Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62813
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University
* These authors contributed equally

Summary

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Abstract

Nöronal dejenerasyondan önce, amiyotrofik lateral skleroz (ALS) ve/veya frontotemporal lob demansı (FTLD) olan hastalarda motor ve kognitif defisitlerin nedeni, nöronlar ile motor nöronlar ve kas arasındaki iletişimin bozulmasıdır. Sinaptik iletimin altında yatan süreç, membran depolarizasyonuna bağımlı sinaptik vezikül füzyonunu ve nörotransmitterlerin sinapsa salınmasını içerir. Bu süreç, sinaptik veziküllerin bulunduğu presinaptik terminallere lokalize kalsiyum akışı yoluyla gerçekleşir. Burada protokol, kültürlü nöronlarda depolarizasyon aracılı sinaptik vezikül ekzositozu ve presinaptik terminal kalsiyum akışı dinamiklerini güvenilir bir şekilde bildiren floresan bazlı canlı görüntüleme metodolojilerini açıklamaktadır.

Sinaptik vezikül membranlarına dahil edilen bir stiril boya kullanılarak, sinaptik vezikül salınımı aydınlatılır. Öte yandan, kalsiyum girişini incelemek için, genetik olarak kodlanmış bir floresan muhabiri olan Gcamp6m kullanılır. Nöronal aktiviteyi taklit etmek için yüksek potasyum klorür aracılı depolarizasyon kullanıyoruz. Sinaptik vezikül ekzositozunu kesin olarak ölçmek için, normalize edilmiş stiril boya floresansının kaybını zamanın bir fonksiyonu olarak ölçüyoruz. Benzer stimülasyon koşulları altında, kalsiyum akışı durumunda, Gcamp6m floresan artar. Bu floresan değişiminin normalleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi, stiril boya protokolüne benzer şekilde gerçekleştirilir. Bu yöntemler, floresan olarak etiketlenmiş mutant proteinlerin transfeksiyon bazlı aşırı ekspresyonu ile çoğaltılabilir. Bu protokoller, primer kemirgen kortikal ve motor nöronları kullanarak, FUS-ALS ve C9ORF72-ALS modellerinde sinaptik disfonksiyonu incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu protokoller, nöronal iletişimi geliştirebilecek bileşiklerin hızlı bir şekilde taranmasına kolayca izin verir. Bu nedenle, bu yöntemler sadece ALS çalışması için değil, nörodejeneratif ve gelişimsel sinirbilim araştırmalarının tüm alanları için değerlidir.

Introduction

Laboratuvarda amiyotrofik lateral sklerozun (ALS) modellenmesi, vakaların %80'inden fazlasının1 ezici bir şekilde sporadik doğası ve hastalığa bağlı olduğu bilinen çok sayıda genetik mutasyon nedeniyle2 benzersiz bir şekilde zorlaştırılmıştır. Buna rağmen, tüm ALS vakaları, doğrudan nöronal dejenerasyondan önce, presinaptik motor nöronlar ve postsinaptik kas hücreleri arasında işlevsiz bir iletişim olduğu birleştirici özelliği paylaşır3,4. Klinik olarak, hastalar kalan üst ve alt motor nöronların bağlantılarını kaybettikçe, hastalık boyunca nöronal hiper ve hipoeksitabilite özellikleri ile ortaya çıkarlar5,6,7,8,9, ALS araştırmacıları olarak anlamaya çalıştığımız bu sinapslardaki karmaşık altta yatan moleküler değişiklikleri yansıtırlar.

Çoklu transgenik modeller, nöromüsküler kavşağın bozulmasının ve düzensizliğinin, SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 ve TDP4317,18,19 dahil olmak üzere ALS-nedensel genetik mutasyonların ekspresyonuyla meydana geldiğini göstermiştir. sinaptik butonların, omurga yoğunluklarının ve sinaptik öncesi / sonrası organizasyonun değerlendirilmesi de dahil olmak üzere morfolojik değerlendirmeler yoluyla. Mekanik olarak, 1930'larda Cole, Hodgkin ve Huxley'nin dönüm noktası niteliğindeki makalelerinden bu yana, in vitro hücre kültüründe veya doku dilimi preparatlarında elektrofizyolojik tekniklerle sinaptik yanıtları değerlendirmek de mümkün olmuştur20. Bu stratejiler sayesinde, birçok ALS modeli sinaptik iletim açıklarını göstermiştir. Örneğin, TDP43'ün mutant bir varyantı, NSC-34 (omurilik x nöroblastom hibrid hücre hattı 34) motor nöron benzeri hücrelerde gelişmiş ateşleme sıklığına neden olur ve aksiyon potansiyeli eşiğini azaltır21. Aynı varyant aynı zamanda bir fare modelinde davranışsal motor eksikliklerin başlamasından önce nöromüsküler kavşakta (NMJ) işlevsiz sinaptik iletime neden olur22. Daha önce, mutant FUS ekspresyonunun, lokomotor kusurlardan önce FUS-ALS'nin drosophila modelinde NMJ'de sinaptik iletimin azalmasına neden olduğu gösterilmiştir11. C9orf72 genleşme taşıyıcılarından türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kullanıldığı yeni bir rapor, kolayca devredilebilen sinaptik vezikül havuzunda bir azalma olduğunu ortaya koymuştur23. Toplamda, bu çalışmalar ve diğerleri, ALS'nin hastalıkla ilgili modellerinde sinaptik sinyallemenin altında yatan mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasının önemini vurgulamaktadır. Bu, ALS'nin patobiyolojisini anlamada ve hastalar için potansiyel terapötik hedefler geliştirmede çok önemli olacaktır.

Akım ve gerilim sıkıştırma hücreleri yöntemleri, iletkenlik, dinlenme membranı potansiyeli ve bireysel sinapsların kantial içeriği gibi membran özelliklerinin belirlenmesinde paha biçilmez olmuştur20,24. Bununla birlikte, elektrofizyolojinin önemli sınırlamalarından biri, teknik olarak zor olması ve bir seferde yalnızca tek bir nörondan içgörü sağlamasıdır. Canlı hücre konfokal mikroskopisi, spesifik floresan problarla birleştiğinde, nöronların sinaptik iletimini mekansal zamansal bir şekilde araştırma fırsatı sunar25,26,27. Nöronal uyarılabilirliğin doğrudan bir ölçüsü olmasa da, bu floresan yaklaşımı, sinaptik fonksiyonun iki moleküler korelasyonunun göreceli bir ölçümünü sağlayabilir: sinaptik vezikül salınımı ve sinaptik terminallerde kalsiyum geçicileri.

Bir aksiyon potansiyeli nöronların presinaptik terminal bölgesine ulaştığında, kalsiyum geçicileri tetiklenir ve bir elektrik sinyalinden nörotransmitter salınım sürecine geçişi kolaylaştırır28. Bu alanlara lokalize olan voltaj kapılı kalsiyum kanalları, nörotransmitter salınımının kinetiğini modüle etmek için kalsiyum sinyalini sıkı bir şekilde düzenler29. Kalsiyum geçicilerinin ilk bildirilen floresan bazlı kayıtları, çift dalga boyu göstergesi Fura-2 veya tek dalga boyu boyası Fluo-3 AM30,31,32 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu boyalar o zamanlar harika yeni bilgiler sunarken, hücreler içinde spesifik olmayan bölümlere ayırma, etiketli hücrelerden aktif veya pasif boya kaybı, fotobeyazlatma ve uzun süre boyunca görüntülendiğinde toksisite gibi çeşitli sınırlamalardan muzdariptirler33. Son on yılda, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, çeşitli nöronal aktivite formlarını görüntülemek için iş gücü haline gelmiştir. Bu göstergeler, modifiye edilmiş bir floresan proteinini, Ca2+ iyonlarının bağlanmasından sonra floresan yoğunluğunu hızla değiştiren bir kalsiyum şelatör proteini ile birleştirir34. Bu yeni göstergelerin uygulanması çok geniştir ve hücre içi kalsiyum geçicilerinin hem in vitro hem de in vivo ortamlarda çok daha kolay görselleştirilmesini sağlar. GCaMP olarak bilinen bu genetik olarak kodlanmış muhabirlerin bir ailesi şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu göstergeler bir C-terminal kalmodülin alanı, ardından yeşil floresan proteini (GFP) içerir ve bir N-terminal kalmodülin bağlama bölgesi ile sınırlıdır35,36. Kalmodülin alanına kalsiyum bağlanması, kalmodulin bağlanma bölgesi ile bir etkileşimi tetikler, bu da genel protein yapısında konformasyonel bir değişikliğe ve GFP moiety35,36'nın floresansında önemli bir artışa neden olur. Yıllar geçtikçe, bu muhabir ailesi, her biri biraz farklı özelliklere sahip olan spesifik kinetiklere (yavaş, orta ve hızlı) sahip belirli kalsiyum geçicileri için farklı okumalar sağlamak için çeşitli evrimler geçirmiştir37,38. Burada, daha önce nöronlarda hem in vivo hem de in vitro37'de tek aksiyon potansiyellerini ve dendritik kalsiyum geçicilerini tespit ettiği gösterilen muhabir GcaMP6'nın kullanımı vurgulanmıştır.

