोग करें। घनत्व ढाल और पृथक्करण मीडिया का इंटरफ़ेस रंग अंतर के आधार पर आसानी से पहचाना जा सकता है।
  6. स्पिन ने 470 x g पर एक और 4% w / v BSA कुशन के माध्यम से 4 °C पर 5 मिनट के लिए बिना किसी ब्रेक के बैंड एकत्र किए।
  7. B27 पूरक (2%), ग्लूटामाइन (0.25%), 2-mercaptoethanol (0.1%), घोड़े के सीरम (2%), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूर्ण न्यूरोबेसल माध्यम में शुद्ध मोटर न्यूरॉन्स को फिर से निलंबित कर दिया।
  8. पॉली-लाइसिन के 100 μg / mL और 50,000 कोशिकाओं / 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश के घनत्व पर लैमिनिन-लेपित कवरलिप्स के 3 μg / mL पर प्लेट न्यूरॉन्स।

3. न्यूरोनल अभिकर्मक

नोट: यह चरण न्यूरॉन्स के लिए किया जाता है जो जीसीएएमपी कैल्शियम इमेजिंग और / या न्यूरॉन्स से गुजरेंगे जिसमें एक बहिर्जात डीएनए प्लास्मिड या ब्याज का आरएनए सिनैप्टिक मूल्यांकन से पहले पेश किया जाता है। इसके विपरीत, स्टायरिल डाई को इमेजिंग सत्र से ठीक पहले लोड किया जाता है और इसे अनुभाग 6 में संबोधित किया जाता है। नीचे सारांश प्रस्तुत उदाहरणों में प्राथमिक कृंतक न्यूरॉन्स के लिए उपयोग किया जाने वाला अभिकर्मक प्रोटोकॉल है, लेकिन इसे आसानी से अनुकूलित और उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. सुसंस्कृत प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के लिए अभिकर्मक दिन 12 इन विट्रो (DIV 12) में होते हैं, जबकि मोटर न्यूरॉन्स विट्रो ( DIV 7) में दिन 7 पर ट्रांसफेक्टेड होते हैं।
    नोट:: सभी निम्न चरणों एक एसेप्टिक biosafety कैबिनेट के भीतर हो।
  2. मात्रा द्वारा 1: 2 के अनुपात में अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके GCaMP6m के 500 एनजी को ट्रांसफेक्ट करें। सह-अभिकर्मकों के लिए, कुल डीएनए / डिश के कुल 1.25 μg जोड़ें, इस डीएनए को अभिकर्मक अनुपात में बनाए रखें।
    नोट: दिखाए गए प्रयोगात्मक उदाहरणों में, ब्याज के एएलएस / एफटीडी से संबंधित प्लास्मिड के 750 एनजी को C9orf72-ALS लिंक्ड डाइपेप्टाइड्स, उत्परिवर्ती FUS प्रोटीन, आदि को व्यक्त करने के लिए ट्रांसफेक्ट किया गया है। सुनिश्चित करें कि सह-संक्रमित प्लास्मिड का फ्लोरोसेंट टैग GCaMP इमेजिंग के FITC चैनल के साथ संघर्ष नहीं करेगा। इसी तरह, यदि स्टायरिल डाई इमेजिंग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि सह-संक्रमित प्लास्मिड इमेजिंग के TRITC चैनल के साथ संघर्ष नहीं करेगा। Synaptophysin-GCaMP3 का उपयोग इस प्रोटोकॉल में समान रूप से प्रभावी है। इसलिए, इस प्लास्मिड की समान मात्रा को ट्रांसफेक्ट करें और अनुभाग 7 में सामान्य रूप से सभी चरणों का पालन करें।
  3. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए-अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर को इनक्यूबेट करें।
  4. धीरे से घुमावदार के साथ न्यूरॉन्स dropwise करने के लिए incubated परिसर जोड़ें. 45-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर को डिश वापस करें।
  5. डीएनए-अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर युक्त पूरे संस्कृति मीडिया को हटा दें और इसे पूर्व-वातानुकूलित और ताजा न्यूरोनल मीडिया की मात्रा की तैयारी द्वारा 50-50 के साथ बदलें। फिर, इमेजिंग तक कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए CO2 इनक्यूबेटर में वापस रखें।

4. बफर समाधान और styryl डाई स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. तालिका 1 में सूचीबद्ध सामग्री का उपयोग करके इमेजिंग से पहले कम और उच्च एसीएसएफ समाधान ों को ताजा करें। उपयोग करने से पहले दोनों बफ़र समाधान फ़िल्टर करें।
    नोट: CaCl2 dihydrate Ca(OH)2 भंडारण पर फार्म कर सकते हैं। अधिकतम प्रभावकारिता के लिए, हमेशा हाल ही में खोले गए कंटेनर का उपयोग करें। यदि यह संभव नहीं है, तो बाहरी सतह से Ca(OH)2 को हटाने और अधिकतम घुलनशीलता सुनिश्चित करने के लिए, CaCl2 के अलावा से पहले 5 मिनट के लिए गैसीय CO2 के साथ समाधान ों को कार्बोनेट किया जा सकता है। यदि यह कदम उठाया जाता है, तो 7.4 के पीएच मान को बनाए रखने के लिए परिणामी समाधान के पीएच को समायोजित करें, क्योंकि अत्यधिक कार्बोनेशन के परिणामस्वरूप Ca (HCO3) 2 गठन होगा।
कम KCL aCSF बफ़र (pH 7.40 से 7.45)
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता
HEPES 10 mM
NaCl 140 mM
KCl 5 mM
ग्लूकोज़ 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
उच्च KCL aCSF बफ़र (pH 7.40 से 7.45)
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता
HEPES 10 mM
NaCl 95 mM
KCl 50 mM
ग्लूकोज़ 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

तालिका 1: कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) बफर की संरचना। इस तालिका में कम और उच्च KCl कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव बफर तैयार करने के लिए सामग्री शामिल है, जबकि इमेजिंग और न्यूरॉन्स उत्तेजक का उपयोग किया जाता है। तैयारी निर्देशों के लिए अनुभाग 4 देखें।

  1. डाई की एक 100 μg शीशी लेने और आसुत पानी या neurobasal माध्यम के साथ 10 mM की एक स्टॉक एकाग्रता के लिए यह पुनर्गठन द्वारा styryl डाई स्टॉक समाधान तैयार करें।

