Summary

얼룩말 피시 가스트룰라의 2광자 현미경을 사용하여 깊고 공간적으로 제어된 볼륨 절제

Published: July 15, 2021
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Summary

배아 발달은 세포 운동의 대규모 조정을 요구합니다. 2광자 포동 중재 레이저 절제는 심층 세포의 큰 그룹의 공간 적으로 제어 된 3 차원 절제를 허용한다. 또한, 이 기술은 생체 내에서 집단적으로 이동하는 세포의 반응을 기계적 환경에서 의 동요로 조사할 수 있다.

Abstract

Morphogenesis는 조직과 기관으로 세포를 조직하기 위하여 많은 세포 운동을 관련시킵니다. 적절한 개발을 위해서는 이러한 모든 움직임을 엄격하게 조정해야 하며 증거를 축적하면 적어도 부분적으로는 기계적 상호 작용을 통해 이 것을 달성해야 합니다. 태아에서 이것을 시험하는 것은 직접적인 물리적 인 동요를 필요로 합니다. 레이저 절제는 기계적 제약을 완화하거나 두 세포 집단을 물리적으로 격리할 수 있는 점점 더 많이 사용되는 옵션입니다. 그러나, 많은 절제는 제한된 축 분해능 및 조직 침투를 제공하는 자외선 (UV) 레이저로 수행됩니다. 방법은 2광자 현미경을 사용하여 깊고, 중요하고, 공간적으로 잘 정의된 볼륨을 축하하기 위하여 여기에서 기술됩니다. 절제는 축 중음근에서 녹색 형광 단백질을 표현하는 형질 형질 제브라피 시라인에서 입증되고 과열 된 자궁 또는 기본 노른자 세포에 영향을 주지 않고 축 성 메센도더름을 절단하는 데 사용됩니다. 세포 행동은 절제 전후에 살아있는 화상 진찰에 의해 감시됩니다. 절제 프로토콜은 몇 미크론에서 백 미크론에 이르는 비늘에서 모든 세포 유형 또는 조직에 다른 발달 단계에서 사용할 수 있습니다.

Introduction

세포 세포 상호 작용은 개발에 중요한 역할을합니다. 세포는 그들의 직접적인 이웃, 또는 더 멀리 세포가, 그들의 운명 및/또는 행동에 영향을 미치는, 인식할 수 있는 신호를 제공합니다. 이러한 신호의 대부분은 본질적으로 화학 물질이다. 예를 들어, 잘 특징인 유도 이벤트에서, 한 세포 그룹은 다른 세포 집단의 운명에 영향을 미치는 확산 분자를 생성1. 그러나 다른 신호는 기계적입니다. 세포는 이웃이 인식하고 대응하는 이웃에게 힘과 제약을 행사합니다2.

생체 내에서 이러한 세포 세포 상호 작용의 중요성을 연구 하는 한 가지 방법은 일부 세포를 제거 하 고 후속 개발을 관찰 하는. 불행히도 세포를 제거하거나 파괴하는 데 사용할 수 있는 기술은 제한됩니다. 세포는 바늘 또는 작은 전선을 사용하여 외과적으로 제거 될 수 있지만, 이러한 치료는 침습적이며 매우 정확하지 않으며 일반적으로 현미경으로 즉시 이미징을 방지하여 스테레오 현미경으로 수행됩니다. 또한 깊은 세포를 대상으로 하는 것은 조직 과대 결막에 구멍을 뚫고 원치 않는 혼란을 일으킵니다. KillerRed와 같은 유전적으로 인코딩된 광세제는 빛 조명을 통해 세포 사멸을 유도하는 데 사용되어 왔다5. 광세제는 빛 조사 시 반응성 산소 종을 생성하는 크로모포라이트입니다. 그들의 주요 한계는 세포가 움직이는 경우에 달성하기 어려울 지도 모르다 긴 빛 일루미네이션 (약 15 분)를 필요로 하고, 즉각적인 것이 아닙니다 세포 사멸을 통해 세포 죽음을 유도한다는 것입니다.