Presinaptik bölgedeki kalsiyum geçicileri sinaptik vezikül füzyon olaylarını tetikleyerek sinapsa nörotransmitter salınımına ve postsinaptik hücrede sinyal olaylarının başlamasına neden olur28,39. Sinaptik veziküller hem hızlı bir şekilde salınır hem de geri dönüştürülür, çünkü hücre homeostatik olarak stabil bir hücre zarı yüzey alanını ve füzyon yeteneğine sahip membrana bağlı veziküllerin kolayca kirlenebilir havuzunu korur40. Burada kullanılan stiril boya, lipit membranlarına karşı bir afiniteye sahiptir ve özellikle çevredeki lipit ortamının sırasına bağlı olarak emisyon özelliklerini değiştirir41,42. Bu nedenle, geri dönüşüm sinaptik veziküllerinin etiketlenmesi ve daha sonra nöronal stimülasyonun ardından serbest bırakıldıkları için bu veziküllerin izlenmesi için ideal bir araçtır41,42. Oluşturulan ve optimize edilen protokol, başlangıçta Gaffield ve meslektaşları tarafından açıklanan kavramların bir uyarlamasıdır ve bu da zaman içinde sürekli olarak stiril boya etiketli sinaptik vezikül punktasını görselleştirmemizi sağlar41.

Burada, sinaptik iletimde yer alan spesifik hücresel olayları güvenilir bir şekilde bildiren iki ilgili floresan tabanlı metodoloji tanımlanmıştır. Kültürlü nöronlarda depolarizasyon aracılı presinaptik terminal kalsiyum inakımı ve sinaptik vezikül ekzositozunun dinamiklerini araştırmak için protokoller tanımlanmıştır. Burada, yöntemler ve temsili sonuçlar, primer kemirgen kortikal veya motor nöronların in vitro model sistemi olarak kullanılmasına odaklanmıştır, çünkü bu hücre tiplerini kullanan yayınlanmış çalışmalar vardır43,44. Bununla birlikte, bu yöntemler farklılaşmış insan i3 kortikal benzeri nöronlar için de geçerlidir45, çünkü laboratuvarımızda halen devam eden deneylerde her iki protokolle de başarı elde ettik. Genel protokol, Şekil 1'de gösterilen kademeli doğrusal bir biçimde özetlenmiştir. Kısacası, nöritlerde kalsiyum dinamiklerini incelemek için, olgun nöronlar, floresan muhabir GCaMP6m'yi bir Sitomegalovirüs (CMV) promotörü37,46 altında eksprese etmek için plazmid DNA'sı ile transfekte edilir. Transfekte hücreler, kalsiyum varlığında artan düşük bir bazal yeşil floresan seviyesine sahiptir. İlgilenilen bölgeler, manipülasyonumuz boyunca floresan değişikliklerini izlemek için belirtilmiştir. Bu, kalsiyumdaki yüksek uzamsal ve geçici olarak lokalize dalgalanmaların ölçülmesini sağlar37,46. Sinaptik vezikül füzyonunu ve salınımını değerlendirmek için, olgun nöronlar, presinaptik hücrelerdeki nörotransmiterlerle geri dönüştürüldükleri, reforme edildikleri ve yeniden yüklendikleri için sinaptik vezikül zarlarına dahil edilen stiril boya ile yüklenir41,42,43,47,48. Bu amaçla kullanılan mevcut boyalar, nöritler boyunca sinaptik vezikülleri etiketlemektedir ve Kraszewski ve meslektaşları tarafından stiril boya ve sinaptotagminin birlikte boyanmasıyla gösterildiği gibi, canlı görüntüleme deneylerinde bu bölgeler için bir vekil olarak kullanılmaktadır49. Burada, benzer boyama işleminin de gerçekleştirilmiş temsili görüntüleri yer almaktadır (Şekil 2A). Önceki araştırmacılar, nöromüsküler kavşaktaki sinaptik vezikül dinamiklerini ve hipokampal nöronları48,49,50,51,52,53,54,55,56'yı bildirmek için bu tür boyaları yaygın olarak kullanmışlardır. . Boya yüklü veziküllerin noktalama bölgelerini seçerek ve vezikül salınımını takiben floresan yoğunluğundaki düşüşleri izleyerek, fonksiyonel sinaptik iletim kapasitesi ve salınımın zamansal dinamikleri stimülasyonu takiben incelenebilir43. Her iki yöntem için, nöronal aktiviteyi taklit etmek için hücreleri depolarize etmek için yüksek konsantrasyonda potasyum klorür içeren bir ortam kullanılır. Görüntüleme parametreleri, bir temel normalizasyonu ve ardından stimülasyon yakalama süremizi kapsayan saniyenin altındaki aralıkları yakalamak için belirtilir. Her zaman noktasındaki floresan ölçümleri belirlenir, arka plana normalleştirilir ve deneysel zaman periyodu boyunca nicelleştirilir. Kalsiyum akışı aracılı GCaMP6m floresan artışı veya etkili sinaptik vezikül ekzositozu stiril boya salınımlı floresan azalması bu strateji ile tespit edilebilir. Bu iki protokol için ayrıntılı metodolojik kurulum ve parametreler ile avantajları ve sınırlamaları hakkında bir tartışma aşağıda açıklanmıştır.

Figure 1
Şekil 1: Genel genel protokol sürecinin görsel olarak işlenmesi. (1) Birincil kemirgen nöronlarını in vitro olarak seçilen olgunlaşma zaman noktasına izole edin ve kültürleyin. (2) GCaMP DNA veya stiril boyasını sinaptik aktivitenin muhabirleri olarak tanıtın. (3) Canlı görüntüleme donanımlı konfokal mikroskop ve ilgili yazılımları kullanarak görüntüleme paradigmasını kurmak. Temel kayıt dönemine başlayın. (4) Hücreler hala canlı görüntü yakalama sürecindeyken, yüksek KCl banyo perfüzyonu yoluyla nöronları uyarın. (5) Kalsiyum geçicilerini veya sinaptik vezikül füzyonunu ölçmek için zaman içindeki floresan yoğunluğu ölçümlerini değerlendirin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, Jefferson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Embriyonik sıçan korteksinden nöronların birincil kültürü

NOT: Primer kortikal nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi E17.5 sıçan embriyolarından izole edilmiştir57,58. Bu kültürleme protokolünün başarısıyla hiçbir gerinim önyargısı yok gibi görünmektedir. Bu yöntem aşağıda kısaca açıklanmıştır. Tüm detaylar için belirtilen önceki makalelere atıfta bulunulmalıdır.

  1. Gebe dişi sıçanları CO2 inhalasyonu ile ötenazileştirin, ardından servikal çıkık ile ikincil doğrulama ile takip edin.
  2. Embriyoları toplayın ve beyinleri buz gibi soğuk 20 mM HEPES tamponlu Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) izole edin. Dış korteks kabuğundan, striatum ve hipokampiyi ayırın ve atın. Kortikleri toplayın.
  3. Meninksleri kortekslerden çıkarmak için ince forseps kullanın. Bunu yapmak için, korteksi hafif basınç kullanarak bir çift kapalı forseps ile yerinde tutun.
    NOT: İkinci eldeki ikinci forseps çifti ile meninksleri sıkıştırın. Sıkışmış çift ile yuvarlanma hareketini kullanarak meninksleri soyun. Kapalı forseps ile tekrar pozisyonlayın ve meninksler tamamen çıkarılana kadar gerektiği gibi tekrarlayın.
  4. HBSS'de 10 μg / mL papain içeren korteksleri 37 ° C'de 4 dakika boyunca inkübe edin.
  5. HBSS'de üç kez yıkayın ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için ateşle parlatılmış cam Pasteur pipetle 5-10 kez hafifçe tritüre edin.
    NOT: Kabarcıklardan kaçının; pipeti hücre süspansiyonu içinde tutun.
  6. 100 μg / mL poli-D-lizin üzerindeki plaka nöronları, B27 takviyesi (% 2) ve penisilin-streptomisin ile nörobazal ortamda 75.000 hücre / çanak yoğunluğunda 35 mm cam tabanlı tabakları kapladı.

2. Embriyonik sıçan omuriliğinden motor nöronların birincil kültürü

NOT: Primer motor nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi E13.5 sıçan embriyolarından birkaç değişiklikle hazırlanır59,60. Bu kültürleme protokolünün başarısıyla hiçbir gerinim önyargısı yok gibi görünmektedir. Bu yöntem aşağıda kısaca açıklanmıştır. Tüm ayrıntılar için belirtilen önceki makalelere atıfta bulunulmalıdır.