5. माइक्रोस्कोप और परफ्यूजन प्रणाली सेटअप

नोट: इमेजिंग ग्लास-बॉटम पेट्री व्यंजनों के लिए, परफ्यूजन के लचीलेपन के कारण और उच्च संख्यात्मक एपर्चर तेल विसर्जन उद्देश्य के उपयोग के लिए एक उलटा कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पसंद किया जाता है। confocal माइक्रोस्कोप, कैमरा, और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तृत उदाहरणों की इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले उद्देश्यों के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. एक इनक्यूबेटर सिस्टम-युग्मित चरण माउंट का उपयोग करके निरंतर 5% CO2 स्तरों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी प्रयोगों को निष्पादित करें।
  2. Confocal सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर छवि अधिग्रहण नियंत्रण. इमेजिंग सत्र की शुरुआत में अधिग्रहण सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए उत्तेजना शक्ति का चयन करें और फोटोब्लीचिंग के बिना संकेतों के इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन को सुनिश्चित करने के लिए लाभ प्राप्त करें।
    1. सभी नमूनों में उत्तेजना शक्ति, एक्सपोजर समय, डिटेक्टर लाभ और फ्रेम दर स्थिर रखें। डाई ब्लीचिंग को कम करने के लिए 512 x 512 के पहलू अनुपात और 2 छवियों की फ्रेम दर का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग करें।
      नोट: जबकि puncta स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए, लेजर तीव्रता को ब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी से बचने के लिए न्यूनतम संभव पर सेट किया जाना चाहिए। न्यूराइट्स के भीतर फ्लोरोसेंट puncta के इष्टतम संकल्प को प्राप्त करने के लिए सबसे संकीर्ण सेटिंग के लिए confocal एपर्चर सेट करें। एक्सपोज़र समय 200 एमएस या उससे कम पर सेट किया गया है, जो नमूनों में सुसंगत है। उपयोग किए गए कैमरे की अधिकतम इमेजिंग गति 2 छवियों / एस थी। यदि एक तेज कैमरे का उपयोग कर रहे हैं, तो अधिक छवियों / यदि संभव हो तो टेम्पोरल इमेजिंग सेटिंग्स को चुना जाना चाहिए।
  3. Confocal सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग के लिए निम्नलिखित प्रतिदीप्ति उत्तेजना / डाइक्रोइक / उत्सर्जन फ़िल्टर संयोजनों का चयन करें: क्रमशः FITC के साथ Gcamp6m / Gcamp3 और TRITC के साथ स्टाइरिल डाई।
  4. Z-बहाव से बचने के लिए समय-अंतराल इमेजिंग के दौरान confocal इमेजिंग अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर की सही फोकस सुविधा का उपयोग करें।
    नोट: इमेजिंग की तेज गति के कारण, एक एकल विमान को चित्रित किया जाता है। प्रयोग के दौरान जेड-बहाव की कमी सुनिश्चित करना बहुत महत्वपूर्ण है।
  5. रिकॉर्डिंग अवधियों और अंतराल सेट करने के लिए छवि अधिग्रहण पैनल में समय टैब का चयन करें।
    1. चरण # 1 को अंतराल 500 एमएस, अवधि 3 - 5 मिनट पर सेट करें।
    2. चरण # 2 को अंतराल 500 एमएस, अवधि 5 मिनट पर सेट करें।
      नोट: चरण # 1 बेसलाइन रिकॉर्डिंग से मेल खाती है, क्रमशः उत्तेजना अवधि के लिए चरण # 2।
  6. एक वाल्व नियंत्रण प्रणाली और एक चैनल कई गुना का उपयोग कर aCSF के लिए गुरुत्वाकर्षण परफ्यूजन उपकरण इकट्ठा.
    1. उच्च KCl लोड ( तालिका 1 देखें) उपकरण के शीर्ष पर एक 50 मिलीलीटर सिरिंज में, ट्यूबिंग सिस्टम के माध्यम से चल रहा के साथ. प्रवाह दर को 1 mL/min पर सेट करें.
  7. confocal इमेजिंग चरण पर न्यूरॉन्स युक्त एक 35 मिमी ग्लास डिश लोड करें, जिसमें डिश किनारे पर परफ्यूजन टयूबिंग के अंत में रखा जाता है। इमेजिंग के लिए फ़ील्ड चुनें.

6. सिनैप्टिक पुटिका रिलीज के स्टायरिल डाई इमेजिंग

  1. कम KCl aCSF में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ( तालिका 1 देखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए, 48 घंटे के बाद अभिकर्मक।
  2. स्टाइरिल डाई के साथ ग्लास-बॉटम पेट्री डिश पर प्राथमिक कॉर्टिकल या मोटर न्यूरॉन्स लोड करें।
    1. आकांक्षा द्वारा कम KCl aCSF निकालें।
    2. 5 मिनट के लिए 50 mM KCl युक्त एसीएसएफ में स्टाइरिल डाई के 10 μM के साथ अंधेरे में न्यूरॉन्स लोड करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    3. गैर-विशिष्ट डाई लोडिंग को खत्म करने के लिए 10 मिनट के लिए कम KCl aCSF में लोडिंग समाधान और स्नान न्यूरॉन्स को हटा दें।
  3. इमेजिंग चरण पर 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश रखें, और फिर एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के 20x हवा के उद्देश्य या 40x तेल विसर्जन उद्देश्य के तहत या तो निरीक्षण करें।
    नोट: एक GFP-टैग किए गए प्लास्मिड के साथ सह-transfected कोशिकाओं के मामले में transfected कोशिकाओं का पता लगाने के लिए GFP प्रतिदीप्ति का उपयोग करें।
  4. एक 546 एनएम लेजर का उपयोग कर उत्तेजक स्टायरिल डाई, एक 630-730 एनएम (TRITC) बैंडपास फिल्टर का उपयोग कर उत्सर्जन इकट्ठा।
  5. इमेजिंग फ़ील्ड का चयन करें और सही फोकस संलग्न करें। अगला, न्यूरोनल सीमाओं को चिह्नित करने के लिए ब्राइटफील्ड, ट्राईटीसी और प्रतिदीप्ति मार्कर चैनलों के साथ एक एकल अभी भी छवि लें।
  6. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में अब चलाएँ प्रारंभ करें. डाई तीव्रता में भिन्नताओं को बाहर करने के लिए 3-5 मिनट के लिए बेसल रिकॉर्डिंग करें, यदि कोई हो (चरण # 1)।
    नोट: यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि डाई तीव्रता में कोई कमी सिनैप्टिक पुटिका रिलीज के कारण है और निष्क्रिय डाई प्रसार या फोटोब्लीचिंग नहीं है। इस 3-5 मिनट की पूर्व-उत्तेजना अवधि के परिणामस्वरूप एक स्थिर और बनाए रखा डाई तीव्रता स्तर होना चाहिए। इस रिकॉर्डिंग के अंतिम 30 s का उपयोग प्रत्येक ROI के लिए एक माध्य बेसलाइन प्रतिदीप्ति मान निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। प्रयोगात्मक स्थितियों का मूल्यांकन करने से पहले, इच्छित अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके लगभग 10 मिनट की निरंतर रिकॉर्डिंग की एक अतिरिक्त गैर-उत्तेजना की स्थिति को भी विस्तारित अवधि के लिए लेजर सेटिंग्स का उपयोग करके स्थिर प्रतिदीप्ति मूल्यों को सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है।
  7. चरण # 2 पर स्विच पर, परफ्यूजन सिस्टम के लिए बटन पर ट्रिगर करें। फिर, लगातार 50 mM KCl को न्यूरॉन्स को डाई अनलोडिंग (चरण # 2) की सुविधा के लिए perfuse।
    1. KCl के अलावा के बाद 300 s के लिए रिकॉर्डिंग बाहर ले जाएँ. इसके बाद, अधिग्रहण बंद हो जाता है; परफ्यूजन सिस्टम के लिए ऑफ स्विच को ट्रिगर करें।
  8. प्रयोग को सहेजें और confocal सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें जैसा कि नीचे अनुभाग 8 में वर्णित है।
    नोट:: प्रयोग इस बिंदु पर रोका जा सकता है, और विश्लेषण बाद में किया जा सकता है। इस मामले में जहां कोशिकाओं को ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं होती है, इस प्रोटोकॉल को सिनैप्टिक अनलोडिंग की कार्यक्षमता की जांच करने की मांग करते समय विट्रो में किसी भी समय बिंदु पर किया जा सकता है। उचित सिनैप्टिक अनलोडिंग सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण कोशिकाओं के परीक्षण के बाद, प्रयोगकर्ता को पूर्वाग्रह को कम करने के लिए परीक्षण किए गए प्रत्येक डिश की आनुवंशिक या फार्माकोलॉजिक स्थितियों के लिए अंधा किया जाना चाहिए।

