Summary
使用多孔微孔板的自动测定是识别通路调节剂的有利方法，因为它允许在单个实验中评估多种条件。在这里，我们将完善的巨噬菌体成像和定量方案改编为96孔微孔板格式，并为使用多模读板仪的自动化提供了全面的概述。
Abstract
大吞细胞增多症是一种非特异性液相摄取途径，允许细胞通过大量内吞作用内吞化大细胞外货物，如蛋白质、病原体和细胞碎片。该途径在各种细胞过程中起着至关重要的作用，包括免疫反应和癌细胞代谢的调节。鉴于这种在生物学功能中的重要性，检查细胞培养条件可以通过识别该途径的调节因子并优化用于发现新治疗方法的条件来提供有价值的信息。该研究描述了一种使用标准实验室设备和细胞成像多模读板仪的自动成像和分析技术，用于快速定量贴壁细胞中的大旋囊细胞指数。该自动化方法基于高分子量荧光葡聚糖的摄取，可应用于96孔微孔板，以方便评估一个实验中的多种条件或安装在玻璃盖玻片上的固定样品。这种方法旨在最大限度地提高可重复性并减少实验变异，同时节省时间和成本效益。
Introduction
巨噬细胞增多症的非特异性内吞途径允许细胞通过大量摄取细胞外液及其成分来内化各种细胞外成分，包括营养素、蛋白质、抗原和病原体1。虽然对许多细胞类型的生物学很重要，但越来越多地描述了巨细胞增多途径在肿瘤生物学中起着至关重要的作用，其中通过大囊泡摄取，肿瘤细胞能够在营养耗尽的微环境中存活和增殖2，3。细胞外大分子（包括白蛋白和细胞外基质）以及坏死细胞碎片的摄取，通过大卵子体和溶酶体融合介导的货物分解代谢产生氨基酸、糖、脂质和核苷酸，为生物质生产提供了替代营养来源4，5，6，7，8。
巨噬细胞增多症的诱导和调节是复杂的，并且可能因细胞环境而异。到目前为止，已经确定了几种大吞细胞增多症的诱导剂，包括配体，例如表皮生长因子（EGF），血小板衍生生长因子（PDGF），半乳糖凝集素-3和Wnt3A9，10，11，12，13。此外，模拟肿瘤微环境的培养条件可以触发该途径的激活。胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤营养不足，特别是对于氨基酸谷氨酰胺，它导致癌细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）依赖巨噬细胞增多症生存7，13，14，15。此外，缺氧和氧化应激等肿瘤应激可以激活这种清除途径16。除了可以诱导巨噬细胞增多症的众多外在影响因素外，多种细胞内途径控制着巨噬细胞体的形成。致癌性Ras介导的转化足以启动大棘球机制，多种癌症类型表现出致癌Ras驱动的组成性巨噬细胞增多症4，5，9，17。或者，已经鉴定出野生型Ras激活和Ras非依赖性途径可以激活癌细胞和CAFs中的巨肺细胞增多症10，11，15，18。使用各种体外模型与抑制剂治疗相结合，已经鉴定出几种巨噬细胞增多调节剂，包括钠氢交换剂，小GTP酶Rac1，磷酸肌醇3-激酶（PI3K），p21活化激酶（Pak）和AMP活化蛋白激酶（AMPK）4，13，15.然而，鉴于调节巨噬细胞增多症的众多所述因素和条件，可以想象更多的调节剂和刺激仍未被发现。通过在单个实验中自动评估多种条件，可以促进新型调节剂和刺激的鉴定。这种方法可以阐明参与大卵子体形成的因素，并可能允许发现靶向该途径的新型小分子或生物制剂。
在这里，我们将先前建立的用于在体外测定癌细胞中巨噬细胞中巨噬细胞作用程度的方案调整为96孔微孔板格式以及自动成像和定量19，20。该协议基于荧光显微镜，已成为在体外和体内确定巨肺细胞增多症领域的标准4，5，6，7，9，10，11，12，13，15，16，17，18，19，20，21，22。大卵磷脂体可以通过其内化大分子的能力与其他内吞途径区分开来，例如高分子量葡聚糖（即70 kDa）2，3，4，20，21，22，23。因此，可以通过摄取细胞外施用的荧光团标记的70 kDa葡聚糖来定义大卵子体。结果，大脊髓细胞囊泡表现为细胞内荧光点簇，大小范围为0.2-5μm。这些点可以进行显微镜成像并随后进行定量，以确定细胞中巨肺细胞增多的程度 - "大棘球细胞指数"。
在该协议中，描述了使用标准实验室设备在96孔微孔板和盖玻片上 体外 可视化贴壁细胞中巨卵子体的基本步骤 （图1）。此外，还提供了使用细胞成像多模读板仪自动获取图像和定量大旋心核细胞指数的方向。与我们之前描述的协议相比，这种自动化减少了时间、成本和工作量19，20。此外，它避免了无意中偏倚的成像采集和分析，从而提高了再现性和可靠性。该方法可以很容易地适应不同的细胞类型或读板器，或者用于确定替代的大促卵子体特征，如大小，数量和位置。本文描述的方法特别适用于筛选诱导巨噬细胞增多症的细胞培养条件，鉴定新型调节剂，或优化已知抑制剂的药物浓度。