  1. Hamile dişi fareleri adım 1.1'de olduğu gibi ötenazileştirin.
  2. Embriyolardan 10-20 omuriliği disseke edin ve sırasıyla sıkıştırmak ve çekmek için iki çift forseps kullanarak mekanik olarak küçük parçalara bölün.
  3. 8 dakika boyunca% 0.025 tripsin içinde inkübe edin, ardından 1 mg / mL'de DNaz ilavesi yapın.
  4. 470 x g'de %4'lük bir BSA yastığı ile 4 °C'de 5 dakika boyunca kesintisiz santrifüj yapın.
  5. Pelet edilmiş hücreleri 4 °C'de 830 x g'de 55 dakika boyunca frensiz olarak %10,4 (v/d) yoğunluklu gradyan ortamından geçirin (bkz. Motor nöron bandını görsel arayüzde ileriye taşıyın.
    NOT: Tüm hücrelerin yakalanmasını sağlamak için, yoğunluk gradyanı adımı için fenol içermeyen ortam ve diğer tüm adımlar için fenol içeren ortam kullanın. Yoğunluk gradyanı ve ayrışma ortamının arayüzü, renk farkına göre kolayca tanımlanabilir.
  6. Spin bantları 470 x g'de 4 x g'de başka bir %4 w / v BSA yastığından 4 ° C'de 5 dakika boyunca kesintisiz olarak topladı.
  7. Saflaştırılmış motor nöronları tam nörobazal ortamda B27 takviyesi (% 2), glutamin (% 0.25), 2-merkaptoetanol (% 0.1), at serumu (% 2) ve penisilin-streptomisin ile yeniden askıya alın.
  8. 100 μg / mL polilizin ve 3 μg / mL laminin kaplı kapaklar üzerindeki plaka nöronları, 50.000 hücre / 35 mm cam tabanlı çanak yoğunluğunda kayar.

3. Nöronal transfeksiyonlar

NOT: Bu adım, GCaMP kalsiyum görüntülemeye tabi tutulacak nöronlar ve / veya sinaptik değerlendirmeden önce eksojen bir DNA plazmidi veya ilgili RNA'nın tanıtıldığı nöronlar için gerçekleştirilir. Buna karşılık, stiril boya görüntüleme seansından hemen önce yüklenir ve bölüm 6'da ele alınır. Aşağıdaki özet, sunulan örneklerde birincil kemirgen nöronları için kullanılan transfeksiyon protokolüdür, ancak kullanıcının ihtiyaçlarına kolayca uyarlanabilir ve optimize edilebilir.

  1. Kültürlenmiş primer kortikal nöronlar için transfeksiyonlar in vitro (DIV 12) 12. günde meydana gelirken, motor nöronlar in vitro (DIV 7) 7 . günde transfekte edilir.
    NOT: Aşağıdaki adımların tümü bir aseptik biyogüvenlik kabini içinde gerçekleşir.
  2. Transfeksiyon reaktifi kullanılarak hacimce 1:2 oranında GCaMP6m'nin 500 ng'sini transfektleyin. Ko-transfeksiyonlar için, bu DNA'nın reaktif oranını koruyarak toplam 1.25 μg toplam DNA / çanak ekleyin.
    NOT: Gösterilen deneysel örneklerde, 750 ng ALS / FTD ile ilişkili plazmid, C9orf72-ALS bağlantılı dipeptitleri, mutant FUS proteinini vb. İfade etmek için transfekte edilmiştir. Ko-transfekte plazmidin floresan etiketinin GCaMP görüntülemenin FITC kanalı ile çakışmayacağından emin olun. Aynı şekilde, stiril boya görüntüleme yapıyorsanız, ko-transfekte plazmidin görüntülemenin TRITC kanalı ile çakışmayacağından emin olun. Sinaptofizin-GCaMP3 kullanımı bu protokolde eşit derecede etkilidir. Bu nedenle, bu plazmidin aynı miktarını transfekte edin ve bölüm 7'de her zamanki gibi tüm adımları izleyin.
  3. DNA transfeksiyon reaktif kompleksini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Kuluçkaya yatırılan kompleksi, dönen nöronlara damla damla yavaşça ekleyin. Çanağı 45-60 dakika boyunca 37 ° C'de CO2 inkübatörüne geri koyun.
  5. DNA-transfeksiyon reaktif kompleksini içeren tüm kültür ortamını çıkarın ve önceden şartlandırılmış ve taze nöronal ortamın hacimce hazırlanmasıyla 50-50 ile değiştirin. Ardından, hücreleri görüntülemeye kadar 48 saat boyunca CO2 inkübatörüne geri koyun.

4. Tampon çözeltilerinin ve stiril boya stok çözeltisinin hazırlanması

  1. Tablo 1'de listelenen bileşenleri kullanarak görüntülemeden önce düşük ve yüksek aCSF çözeltilerini taze hale getirin. Kullanmadan önce her iki tampon çözeltisini de filtreleyin.
    NOT: CaCl2 dihidrat, depolandıktan sonra Ca(OH)2 oluşturabilir. Maksimum etkinlik için, her zaman yakın zamanda açılmış bir kap kullanın. Bu mümkün değilse, Ca(OH)2'yi dış yüzeyden çıkarmak ve maksimum çözünürlüğü sağlamak için, çözeltiler CaCl2 ilavesinden önce 5 dakika boyunca gaz halindeki CO2 ile karbonatlanabilir. Bu adım atılırsa, elde edilen çözeltinin pH'ını 7.4'lük bir pH değerini koruyacak şekilde ayarlayın, çünkü aşırı karbonasyon Ca (HCO3) 2 oluşumuna neden olur.
Düşük KCL aCSF tamponu (pH 7,40 ila 7,45)
Reaktif Konsantrasyon
HEPES 10 mM
Arjantin 140 mM
Kartal 5 mM
Glikoz 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM
Yüksek KCL aCSF tamponu (pH 7,40 ila 7,45)
Reaktif Konsantrasyon
HEPES 10 mM
Arjantin 95 mM
Kartal 50 mM
Glikoz 10 mM
CaCl2 2H2O 2 mM
MgCl2 4H2O 1 mM

Tablo 1: Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) tamponlarının bileşimi. Bu tablo, nöronları görüntülerken ve uyarırken kullanılan düşük ve yüksek KCl yapay beyin omurilik sıvısı tamponlarının hazırlanması için kullanılan bileşenleri içerir. Hazırlık talimatları için bölüm 4'e bakın.

  1. 100 μg'lık bir şişe boya alarak ve damıtılmış su veya nörobazal ortam ile 10 mM'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırarak stiril boya stok çözeltisi hazırlayın.

5. Mikroskop ve perfüzyon sistemi kurulumu

NOT: Cam tabanlı Petri kaplarını görüntülemek için, perfüzyonun esnekliği ve yüksek sayısal açıklıklı yağ daldırma hedefinin kullanılması nedeniyle ters çevrilmiş bir konfokal floresan mikroskobu tercih edilir. Temsili Sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak açıklanan örneklerin görüntülenmesinde kullanılan konfokal mikroskop, kamera ve hedefler için Malzeme Tablosuna bakın.

  1. Tüm deneyleri 37 °C'de sabit %5 CO2 seviyeleri ile inkübatör sistemine bağlı bir aşama montajı kullanarak gerçekleştirin.
  2. Konfokal yazılımı kullanarak görüntü yakalamayı kontrol edin. Uyarma gücünü seçmek için görüntüleme oturumunun başlangıcında alma ayarlarını optimize edin ve fotobeyazlatma olmadan sinyallerin en iyi şekilde görselleştirilmesini sağlamak için kazanın.
    1. Tüm numunelerde uyarma gücünü, pozlama süresini, dedektör kazancını ve kare hızını sabit tutun. Boya ağartmasını en aza indirmek için 512 x 512 en boy oranını ve 2 görüntü/sn kare hızını kullanarak hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
      NOT: Puntta açıkça görülebilmeli olsa da, ağartma ve fototoksisiteyi önlemek için lazer yoğunluğu mümkün olan en aza indirilmelidir. Nöritler içinde floresan punktanın optimum çözünürlüğünü elde etmek için konfokal diyaframı en dar ayara ayarlayın. Pozlama süresi, numuneler arasında tutarlı olarak 200 ms veya daha kısa bir süreye ayarlanır. Kullanılan kameranın maksimum görüntüleme hızı 2 görüntü/sn idi. Daha hızlı bir kamera kullanıyorsanız, daha fazla görüntü / s çekilebilir. Mümkünse zamansal görüntüleme ayarları seçilmelidir.
  3. Konfokal yazılım kullanarak görüntüleme için aşağıdaki floresan uyarma/dikroik/emisyon filtresi kombinasyonlarını seçin: sırasıyla FITC ile Gcamp6m/Gcamp3 ve TRITC ile stiril boya.
  4. Z-driftini önlemek için hızlandırılmış görüntüleme sırasında konfokal görüntüleme alma yazılımının mükemmel odak özelliğini kullanın.
    NOT: Hızlı görüntüleme hızı nedeniyle, tek bir düzlem görüntülenir. Deney sırasında z-drift eksikliğinin sağlanması çok önemlidir.
  5. Kayıt dönemlerini ve aralıklarını ayarlamak için görüntü alma panelinde Zaman sekmesini seçin.
    1. Faz #1'i Aralık 500 ms, Süre 3 - 5 dakika olarak ayarlayın.
    2. Faz #2'yi Aralık 500 ms, Süre 5 dakika olarak ayarlayın.
      NOT: Faz #1 sırasıyla temel kayda, Faz #2 stimülasyon periyoduna karşılık gelir.
  6. Bir valf kontrol sistemi ve bir kanal manifoldu kullanarak aCSF için yerçekimi perfüzyon aparatını monte edin.
    1. Yüksek KCl'yi (bakınız Tablo 1) aparatın üst kısmındaki 50 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin ve boru sistemden geçin. Akış hızını 1 mL/dk olarak ayarlayın.
  7. Nöronlar içeren 35 mm'lik bir cam kabı, perfüzyon borusunun ucu çanak kenarına yerleştirilecek şekilde konfokal görüntüleme aşamasına yükleyin. Görüntüleme için alanı seçin.