7. Gcamp6m कैल्शियम transients के प्रतिदीप्ति इमेजिंग

  1. Gcamp6m के 500 ng के साथ 35 मिमी ग्लास-बॉटम व्यंजनों पर सुसंस्कृत प्राथमिक कृंतक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्ट करें जैसा कि खंड 3 में इंगित किया गया है।
    नोट: यदि वांछित है, तो लाल या दूर-लाल रेंज में एक फ्लोरोसेंट टैग युक्त ब्याज के प्लास्मिड के साथ सह-ट्रांसफेक्ट न्यूरॉन्स।
  2. 15 मिनट 48 ज पोस्ट-अभिकर्मक के लिए कम KCl aCSF के साथ न्यूरॉन्स इनक्यूबेट करें और फिर इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म पर डिश को माउंट करें।
  3. एक FITC फ़िल्टर (488 nm) और एक 20x या 40x उद्देश्य का उपयोग कर GCaMP6m प्रतिदीप्ति विज़ुअलाइज़ करें।
  4. इमेजिंग फ़ील्ड का चयन करें और सही फोकस संलग्न करें। अगला, न्यूरोनल सीमाओं को चिह्नित करने के लिए ब्राइटफील्ड, FITC और प्रतिदीप्ति मार्कर चैनलों के साथ एक एकल अभी भी छवि लें।
  5. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में अब चलाएँ प्रारंभ करें. 5 मिनट के लिए बेसलाइन रिकॉर्डिंग करें, और फिर 50 एमएम केसीएल वाले एसीएसएफ के साथ उसी तरह से परफ्यूज करें जैसा कि स्टाइरिल डाई प्रयोगों के लिए अनुभाग 6 में वर्णित है।
    नोट: इस इमेजिंग का लक्ष्य उत्पन्न कैल्शियम transients को मापने के लिए है। पूर्व-उत्तेजना अवधि के दौरान एक न्यूरॉन में बेसल फायरिंग गतिविधि और कैल्शियम फ्लक्स होना चाहिए, इसका उपयोग डेटा विश्लेषण में नहीं किया जाता है। इसके बजाय, केवल स्थिर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति वाली कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। पोस्ट-उत्तेजना अवधि को कैल्शियम क्षणिकों के लिए 60 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है, अतिरिक्त निरंतर उच्च केसीएल परफ्यूजन के साथ या बिना।
  6. प्रयोग को सहेजें और confocal सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें जैसा कि नीचे अनुभाग 8 में वर्णित है। प्रयोग को इस बिंदु पर रोका जा सकता है, और विश्लेषण बाद में किया जा सकता है।
    नोट: यदि कोशिकाओं को ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं होती है, तो कैल्शियम क्षणिकों की जांच करने की मांग करते समय इस प्रोटोकॉल को विट्रो में किसी भी समय बिंदु पर किया जा सकता है। कैल्शियम क्षणिकों के माप को सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण कोशिकाओं के परीक्षण के बाद, प्रयोगकर्ता को पूर्वाग्रह को कम करने के लिए परीक्षण किए गए प्रत्येक पकवान की आनुवंशिक या फार्माकोलॉजिक स्थितियों के लिए अंधा किया जाना चाहिए।

8. छवि विश्लेषण

  1. Confocal सॉफ़्टवेयर के साथ समय-चूक छवियों को खोलें।
  2. आदेश श्रृंखला द्वारा समय-अंतराल श्रृंखला में छवियों को संरेखित करें: छवि | प्रसंस्करण | वर्तमान दस्तावेज़ संरेखित करें. पहले फ़्रेम में संरेखित करें का चयन करें.
  3. ROI चयन उपकरण का उपयोग करके न्यूराइट्स के साथ ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) का चयन करें, छवि फ्रेम (चित्रा 3 B) के दाईं ओर एक बीन-आकार का आइकन। इसके अलावा, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने वाले एक आरओआई को चिह्नित करें।
    नोट: ROIs को ब्राइटफील्ड अभी भी छवि द्वारा इंगित न्यूरोनल पटरियों के साथ स्पष्ट रूप से अलग किए गए puncta के क्षेत्रों को चुनकर चुना जाता है। विश्लेषण के लिए प्रति न्यूरॉन कम से कम पांच आरओआई चुने जाते हैं। पृष्ठभूमि ROI को दृश्य के क्षेत्र के एक क्षेत्र में चुना जाता है जिसमें न्यूराइट्स शामिल नहीं होते हैं।
  4. निम्न आदेश श्रृंखला का उपयोग कर चयनित ROIs के लिए समय के साथ कच्चे प्रतिदीप्ति को मापें: | समय मापन.
    1. समय माप पैनल के ऊपरी भाग पर माप फ़ंक्शन प्रारंभ करें। समय के साथ कच्चे प्रतिदीप्ति का एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व (चित्रा 3 सी) और मात्रात्मक डेटा दोनों उत्पन्न होते हैं।
      नोट:: प्रत्येक डेटा बिंदु उस विशिष्ट मापा समय बिंदु के साथ संबद्ध फ़्रेम के लिए उस ROI के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है।
  5. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्यात करें।
  6. स्वतंत्र रूप से प्रत्येक ROI का विश्लेषण करें। सबसे पहले, प्रत्येक समय बिंदु पर ब्याज तीव्रता के ROI से पृष्ठभूमि ROI तीव्रता घटाकर डेटा को सामान्य करें।
    1. प्रत्येक विशिष्ट समय बिंदु पर पृष्ठभूमि ROI से कच्चे प्रतिदीप्ति मान ले लो और उस समय बिंदु पर ब्याज कच्चे तीव्रता मूल्य के ROI से यह घटाना।
      नोट: यह बेसल और उत्तेजना चरणों दोनों, पूरी रिकॉर्डिंग अवधि के लिए किया जाता है।
  7. बेसलाइन के अंतिम 30 s के लिए ब्याज तीव्रता का औसत ROI निर्धारित करें।
    1. 3-5 मिनट बेसल रिकॉर्डिंग अवधि के अंतिम 30 s से चरण 8.6 में उत्पन्न सामान्यीकृत कच्चे बेसल मानों का औसत।
      नोट:: बेसल रिकॉर्डिंग की पूरी अवधि इस मान को जनरेट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, जैसा कि यह मान स्थिर हो जाता है और बनाए रखा जाता है, अंतिम 30 s के 60-समय बिंदु पूरे का प्रतिनिधित्व करने के लिए पर्याप्त नमूना आकार के होते हैं।
  8. इस आधार रेखा मान की तुलना प्रत्येक समय बिंदु पर सामान्यीकृत तीव्रता मान से करें, जिससे प्रतिदीप्ति (ΠF) मान में परिवर्तन उत्पन्न होता है.
    1. चरण 8.7 से मान लें और औसत बेसलाइन फ्लोरोसेंट मान घटाएं। यह और पूरी रिकॉर्डिंग अवधि के लिए बाद के चरणों, दोनों बेसल और उत्तेजना चरणों के लिए करते हैं।
  9. बेसलाइन प्रतिदीप्ति मान से संबंधित इस परिवर्तन की गणना करें, प्रतिदीप्ति / बेसलाइन प्रतिदीप्ति (ΠF / F) में परिवर्तन उत्पन्न करता है। ऐसा करने के लिए, चरण 8.8 से मान लें और इसे औसत बेसलाइन फ्लोरोसेंट मान से विभाजित करें।
  10. अंत में, प्रारंभिक बिंदु मान को 1 पर सेट करें ताकि समय के साथ बढ़ता या घटता है, आसानी से रेखांकन रूप से देखा जा सके।
    1. चरण 8.9 में जनरेट किया गया मान लें और 1 जोड़ें।
      नोट:: जब यह ठीक से किया जाता है, तो आधार रेखा अवधि मान के 30 s 1 के मान के पास होवर करना चाहिए। प्रभावी रूप से सिनैप्टिक सामग्री जारी करने वाली कोशिकाओं में, इस मान को उत्तेजना की शुरुआत के बाद 1 से 0 तक ट्रेंड करना चाहिए। चरण 6-9 का एक उदाहरण चित्र 3E में प्रस्तुत किया गया है।

9. डेटा विश्लेषण

नोट:: प्रयोगकर्ता को उचित रूप से विश्लेषण के लिए डेटा पूल करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अनब्लाइंड किया जा सकता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों में से प्रत्येक से प्रति स्थिति कम से कम 10 न्यूरॉन्स के नमूना आकार का उपयोग करें। केवल शामिल करने के लिए न्यूरॉन्स पर विचार करें यदि कम से कम पांच आरओआई क्षेत्रों को नामित किया जा सकता है। प्रयोगात्मक प्रतिकृति का यह स्तर प्रकाशित अध्ययनों में पर्याप्त था ताकि एएलएस से संबंधित पॉली-जीए-युक्त कोशिकाओं बनाम जीएफपी नियंत्रणों में सिनैप्टिक अनलोडिंग के गहन नुकसान को प्रदर्शित किया जा सके ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)। हालांकि, यदि अधिक सूक्ष्म फेनोटाइप देखा जाता है, तो जैविक और / या तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या को उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