图1：用于确定贴壁细胞中"大脊髓细胞指数"的自动测定示意图。 使用BioRender创建。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Protocol
1. 准备材料
- 将标有FITC或四甲基罗丹明（TMR）的70 kDa葡聚糖溶解在PBS中，以获得20mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。
- 将DAPI溶解在ddH 2 O中，以获得1mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。
注意：DAPI 是一种潜在的致癌物质，应谨慎处理。 - 在固定当天，在PBS中制备新鲜的3.7%ACS级甲醛。
注意：甲醛是一种固定剂，已知致癌物质，吸入有毒。在化学通风橱中制作溶液，以避免吸入并小心处理。 - 准备酸洗盖玻片。
- 使用500 mL烧杯和水浴在100 mL 1 M HCl中加热直径为12 mm，厚度为#1.5的28 g硼硅酸盐玻璃盖玻片，在56°C下加热24小时。
注意：HCl是一种强酸，具有高度腐蚀性，因此应小心处理，并在化学通风橱中使用，以避免吸入。 - 用蒸馏水清洗盖玻片。重复洗涤4次。然后用95%乙醇洗涤盖玻片。重复洗涤4次。
- 将酸洗的盖玻片储存在室温下的细胞培养皿中，通过浸没在95%乙醇中保持无菌性以备将来使用。用石蜡膜密封培养皿，以避免大量蒸发。
- 使用500 mL烧杯和水浴在100 mL 1 M HCl中加热直径为12 mm，厚度为#1.5的28 g硼硅酸盐玻璃盖玻片，在56°C下加热24小时。
2. 细胞的制备
- 使用与目标贴壁细胞融合的10cm组织培养板，吸出培养基并用5mL DPBS冲洗细胞，在37°C下预热。
- 通过加入1.5mL预热的0.25%胰蛋白酶并在37°C下孵育，将细胞从板中分离出来。
注意：分离目标细胞所需的胰蛋白酶孵育时间应根据经验确定，并且可以通过在常规光学显微镜下观察分离来确认。 - 将细胞收集在15mL离心管中，并加入4.5mL完整培养基以淬灭胰蛋白酶。
- 通过以200× g 离心3分钟沉淀细胞并吸出上清液。
- 将细胞沉淀重悬于足够体积的预热完整培养基中，以获得用于接种的单细胞悬浮液。
- 继续在带有盖玻片或96孔微孔板格式的24孔板上接种细胞（图1）。
注意：应根据经验确定每个细胞系的接种细胞数量，因为细胞系之间的增殖速率和大小各不相同。该协议已针对贴壁癌细胞进行了优化，在大促卵体标记当天具有80%的细胞汇合度。细胞汇合可能影响大囊泡细胞能力，这也应根据经验确定。- 24 孔板，带盖玻片格式
- 将盖玻片加入24孔组织培养板中，使用镊子从乙醇浴中夹住单个盖玻片。将盖玻片轻拍到板的内壁以除去多余的乙醇，并将盖玻片平放在孔的底部。
- 让乙醇蒸发，并用DPBS清洗盖玻片2次。
- 通过向每个孔中加入500μL细胞悬浮液，将细胞接种在盖玻片的顶部。将细胞置于具有5%CO 2 的37°C细胞培养箱中，直到细胞汇合度在巨噬菌体标记前一天达到60%-80%。
- 在大卵泡体标记的前一天，从孔中吸出培养基，向每个孔中加入500μL预热的无血清培养基，并将细胞置于37°C细胞培养箱中，其中5%CO 216-24小时。
注意：根据要研究的条件，建议使用无血清培养基，以减少可诱发巨噬细胞增多症且通常存在于血清中的生长因子的影响。然而，应该考虑到血清饥饿可能会影响其他细胞过程，如增殖和自噬。由于残留血清会影响细胞的大脊髓细胞容量以及抑制剂活性，因此可以通过用500μL预热的DPBS轻轻冲洗细胞1或2次来改善血清的去除。
- 96 孔微孔板形式
- 将细胞悬浮液转移到25 mL试剂储液槽中。使用多通道移液器（8或12个通道），将100μL细胞悬浮液接种到具有光学透明环烯烃或玻璃底的黑色96孔高内涵筛选微孔的每个孔中。
- 将细胞置于具有5%CO 2 的37°C细胞培养箱中，直到细胞汇合度在巨噬菌体标记前一天达到60%-80%。
- 在标记大促卵泡体的前一天，使用多通道移液器（8 或 12 通道）或多通道吸液适配器（用于连接到真空泵的标准吸头）从每个孔中取出并丢弃培养基。
- 使用试剂储液槽和多通道移液器（8或12个通道），轻轻地向每个孔中加入100μL预热的无血清培养基。将细胞置于37°C细胞培养箱中，其中5%CO 216-24小时。
注意：根据要研究的条件，建议使用无血清培养基，以减少可诱发巨噬细胞增多症且通常存在于血清中的生长因子的影响。然而，应该考虑到血清饥饿可能会影响其他细胞过程，如增殖和自噬。由于残留血清会影响细胞的大脊髓细胞容量以及抑制剂活性，因此可以通过用100μL预热DPBS轻轻冲洗细胞1或2次来改善血清的去除。
- 24 孔板，带盖玻片格式
3. 大促卵泡体标记
- 24 孔板，带盖玻片格式