6. Sinaptik vezikül salınımının stiril boya görüntülemesi

  1. Düşük KCl aCSF'deki hücreleri (bakınız Tablo 1) 37 °C'de 10 dakika, transfeksiyon sonrası 48 saat boyunca inkübe edin.
  2. Birincil kortikal veya motor nöronları cam tabanlı Petri kaplarına stiril boya ile yükleyin.
    1. Düşük KCl aCSF'yi aspirasyonla çıkarın.
    2. 5 dakika boyunca 50 mM KCl içeren aCSF'de 10 μM stiril boya ile karanlıkta nöronları yüklemek için bir pipet kullanın.
    3. Spesifik olmayan boya yüklemesini ortadan kaldırmak için yükleme solüsyonunu çıkarın ve nöronları düşük KCl aCSF'de 10 dakika boyunca yıkayın.
  3. 35 mm'lik cam tabanlı kabı görüntüleme aşamasına yerleştirin ve ardından ters çevrilmiş bir konfokal mikroskobun 20x hava hedefi veya 40x yağ daldırma hedefi altında gözlemleyin.
    NOT: GFP etiketli plazmidle birlikte transfekte edilen hücreler söz konusu olduğunda transfekte hücreleri bulmak için GFP floresansını kullanın.
  4. 546 nm lazer kullanarak stiril boyayı uyarın, 630-730 nm (TRITC) bandpass filtresi kullanarak emisyon toplayın.
  5. Görüntüleme alanını seçin ve mükemmel odaklama yapın. Ardından, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, TRITC ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın.
  6. Edinme yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın. Varsa boya yoğunluğundaki değişimleri dışlamak için bazal kaydı 3-5 dakika boyunca gerçekleştirin (Faz #1).
    NOT: Boya yoğunluğundaki herhangi bir azalmanın, pasif boya difüzyonu veya fotobeyazlatma değil, sinaptik vezikül salınımından kaynaklandığından emin olmak önemlidir. Bu 3-5 dakikalık ön stimülasyon süresi, sabit ve korunmuş bir boya yoğunluğu seviyesi ile sonuçlanmalıdır. Bu kaydın son 30 saniyesi, her bir yatırım getirisi için ortalama bir temel floresan değeri belirlemek için kullanılacaktır. Deneysel koşulları değerlendirmeden önce, lazer ayarlarını uzun süre kullanarak sabit floresan değerleri sağlamak için amaçlanan edinme ayarlarını kullanarak yaklaşık 10 dakikalık sürekli kayıttan oluşan ek bir uyarılmama koşulu da gerçekleştirilebilir.
  7. Faz #2'ye geçişte, perfüzyon sistemi için düğmede düğmesine basın. Daha sonra, boya boşaltmayı kolaylaştırmak için nöronlara sürekli olarak 50 mM KCl perfüze edin (Faz #2).
    1. KCl ilavesinden sonra 300 sn için kayıtlar yapın. Bundan sonra, satın alma durur; perfüzyon sistemi için Kapalı düğmesini tetikleyin.
  8. Denemeyi kaydedin ve aşağıdaki bölüm 8'de açıklandığı gibi konfokal yazılımı kullanarak verileri analiz edin.
    NOT: Deney bu noktada durdurulabilir ve analiz daha sonra yapılabilir. Hücrelerin ilgilenilen proteinlerin ekspresyonu için transfeksiyona ihtiyaç duymadığı durumlarda, bu protokol, sinaptik boşaltmanın işlevselliğini incelemeye çalışırken in vitro olarak herhangi bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Uygun sinaptik boşaltmayı sağlamak için kontrol hücrelerinin bir testini takiben, deneyci, önyargıyı en aza indirmek için test edilen her bir kabın genetik veya farmakolojik koşullarına kör edilmelidir.

7. Gcamp6m kalsiyum geçicilerinin floresan görüntülemesi

  1. Transfect primer kemirgen kortikal nöronları, bölüm 3'te belirtildiği gibi 500 ng Gcamp6m ile 35 mm cam tabanlı kaplarda kültürlenmiştir.
    NOT: İstenirse, kırmızı veya uzak kırmızı aralıkta bir floresan etiketi içeren bir plazmid ile birlikte transfekt nöronlar.
  2. Transfeksiyon sonrası 15 dakika 48 saat boyunca düşük KCl aCSF'li nöronları inkübe edin ve ardından çanağı görüntüleme platformuna monte edin.
  3. GCaMP6m floresansını bir FITC filtresi (488 nm) ve 20x veya 40x hedefi kullanarak görselleştirin.
  4. Görüntüleme alanını seçin ve mükemmel odaklama yapın. Ardından, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, FITC ve floresan işaretleyici kanallarıyla tek bir hareketsiz görüntü alın.
  5. Edinme yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın. Temel kaydı 5 dakika boyunca gerçekleştirin ve ardından stiril boya deneyleri için bölüm 6'da açıklandığı gibi 50 mM KCL içeren aCSF ile perfüze edin.
    NOT: Bu görüntülemenin amacı, uyarılmış kalsiyum geçicilerini ölçmektir. Bir nöronun ön stimülasyon döneminde bazal ateşleme aktivitesi ve kalsiyum akıları varsa, veri analizinde kullanılmaz. Bunun yerine, sadece stabil arka plan floresansına sahip hücreler kullanılır. Stimülasyon sonrası süreler, ilave sürekli yüksek KCl perfüzyonu olsun veya olmasın, kalsiyum geçicileri için 60 dakikaya kadar uzatılabilir.
  6. Denemeyi kaydedin ve aşağıdaki bölüm 8'de açıklandığı gibi konfokal yazılımı kullanarak verileri analiz edin. Deney bu noktada durdurulabilir ve analiz daha sonra yapılabilir.
    NOT: Hücreler, ilgilenilen proteinlerin ekspresyonu için transfeksiyona ihtiyaç duymuyorsa, kalsiyum geçicilerini incelemek için bu protokol in vitro olarak herhangi bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Kalsiyum geçicilerinin ölçümünü sağlamak için kontrol hücrelerinin test edilmesinin ardından, deneyci, önyargıyı en aza indirmek için test edilen her bir kabın genetik veya farmakolojik koşullarına kör edilmelidir.

8. Görüntü analizi

  1. Hızlandırılmış görüntüleri konfokal yazılımla açın.
  2. Hızlandırılmış serideki görüntüleri komut serisiyle hizalayın: Görüntü | İşleme | Geçerli Belgeyi Hizalayın. İlk kareye hizala'yı seçin.
  3. Görüntü çerçevesinin sağındaki fasulye şeklindeki bir simge olan ROI seçim aracını kullanarak nöritler boyunca ilgi çekici bölgeleri (ROI) seçin (Şekil 3B). Ayrıca, arka plan floresan yoğunluğunu temsil eden bir yatırım getirisini işaretleyin.
    NOT: ROI'ler, parlak alan hareketsiz görüntüsü tarafından gösterilen nöronal izler boyunca belirgin şekilde ayrılmış puncta alanları seçilerek seçilir. Analiz için nöron başına en az beş ROI seçilir. Arka plan yatırım getirisi, görüş alanının nörit içermeyen bir bölgesinde seçilir.
  4. Aşağıdaki komut serisini kullanarak seçilen yatırım getirilerinde zaman içinde ham floresan ölçümü: | ölçün Zaman Ölçümü.
    1. Zaman Ölçümü panelinin üst kısmındaki Ölçüm işlevini başlatın. Zaman içinde ham floresanın grafiksel bir temsili (Şekil 3C) ve nicel verilerin her ikisi de üretilir.
      NOT: Her veri noktası, ölçülen belirli zaman noktasıyla ilişkili çerçeve için söz konusu YG'nin ham floresansını temsil eder.
  5. Ham floresan yoğunluklarını elektronik tablo yazılımına aktarın.
  6. Her yatırım getirisini bağımsız olarak analiz edin. İlk olarak, arka plan yatırım getirisi yoğunluğunu her zaman noktasında faiz yoğunluğunun yatırım getirisinden çıkararak verileri normalleştirin.
    1. Her belirli zaman noktasında arka plan yatırım getirisinden ham floresan değerini alın ve bunu o zaman noktasındaki faiz ham yoğunluk değerinin YG'sinden çıkarın.
      NOT: Bu, hem bazal hem de stimülasyon aşamaları olmak üzere tüm kayıt süresi boyunca yapılır.
  7. Taban çizgisinin son 30 saniyesi için faiz yoğunluğunun ortalama yatırım getirisini belirleyin.
    1. 3-5 dakikalık bazal kayıt periyodunun son 30 saniyesinden 8.6. adımda üretilen normalleştirilmiş ham bazal değerlerin ortalaması.
      NOT: Bu değeri üretmek için bazal kayıt periyodunun tamamı kullanılabilir. Bununla birlikte, bu değer stabilize edildiğinden ve korunduğundan, son 30 s'nin 60 zaman noktası, bütünü temsil etmek için yeterli örnekleme boyutuna sahiptir.
  8. Bu temel değeri, floresan (ΔF) değerinde bir değişiklik yaratarak her zaman noktasındaki normalleştirilmiş yoğunluk değeriyle karşılaştırın.
    1. Adım 8.7'deki değeri alın ve ortalama temel floresan değerini çıkarın. Bunu ve sonraki adımları tüm kayıt dönemi boyunca, hem bazal hem de stimülasyon fazları için yapın.
  9. Bu değişikliği temel floresan değeri ile ilgili olarak hesaplayın ve floresan/bazal floresanda (ΔF/F) bir değişiklik yaratın. Bunu yapmak için, adım 8.8'deki değeri alın ve ortalama temel floresan değerine bölün.
  10. Son olarak, başlangıç noktası değerini 1 olarak ayarlayın, böylece artışlar veya azalmalar zaman içinde grafiksel olarak kolayca görselleştirilebilir.
    1. Adım 8.9'da üretilen değeri alın ve 1 ekleyin.
      NOT: Bu doğru yapıldığında, 30 sn'lik temel dönem değerleri 1 değerinin üzerine gelmelidir. Sinaptik içeriği etkili bir şekilde serbest bırakan hücrelerde, bu değer stimülasyonun başlamasından sonra 1'den 0'a doğru eğilim göstermelidir. Adım 6-9'a bir örnek Şekil 3E'de sunulmuştur.