  1. किसी दिए गए प्रयोगात्मक स्थिति के ROIs से समय के साथ सभी परिकलित ΠF/F मानों का उपयोग करते हुए, SEM के साथ-साथ प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक माध्य ΠF/F मान निर्धारित करें।
  2. XY-प्रारूप में एक ग्राफिंग और सांख्यिकी सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके डेटा प्लॉट करें, जहां x बीतने वाला समय है, और y चरण 9.1 में परिकलित ΠF/F मान है। SEM के ± माध्य के रूप में सभी मानों को प्रस्तुत करें।
  3. सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए, दो समूहों की तुलना करने के लिए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करें और तीन या अधिक समूहों की तुलना के लिए टुकी के पोस्टहॉक विश्लेषण के बाद विचरण (एनोवा) के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग करें।

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Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के बाद, प्रतिनिधि परिणाम एक ठेठ स्टाइरिल डाई सिनैप्टिक पुटिका रिलीज प्रयोग के लिए दिखाए जाते हैं। सुसंस्कृत चूहे प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को खंड 6 में वर्णित विधि का उपयोग करके डाई के साथ लोड किया गया था। डाई लोडिंग की विशिष्टता सिनैप्टिक पुटिका मार्कर synaptophysin के साथ सह-लेबलिंग द्वारा निर्धारित की गई थी। स्टाइरिल डाई सकारात्मक puncta के बहुमत इस मार्कर (चित्रा 2A) के लिए सह-सकारात्मक हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या स्टायरिल डाई इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स फोटोब्लीचिंग का कारण बनती हैं, आमतौर पर, एक अनुपचारित अच्छी तरह से डाई के साथ लोड किया जाता है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रतिदीप्ति मान स्थिर रहें, यह सुनिश्चित करने के लिए उत्तेजना के बिना एक विस्तारित 10 मिनट की अवधि के लिए चित्रित किया जाता है।

इसके अतिरिक्त, परिणाम फिर से synaptophysin और styryl डाई के सह-लेबलिंग का उपयोग करके दिखाए जाते हैं जैसा कि चित्र 2A में है। इन fluorophores सह-TRITC स्टाइरिल डाई इमेजिंग के लिए अनुभाग 6 में इंगित प्रतिमान का उपयोग कर छवि बनाई गई थी, साथ ही dapi चैनल पर उच्च तीव्रता लेजर शक्ति का उपयोग कर synaptophysin प्रतिदीप्ति के दोहरे कब्जा mTurquoise-synaptophysin कल्पना करने के लिए। दिखाया गया है कि सिनैप्टिक क्षेत्रों की प्रतिनिधि छवियां पूर्व और बाद की उत्तेजना (चित्रा 2 बी)। हालांकि यह विधि फोटोब्लीचिंग की कमी के लिए एक अप्रत्यक्ष अनुमान है, पूरे इमेजिंग अवधि में कच्चे तीव्रता मूल्यों के विश्लेषण से पता चलता है कि synaptophysin तीव्रता स्थिर रहती है, जबकि स्टाइरिल डाई तीव्रता उत्तेजना के बाद नीचे जाती है (चित्रा 2 सी)। इस प्रकार, इस प्रयोग और उत्तेजना से पहले स्थिर प्रतिदीप्ति के हमारे अन्य नियंत्रणों को लेते हुए और गैर-उत्तेजना कुओं में विस्तारित अवधि में, हमने स्थापित किया है कि स्टाइरिल प्रतिदीप्ति में कमी को फोटोब्लीचिंग प्रभावों के बजाय केसीएल विध्रुवीकरण के माध्यम से सिनैप्टिक अनलोडिंग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: styryl डाई लेबलिंग की विशिष्टता और इमेजिंग मापदंडों का आकलन। (ए) एक स्टायरिल डाई-लेबल वाले चूहे कॉर्टिकल न्यूरॉन (लाल) की एक प्रतिनिधि 40x छवि, जिसे 24 घंटे पहले एक प्लास्मिड के साथ ट्रांसफेक्टेड किया गया था ताकि mTurquoise2-synaptophysin61 को व्यक्त किया जा सके, जो सिनेप्सिन प्रमोटर (हरे रंग) से दूर चला गया था। इन दो fluorophores के colocalization इंगित करता है कि styryl डाई सकारात्मक puncta के एक बड़े बहुमत synaptic पुटिका मार्कर synaptophysin के साथ सह-दाग कर रहे हैं। स्केल बार 5 μm इंगित करता है। (बी) कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्टेड किया गया था और स्टायरिल डाई को (ए) के रूप में लोड किया गया था और स्टायरिल डाई प्रतिमान के अनुसार चित्रित किया गया था, साथ ही डीएपीआई चैनल पर mTurquoise-synaptophysin के दोहरे प्रतिदीप्ति कैप्चर के साथ। प्रतिनिधि छवियों synaptophysin और styryl डाई puncta क्षेत्रों पूर्व और बाद उत्तेजना दिखा रहे हैं. स्केल बार 5 μm इंगित करता है। (सी) प्रतिदीप्ति synaptophysin (DAPI चैनल शीर्ष) और styryl डाई (FITC चैनल नीचे) के लिए समय के साथ निगरानी की गई थी। Synaptophysin तीव्रता इमेजिंग और उत्तेजना अवधि पर एक स्थिर प्रतिदीप्ति पर बनाए रखा गया था, जबकि स्टायरिल डाई प्रतिदीप्ति में कमी आई क्योंकि डाई उत्तेजना पर उतार दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रतिनिधि छवियां आरओआई (चित्रा 3 ए-बी) के चयन के साथ इमेजिंग के दौरान स्टाइरिल डाई की लोडिंग दिखाती हैं। चयनित ROIs और एक पृष्ठभूमि ROI की कच्ची प्रतिदीप्ति तीव्रता confocal सॉफ्टवेयर (चित्रा 3C) का उपयोग कर प्लॉट कर रहे हैं. यहां दिखाए गए न्यूरॉन्स को C9ORF72-ALS के संदर्भ में उत्पादित डाइपेप्टाइड प्रोटीन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्लास्मिड के साथ भी संक्रमित किया गया था, अर्थात्, FLAG-eGFP और FLAG-GA50-eGFP T7 प्रमोटर से दूर चला गया। सफल synaptic पुटिका रिलीज एक GFP-transfected नियंत्रण न्यूरॉन के लिए उच्च KCl विध्रुवीकरण (चित्रा 3 डी, शीर्ष दो पैनलों) पर डाई प्रतिदीप्ति के हड़ताली नुकसान में परिणाम. यहां शामिल एक प्रतिनिधि वीडियो दर्शाता है कि इमेजिंग के दौरान यह कैसे दिखाई देता है। इसके अलावा, एक न्यूरॉन चुनिंदा रूप से उत्तेजना के बाद एक न्यूराइट क्षेत्र में स्टाइरिल डाई को अनलोड करता है (वीडियो 1)।

दूसरी ओर, बिगड़ा हुआ सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को एक C9ORF72-लिंक्ड डाइपेप्टाइड दोहराने के निर्माण (GA50) (चित्रा 3 डी, नीचे दो पैनलों) 43 के साथ ट्रांसफेक्ट किए गए न्यूरॉन्स में उच्च KCl विध्रुवीकरण के बाद भी बरकरार डाई प्रतिदीप्ति द्वारा दर्शाया जाता है। मात्रात्मक डेटा विश्लेषण (चित्रा 3E) के बाद, डेटा को नियंत्रण (GFP) और ALS / FTD (GA50) समूहों (चित्रा 3F) 43 के लिए इमेजिंग के दौरान डाई तीव्रता के रूप में दर्शाया जाता है। यह विधि मध्यवर्ती प्रभावों को भी पार्स कर सकती है और केवल एक "सभी या कुछ भी नहीं" बाइनरी माप नहीं है। GA50 द्वारा मध्यस्थता किए गए सिनैप्टिक घाटे को बचाने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों में, बहिर्जात सिनैप्टिक पुटिका से जुड़े प्रोटीन 2 (SV2) को rSV2a-eGFP-pRRL प्लास्मिड का उपयोग करके lentiviral transduction द्वारा पेश किया गया था जो मानव PGK प्रमोटर से संचालित होता है। इमेजिंग और विश्लेषण के बाद जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, सिनैप्टिक फायरिंग को न्यूरॉन्स में सह-अभिव्यक्त GA50 और SV2 (चित्रा 3 G) में बचाया गया था।