마지막으로, 레이저 절제는 개발 되었으며 널리 지난 15 년 동안 사용 되었습니다6,7,8,9,10,11,12. 레이저 빔은 표적 세포/조직에 초점을 맞습니다. 그것은 가열을 통해 그것의 절제를 유도, 광절, 또는 플라즈마 유도 절제; 관련 프로세스는 전력 밀도 및 노출 시간13에 따라 달라집니다. 대부분의 절제 프로토콜은 높은 에너지에 자외선 레이저를 사용합니다. 그러나, UV 광은 모두 흡수되고 생물학 조직에 의해 산란됩니다. 따라서 깊은 세포를 대상으로하려면 높은 레이저 전력이 필요하며, 이는 더 피상적이고 평면 외 조직에서 손상을 유도합니다. 이것은 표면 구조에 UV 레이저의 사용을 제한하고 상대적으로 낮은 축 해상도를 설명합니다. 비선형 광학(소위 2광자 현미경 검사법)은 적외선 영역에서 약 반 에너지의 두 광자를 가진 형광을 자극하기 위해 빛의 비선형 특성을 사용합니다. 절제에 적용하면 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 적외선은 생물학적 조직에 의해 UV 빛보다 덜 산발적이고 덜 흡수되어 필요한 레이저 전력을 증가하지 않고 더 깊은 구조물에 도달할 수 있습니다. 둘째, 펨토초 펄스 레이저의 사용은 매우 높은 전력 밀도를 제공하여 플라즈마 유도를 통해 절제를 생성하며, 이는 가열과는 달리 공간적으로 확산되지 않습니다15. 셋째, 플라즈마 형성을 유도하는 전력 밀도는 초점에서만 도달한다. 이러한 특성 덕분에, 2광자 레이저 절제는 주변 조직 환경에 영향을 주지 않고 깊은 세포를 정확하게 표적으로 하는 데 사용될 수 있다.

집단 이동은 세포 세포 상호 작용이 기본인 발달 과정의 훌륭한 예입니다. 집단 이동은 인접한 세포가 하나의 cell16의 동작에 영향을 미치는 세포 마이그레이션으로 정의됩니다. 이러한 상호 작용의 본질 (화학 또는 기계적) 그리고 세포 마이그레이션에 미치는 영향은 크게 다를 수 있으며 종종 완전히 이해되지 않습니다. 세포를 제거하고 이것이 다른 사람들에게 어떻게 영향을 미치는지 관찰하는 능력은 이러한 집단 적 과정을 더욱 해명하는 데 중요합니다. 몇 년 전, 우리는 제브라피쉬 위장 중 폴스터의 이주가 집단 이주라는 외과 적 접근법을 사용하여 설립했습니다17. polster는 배아18의 등쪽 측에 있는 첫번째 내재화 세포를 구성하는 세포의 단입니다. Tg(gsc:GFP) 형질전환선에서 녹색으로 표지된 이 세포는 태아 의 깊은 곳에 위치하며, 에피블라스트 세포의 여러 층 아래에 있습니다. 위질 도중, 이 단은 축 중구의 확장을 이끌고, 배아 조직자에서 동물 극으로 이동19,20,21,22,23 (도 1A). 우리는 세포가 동물 극의 방향으로 그들의 이주를 방향을 그들의 이웃과 접촉이 필요하다는 것을 설치했습니다. 그러나, 이 집단 이주의 세포 및 분자 기지를 더 잘 이해하는 것은 이것이 나머지 그들에 어떻게 영향을 미치는지 보기 위하여 몇몇 세포를 제거하는 관련시킵니다. 따라서 우리는 2광자 현미경 설정을 사용하여 크고 깊은 양의 절제를 개발했습니다. 여기에서, 우리는 Histone2B-mCherry로 표지된 핵을 추적하여 중앙에 있는 polster를 단절하고 세포 이동에 대한 결과를 관찰하기 위하여 이 프로토콜의 사용을 보여줍니다.