9. Veri analizi

NOT: Deneyci, analiz için verileri uygun şekilde bir araya getirmek için deneysel koşullara kör olmayabilir. Üç bağımsız deneyin her birinden koşul başına en az 10 nöron örneklem büyüklüğü kullanın. Nöronları yalnızca en az beş ROI bölgesi belirlenebiliyorsa dahil etmek için düşünün. Bu deneysel replikasyon seviyesi, yayınlanmış çalışmalarda, GFP kontrollerine karşı ALS ile ilişkili poli-GA içeren hücrelerde derin bir sinaptik boşaltma kaybını göstermek için yeterliydi (bkz. Bununla birlikte, daha ince bir fenotip gözlenirse, biyolojik ve / veya teknik kopyaların sayısı kullanıcı tarafından optimizasyon gerektirebilir.

  1. Belirli bir deneysel koşulun YG'lerinden zaman içinde hesaplanan tüm ΔF / F değerlerini kullanarak, bir SEM ile birlikte her zaman noktası için ortalama bir ΔF / F değeri belirleyin.
  2. xy biçiminde bir grafik ve istatistik yazılımı programı kullanarak verileri çizin, burada x geçen süredir ve y, adım 9.1'de hesaplanan ΔF / F değeridir. Tüm değerleri ortalama SEM ± olarak sunun.
  3. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için, iki grubu karşılaştırmak için Öğrencinin t-testini ve tek yönlü varyans analizini (ANOVA) ve ardından üç veya daha fazla grubu karşılaştırmak için Tukey'in posthoc analizini kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıdaki protokolün başarılı bir şekilde uygulanmasını takiben, tipik bir stiril boya sinaptik vezikül salınım deneyi için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Kültürlenmiş sıçan primer kortikal nöronları, bölüm 6'da açıklanan yöntem kullanılarak boya ile yüklendi. Boya yüklemesinin özgüllüğü, sinaptik vezikül marker sinaptophysin ile birlikte etiketlenerek belirlendi. Steril boya pozitif puncta'nın çoğunluğu bu belirteç için eş pozitiftir (Şekil 2A). Steril boya görüntüleme için kullanılan ayarların fotobeyazlatmaya neden olup olmadığını belirlemek için, tipik olarak, işlenmemiş bir kuyu boya ile yüklenir ve floresan değerlerinin sabit kalmasını sağlamak için stimülasyon olmadan 10 dakikalık uzun bir süre boyunca görüntülenir.

Ek olarak, sonuçlar Şekil 2A'da olduğu gibi sinaptofizin ve stiril boyanın birlikte etiketlenmesi kullanılarak tekrar gösterilmiştir. Bu floroforlar, TRITC stiril boya görüntüleme için bölüm 6'da belirtilen paradigma kullanılarak birlikte görüntülendi, ayrıca mTurkuaz-sinaptofizin görselleştirmek için DAPI kanalında yüksek yoğunluklu lazer gücü kullanılarak sinaptofizin floresansının ikili yakalanması sağlandı. Gösterilenler, stimülasyon öncesi ve sonrası sinaptik bölgelerin temsili görüntüleridir (Şekil 2B). Bu yöntem, fotobeyazlatma eksikliği için dolaylı bir çıkarım olsa da, tüm görüntüleme periyodu boyunca ham yoğunluk değerlerinin analizi, sinaptofizin yoğunluğunun sabit kaldığını, stiril boya yoğunluğunun ise stimülasyondan sonra azaldığını ortaya koymaktadır (Şekil 2C). Bu nedenle, bu deneyi ve stimülasyondan önce ve stimülasyon olmayan kuyularda uzun süreler boyunca stabil floresanın diğer kontrollerini alarak, stiril floresandaki azalmaların, fotobeyazlatma etkilerinden ziyade KCl depolarizasyonu yoluyla sinaptik boşaltmaya atfedilebileceğini belirledik.

Figure 2
Şekil 2: Steril boya etiketlemesinin özgüllüğü ve görüntüleme parametrelerinin değerlendirilmesi. (A) Sinapsin promotöründen (yeşil) çıkarılan mTurkuaz2-sinaptofizin61'i ifade etmek için bir plazmid ile 24 saat önce transfekte edilen stiril boya etiketli sıçan kortikal nöronun (kırmızı) temsili 40x görüntüsü. Bu iki floroforun kolokalizasyonu, stiril boya pozitif punktanın büyük çoğunluğunun sinaptik vezikül belirteci sinaptofisin ile birlikte boyandığını göstermektedir. Ölçek çubuğu 5 μm'yi gösterir. (B) Kortikal nöronlar transfekte edildi ve stiril boya (A)'da olduğu gibi yüklendi ve stiril boya paradigmasına göre görüntülendi ve DAPI kanalındaki mTurkuaz-sinaptofinin çift floresan yakalaması ile birlikte görüntülendi. Temsili görüntüler, stimülasyon öncesi ve sonrası sinaptofizin ve stiril boya puncta bölgelerini göstermektedir. Ölçek çubuğu 5 μm'yi gösterir. (C) Floresan, sinaptofizin (DAPI kanal üstü) ve stiril boya (FITC kanal tabanı) için zaman içinde izlendi. Sinaptofizin yoğunluğu, görüntüleme ve stimülasyon süresi boyunca sabit bir floresanda korunurken, boya stimülasyonda boşaltıldıkça stiril boya floresansı azaldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Temsili görüntüler, görüntüleme sırasında stiril boyanın yüklenmesini ve ROI'lerin seçimini göstermektedir (Şekil 3A-B). Seçilen ROI'lerin ham floresan yoğunluğu ve bir arka plan ROI'si, konfokal yazılım kullanılarak çizilir (Şekil 3C). Burada gösterilen nöronlar ayrıca, C9ORF72-ALS bağlamında üretilen dipeptid proteinlerinin, yani T7 promotöründen çıkarılan FLAG-eGFP ve FLAG-GA50-eGFP'nin etkilerini incelemek için plazmidlerle transfekte edildi. Başarılı sinaptik vezikül salınımı, GFP-transfekte kontrol nöronu için yüksek KCl depolarizasyonu (Şekil 3D, üst iki panel) üzerine boya floresansının çarpıcı kaybına neden olur. Burada yer alan temsili bir video, bunun görüntüleme sırasında nasıl göründüğünü gösterir. Ek olarak, bir nöron, stimülasyonu takiben bir nörit bölgesinde stiril boyayı seçici olarak boşaltır (Video 1).

Öte yandan, bozulmuş sinaptik iletim, C9ORF72'ye bağlı bir dipeptid tekrar yapısı (GA50) ile transfekte edilen nöronlarda yüksek KCl depolarizasyonundan sonra bile tutulan boya floresansı ile temsil edilir (Şekil 3D, alt iki panel)43. Kantitatif veri analizini takiben (Şekil 3E), veriler kontrol (GFP) ve ALS/FTD (GA50) grupları için görüntüleme boyunca boya yoğunluğu olarak gösterilmiştir (Şekil 3F)43. Bu yöntem aynı zamanda ara etkileri ayrıştırabilir ve sadece "ya hep ya hiç" ikili ölçüsü değildir. GA50'nin aracılık ettiği sinaptik açıkları kurtarmak için tasarlanan deneylerde, insan PGK promotöründen çıkarılan rSV2a-eGFP-pRRL plazmidi kullanılarak lentiviral transdüksiyon ile eksojen sinaptik vezikül ilişkili protein 2 (SV2) tanıtıldı. Yukarıda özetlendiği gibi görüntüleme ve analizleri takiben, GA50 ve SV2'yi birlikte eksprese eden nöronlarda sinaptik ateşleme kurtarıldı (Şekil 3G).