- 吸出孔并用1mg / mL荧光团标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖重新加入200μL无血清培养基。将细胞置于37°C细胞培养箱中30分钟。
注意：根据要研究的条件，而不是使用新鲜培养基，重复使用条件培养基进行葡聚糖上样可能是优选的，因为它将分别含有分泌或补充的因子，例如EGF或抑制剂化合物，可以影响细胞的大棘球细胞能力。 - 吸出培养基，使用预冷的洗涤瓶用冰冷的PBS轻轻但快速地洗涤细胞5次。在洗涤过程中用手用力摇动盘子，以帮助去除粘在盖玻片上的葡聚糖聚集体。
- 通过加入350μL3.7%甲醛并孵育20分钟来固定细胞。然后，吸出固定溶液并用PBS洗涤细胞两次。
- 在PBS中用350μL的2μg/ mL DAPI染色细胞核。20分钟后，吸出DAPI溶液并用PBS洗涤细胞三次。
- 将有机硅隔离器并排放在显微镜载玻片上，以获得成像自动化所需的均匀间距和可重复的盖玻片定位（图2A，B）。
注：整个显微镜载玻片总共可以装有3个隔离器。 - 对于每个盖玻片，在隔离器开放空间内的显微镜载玻片上添加一滴硬化荧光安装介质（图2C）。使用镊子拿起盖玻片，通过在无绒擦拭物上轻轻敲击盖玻片的侧面来去除多余的PBS。
- 将盖玻片倒置在安装介质的落差上（图2D）。使用封闭的镊子轻轻敲击盖玻片，以清除安装介质上的气泡（图2E）。
- 将载玻片存放在黑暗的环境中，让安装介质在室温下干燥，通常需要16-24小时。载玻片现在可以成像或在-20°C下储存长达2周。
- 在成像之前，从显微镜载玻片上取下隔离器。让载玻片平衡到室温，并使用用无氨玻璃清洁剂润湿的棉头涂抹器清洁盖玻片。随后，使用用70%乙醇润湿的清洁棉头涂抹器清洁并保持盖玻片干燥。
- 吸出孔并用1mg / mL荧光团标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖重新加入200μL无血清培养基。将细胞置于37°C细胞培养箱中30分钟。
图 2：将盖玻片放在带有硅胶隔离器的显微镜载玻片上。 （A） 将硅胶隔离器压紧并粘附在显微镜载玻片上。（B）整个显微镜载玻片总共可以填充3个隔离器，从而实现均匀的间距和盖玻片的可重复定位。（C）对于每个盖玻片，在隔离器的开放空间内的显微镜载玻片上添加一滴荧光安装介质。（D）使用镊子，从24孔板上拿起盖玻片，并将其倒置在安装介质的落差上。（E）当盖玻片和显微镜载玻片之间存在气泡时，使用封闭的镊子轻轻敲击盖玻片以除去气泡。使用BioRender创建。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 96 孔微孔板形式
- 使用连接到真空的多通道吸入适配器吸出孔，并将40μL无血清培养基和1mg / mL荧光团标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖加回孔中。将细胞在37°C细胞培养箱中孵育30分钟。
注意：根据要研究的条件，而不是使用新鲜培养基，重复使用条件培养基进行葡聚糖上样可能是优选的，因为它将分别含有分泌或补充的因子，例如EGF或抑制剂化合物，可以影响细胞的大棘球细胞能力。 - 通过手动将板倒置到空的5 L烧杯中，将微孔板中的介质丢弃（图3A）。
- 通过将板垂直以轻微角度缓慢浸入充满冰冷PBS的2 L烧杯中来冲洗微孔板中的细胞（图3B），然后通过将板倒置到5 L烧杯中来处理微孔板中的PBS（图3C）。重复2次。
注意：弱附着在成像微孔板上的细胞可能会在此过程中分离。如果需要，也可以使用多通道抽吸适配器吸出孔，或者使用多通道移液器用PBS轻轻清洗。处理一个96孔微孔板将需要大约2升冰冷的PBS。如果要分析更多板，请使用更大的烧杯，并为每个额外的板添加1升冰冷PBS或根据需要刷新冰冷PBS。 - 在最后一次冲洗中处理PBS后，使用25mL试剂储液器和多通道移液器将PBS中的100μL3.7%甲醛加入每个孔中，在室温下固定细胞20分钟（图3D）。
- 取出固定溶液，并使用浸没和轻拂技术用PBS洗涤细胞两次。用每孔PBS中的100μL2μg/ mL DAPI染色细胞核。
- 20分钟后，使用上述浸没和轻拂技术（步骤3.2.3）用冰冷的PBS冲洗细胞三次。通过将微孔板倒置在无绒擦拭物上，并使用25 mL试剂储液器和多通道移液器向每个孔中加入100μL新鲜PBS，以除去任何残留的PBS。现在对细胞进行成像或将它们在4°C的光照下储存长达一周。
注意：或者，可以使用PBS中的甘油溶液（而不是PBS）进行成像和储存，以更好地稳定荧光（图4A）。 - 在成像之前，让板平衡到室温。用不起毛的湿巾擦干微孔板。
- 使用连接到真空的多通道吸入适配器吸出孔，并将40μL无血清培养基和1mg / mL荧光团标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖加回孔中。将细胞在37°C细胞培养箱中孵育30分钟。