Figure 3
चित्रा 3: स्टाइरिल डाई लेबलिंग के माध्यम से सिनैप्टिक पुटिका रिलीज का मूल्यांकन करना। (ए) इमेजिंग प्रयोग की शुरुआत में कम केसीएल एसीएसएफ मीडिया में एक स्टाइरिल डाई-लेबल न्यूरॉन की एक प्रतिनिधि 40x छवि। स्केल बार 20 μm इंगित करता है। (बी) (ए) से छवि पर आरओआई पीढ़ी का चित्रण। न्यूराइट्स (# 1-4) के साथ विशिष्ट puncta क्षेत्रों को ROI उपकरण का उपयोग करके चुना जाता है, बीन के आकार का बटन दाईं ओर हाइलाइट किया गया है। पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता को कैप्चर करने के लिए एक रिक्त क्षेत्र में एक अंतिम ROI (# 5) का चयन किया जाता है। गैर-विशिष्ट, गैर-न्यूरोनल उज्ज्वल धब्बों वाले क्षेत्रों से बचा जाता है। स्केल बार 20 μm इंगित करता है। (ग) आरओआई # 1-5 के लिए सिग्नल तीव्रता का प्रतिनिधित्व (बी) से समय के साथ जैसा कि कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर द्वारा ग्राफ/ चित्रित किया गया है। (डी) आरओआई क्षेत्रों के दृश्य प्रतिनिधित्व एक न्यूरॉन के लिए पूर्व / पोस्ट-उत्तेजना जो प्रभावी रूप से सिनैप्टिक ट्रांसमिशन (शीर्ष दो पैनलों) से गुजरता है। नीचे दो पैनलों को एक निष्पक्ष दहलीज के साथ ज़ूम की गई छवियों को अलग-अलग क्षेत्रों को नेत्रहीन रूप से दिखाने के लिए पृष्ठभूमि से पंक्टा को अलग करने के लिए लागू किया जाता है। जीएफपी युक्त न्यूरॉन्स प्रभावी रूप से सिनैप्टिक रिलीज से गुजरते हैं, जबकि C9ORF2-ALS से संबंधित पेप्टाइड GA50 की अभिव्यक्ति इस प्रभाव को रोकती है। स्केल सलाखों को इंगित करता है 10 μm-जेन्सेन एट अल. 202043 से पुनर्मुद्रित. (ई) स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक परिमाणीकरण फ़ाइल का उदाहरण, जो आधार रेखा के लिए मूल्यों के सामान्यीकरण और समय के साथ ΠF/ F मानों की पीढ़ी को दर्शाता है। डेटा को पहले प्रत्येक समय बिंदु पर पृष्ठभूमि ROI तीव्रता मान के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। इस मान की तुलना तब पिछले 30 s पूर्व-उत्तेजना के लिए ब्याज बेसलाइन मान के औसत ROI से की जाती है (यहां सादगी के लिए 1 s अंतराल में 10 s के रूप में दिखाया गया है) (ΠF)। इस परिवर्तन की गणना बेसलाइन प्रतिदीप्ति (ΠF/F) के एक अंश के रूप में की जाती है। अंत में, प्रारंभिक बिंदु मान को 1 पर सेट किया गया है ताकि समय के साथ बढ़ता या घटता है, आसानी से रेखांकन रूप से कल्पना की जा सके। प्रति न्यूरॉन कम से कम पांच puncta क्षेत्रों और प्रति प्रयोगात्मक स्थिति में कम से कम दस न्यूरॉन्स एकत्र किए जाते हैं, इस तरह के डेटा के साथ प्रत्येक समय बिंदु पर औसत माप उत्पन्न करने के लिए संयुक्त। (एफ) स्प्रेडशीट फ़ाइल से डेटा जैसे कि (ई) को ग्राफिंग और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में ले जाया जाता है। यहाँ दिखाए गए ग्राफ़ के लिए, एक प्रयोगात्मक स्थिति के सभी puncta क्षेत्रों पर औसत प्रत्येक समय बिंदु पर ΠF/F मान को माध्य की मानक त्रुटि के साथ प्लॉट किया गया है। यहां ग्राफ जीएफपी बनाम GA50 प्रयोगों से डेटा है जो (डी) में इंगित किया गया है, जहां बेसलाइन के अंतिम 10 एस और उत्तेजना अवधि के पहले 10 एस को जेन्सेन एट अल 202043 से पुनर्मुद्रित दिखाया गया है। (जी) इस परख मध्यवर्ती synaptic रिलीज के लिए घटता का उत्पादन कर सकते हैं और बस एक "सभी या कुछ भी नहीं" प्रतिक्रिया नहीं है. GA50 को बहिर्जात सिनैप्टिक प्रोटीन SV2 (synaptic vesicle-associated protein 2) के साथ सह-व्यक्त किया गया था, और स्टाइरिल डाई इमेजिंग और विश्लेषण पिछले चरणों में इंगित किए गए अनुसार किया गया था। जैसा कि चित्र 3F में दिखाया गया है, यहां दिखाया गया ग्राफ एक प्रयोगात्मक स्थिति के सभी पंक्टा क्षेत्रों पर औसत प्रत्येक टाइमपॉइंट पर ΠF / F मान का प्रतिनिधित्व करता है, साथ ही माध्य की मानक त्रुटि के साथ प्लॉट किया गया है। ग्राफ बेसलाइन के अंतिम मिनट और जेन्सेन एट अल से उत्तेजना अवधि के पहले मिनट को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: styryl डाई इमेजिंग प्रयोग के प्रतिनिधि वीडियो. दिखाया गया है एक cortical न्यूरॉन styryl डाई के साथ भरी हुई का एक प्रतिनिधि वीडियो है. वीडियो उच्च KCl aCSF के स्नान परफ्यूजन के समय शुरू होने वाली अवधि को दिखाता है। बॉक्स्ड क्षेत्र समय के साथ पंक्टा प्रतिदीप्ति के अवलोकन योग्य नुकसान के साथ न्यूराइट्स पर प्रकाश डालता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुभाग 7 में वर्णित विधि के बाद, दिखाया गया है कि कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां हैं जो KCl विध्रुवीकरण (चित्रा 4 A) से पहले और बाद में GcaMP6m के साथ transfected हैं। कच्चे तीव्रता रेखांकन में वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति मूल्यों को दिखाया गया है जो उतार-चढ़ाव करते हैं, जो KCl-प्रेरित विध्रुवीकरण (चित्रा 4 B) के बाद न्यूराइट्स में कैल्शियम प्रवेश का संकेत देते हैं। यह दूसरा प्रतिनिधि वीडियो इस प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए रिकॉर्डिंग बेसलाइन अवधि के अंत में कम प्रतिदीप्ति के साथ GcaMP6m व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स को दिखाता है। उत्तेजना की शुरुआत में, न्यूरॉन्स एक नाटकीय प्रतिदीप्ति वृद्धि (वीडियो 2) प्रदर्शित करते हैं। इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग उत्परिवर्ती एफयूएस-एएलएस मॉडल में कैल्शियम-प्रवेश परिवर्तनों को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है। इस मॉडल में एस्ट्रोसाइट्स को सीएमवी-प्रमोटर-संचालित ईजीएफपी-एफयूएस प्लास्मिड वाले एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। जब उत्परिवर्ती एफयूएस-व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स से वातानुकूलित माध्यम को मोटर न्यूरॉन्स पर रखा गया था, तो α-अमीनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलप्रोपियोनिक एसिड (एएमपीए) + साइक्लोथियाजाइड उत्तेजना (चित्रा 4 सी) 44 के बाद गैर-उत्परिवर्ती एफयूएस स्थितियों की तुलना में कैल्शियम की आमद में वृद्धि देखी गई थी। इस परख की संवेदनशीलता के साथ और कैल्शियम के बिना परफ्यूजन माध्यम में शामिल प्रयोगों का प्रदर्शन करके परीक्षण किया गया है. ऊपर उल्लिखित जीएफपी बनाम GA50 की सेटिंग में, मोटर न्यूरॉन्स युक्त GA50 में बढ़े हुए पीक कैल्शियम क्षणिकों को देखा गया था। विशेष रूप से, यह सेल में आने वाले कैल्शियम पर निर्भर करता है, न कि आंतरिक कैल्शियम भंडार की रिहाई पर। जब कैल्शियम को उत्तेजक एसीएसएफ माध्यम से हटा दिया गया था, तो प्रयोगात्मक स्थिति (चित्रा 4 डी) 43 में कोई कैल्शियम क्षणिक प्रतिक्रियाओं को नोट नहीं किया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: GCaMP पत्रकारों का उपयोग करके वास्तविक समय में कैल्शियम क्षणिकों का अवलोकन करना। (A) GCaMP6m की एक 40x छवि न्यूरॉन को व्यक्त करती है, जीएफपी प्रतिदीप्ति की तीव्रता दिखाने के लिए छद्म रंग की (नीले रंग में कम से लाल रंग में उच्च)। बाएं हाथ के पैनल दृश्य पूर्व और बाद की उत्तेजना के पूरे 40x क्षेत्र को दिखाते हैं। स्केल बार 20 μm इंगित करता है। दाईं ओर की छवियों को बॉक्स किए गए क्षेत्रों के ज़ूम किए गए संस्करणों से पता चला है। इन छवियों के माध्यम से, यह आंखों से स्पष्ट है कि उत्तेजना के बाद फोकल न्यूरिटिक कैल्शियम के स्तर में एक मजबूत वृद्धि हुई है। स्केल बार 12 μm को इंगित करता है। (बी) आरओआई चयन और पूरे प्रयोग के दौरान प्रतिदीप्ति तीव्रता की निगरानी चित्र 3 के रूप में की जाती है। जीसीएएमपी 6 एम प्रतिदीप्ति निगरानी से गुजरने वाले न्यूरॉन के दो चयनित आरओआई के लिए बेसलाइन के अंतिम 30 एस और 1 मिनट की उत्तेजना यहां दिखाई गई है। स्टाइरिल डाई इमेजिंग के विपरीत, न्यूरोनल उत्तेजना के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि यहां उल्लेख किया गया है, कैल्शियम क्षणिक समय के साथ न्यूराइट्स में उतार-चढ़ाव करते हैं; इसलिए, परिणाम आमतौर पर प्रत्येक ROI क्षेत्र के लिए औसत चोटी सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति परिवर्तन मान के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। (सी) इस तरह के प्रयोग के प्रतिनिधि परिमाणीकरण को दिखाया गया है जैसा कि किआ-मैकएवॉय एट अल 201844 में प्रकाशित किया गया था, जहां प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स जो उत्परिवर्ती एफयूएस-एएलएस एस्ट्रोसाइट्स से व्युत्पन्न supernatant प्राप्त करते हैं, एएमपीए रिसेप्टर उत्तेजना के बाद कैल्शियम की काफी वृद्धि हुई है, एस्ट्रोसाइट्स को व्यक्त करने वाले जंगली-प्रकार के एफयूएस से supernatant प्राप्त करने वाले न्यूरॉन्स की तुलना में। (डी) कैल्शियम क्षणिक इमेजिंग का प्रतिनिधि परिमाणीकरण जहां कैल्शियम को उत्तेजक एसीएसएफ में शामिल नहीं किया गया था। दिखाया गया है कि mCherry बनाम GA50-mCherry की स्थिति उच्च KCl aCSF के साथ या बिना कैल्शियम के साथ प्रेरित है जैसा कि जेन्सेन एट अल. 202043 में प्रकाशित किया गया है। GA50 युक्त न्यूरॉन्स mCherry युक्त कोशिकाओं की तुलना में वृद्धि हुई चोटी कैल्शियम प्रवाह प्रदर्शित किया. या तो प्रयोगात्मक स्थिति में आंतरिक कैल्शियम के स्तर की कोई ऊंचाई नहीं थी जब कैल्शियम को उच्च केसीएल एसीएसएफ को उत्तेजित करने से हटा दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2: GCaMP कैल्शियम क्षणिक प्रयोग के प्रतिनिधि वीडियो. दिखाया गया है कि GCaMP6m के साथ transfected cortical न्यूरॉन्स के एक क्षेत्र का एक प्रतिनिधि वीडियो है। एक आधार रेखा अवधि के बाद, एक बड़ा कैल्शियम प्रवाह 6 s चिह्न पर नोट किया जाता है जब उच्च KCl aCSF लागू किया गया था। कैल्शियम प्रविष्टि को या तो पूरे सेल के लिए, या विशिष्ट न्यूराइट क्षेत्रों में मापा जा सकता है जैसा कि वर्णित है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