Figure 3
Şekil 3: Styryl boya etiketleme yoluyla sinaptik vezikül salınımının değerlendirilmesi. (A) Bir görüntüleme deneyinin başlangıcında düşük KCl aCSF ortamında stiril boya etiketli bir nöronun temsili 40x görüntüsü. Ölçek çubuğu 20 μm'yi gösterir. (B) (A)'dan alınan görüntüde ROI üretiminin tasviri. Nöritler boyunca belirli puncta bölgeleri (# 1-4), sağda vurgulanan fasulye şeklindeki düğme olan ROI aracı kullanılarak seçilir. Arka plan sinyal yoğunluğunu yakalamak için boş bir bölgede son bir yatırım getirisi seçilir. Spesifik olmayan, nöronal olmayan parlak noktalara sahip alanlardan kaçınılır. Ölçek çubuğu 20 μm'yi gösterir. (C) ROI'ler için sinyal yoğunluklarının zaman içinde (B)'den 1-5 numaralı yatırım getirilerinin zaman içinde konfokal yazılım tarafından grafiklendirildiği / gösterildiği şekilde gösterilmesi. (D) Etkili bir şekilde sinaptik iletim geçiren bir nöron için ROI bölgelerinin stimülasyon öncesi / sonrası görsel temsilleri (ilk iki panel). Alttaki iki panel, farklı bölgeleri görsel olarak göstermek için puncta'yı arka plandan izole etmek için tarafsız bir eşik uygulanan yakınlaştırılmış görüntülerdir. GFP içeren nöronlar etkili bir şekilde sinaptik salınıma uğrarken, C9ORF2-ALS ile ilişkili peptid GA50'nin ekspresyonu bu etkiyi önler. Ölçek çubukları, Jensen et al. 202043'ten 10 μm-Yeniden basılmış olduğunu göstermektedir. (E) Elektronik tablo yazılımını kullanan, değerlerin taban çizgisine normalleştirilmesini ve zaman içinde ΔF/F değerlerinin oluşturulmasını gösteren bir niceleme dosyası örneği. Veriler önce her zaman noktasında arka plan yatırım getirisi yoğunluk değerine normalleştirilir. Bu değer daha sonra son 30 s ön stimülasyon için faiz taban çizgisi değerinin ortalama ROI ile karşılaştırılır (burada basitlik için 1 s aralıklarla 10 s olarak gösterilmiştir) (ΔF). Bu değişiklik daha sonra temel floresanın (ΔF / F) bir kısmı olarak hesaplanır. Son olarak, başlangıç noktası değeri 1 olarak ayarlanır, böylece artışlar veya azalmalar zaman içinde grafiksel olarak kolayca görselleştirilebilir. Nöron başına en az beş puncta bölgesi ve deneysel koşul başına en az on nöron toplanır ve bunun gibi veriler her zaman noktasında ortalama ölçümler üretmek için birleştirilir. (F) (E) örneğindeki gibi bir elektronik tablo dosyasındaki veriler, bir grafik ve istatistik yazılımı programına taşınır. Burada gösterilen grafik için, deneysel bir koşulun tüm puncta bölgeleri üzerinden ortalaması alınan her zaman noktasındaki ΔF/F değeri, ortalamanın standart hatasıyla birlikte çizilir. Buradaki grafik, (D) de belirtilen GFP'ye karşı GA50 deneylerinden elde edilen verilerdir; burada taban çizgisinin son 10 s'si ve stimülasyon periyodunun ilk 10 saniyesi gösterilmiştir ve Jensen et al. 202043'ten yeniden basılmıştır. (G) Bu tahlil, ara sinaptik salınım için eğriler üretebilir ve sadece "ya hep ya hiç" yanıtı değildir. GA50, eksojen sinaptik protein SV2 (sinaptik vezikül ile ilişkili protein 2) ile birlikte eksprese edildi ve önceki adımlarda belirtildiği gibi stiril boya görüntüleme ve analizi yapıldı. Şekil 3F'de olduğu gibi, burada gösterilen grafik, deneysel bir koşulun çizildiği tüm puncta bölgeleri üzerinden ortalaması alınan her zaman noktasındaki ΔF / F değerini, ortalamanın standart hatasıyla birlikte temsil eder. Grafik, taban çizgisinin son dakikasını ve Jensen ve ark. 202043'ten stimülasyon periyodunun ilk dakikasını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Steril boya görüntüleme deneyinin temsili videosu. Gösterilen, stiril boya ile yüklü kortikal bir nöronun temsili bir videosudur. Video, yüksek KCl aCSF'nin banyo perfüzyonu sırasında başlayan dönemi göstermektedir. Kutulu bölge, zaman içinde gözlemlenebilir puncta floresan kaybı ile nöritleri vurgular. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Bölüm 7'de açıklanan yöntemi takiben, KCl depolarizasyonundan önce ve sonra GcaMP6m ile transfekte edilen kortikal nöronların temsili floresan görüntüleri gösterilmiştir (Şekil 4A). Ham yoğunluk grafikleri, dalgalanan artmış floresan değerlerini göstererek, KCl kaynaklı depolarizasyonu takiben nöritlere kalsiyum girişini göstermektedir (Şekil 4B). Bu ikinci temsili video, bu etkiyi göstermek için kayıt başlangıç döneminin sonunda GcaMP6m'yi düşük floresanla ifade eden nöronları göstermektedir. Stimülasyonun başlangıcında, nöronlar dramatik bir floresan artışı gösterir (Video 2). Bu yaklaşım, mutant bir FUS-ALS modelinde kalsiyum giriş değişikliklerini göstermek için başarıyla kullanılmıştır. Bu modeldeki astrositler, CMV promotör güdümlü eGFP-FUS plazmidleri içeren adenovirüs ile transdüke edildi. Mutant FUS eksprese eden astrositlerden şartlandırılmış ortam motor nöronlara yerleştirildiğinde, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) + siklotiazid stimülasyonunu takiben mutant olmayan FUS koşullarına kıyasla artmış kalsiyum akışı gözlenmiştir (Şekil 4C)44. Bu tahlilin duyarlılığı, perfüzyon ortamına dahil edilen kalsiyum içeren ve içermeyen deneyler yapılarak test edilmiştir. Yukarıda bahsedilen GA50'ye karşı GFP ayarında, motor nöronları içeren GA50'de artmış pik kalsiyum geçicileri gözlenmiştir. Özellikle, bu, iç kalsiyum depolarının salınımına değil, hücreye gelen kalsiyuma bağlıydı. Kalsiyum uyarıcı aCSF ortamından çıkarıldığında, her iki deneysel durumda da kalsiyum geçici yanıtları kaydedilmemiştir (Şekil 4D)43.

Figure 4
Şekil 4: GCaMP muhabirlerini kullanarak kalsiyum geçicilerini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek. (A) GFP floresansının yoğunluğunu göstermek için nöron, sahte renkli (mavide düşükten kırmızıda yüksek) bir GCaMP6m'nin 40x görüntüsü. Soldaki paneller, stimülasyon öncesi ve sonrası 40x görüş alanının tamamını gösterir. Ölçek çubuğu 20 μm'yi gösterir. Sağdaki görüntüler, ortaya çıkarılan kutulu alanların yakınlaştırılmış versiyonlarıdır. Bu görüntüler sayesinde, stimülasyonu takiben fokal nöritik kalsiyum seviyelerinde sağlam bir artış olduğu gözle görülür. Ölçek çubuğu 12 μm'yi gösterir. (B) Deney boyunca ROI seçimi ve floresan yoğunluğu izlemesi Şekil 3'te olduğu gibi gerçekleştirilir. GCaMP30m floresan izlemesi yapılan bir nöronun seçilen iki ROI'si için son 30 s taban çizgisi ve 1 dakikalık stimülasyon burada gösterilmiştir. Steril boya görüntülemenin aksine, nöronal stimülasyonu takiben floresan yoğunluğu artar. Ek olarak, burada belirtildiği gibi, kalsiyum geçicileri zamanla nöritlerde dalgalanır; bu nedenle, sonuçlar tipik olarak her ROI bölgesi için ortalama tepe normalleştirilmiş floresan değişim değeri olarak temsil edilir. (C) Böyle bir deneyin temsili nicelleştirilmesi, Kia-McAvoy ve ark. 201844'te yayınlandığı gibi, mutant FUS-ALS astrositlerinden türetilen süpernatant alan birincil motor nöronların, astrositleri ifade eden vahşi tip FUS 'dan süpernatant alan nöronlara kıyasla, AMPA reseptör stimülasyonunu takiben önemli ölçüde artmış kalsiyum akışı gösterdiği gösterilmiştir. (D) Kalsiyumun uyarıcı aCSF'ye dahil edilmediği kalsiyum geçici görüntülemenin temsili miktarı. Jensen et al. 202043'te yayınlandığı gibi, kalsiyumlu veya kalsiyumsuz yüksek KCl aCSF ile uyarılan mCherry'ye karşı GA50-mCherry koşulları gösterilmiştir. GA50 içeren nöronlar, mCherry içeren hücrelere kıyasla artmış pik kalsiyum akışı gösterdi. Her iki deneysel durumda da, kalsiyum yüksek KCL aCSF'yi uyarmaktan çıkarıldığında iç kalsiyum düzeylerinde yükselme yoktu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: GCaMP kalsiyum geçici deneyinin temsili videosu. Gösterilen, GCaMP6m ile transfekte edilen kortikal nöronların bir alanının temsili bir videosudur. Bir başlangıç periyodundan sonra, yüksek KCl aCSF uygulandığında 6 s işaretinde büyük bir kalsiyum akışı kaydedilir. Kalsiyum girişi, tüm hücre için veya tarif edildiği gibi belirli nörit bölgelerinde ölçülebilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Olası sorunlar Olası nedenler/çözüm
1 Spesifik olmayan yükleme Yükleme süresi konusunda hassas olun. Daha uzun yükleme süreleri, FM4-64'ün endozomlara ve lizozomlara spesifik olmayan yüklenmesine neden olur
2 Kontrol nöronlarında kayda değer bir ekzositoz yok Yüksek KCl aCSF çözeltisinin pH'ını kontrol edin.
3 Odak kaybı ve yanal kayma Mükemmel odağın açık olduğundan emin olun. Nikon yazılımını veya ImageJ eklentisini kullanarak görüntüleme sonrası görüntüleri hizalayın.
4 FM4-64 floresan ağartma Görüntüleme için kullanılan lazer yoğunluğunu kontrol edin. Her zaman mümkün olan en düşük yoğunluğu kullanmaya çalışın. Kullanılan lazer yoğunluğunun, deneme sürüşleri yaparak ağartmaya neden olmadığını doğrulayın.