图3：冲洗96孔微孔板以准备固定。 （A）通过手动轻拂将培养基的微孔板倒入5 L烧杯中。（B）垂直并以轻微的角度将微孔板缓慢浸入装有冰冷PBS的2 L烧杯中。（C）通过手动轻拂将PBS的微孔板倒入5L烧杯中。按照 B 中所述重复洗涤步骤两次。（D）最后一次清空微孔板中的PBS后，使用多通道移液管向孔中加入100μL 3.7%甲醛。使用BioRender创建。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. 自动大促肾小体成像
大卵泡体的图像可以使用标准荧光显微镜捕获，如前所述19，20。然而，这样的程序可以通过自动化在效率方面得到改进，特别是在评估许多不同的细胞培养条件时。图像采集的自动化可以通过细胞成像多模读板器完成，通过减少处理程序来减少工作量，重要的是，通过以无偏的方式采集图像来提高数据的再现性和可靠性。市面上有多种成像系统，仪器之间的方向会有所不同。这里描述了使用Cytation 5获取图像。但是，以下协议可以通过遵守以下准则来针对每一种仪器进行定制：
- 创建自动化协议，以在葡聚糖荧光团（FITC / TMR）和DAPI的波长通道中采集具有40倍空气物镜的图像。
注意：常用的巨噬细胞增多抑制剂 EIPA 在 FITC 通道中表现出自发荧光，特别是当先前在 DAPI 通道中激发时。其他正在测试的化合物也可能显示自发荧光。为了避免此问题，将图像采集设置为首先在具有最高激发波长（FITC/TMR）的信道中进行，然后在第二个在DAPI信道中发生有助于避免这种情况发生。 - 使用预测具有最高水平巨噬细胞增多的样品优化曝光设置，以避免过度曝光，这可能导致信号饱和和强度数据丢失。使用可轻松、一致地定位样品的对焦设置，以生成高质量的图像。
- 在每个孔或盖玻片上采集多张图像，以考虑样品的变异性并获得样品的准确表示。
- 确定成像设置后，对实验中的每个样品使用相同的设置。
- 使用Cytation 5和Gen5软件时，请按照以下说明进行大卵泡体图像采集：
- 24 孔板，带盖玻片格式
- 启动读板器并使用载玻片支架将显微镜载玻片倒置插入。
- 打开酶标仪和成像软件，通过单击"协议"创建新 协议，然后 创建新协议。双击 "过程 "，然后选择板类型。
注：如果板类型不可用，请单击" 系统>板类型">添加板"，然后使用制造商提供的板尺寸，将板类型添加到软件中。为便于使用， 补充文件1中提供了两个显微镜载玻片的模板，其中有三个盖玻片，使用有机硅隔离器间隔。 - 要访问成像设置，请选择 "图像>反转成像器>操作 "，然后单击" 确定"。使用具有 宽视场 和 自动对焦像素对比的40倍PL FL相位物镜。
- 对于第一个通道，选择与葡聚糖荧光团标签（GFP 或 RFP）对应的 LED 立方体。取消单击 "自动曝光 "，然后单击显微镜图标按钮以优化曝光设置。确定适当的曝光设置后，单击" 保存设置"。
注意：使用预测具有最高水平巨噬细胞增多的样品调整曝光设置，以避免过度曝光的图像，这可能导致信号饱和和强度数据丢失。 - 使用 DAPI LED 立方体对第二个通道重复上一步。
- 设置每个荧光通道的自动对焦设置，选择对焦选项。取消选择默认对焦方法，然后分别对右旋糖酐-荧光团和 DAPI 通道使用带有可选扫描的自动对焦和不带可选扫描的自动对焦。单击"确定"以保存设置。
注：扫描距离可减小至200 μm，增量可减至20 μm，以提高自动对焦效率。需要可选的扫描才能对具有低荧光的样品进行充分的自动对焦。这通常发生在分析具有低巨细胞增多症的病症时，例如当巨肺红细胞增多症受到抑制或未先天存在时。 - 使用 "定义信标 "选项可自动采集盖玻片不同区域的图像。单击显微镜图标，通过单击图像窗口并将载物台移动到下一个区域来添加信标。选择适当数量的区域后，移动到下一个盖玻片并重复该过程。要完成，请单击" 保存设置"。
注意：为了在整个样品中获得宏视细胞增多症的良好表示，选择大约20个均匀分布在盖玻片上的信标（图4B）。可以使用较少的信标，但由于质量差异，某些图像可能必须在采集后从图像分析中排除，例如当图像失焦或包含气泡或荧光斑点和污迹时。 - 要完成成像设置的调整，请单击 "确定"。要对封面进行成像，请选择" 创建新实验"，然后 从 "实验工具"中选择"立即读取"。出现提示时保存实验方案和实验。
- 24 孔板，带盖玻片格式
图4：优化图像采集条件（A）增加甘油浓度会增加TMR-葡聚糖荧光，如用EGF处理的AsPC-1细胞中确定的那样。（B）使用带盖玻片格式的24孔板时用于自动图像采集的成像信标的示例坐标。条形图显示了5个实验的SEM下的平均相对荧光。统计显著性由双向方差分析相对于PBS确定。** p < 0.01;p < 0.001。请点击此处查看此图的放大版本。