Protocol

모든 동물 작업은 윤리위원회 N 59와 미니스티에르 드 l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche에 의해 승인되었다 파일 번호 APAFIS#15859-2018051710341011v3. 아래에 설명된 단계 중 일부는 장비 및 소프트웨어에 만지지만 다른 장비에 쉽게 적응할 수 있습니다. 1. 사출 준비 배아 매체(EM)에서 1% 아가로즈 용액의 75mL를 준비한다. 주입 금형을 90mm 페트리 접시…

Representative Results

중간에 폴스터를 끊기 위해, Histone2B-mCherry mRNAs로 주입된 Tg(gsc:GFP) 배아는 4단계에서 설명된 바와 같이 70% 에피보리 스테이지에 장착되었다. 폴스터는 GFP 발현에 의해 확인되었고, 배아는 폴스터의 평면이 광학 축(도 1B)에 수직되도록 장착되었다. 이 위치에서 배아를 기울이면 절차가 복잡해집니다. 빛은 절제 비행기에 도달하기 위해 더 많은 조직을 통과해야하며, 절?…

Discussion

여기서는 비선형 광학을 사용하여 깊고 공간적으로 잘 정의된 볼륨 절제를 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜의 가장 중요한 단계는 과도한 파편이나 캐비테이션을 피하기 위해 절제를 허용하지만 너무 많은 에너지를 허용하는 충분한 에너지를 제공하는 치료 조건을 찾는 것입니다. 대상 부위에 전달되는 에너지의 양은 주로 레이저 출구 전력, (2) 레이저 정렬의 품질, (3) 빛이 절제 평면…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 물고기 관리에 대한 에밀리 메넌트, 폴리 테크닉 바이오 이미징 시설, 특히 피에르 마후, 부분적으로 레지온 일 드 프랑스 (interDIM)와 기관 국립 드 라 레체체 (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04)에 의해 지원 자신의 장비에 라이브 이미징에 대한 지원을 제공합니다. 이 작품은 ANR 보조금 15-CE13-0016-1에 의해 지원되었다, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016, 그리고 마리 Skłodowska-Curie 보조금 협정에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 No 840201, 미니슈레 드 l’Enseignement Supérieur et de la Recherche 및 국립 센터 드 라 리셔.

Materials

25x water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
Agarose PanReac AppliChem A8963,0500
Data analysis software : Matlab Math Works
Electro-optic modulator (EOM) ConOptics 350-80LA
Embryo Medium (EM) solution Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000).
Environmental chamber chamber Okolab H201-T-UNIT-BL
EOM driver ConOptics 302RM
Fluorescence source Lumencor SOLA
Glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C
Glass capillaries Harvard Apparatus 300085 Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm
Glass pipettes Volac D810 Tip should be fire polished
Green/ablation laser Spectra Physics Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012)
Image analysis software: IMARIS Bitplane
ImSpector software Abberior Instruments Development Team
Injection mold Adapative Science Tools I-34
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micromanipulator Narishige MN-151
Micropipette puller Sutter P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
Penicillin-Streptomycin Thermofisher 15140-122 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml
Photomultiplier tube (PMT) Hammamatsu H7422-40
PicoPump (Air injector) World Precision Instrument PV820
Red laser Spectra Physics OPO/Insight DeepSee
RNAse free water for injection Sigma W3500
Spreadsheet software: Excel Microsoft
Stereomicroscope Nikon SMZ18
Tg(gsc:GFP) zebrafish line Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
TriM Scope II microscope La Vision Biotech

References

  1. Slack, J. M. W. Embryonic induction. Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).
  2. Fernandez-Sanchez, M. -. E., Brunet, T., Röper, J. -. C., Farge, E. Mechanotransduction’s impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
  3. Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
  4. Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
  5. Bulina, M. E., et al. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).
  6. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
  7. Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
  8. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -. P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, 219-235 (2015).
  9. Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
  10. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
  11. Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
  12. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
  13. Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition – Four Volume Set. , (2019).
  14. Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
  15. Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
  16. Theveneau, E., David, N. B. Migrations cellulaires collectives. Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).
  17. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
  18. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
  19. Montero, J. -. A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -. P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
  20. Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
  21. Kai, M., Heisenberg, C. -. P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
  22. Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
  23. Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
  24. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
  25. Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), 518-521 (2003).
  26. Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -. A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
  27. Farhadifar, R., Röper, J. -. C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
  28. Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. . Foundations of Experimental Embryology. , (1964).
  29. Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
  30. Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).

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Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula. J. Vis. Exp. (173), e62815, doi:10.3791/62815 (2021).

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