Tablo 2: Steril boya deneyleri için olası sorunlar ve sorun giderme. Sorunlar için tipik senaryolar ve sinaptik boşaltma denemeleri için genel sorun giderme.

Olası sorunlar Olası nedenler/çözüm
1 Transfeksiyon verimliliği çok düşük Nöronal sağlığı kontrol edin. Nöronların transfekte edilmesi zorsa, GCaMP'nin AAV veya lentiviral transdüksiyonuna geçilebilir.
2 GCaMP6 floresansının çekirdekte birikmesi Tehlikeye atılmış nöronal sağlık. Transfeksiyon protokolünü kontrol edin.
3 Odak kaybı ve yanal Görüntü kayması Mükemmel odağın açık olduğundan emin olun. Nikon yazılımını veya ImageJ eklentisini kullanarak görüntüleme sonrası görüntüleri hizalayın.
4 KCL stimülasyonu üzerine kalsiyum yanıtı yok aCSF'nin pH'ının doğru olduğundan emin olun.
5 GCaMP6 floresan ağartma Görüntüleme için kullanılan lazer yoğunluğunu kontrol edin. Her zaman mümkün olan en düşük yoğunluğu kullanmaya çalışın. Kullanılan lazer yoğunluğunun, deneme sürüşleri yaparak ağartmaya neden olmadığını doğrulayın.
6 Nöritlerin ağartılması Transfeksiyon nedeniyle tehlikeye giren nöronal sağlık. Yeni bir nöronal kültür grubu kullanın.

Tablo 3: Nöritlerde kalsiyum geçicilerinin görüntülenmesinde olası sorunlar ve sorun giderme. GCaMP kalsiyum geçici deneyleri için sorunlar için tipik senaryolar ve genel sorun giderme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan her iki yöntemde de ortak olan üç adım, deneysel başarı ve ölçülebilir sonuçlar için çok önemlidir. İlk olarak, ekteki talimatları izleyerek, her deney turundan önce taze aCSF'nin hazırlanması esastır. Bunun yapılmaması, uygun nöronal depolarizasyonu önleyebilir. Tedavi edilmemiş kontrol nöronlarının bir örneği, uygun hücresel depolarizasyonu sağlamak ve bu görüntüleme seansında elde edilen olumlu sonuçlar için bir ölçüt sağlamak için herhangi bir deney grubunun uyarılmasından önce sürekli olarak test edilmelidir. İkincisi, belirli sinaptik bölgeler için zaman içinde floresanı başarılı bir şekilde izlemek için, görüntüleme parametrelerini ve izleme için ROI alanlarını ayarlarken de özel dikkat gösterilmelidir. Temel dönem kaydı derhal stimülasyon kayıt periyoduna geçmelidir. Steril boya salınımının tek bozunma dinamiklerini yakalamak için yeterince hızlı bir kare hızı (2 görüntü/sn) gereklidir. Son olarak, deney analizinde kritik bir adım, floresan ölçümlerinin önce görüntüleme arka planına ve daha sonra önceden uyarılmış taban çizgisine normalleştirilmesidir. Diğer görüntüleme protokollerinde olduğu gibi, KCl ortamının eklenmesinin getirebileceği herhangi bir arka plan otofloresansını kaldırmak için önce boş bir görüntüleme bölgesinin çıkarılması tüm eşleştirilmiş zaman-floresan ölçümlerinde gerçekleştirilir. Ayrıca, stimülasyondan önce son 30 s taban çizgisinden her ROI için ortalama floresan okumasını ölçmek ve hesaplamak da önemlidir. Bu ortalama başlangıç değeri daha sonra "taban çizgisinden değişim" yoğunluğunu ölçmek için tanımlanmış bir başlangıç noktası olarak bu YG için tüm zaman ölçümlerinde kullanılır.

Birincil nöronal kültürün eksojen DNA ile transfekte edilmesi zordur ve optimize edilmiş protokoller bile sıklıkla kültürdeki toplam hücrelerin düşük verimliliğini sağlar. Transfeksiyon etkinliğinin% 20-25'i, nöronal kültürlerimizde, transfeksiyona bağlı toksisiteye dair hiçbir kanıt olmaksızın yaygın olarak elde edilir. GCaMP içeren hücreler arasında oldukça tutarlı ifadeler görülürken, bireysel hücreler içindeki ince olarak farklı prob ekspresyon seviyeleri, bu taban çizgisine kıyasla taban çizgisindeki flüoresandaki değişimin bireysel bölge nicelleştirilmesi yöntemine dayanarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu nispeten düşük verimlilikle, GCaMP muhabirini tanıtmak için transfeksiyon tabanlı yöntemler kullanmak, yüksek verimli tarama çalışmaları için büyük ölçekli biyolojik kopyalar için yeterli sağlamlığa sahip değildir. Bunun üstesinden gelmek için, lentiviral veya adenoviral paketleme veya hücre soyuna özgü ekspresyon için ticari olarak çeşitli varyant yapıları mevcuttur, bu da daha yüksek transdüksiyon verimliliklerine izin verecektir. Bu protokolleri kullanırken istenebilecek birincil modifikasyon, KCl62'nin banyo uygulaması yerine nöronların optogenetik stimülasyonunu kullanmaktır. Şu anda mevcut olan kanalrodopsinlerin ailelerinden birini ifade etmek için tasarlanmış lentiviral yapılarla transdüksiyon, ardından ışığın belirli dalga boyları ile aktivasyon, nöronların alt kümelerinin depolarizasyonu için mekansal kontrole ve ayrıca aksiyon potansiyeli trenlerinin tekrarlayan kalsiyum akışı seviyeleri ve sinaptik vezikül depolarının tükenmesi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine olanak tanır63 . Bununla birlikte, bu yöntemin kullanımının şu anda biraz kısıtlı olduğunu akılda tutmak önemlidir, çünkü kullanıcı optogenetik raporlayıcılarının, sinaptik raporlayıcılarının ve ekzojen olarak tanıtılan proteinlerin, kullanılan floroforlar arasında spektral örtüşme olmadığından emin olmalıdır. Steril boyayı kullanırken karşılaşılan yaygın bir sorun giderme sorunu, temel kayıt döneminde pasif yoğunluk azaltımıdır. Deneysel çalışmalardan önce, fotobeyazlatma etkilerini en aza indirmek için lazer yoğunluğunu ve fotoğraf yakalama aralıklarını optimize etmek çok önemlidir. Deneylerin dikkate alınması için, temel dönemin en az son 30 saniyesi için yoğunluğun stabilizasyonu gereklidir. Sırasıyla stiril boya ve kalsiyum geçici deneyleri için yaygın problemler ve çözümleri için Tablo 2 ve Tablo 3'e bakınız.

Bu iki yöntemin birincil sınırlaması, kültürlerin yalnızca tek bir durumda uyarılabilmesi ve incelenebilmesidir. Banyo uygulaması depolarizan ajan KCl'yi tanıtmak için kullanıldığından, o çanaktaki bu durumdan incelenecek tüm nöronlar mikroskop hedefinin ilk görüş alanı içinde olmalıdır. Zaman içindeki işlevsellik ilgi çekiciyse, eşleştirilmiş kültürler gereklidir. Ancak yukarıda bahsedilen optogenetik yöntem, istenirse kalsiyum dinamiklerinin zaman içinde gözlemlenmesini sağlayacaktır. Ek olarak, nöronların sinaptik veziküllerin geri dönüşümünde bir kusuru varsa, stiril boyanın ilk yüklenmesi bozulacaktır. İç yoğunluk normalizasyonu koşullar arasında karşılaştırmaya izin verirken, yanıtların büyüklüklerindeki küçük farklılıkların tespit edilmesi zor olabilir. Son olarak, bu muhabirlerin yeni yinelemeleri hızla kullanılabilir hale geldi ve daha hızlı algılama süreleri veya daha sağlam sonuçlar için kapatılabilir. Örneğin, GCaMP6m artık sinaptik terminallerde kalsiyum geçicilerinin en hızlı raporlayıcısı olarak kabul edilmemektedir. Bunun yerine, en son nesil jGCaMP864 kullanılabilir.