- 96 孔微孔板形式
- 启动读板器并插入微孔板。
- 打开酶标仪和成像软件，通过单击"协议"创建新 协议，然后 创建新协议。双击 "过程 "，然后选择板类型。
注：如果板类型不可用，请单击" 系统>板类型">添加板"，并使用制造商提供的板尺寸，将板类型添加到软件中。为了便于使用，珀金埃尔默的CellCarrier-96超微孔板的模板在 补充文件2中提供。 - 要访问成像设置，请选择 "图像>反转成像器>操作 "，然后单击" 确定"。使用具有 宽视场 和 自动对焦像素对比的40倍PL FL相位物镜。
- 对于第一个通道，选择与葡聚糖荧光团标签（GFP 或 RFP）对应的 LED 立方体。取消单击 "自动曝光 "，然后单击显微镜图标按钮以优化曝光设置。确定适当的曝光设置后，单击" 保存设置"。
注意：在优化曝光设置期间，可能会发生明显的荧光漂白。这可能会导致在新场成像时过度曝光的设置。因此，通过检查尚未曝光的场并确保在所选设置下不会出现信号饱和来验证曝光设置。不要在大卵子体定量中包括用于优化曝光设置的孔，因为在优化过程中由于漂白而导致荧光减少。使用预测具有最高水平巨噬细胞增多的样品调整曝光设置，以避免过度曝光的图像，这可能导致信号饱和和强度数据丢失。 - 使用 DAPI LED 立方体对第二个通道重复上一步。
- 设置每个荧光通道的自动对焦设置，选择对 焦选项。取消选择默认对焦方法，然后使用 激光自动对焦。在确定焦平面后捕获参考扫描，以最佳地显示大卵泡小体和细胞核。单击 "确定" 以保存设置。
注：扫描距离可缩短至400 μm，增量可减至3 μm，以提高自动对焦效率。要使激光自动对焦选项正常工作，请在成像前清洁板的底部，干燥并用不起毛的擦拭擦拭板。激光自动对焦是一种优越的对焦方法，因为它需要最少的时间才能找到焦平面。可以使用其他聚焦方法，但是，由于没有向孔中添加防褪色，这些方法可能会导致样品的显着漂白，这将对数据收集产生负面影响。 - 将水平和垂直偏移设置为零，然后在"单张图像"下选择"无重叠蒙太奇"并使用 3 x 3 图像，具体取决于分析中需要包含的单元格数。
注意：根据细胞的大小和密度，可以拍摄或多或少的图像来获得整个样品中巨噬细胞增多症的代表性评估。在不同条件下评估AsPC-1或MIA PaCa-2细胞中的巨噬细胞增多症，没有观察到2 x 2或4 x 4相框之间的数据解释差异，尽管在拍摄较少的照片时复制样品之间的差异可能会增加（图5A，B）。增加或减少框架的大小将影响扫描板所需的时间。根据曝光时间的不同，使用3 x 3帧完全扫描完整的96孔微孔板大约需要1-1.5小时。2 x 2 和 4 x 4 帧将分别将该时间减半或加倍。 - 要完成成像设置的调整，请单击 "确定"。
- 要对平板进行成像，请选择 创建新实验，然后 从 实验方案工具中立即读取。出现提示时保存实验方案和实验。
图5：评估PDAC细胞中巨肺细胞增多症的控制条件。 （A）AsPC-1细胞在100ng / mL EGF刺激5分钟或谷氨酰胺剥夺24小时后显示巨肺细胞增多症。对于图像采集，拍摄4 x 4，3 x 3，2 x 3或2 x 2的相框，以确定照片数量对数据质量的影响。（B）MIA PaCa-2细胞显示构成性巨噬细胞增多症，通过用75μM EIPA处理30分钟或用10μM EHop-016处理2小时来抑制。相框拍摄如 A。比例尺 = 25 μm。条形图显示了SD为1次实验的平均相对大脊髓细胞指数，有4次重复。统计显著性由相对于+Q或车辆状况的双向方差分析确定。 p < 0.001 请点击此处查看此图的大图。
5. 确定大脊髓细胞指数
"大棘球细胞指数"是细胞巨噬细胞增多的程度，通过使用显微镜成像量化每个细胞的荧光葡聚糖摄取来确定19。为此，通过测量总荧光强度或荧光阳性区域以及通过DAPI染色确定的细胞总数，获取的图像用于确定内化葡聚糖的量。如前所述，可以使用开源图像处理和分析软件（如Cell Profiler或FIJI/ImageJ）进行这种分析19，20。然而，当使用多模读板器时，仪器随附的软件可能包括可用于计算大旋心核细胞指数的内置分析应用程序。在某些情况下，内置的软件分析管道对用户来说可能并不完全明显。因此，建议通过与非自动化程序（如Cell Profiler或FIJI / ImageJ）进行比较，在早期阶段验证软件。通过遵循以下一般说明，该协议可以适应其他图像处理和分析软件工具：
- 对于DAPI和相应的葡聚糖图像，通过应用适当的函数（通常称为滚动球函数）来减去背景。调整设置，使背景噪声最小化，并且对DAPI和葡聚糖信号的影响最小或没有减法。
- 利用具有高葡聚糖醛酸信号的场，确定强度信号设置，通常称为阈值函数，以选择原子核并确定仅选择大卵子体所需的最小强度信号设置。
- 对于葡聚糖图像，计算所创建的巨噬细胞体选择内的总荧光，或使用选择来确定葡聚糖阳性的总面积。
- 对于 DAPI 图像，使用选择来确定图像中的细胞核数，以反映存在的细胞数。
- 为了确定大棘球细胞指数，将总葡聚糖荧光或面积除以由DAPI确定的细胞数。
- 对所有采集的图像重复这些分析步骤，并始终应用相同的数值设置。
- 使用Gen5软件时，请按照以下说明确定大脊髓细胞指数：
注：内置分析管道已经过验证，在计算方面没有检测到相对于斐济/ImageJ（图 6A).- 成像完成后，选择具有高级别巨噬细胞增多症的图像。卸下背景信号，单击 处理 （补充图1A），然后选择 图像预处理 选项。
- 对于葡聚糖通道，取消选择" 自动 "并使用直径为 5 μm 的滚动球，优先处理精细结果，并使用 1 个周期平滑图像。
- 对于 DAPI 通道，请使用自动预处理和 1 个平滑循环。单击"确定"，将图像预处理步骤添加到协议中;单击"添加步骤"。接下来，在"图像"卷展栏（补充图 1B）下选择已处理的图像，然后单击"分析"按钮（补充图 1C）。
- 在 "分析设置"下，将 "类型" 设置为 "细胞分析"。选择 DAPI 通道，然后单击 "选项" （补充图 2A）。
- 对于主掩码，使用处理后的DAPI映像，创建一个掩码以选择单个原子核。使用深色背景和 自动 选项。此外，确定哪些设置允许选择单核的掩码，完成后，单击" 应用 "按钮以确定是否正确应用了掩码。
注意：激活 "分裂触摸对象" 和" 填充掩码中的孔" 选项可能最适合选择单个原子核。最小和最大物体尺寸可能需要根据细胞系进行调整，并且通常设置在5-40μm范围内。可以包括 主边缘对象 ，并应分析整个图像。可以应用滑块来调整根据信号强度选择模板。 - 接下来，应用辅助掩模以优化选择大瞳孔体荧光点的设置。使用 "在次要掩码内测量" 功能，并根据细胞的大小将初级掩模扩展 40 μm。
- 使用 阈值 函数和 "掩码中的阈值" 方法选择正右旋糖酐区域。单击" 应用 "以确定是否正确应用了设置。
注：要确定阈值，请使用 "查看线轮廓" 工具（补充图2B），并在右旋阳性区域上绘制一条线（补充图2C）。使用测量的强度确定最佳设置，以创建选择大卵泡体并排除背景信号的掩模（补充图2D）。 - 创建适当的掩码以选择原子核和大倍体后，单击" 计算的衡量指标 "选项卡，然后选择 "选择或创建感兴趣的对象级衡量指标"。
- 删除存在的所有指标，并添加 积分 和 面积 指标，以分析辅助掩码。单击 "确定"， 然后为新指标选择" 计算 并 显示 "。完成后，单击" 确定 "，然后选择" 添加步骤" 以将分析和计算添加到实验方案中。
- 保存最终确定的协议以供将来使用，单击" 文件 "和" 协议另存为"。
- 数据分析完成后，选择感兴趣的指标并导出数据以确定宏囊泡指数。确定大脊髓细胞指数如下：
每个细胞的葡聚糖荧光=对象Int_2[葡聚糖荧光团]
每个细胞的葡聚糖面积=对象Area_2[葡聚糖荧光团]
注意：对于带盖玻片格式的24孔板，指标反映了每张图像的平均大囊泡指数的平均值。或者，可以通过将所有图像的"面积"或"积分"之和除以总"细胞计数"来手动计算整个样品的大旋心细胞指数。在大多数环境中，这些方法在计算大脊髓细胞指数方面的差异很小。对于96孔微孔板形式，大棘球细胞指数计算为整个样品的平均值。 - 保存实验方案以进行成像和随后的自动分析。重复使用该协议用于将来使用相同的荧光团进行实验。
注意：使用激光自动对焦功能时，如果要分析不同的细胞系，必须进行新的参考扫描，因为细胞核和大倍体可能定位到不同的平面。每次使用先前确定的实验方案执行新实验时，都必须优化该实验的曝光设置。
6. 添加治疗
细胞治疗（小分子，生物制剂，生长因子，代谢物等）可以在方案的任何阶段掺入，精确的时间将取决于研究的目标和目的。
- 如第 2 部分所述准备单元格。
- 在添加感兴趣的治疗之前，在无血清培养基中以两倍于其最终浓度准备治疗和适当的对照。以等于所评估的重复孔数的体积的体积准备处理。
注意：鉴于分泌因子在控制细胞功能方面可以发挥作用，可能更愿意稀释条件培养基中感兴趣的治疗。出于这些目的，在制备细胞时，如第2节所述，接种额外的平板（例如6-cm或10-cm细胞培养皿）以产生用于制备治疗溶液的条件培养基可能会有所帮助。 - 在不从孔中取出培养基的情况下，向每个孔中加入一个孔体积的处理溶液。摇动盘子以确保正确混合。将细胞孵育所需的时间。
- 继续阅读第 3 节。
注意：当添加葡聚糖时，使用新鲜培养基会导致添加的治疗物的去除，这可能会影响巨噬细胞增多症的水平。因此，可以优选将葡聚糖直接添加到孔中，而不吸气或替代性地重新添加处理或重复使用条件培养基来制备葡聚糖溶液。
图6：对大吞细胞增多抑制剂进行剂量反应曲线。 在新细胞系中测试已知巨噬细胞增多抑制剂时获得的实例数据。将PATU8998T细胞用于96孔微孔板形式，并分别用（A）EHop-16和（B）EIPA的指示浓度处理2小时和30分钟。通过Gen5软件或ImageJ进行图像分析获得的结果的比较显示，两种方法之间没有显着差异，如（A）中的ns所示。比例尺 = 25 μm。条形图显示了具有4个重复的单个实验的平均值和SD。与未经处理的条件相比，通过单因子或双向方差分析确定统计学意义。* p < 0.05; p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Representative Results
当相应地遵循上述方案的步骤和调整时，最终实验结果应提供有关所研究的细胞培养条件或抑制剂是否诱导或减少目标细胞系中的巨噬细胞增多症的信息。为了加强这些发现的有效性，纳入控制条件将允许对结果进行仔细检查，以确定实验是否已成功完成。巨噬细胞增多症诱导对照将提供有关巨噬细胞增多症相对水平的信息。为此，配体EGF是最常用的13。在AsPC-1 PDAC细胞中，在加入葡聚糖之前以100ng / mL加入EGF5分钟激活巨噬细胞增多症（图5A）。此外，通过剥夺细胞的谷氨酰胺16-24小时，可以诱导自分泌EGF激活大吞细胞增多症（图5A）。或者，可以根据细胞类型和可用文献掺入其他诱导剂;这些可能包括PDGF或Wnt3A10，11，12。并非所有细胞的行为都相似，KRAS突变细胞可能表现出构成性巨噬细胞增多症13。一个例子是MIA PaCa-2 PDAC细胞系，它对EGF治疗没有反应。在这里，添加已知的大吞吐作用抑制剂将验证观察到和定量的荧光点确实是大卵子体。最常用的抑制性对照包括钠氢交换剂抑制剂EIPA，它是一种特异性的巨噬细胞增多抑制剂（图5B）4。还可以包括其他对照，例如Rac1抑制剂EHop-016（图5B），Pak抑制剂FRAX597或PI3K抑制剂LY294002;然而，它们对巨噬细胞增多症的影响可能是模型特异性的13。
对于以前未评估过巨噬细胞增多症和抑制剂的细胞系，剂量-反应曲线是确认巨噬细胞增多症和确定未来使用的最佳药物浓度的绝佳方法。出于这些目的，96孔微孔板格式方案用于确定以前未在实验室中评估的细胞系PATU8998T PDAC细胞中的构成性巨细胞增多症。为了确定这些细胞是否表现出巨噬细胞增多症，研究了两种已知的葡聚糖摄取抑制剂（EHop-016和EIPA）的作用。如图所示，剂量反应实验在较高药物浓度下逐渐降低大棘球细胞指数（图6A，B），从而证实了这些细胞中存在构成性Rac1依赖性巨噬细胞增多症。此外，结果为研究该细胞系中的巨噬细胞增多症时用于未来实验的最佳药物浓度提供了信息。
图7：可能遇到的故障排除条件。 （A）图像曝光过度，如粉红色所示。（B） 图像失焦。（C）图像包含葡聚糖斑点或污迹。（D）图像含有残留物。（E） 图像包含气泡。（F）细胞显示药物诱导的自发荧光。比例尺 = 25 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
补充图1：图像预处理的屏幕截图。 （A） 处理 按钮。（B） 图像 推出。（C） 分析 按钮。 请点击此处下载此文件。
补充图2：图像量化设置的屏幕截图。 （A） 分析设置。（B） 查看直线轮廓工具。（三）右旋糖酐正区上方的线。（D） 查看线路轮廓结果 请单击此处下载此文件。
补充文件 1.请点击此处下载此文件。
补充文件 2.请点击此处下载此文件。
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Discussion
实验和数据采集的质量在很大程度上取决于试剂的质量、设置的优化以及盖玻片和微孔板的清洁度。最终结果应给出重复之间的最小差异;然而，生物变异确实是自然发生的，或者可能是由许多因素引起的。细胞密度可能导致细胞或多或少地对巨噬细胞增多诱导剂或抑制剂作出反应。因此，遵守协议中建议的80%汇合度至关重要。或者，微孔板制造商有充分的记录，即介质蒸发发生在96孔微孔板上。在这里，外孔相对于内孔受到更多的蒸发，从而可能影响巨细胞增多症。因此，可以选择不在分析中包括外井，而是用PBS填充这些井，以建立"缓冲壁"以保护内孔免受大量蒸发。
强烈建议目视检查每种情况的图像，以确定采集是否成功完成。这可以在第一组条件的成像过程中完成，以确定应用的设置确实是正确的，并允许在需要时进行干预。可能发生的具体问题如下：图像过度曝光（图7A），图像失焦（图7B），图像包含荧光葡聚糖（图7C）或残留物的斑点（图7D），图像包含气泡（图7E），或者在葡聚糖或DAPI通道中可见自发荧光（图7F）。对于前两个问题，过度曝光和失焦（图7A，B），必须调整图像采集设置，并且必须重复采集。此外，应清洁印版和盖玻片，以便自动对焦正常工作。如果只有几张图像失焦，则使用"蒙版"图像功能也可以将特定图像或整个孔从分析中排除。同样的功能可以用于排除葡聚糖通道中含有斑点的图像（图7C），杂质（图7D）或气泡（图7E）。此外，确保样品已经洗好，葡聚糖已经完全溶解，这可以通过在37°C下加热葡聚糖溶液并涡旋来改善，并且实验是用新鲜制备和清洁的试剂进行的。最后，可能发生药物诱导的自发荧光，并且对于在FITC和DAPI通道中发出荧光的巨噬细胞增多抑制剂EIPA非常常见，特别是当先前在DAPI通道中激发时。解决方法是在 DAPI 之前获取 FITC 通道。或者，可以使用TMR-葡聚糖代替FITC-葡聚糖，或者对于曝光设置，可以在增加增益的同时降低光强度和曝光时间。
为了计算大脑脊髓细胞指数，利用核DAPI染色来确定每个图像中的细胞数。该染色程序易于应用，是细胞数量的可靠读数，因此用于计算每个细胞的相对葡聚糖摄取。这种方法的一个警告是，它不考虑细胞大小的差异，这在比较不同的细胞系或响应药物治疗时可能发生。在这些情况下，怀疑细胞大小影响大脊髓空细胞指数，细胞区域可用于右旋糖吸收的归一化，如前所述4。这可以通过稍微修改方案来实现，以在固定后包括细胞掩膜染色或结合相差或明场成像。还强烈建议使用所述测定法随访任何发现，以评估巨噬细胞增多症是否是一种营养供应途径，有助于所采用的特定基于细胞的系统中的细胞适应性。这可以通过评估营养耗尽条件下的增殖能力，存活率或生存能力来实现，无论是否添加细胞外白蛋白4，7。此外，DQ-BSA脉冲追逐测定可以为巨噬细胞增多症的变化是否转化为溶酶体中白蛋白降解的变化提供证据。与高分子量葡聚糖一样，DQ-BSA通过巨噬细胞增多作用内化并递送到溶酶体，在蛋白水解消化后发出荧光4。鉴于与荧光葡聚糖摄取的相似性，所述方法可以用于评估DQ-BSA摄取。同样，该协议可用于评估其他荧光标记的货物的摄取，例如白蛋白，脂质或已知通过巨细胞增多症进入细胞的坏死细胞碎片。在所有情况下，这些适应性应符合制造商的协议，并且应使用实验对照来验证测定。
显微图像分析和定量是评估巨噬细胞增多症的常用方法，已成为该领域的标准4，5，6，7，9，10，11，12，13，15，16，17，18，19，20，21，22.它允许对样品进行目视检查，并可以提供有关大倍体数量，大小和位置的其他信息。此外，目视检查图像的可能性允许评估细胞的适应性和活力，并识别由药物管理引起的伪影和/或自发荧光。与其他提出的定量方法（如流式细胞术）相比，这些数据可能会丢失或被忽略，并可能导致假阳性或假阳性23。然而，成像更费力，并且更容易像流式细胞术那样进行偏倚的数据采集。在这里，我们通过协议的自动化克服了这些障碍，从而减少了偏见、劳动力、成本和时间。
许多巨噬细胞增多症的调节剂很可能仍未被发现，并且鉴于巨噬细胞通路在某些病理学（如癌症）中的重要性，它们的发现可能对开发新的治疗方法具有重要意义2，3。这些调节剂的鉴定可以通过高内涵筛选化合物来实现，本文提出的方法可作为基石。概述的协议旨在使用标准实验室设备进行实验。然而，96孔板格式可以针对高内涵筛选进行优化和调整。将孔格式增加到384或1536孔微孔板将允许用户增加可以在一个板上测试的化合物的数量。此外，细胞接种，平板洗涤，化合物和葡聚糖给药的机器人化将减少手动处理和孔到孔的可变性，从而提高可扩展性。最终，将该方案应用于高内涵筛查将极大地促进确定调节巨噬细胞增多症的新因素。
总之，本文提出的方法对于确定感兴趣细胞中巨噬细胞增多症的水平，鉴定该过程的调节因子以及优化已知抑制剂的药物浓度是一种极好的方法。此外，该协议可以作为评估除葡聚糖以外的其他货物的大脊髓细胞吸收的起点，以及旨在鉴定可能导致开发新型治疗策略的先导化合物的高内涵筛选。
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Disclosures
C.C.是一项已颁发专利的发明人，该专利名为"与巨噬细胞增多症相关的癌症诊断，治疗和药物发现"，专利号：9，983，194。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH / NCI资助（R01CA207189，R21CA243701）的支持，C.C. KMO.G.是TRDRP博士后奖学金（T30FT0952）的获得者。BioTek Cytation 5是Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core的一部分，该核心获得了NCI癌症中心支持补助金（P30 CA030199）的财政支持。图1-3是使用BioRender创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
References
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