संभावित समस्याएं संभावित कारण / समाधान
1 गैर-विशिष्ट लोड हो रहा है लोडिंग समय के साथ सटीक रहें। लंबे समय तक लोड िंग समय के परिणामस्वरूप एंडोसोम और लाइसोसोम में FM4-64 की गैर-विशिष्ट लोडिंग होती है
2 नियंत्रण न्यूरॉन्स में कोई प्रशंसनीय एक्सोसाइटोसिस नहीं उच्च KCl aCSF समाधान के pH की जाँच करें।
3 फोकस और पार्श्व बहाव की हानि सुनिश्चित करें कि सही ध्यान केंद्रित किया गया है। Nikon सॉफ्टवेयर या ImageJ प्लगइन का उपयोग कर इमेजिंग के बाद छवियों को संरेखित करें.
4 FM4-64 प्रतिदीप्ति का विरंजन इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर तीव्रता की जाँच करें। हमेशा सबसे कम संभव तीव्रता का उपयोग करने का प्रयास करें। पुष्टि करें कि उपयोग की जाने वाली लेजर तीव्रता के परिणामस्वरूप परीक्षण रन चलाकर ब्लीचिंग नहीं होती है।

तालिका 2: संभावित समस्याओं और styryl डाई प्रयोगों के लिए समस्या निवारण. समस्याओं और synaptic अनलोडिंग प्रयोगों के लिए सामान्य समस्या निवारण के लिए विशिष्ट परिदृश्य।

संभावित समस्याएं संभावित कारण / समाधान
1 अभिकर्मक दक्षता बहुत कम न्यूरोनल स्वास्थ्य की जाँच करें। यदि न्यूरॉन्स को ट्रांसफ़ेक्ट करना मुश्किल है, तो कोई भी एएवी या जीसीएएमपी के लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन पर स्विच कर सकता है।
2 नाभिक में GCaMP6 प्रतिदीप्ति का संचय समझौता न्यूरोनल स्वास्थ्य. अभिकर्मक प्रोटोकॉल की जाँच करें.
3 फोकस और पार्श्व छवि बहाव की हानि सुनिश्चित करें कि सही ध्यान केंद्रित किया गया है। Nikon सॉफ्टवेयर या ImageJ प्लगइन का उपयोग कर इमेजिंग के बाद छवियों को संरेखित करें.
4 केसीएल उत्तेजना पर कोई कैल्शियम प्रतिक्रिया नहीं सुनिश्चित करें कि एसीएसएफ का पीएच सही है।
5 GCaMP6 प्रतिदीप्ति का विरंजन इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर तीव्रता की जाँच करें। हमेशा सबसे कम संभव तीव्रता का उपयोग करने का प्रयास करें। पुष्टि करें कि उपयोग की जाने वाली लेजर तीव्रता के परिणामस्वरूप परीक्षण रन चलाकर ब्लीचिंग नहीं होती है।
6 न्यूराइट्स का ब्लेबिंग अभिकर्मक के कारण समझौता न्यूरोनल स्वास्थ्य। न्यूरोनल संस्कृतियों के एक नए बैच का उपयोग करें।

तालिका 3: संभावित समस्याओं और neurites में कैल्शियम transients इमेजिंग के लिए समस्या निवारण. समस्याओं और GCaMP कैल्शियम क्षणिक प्रयोगों के लिए सामान्य समस्या निवारण के लिए विशिष्ट परिदृश्य।

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Discussion

वर्णित दोनों तरीकों के लिए सामान्य तीन कदम प्रयोगात्मक सफलता और मात्रात्मक परिणामों के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं। सबसे पहले, प्रयोगों के प्रत्येक दौर से पहले ताजा एसीएसएफ की तैयारी आवश्यक है, संलग्न निर्देशों का पालन करते हुए। ऐसा करने में विफलता उचित न्यूरोनल विध्रुवीकरण को रोक सकती है। अनुपचारित नियंत्रण न्यूरॉन्स के एक नमूने को उचित सेलुलर विध्रुवीकरण सुनिश्चित करने और उस इमेजिंग सत्र में प्राप्त सकारात्मक परिणामों के लिए एक बेंचमार्क प्रदान करने के लिए किसी भी प्रयोगात्मक समूहों की उत्तेजना से पहले लगातार परीक्षण किया जाना चाहिए। दूसरा, विशिष्ट सिनैप्टिक क्षेत्रों के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति को सफलतापूर्वक ट्रैक करने के लिए, निगरानी के लिए इमेजिंग पैरामीटर और आरओआई के क्षेत्रों की स्थापना करते समय विशेष देखभाल भी की जानी चाहिए। बेसलाइन अवधि रिकॉर्डिंग को तुरंत उत्तेजना रिकॉर्डिंग अवधि में संक्रमण करना चाहिए। स्टाइरिल डाई रिलीज की एकल-क्षय गतिशीलता को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त रूप से तेजी से फ्रेम दर (2 छवियों / एस) की आवश्यकता होती है। अंत में, प्रयोग के विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम प्रतिदीप्ति माप का सामान्यीकरण है जो पहले इमेजिंग पृष्ठभूमि के लिए और फिर पूर्व-उत्तेजित आधार रेखा के लिए है। अन्य इमेजिंग प्रोटोकॉल के साथ, एक खाली इमेजिंग क्षेत्र का घटाव पहले किसी भी पृष्ठभूमि autofluorescence है कि KCl मीडिया के अलावा पेश कर सकते हैं को हटाने के लिए सभी युग्मित समय-प्रतिदीप्ति माप भर में प्रदर्शन किया जाता है। उत्तेजना से पहले पिछले 30 एस बेसलाइन से प्रत्येक आरओआई के लिए औसत प्रतिदीप्ति पढ़ने को मापना और गणना करना भी आवश्यक है। इस औसत प्रारंभिक मान का उपयोग तब उस ROI के लिए सभी समय मापों में "बेसलाइन से परिवर्तन" तीव्रता को मापने के लिए एक परिभाषित प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जाता है।

प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृति बहिर्जात डीएनए के साथ ट्रांसफेक्ट करना कुख्यात रूप से मुश्किल है, और यहां तक कि अनुकूलित प्रोटोकॉल अक्सर संस्कृति में कुल कोशिकाओं की कम दक्षता पैदा करते हैं। अभिकर्मक दक्षता का 20% -25% आमतौर पर हमारी न्यूरोनल संस्कृतियों में प्राप्त किया जाता है, जिसमें अभिकर्मक-प्रेरित विषाक्तता का कोई सबूत नहीं होता है। जबकि जीसीएएमपी युक्त कोशिकाओं में काफी सुसंगत अभिव्यक्तियों को देखा जाता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर जांच अभिव्यक्ति के अलग-अलग स्तरों को उस आधार रेखा की तुलना में बेसलाइन प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के व्यक्तिगत क्षेत्र परिमाणीकरण की विधि के आधार पर माना जाता है। हालांकि, इस अपेक्षाकृत कम दक्षता के साथ, जीसीएएमपी रिपोर्टर को पेश करने के अभिकर्मक-आधारित तरीकों का उपयोग करना उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग अध्ययनों के लिए बड़े पैमाने पर जैविक प्रतिकृति के लिए पर्याप्त मजबूती नहीं है। इसे दूर करने के लिए, कई वेरिएंट निर्माण व्यावसायिक रूप से लेंटिवायरल या एडेनोवायरल पैकेजिंग या सेल-वंश विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध हैं, जो उच्च ट्रांसडक्शन क्षमता के लिए अनुमति देगा। एक प्राथमिक संशोधन जो इन प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय वांछित हो सकता है, वह KCl62 के स्नान अनुप्रयोग के बजाय न्यूरॉन्स के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना का उपयोग करना है। अब उपलब्ध चैनलरोडोप्सिन के परिवारों में से एक को व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किए गए लेंटिवरल निर्माणों के साथ ट्रांसडक्शन, प्रकाश के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ सक्रियण के बाद, न्यूरॉन्स के सबसेट के विध्रुवीकरण के लिए स्थानिक नियंत्रण के लिए और दोहराए जाने वाले कैल्शियम प्रवाह स्तरों पर कार्रवाई क्षमता की ट्रेनों के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए भी अनुमति देता है और सिनैप्टिक पुटिका भंडार की कमी 63 . हालांकि, यह ध्यान में रखना आवश्यक है कि इस विधि का उपयोग वर्तमान में कुछ हद तक सीमित है, क्योंकि उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि उनके ऑप्टोजेनेटिक रिपोर्टर, सिनैप्टिक रिपोर्टर और किसी भी अतिरिक्त बहिर्जात रूप से पेश किए गए प्रोटीन में उपयोग किए गए फ्लोरोफोर के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप नहीं है। स्टाइरिल डाई का उपयोग करके एक सामान्य समस्या निवारण समस्या बेसलाइन रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान निष्क्रिय तीव्रता में कमी है। प्रयोगात्मक अध्ययनों से पहले, फोटोब्लीचिंग प्रभावों को कम करने के लिए लेजर तीव्रता और फोटो कैप्चर अंतराल को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। प्रयोगों पर विचार करने के लिए, बेसलाइन अवधि के कम से कम अंतिम 30 सेकंड के लिए तीव्रता का स्थिरीकरण आवश्यक है। सामान्य समस्याओं के लिए तालिका 2 और तालिका 3 और क्रमशः स्टाइरिल डाई और कैल्शियम क्षणिक प्रयोगों के लिए उनके समाधान देखें।

इन दो तरीकों की प्राथमिक सीमा यह है कि संस्कृतियों को केवल एक ही उदाहरण में उत्तेजित और जांचा जा सकता है। चूंकि स्नान आवेदन का उपयोग विध्रुवीकरण एजेंट KCl को पेश करने के लिए किया जाता है, इसलिए उस डिश में उस स्थिति से जांच किए जाने वाले सभी न्यूरॉन्स को माइक्रोस्कोप उद्देश्य के दृश्य के प्रारंभिक क्षेत्र के भीतर होना चाहिए। यदि समय के साथ कार्यक्षमता ब्याज की है, तो युग्मित संस्कृतियों की आवश्यकता होती है। हालांकि, ऊपर उल्लिखित ऑप्टोजेनेटिक विधि कैल्शियम गतिशीलता को वांछित होने पर समय के साथ मनाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यदि न्यूरॉन्स में सिनैप्टिक पुटिकाओं के रीसाइक्लिंग में दोष है, तो स्टाइरिल डाई की प्रारंभिक लोडिंग बिगड़ा हुआ होगा। जबकि आंतरिक तीव्रता सामान्यीकरण स्थितियों में तुलना के लिए अनुमति देता है, प्रतिक्रियाओं के परिमाणों में मामूली अंतर का पता लगाना मुश्किल हो सकता है। अंत में, इन पत्रकारों के नए पुनरावृत्तियों तेजी से उपलब्ध हो गए हैं और तेजी से पता लगाने के समय या अधिक मजबूत परिणामों के लिए बाहर स्विच किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, GCaMP6m को अब सिनैप्टिक टर्मिनलों पर कैल्शियम क्षणिकों का सबसे तेज़ रिपोर्टर नहीं माना जाता है। इसके बजाय, कोई भी नवीनतम पीढ़ी jGCaMP864 का उपयोग कर सकता है।

यहां वर्णित तरीके यह निर्धारित करने का एक तेज़ और विश्वसनीय तरीका है कि न्यूरॉन्स के आनुवंशिक या औषधीय हेरफेर कार्यात्मक सिनैप्टिक सिग्नलिंग और रिलीज को परेशान करते हैं या नहीं। विस्तृत प्रयोग पारंपरिक वोल्टेज / वर्तमान क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और कम महंगे हैं। इसके अतिरिक्त, जबकि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रकृति द्वारा कम थ्रूपुट और व्यक्तिगत सेल स्तर पर है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट और तेजी से हैं, जिससे कई न्यूरॉन्स को एक साथ इमेजिंग करने और कई पुनरावृत्तियों को एक ही इमेजिंग सत्र में निष्पादित करने की अनुमति मिलती है। यह प्रस्तावित है कि इन कैल्शियम गतिशीलता और सिनैप्टिक रिलीज प्रतिमानों का उपयोग एएलएस मॉडल में सिनैप्टिक ट्रांसमिशन परिवर्तन के पहले संकेतक और न्यूरोनल अपघटन के अन्य रूपों के अध्ययन के रूप में किया जाना चाहिए। हालांकि Gcamp6m और styryl डाई इमेजिंग से प्राप्त निष्कर्ष ठीक से सिनैप्टिक डिसफंक्शन के एक विशिष्ट तंत्र को चिढ़ा नहीं सकते हैं, इस तरह के निष्कर्षों के आधार पर, शोधकर्ता तब शामिल चैनलों, सिनैप्टिक पुटिका संख्या, या क्वांटल सामग्री को निर्धारित करने के लिए पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके लक्षित, साक्ष्य-आधारित पूरक अध्ययन कर सकते हैं।

इन प्रोटोकॉल में उपयोगिता उचित विध्रुवीकरण-मध्यस्थता कैल्शियम प्रवाह और / या विशिष्ट एएलएस मॉडल में सिनैप्टिक पुटिका संलयन में परिवर्तन का तेजी से और सीधा मूल्यांकन है। हमने हाल ही में एक प्रकाशन में इसका प्रदर्शन किया है जिसमें कैल्शियम की आमद में वृद्धि हुई है और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में सिनैप्टिक अनलोडिंग को रद्द कर दिया गया है, जो डाइपेप्टाइड प्रोटीन (ग्लाइसिन-अलैनिन) को व्यक्त करता है 50 C9ORF72 हेक्सान्यूक्लियोटाइड दोहराने वाले विस्तार 43 के परिणामस्वरूप। जैसा कि हमारे प्रकाशित काम में दिखाया गया है, इन तरीकों को उत्परिवर्ती आरएनए या ब्याज के प्रोटीन के सह-अभिकर्मक के साथ मिलकर या ट्रांसजेनिक पशु मॉडल 43 से सीधे सुसंस्कृत कोशिकाओं में आसानी से किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इन प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता और मजबूती ने न्यूरोनल रूप से विभेदित मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल 45 में सफलतापूर्वक परीक्षण किया है, जिससे भविष्य के अध्ययन ों को सीधे रोगी-व्युत्पन्न रोग-प्रासंगिक कोशिकाओं में किया जा सकता है। एक अन्य हालिया पांडुलिपि में, हम सबूत प्रदान करते हैं कि जंगली-प्रकार के मोटर न्यूरॉन्स उत्तेजना के बाद उच्च कैल्शियम प्रवाह से गुजरते हैं जब उत्परिवर्ती एफयूएस से जारी घुलनशील कारक की उपस्थिति में एस्ट्रोसाइट्स 44 को व्यक्त करते हैं। एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम सिग्नलिंग की घटनाएं भी पड़ोसी न्यूरॉन्स 65 में सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के साथ गहराई से जुड़ी हुई हैं। कैल्शियम गतिशीलता प्रोटोकॉल को एस्ट्रोसाइटिक संस्कृति के मॉडल में पूरे सेल कैल्शियम क्षणिकों की जांच करने के लिए लागू किया गया है, जो कृन्तकों प्राथमिक और मानव आईपीएस-व्युत्पन्न कोशिकाओं दोनों में प्रभावी साबित हुआ है। एएलएस मॉडल में एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम गतिशीलता और सिग्नलिंग की आगे की समझ मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी कि सिनैप्टिक ट्रांसमिशन कैसे परिणामस्वरूप प्रभावित हो सकता है। आखिरकार, सेल-प्रकार-विशिष्ट जीसीएएमपी पत्रकारों को नियोजित करना मिश्रित सह-संस्कृति सेटिंग्स में न्यूरोनल और एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम गतिशीलता की जांच करने और विशेष रूप से प्रत्येक सेल आबादी से उत्पन्न गैर-सेल-स्वायत्त प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होगा।

अंत में, इन तरीकों का संभावित उपयोग न केवल एएलएस के अध्ययन से परे है, बल्कि न्यूरोडीजेनेरेटिव और यहां तक कि विकासात्मक तंत्रिका विज्ञान के व्यापक क्षेत्रों तक भी है। प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट प्लास्मिडों के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान की जाती है और एफयूएस, एसओडी 1 और सी 9ओआरएफ 72 हेक्सान्यूक्लियोटाइड के कई अलग-अलग आनुवंशिक रूपों वाले प्लास्मिड को ट्रांसफेक्ट करने में सफल होती है और डाइपेप्टाइड्स 43,44,66,67,68। बशर्ते प्लास्मिड में न्यूरॉन्स में उपयोग किए जाने वाले प्रमोटर होते हैं, इस बात की कोई सीमा नहीं है कि इन तरीकों का उपयोग करके एएलएस या अपक्षयी बीमारी के मॉडल का अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, उत्परिवर्ती प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए अभिकर्मक एक पूरी तरह से वैकल्पिक कदम है। ट्रांसजेनिक जानवरों या मानव रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं से उत्पन्न संस्कृतियां ब्याज के उत्परिवर्ती प्रोटीन वाली कोशिकाओं की पहचान करने की आवश्यकता को समाप्त करती हैं। वर्तमान में, इन प्रणालियों को फैशन में विवश किया जाता है कि यदि स्टाइरिल डाई का उपयोग किया जाएगा, तो TRITC चैनल पर कब्जा कर लिया गया है, और यदि GcaMP6 का उपयोग किया जाता है, तो FITC चैनल पर कब्जा कर लिया जाता है। वास्तविक समय में न्यूरोनल और एस्ट्रोसाइटिक गतिविधि की परीक्षा के लिए अनुमति देने वाली तकनीकें सिनैप्टिक परिपक्वता / अध: पतन के लिए समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण को समझने की संभावनाओं को व्यापक बनाती हैं, साथ ही न्यूरोनल संचार को बढ़ावा देने या दबाने में औषधीय यौगिकों की प्रभावकारिता के लिए तेजी से परीक्षण करती हैं। ये दो विधियां स्क्रीनिंग के लिए उच्च थ्रूपुट स्केलिंग के लिए उपयुक्त हैं। व्यक्तिगत 35 मिमी व्यंजनों में न्यूरॉन्स चढ़ाना के बजाय, इन दो प्रोटोकॉल के इमेजिंग पैरामीटर को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में एक स्वचालित फैशन में नियोजित किया जा सकता है। इस तरह के एक मंच का उपयोग करते हुए, यौगिक पुस्तकालयों को चिकित्सीय के लिए जल्दी से परीक्षण किया जा सकता है, जो कैल्शियम प्रविष्टि को संशोधित करते हैं या रोग के आनुवंशिक मॉडल या यहां तक कि रोगियों से सीधे प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करके सिनैप्टिक रिलीज में सुधार करते हैं। यह विधि आगे की जांच के लिए तेजी से उम्मीदवार अणुओं की पहचान करके उपसमूह-विशिष्ट या यहां तक कि व्यक्तिगत चिकित्सीय की संभावना को तेजी से ट्रैक कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम इन तकनीकों और उनके विश्लेषणों को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया और सुझावों के लिए जेफरसन वेनबर्ग एएलएस सेंटर के वर्तमान और पूर्व सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को NIH (RF1-AG057882-01 और R21-NS0103118 से D.T.), NINDS (R56-NS092572 और R01-NS109150 से P.P.), मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन (D.T.), ALS Research (D.T.), Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), The Family Strong 4 ALS Foundation और Farber Family Foundation (D.T.), The Family Strong 4 ALS Foundation और Farber Family Foundation (D.T.), The Family Strong 4.K., The Family Strong Foundation और Farber Family Foundation (D.T.) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

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तंत्रिका विज्ञान अंक 173
एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के मॉडल में सिनैप्टिक कार्यों का वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मापन
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Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

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