Burada açıklanan yöntemler, nöronların genetik veya farmakolojik manipülasyonunun fonksiyonel sinaptik sinyal ve salınımı bozup bozmadığını belirlemenin hızlı ve güvenilir bir yoludur. Ayrıntılı deneyler, geleneksel voltaj / akım kelepçesi elektrofizyolojisi ve elektron mikroskobundan daha az teknik olarak daha az zorlu ve daha az maliyetlidir. Ek olarak, elektrofizyoloji doğası gereği düşük verim ve bireysel hücre düzeyinde olsa da, burada açıklanan protokoller daha yüksek verim ve hızlıdır, bu da birkaç nöronun aynı anda görüntülenmesine ve birçok yinelemenin tek bir görüntüleme oturumunda gerçekleştirilmesine izin verir. Bu kalsiyum dinamikleri ve sinaptik salınım paradigmalarının, ALS modellerinde sinaptik iletim değişikliklerinin ilk göstergesi olarak kullanılması ve diğer nöronal dejenerasyon formlarının incelenmesi önerilmektedir. Gcamp6m ve stiril boya görüntülemeden elde edilen sonuçlar, belirli bir sinaptik disfonksiyon mekanizmasını tam olarak ortaya çıkaramasa da, bu bulgulara dayanarak, araştırmacılar daha sonra ilgili kanalları, sinaptik vezikül sayısını veya kantial içeriği belirlemek için geleneksel yöntemleri kullanarak hedefli, kanıta dayalı tamamlayıcı çalışmalar yürütebilirler.

Bu protokollerdeki fayda, spesifik ALS modellerinde uygun depolarizasyon aracılı kalsiyum akışı ve / veya sinaptik vezikül füzyonundaki değişikliklerin hızlı ve basit bir şekilde değerlendirilmesidir. Son zamanlarda bunu, C9ORF72 hekzanükleotid tekrar genişlemesinden kaynaklanan dipeptid proteinini (glisin-alanin)50 eksprese eden kortikal nöronlarda artan kalsiyum akışını ve sinaptik boşaltmanın yok edilmesini gösteren bir yayında gösterdik43. Yayınlanmış çalışmamızda gösterildiği gibi, bu yöntemler mutant RNA'ların veya ilgili proteinlerin birlikte transfeksiyonu ile birlikte veya doğrudan transgenik hayvan modellerinden kültürlenmiş hücrelerde kolayca gerçekleştirilebilir43. Ek olarak, bu protokollerin güvenilirliği ve sağlamlığı, nöronal olarak farklılaşmış insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde başarıyla test edilmiştir45 ve gelecekteki çalışmaların doğrudan hasta kaynaklı hastalıkla ilgili hücrelerde yapılmasını sağlamıştır. Yakın tarihli bir başka makalede, vahşi tip motor nöronların, astrositleri eksprese eden mutant FUS'tan salınan çözünür bir faktörün varlığında stimülasyonu takiben yüksek kalsiyum akışına uğradığına dair kanıtlar sunuyoruz44. Astrositik kalsiyum sinyal olayları da komşu nöronlardaki sinaptik iletim ile derinden iç içe geçmiştir65. Kalsiyum dinamiği protokolü, hem kemirgenlerin birincil hem de insan IPS türevi hücrelerinde etkili olduğu kanıtlanmış astrositik kültür modellerinde tüm hücre kalsiyum geçicilerini araştırmak için uygulanmıştır. ALS modellerinde astrositik kalsiyum dinamiği ve sinyalizasyonun daha iyi anlaşılması, sinaptik iletimin sonuç olarak nasıl etkilenebileceğine dair değerli bilgiler sağlayacaktır. Nihayetinde, hücre tipine özgü GCaMP muhabirlerinin kullanılması, karışık ko-kültür ortamlarında nöronal ve astrositik kalsiyum dinamiklerini araştırmak ve her hücre popülasyonundan kaynaklanan hücre dışı özerk etkileri özel olarak değerlendirmek için güçlü bir araç olacaktır.

Son olarak, bu yöntemlerin potansiyel kullanımı sadece ALS çalışmasının ötesine değil, aynı zamanda nörodejeneratif ve hatta gelişimsel sinirbilimin daha geniş alanlarına da uzanmaktadır. Temsili sonuçlar üretmek için kullanılan spesifik plazmidler hakkında ayrıntılı bilgi sağlanmış ve FUS, SOD1 ve C9ORF72 hekzanükleotid tekrarlarının ve dipeptidlerin43,44,66,67,68 birçok farklı genetik varyantını içeren plazmidlerin transfeksiyonunda başarılı olmuştur. Plazmidlerin nöronlarda kullanılan bir promotör içermesi koşuluyla, bu yöntemler kullanılarak hangi ALS veya dejeneratif hastalık modellerinin çalışılabileceği konusunda bir sınırlama yoktur. Ayrıca, mutant proteinleri eksprese etmek için transfeksiyon tamamen isteğe bağlı bir adımdır. Transgenik hayvanlardan veya insan tarafından türetilen hücrelerden üretilen kültürler, ilgilenilen mutant proteini içeren hücreleri tanımlama ihtiyacını ortadan kaldırır. Halen, bu sistemler, stiril boya kullanılacaksa, TRITC kanalının işgal edileceği ve GcaMP6 kullanılıyorsa, FITC kanalının işgal edileceği şekilde kısıtlanmıştır. Nöronal ve astrositik aktivitenin gerçek zamanlı olarak incelenmesine izin veren teknikler, sinaptik olgunlaşma / dejenerasyon için zaman-kurs analizini anlama olanaklarını ve ayrıca farmakolojik bileşiklerin nöronal iletişimi teşvik etmede veya baskılamadaki etkinliği için hızlı testleri genişletir. Bu iki yöntem, tarama için yüksek aktarım hızı ölçeklendirmesine uygundur. Nöronları bireysel 35 mm'lik tabaklarda kaplamak yerine, bu iki protokolün görüntüleme parametreleri 96 kuyucuklu plakalarda otomatik bir şekilde kullanılabilir. Böyle bir platform kullanılarak, bileşik kütüphaneler, kalsiyum girişini modüle eden veya genetik bir hastalık modeli veya hatta doğrudan hastalardan türetilen hücreler kullanarak sinaptik salınımı iyileştiren terapötikler için hızlı bir şekilde test edilebilir. Bu yöntem, daha fazla araştırma için aday molekülleri hızla tanımlayarak alt gruba özgü veya hatta kişiselleştirilmiş terapötiklerin olasılığını hızlı bir şekilde izleyebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Jefferson Weinberg ALS Merkezi'nin mevcut ve eski üyelerine, bu teknikleri ve analizlerini optimize etmek için eleştirel geri bildirim ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH (RF1-AG057882-01 ve R21-NS0103118'den D.T.'ye), NINDS (R56-NS092572 ve R01-NS109150'den P.P.'ye), Kas Distrofisi Derneği (DT), Robert Packard ALS Araştırma Merkezi (D.T.), Family Strong 4 ALS vakfı ve Farber Family Foundation (B.K.J., K.K ve P.P.) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20x air objective Nikon For imaging
40x oil immersion objective Nikon For imaging
B27 supplement Thermo Scientific 17504044 Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL Thermo Scientific 13-689-8 Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood Baker SterilGARD III SG403A Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol Millipore Sigma M3148 For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9418 For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate Millipore Sigma 223506 Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator Thermo Scientific 13-998-123 For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge Eppendorf 5810R For neuronal culture preparation
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti +A1R core For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera Photometrics For image acquisition
D-Glucose Millipore Sigma G8270 Component of aCSF solutions
DNase Millipore Sigma D5025 For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats Charles river 400SASSD For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube Nikon 77032509 For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye Invitrogen T13320 For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5) CellVis D35-10-1.5-N For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette Grainger 52NK56 For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Millipore Sigma H6648 For preparing neuronal cultures
HEPES Millipore Sigma H3375 Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
horse serum Millipore Sigma H1138 For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood NUAIRE NU-301-630 For preparing neuronal cultures
Laminin Thermo Scientific 23017015 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Scientific 11415064 For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Scientific 21083027 For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM) Thermo Scientific 25030149 Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Scientific 11668019 For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF) For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride Millipore Sigma 208337 Component of aCSF solutions
Microsoft Excel Microsoft Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES Thermo Scientific 565-0020 Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium Thermo Scientific 21103049 For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research Nikon Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes Thermo Scientific 339650 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes Thermo Scientific 339652 For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep Millipore Sigma D1556 For preparing neuronal cultures
Papain Millipore Sigma P4762 For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Scientific 15140122 To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system Warner Instruments SF-77B For exchange of aCSF
Perfusion tubing Cole-Parmer UX-30526-14 Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid Addgene 40754 For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide Millipore Sigma P7886 Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride Millipore Sigma P3911 Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761 Component of aCSF solutions
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888 Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator Tokai Hit For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube Nikon 77032809 For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor Millipore Sigma T6414 For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table New Port VIP320X2430-135520 Table/stand for microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16 (2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13 (2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722 (2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113 (2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570 (2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583 (2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427 (2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

Tags

Nörobilim Sayı 173
Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, K., Trotti, D.,… More

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (173), e62813, doi:10.3791/62813 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter