Summary
Geautomatiseerde assays met behulp van multi-well microplaten zijn voordelige benaderingen voor het identificeren van pathway-regulatoren door de beoordeling van een groot aantal omstandigheden in één experiment mogelijk te maken. Hier hebben we het gevestigde macropinosoombeeldvormings- en kwantificeringsprotocol aangepast aan een 96-well microplaatformaat en bieden we een uitgebreid overzicht voor automatisering met behulp van een multi-mode plaatlezer.
Abstract
Macropinocytose is een niet-specifieke opnameroute in de vloeistoffase waarmee cellen grote extracellulaire lading, zoals eiwitten, pathogenen en celresten, kunnen internaliseren via bulk endocytose. Deze route speelt een essentiële rol in een verscheidenheid aan cellulaire processen, waaronder de regulatie van immuunresponsen en het metabolisme van kankercellen. Gezien dit belang in de biologische functie, kan het onderzoeken van celkweekomstandigheden waardevolle informatie opleveren door regulatoren van deze route te identificeren en omstandigheden te optimaliseren die moeten worden gebruikt bij de ontdekking van nieuwe therapeutische benaderingen. De studie beschrijft een geautomatiseerde beeldvormings- en analysetechniek met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en een multi-mode plaatlezer voor celbeeldvorming voor de snelle kwantificering van de macropinocytische index in adherente cellen. De geautomatiseerde methode is gebaseerd op de opname van fluorescerend dextran met een hoog molecuulgewicht en kan worden toegepast op 96-well microplaten om beoordelingen van meerdere omstandigheden in één experiment of vaste monsters gemonteerd op glazen afdekplaten te vergemakkelijken. Deze aanpak is gericht op het maximaliseren van de reproduceerbaarheid en het verminderen van experimentele variatie, terwijl het zowel tijdbesparend als kosteneffectief is.
Introduction
De niet-specifieke endocytische route van macropinocytose stelt cellen in staat om een verscheidenheid aan extracellulaire componenten, waaronder voedingsstoffen, eiwitten, antigenen en pathogenen, te internaliseren door bulkopname van extracellulaire vloeistof en zijn bestanddelen1. Hoewel belangrijk voor de biologie van talrijke celtypen, wordt in toenemende mate beschreven dat de macropinocytoseroute een essentiële rol speelt in de tumorbiologie, waar tumorcellen door macropinocytische opname in staat zijn om te overleven en zich te vermenigvuldigen in de aanwezigheid van een door voedingsstoffen uitgeputte micro-omgeving2,3. De opname van extracellulaire macromoleculen, waaronder albumine en extracellulaire matrix, en necrotisch celpuin, biedt een alternatieve voedingsbron voor biomassaproductie door aminozuren, suikers, lipiden en nucleotiden te creëren door middel van macropinosoom en lysosoom fusie-gemedieerd ladingkatabolisme4,5,6,7,8.
De inductie en regulatie van macropinocytose zijn complex en kunnen variëren afhankelijk van de cellulaire context. Tot nu toe zijn verschillende inductoren van macropinocytose geïdentificeerd en omvatten liganden, zoals epidermale groeifactor (EGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), galectine-3 en Wnt3A9,10,11,12,13. Bovendien kunnen kweekomstandigheden die de micro-omgeving van de tumor nabootsen, activering van de route veroorzaken. Pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) tumoren zijn voedingsarm, vooral voor het aminozuur glutamine, waardoor zowel kankercellen als kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) afhankelijk zijn van macropinocytose voor overleving7,13,14,15. Bovendien kunnen tumorspanningen, zoals hypoxie en oxidatieve stress, deze opruimroute activeren16. Naast de vele extrinsieke beïnvloeders die macropinocytose kunnen induceren, regelen verschillende intracellulaire routes de vorming van macropinosomen. Oncogene Ras-gemedieerde transformatie is voldoende om de macropinocytische machinerie te initiëren, en meerdere kankertypen vertonen oncogene Ras-gedreven constitutieve macropinocytose4,5,9,17. Als alternatief zijn rasactiverings- en Ras-onafhankelijke routes geïdentificeerd om macropinocytose in kankercellen en CAFs10,11,15,18 te activeren. Het gebruik van verschillende in vitro modellen in combinatie met inhibitorbehandelingen heeft geresulteerd in de identificatie van verschillende macropinocytosemodulatoren, waaronder natrium-waterstofwisselaars, de kleine GTPase Rac1, fosfoinositide 3-kinase (PI3K), p21-geactiveerd kinase (Pak) en AMP-geactiveerd eiwitkinase (AMPK)4,13,15 . Gezien de veelheid aan beschreven factoren en aandoeningen die macropinocytose reguleren, is het echter denkbaar dat veel meer modulatoren en stimuli onontdekt blijven. De identificatie van nieuwe modulatoren en stimuli kan worden vergemakkelijkt door geautomatiseerde beoordeling van een groot aantal omstandigheden in een enkel experiment. Deze methodologie kan licht werpen op de factoren die betrokken zijn bij de vorming van macropinosomen en kan de ontdekking van nieuwe kleine moleculen of biologische geneesmiddelen mogelijk maken die zich op deze route richten.
Hier hebben we ons eerder vastgestelde protocol voor het bepalen van de mate van macropinocytose in kankercellen in vitro aangepast naar een 96-well microplaatformaat en geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering19,20. Dit protocol is gebaseerd op fluorescerende microscopie, die een standaard is geworden in het veld om macropinocytose in vitro en in vivo te bepalen4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Macropinosomen kunnen worden onderscheiden van andere endocytische routes door hun vermogen om grote macromoleculen te internaliseren, zoals dextran met een hoog molecuulgewicht (d.w.z. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Macropinosomen kunnen dus worden gedefinieerd door opname van extracellulair toegediende fluorofoor-gelabelde 70 kDa dextran. Als gevolg hiervan manifesteren macropinocytische blaasjes zich als intracellulaire clusters van fluorescerende puncta met afmetingen variërend van 0,2-5 μm. Deze puncta kunnen microscopisch in beeld worden gebracht en vervolgens worden gekwantificeerd om de mate van macropinocytose in de cel te bepalen - 'de macropinocytische index'.
In dit protocol worden de essentiële stappen beschreven om macropinosomen in aanhangende cellen in vitro te visualiseren op een 96-well microplaat en coverslips met behulp van standaard laboratoriumapparatuur (figuur 1). Daarnaast worden de aanwijzingen gegeven om de beeldacquisitie en kwantificering van de macropinocytische index te automatiseren met behulp van een multi-mode plaatlezer voor celbeeldvorming. Deze automatisering vermindert tijd, kosten en moeite in vergelijking met onze eerder beschreven protocollen19,20. Bovendien voorkomt het onbedoeld bevooroordeelde beeldvormingsacquisitie en -analyse en verbetert het daardoor de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende celtypen of plaatlezers of worden gebruikt om alternatieve macropsoomkenmerken te bepalen, zoals grootte, aantal en locatie. De hierin beschreven methode is vooral geschikt voor de screening van celkweekomstandigheden die macropinocytose induceren, de identificatie van nieuwe modulatoren of optimalisatie van medicijnconcentraties van bekende remmers.
Figuur 1: Schema van de geautomatiseerde assay om de 'macropinocytische index' in adherente cellen te bepalen. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van materialen
- Los 70 kDa dextran gelabeld met FITC of tetramethylrhodamine (TMR) op in PBS om een oplossing van 20 mg/ml te verkrijgen. Bewaar de aliquots bij -20 °C.
- Los DAPI op in ddH2O om een oplossing van 1 mg/ml te verkrijgen. Bewaar de aliquots bij -20 °C.
LET OP: DAPI is een potentieel carcinogeen en moet met zorg worden behandeld. - Bereid op de dag van fixatie verse 3,7% ACS-grade formaldehyde in PBS.
LET OP: Formaldehyde is een fixatief, bekend carcinogeen en is giftig bij inademing. Maak de oplossing in een chemische zuurkast om inademing te voorkomen en voorzichtig te behandelen. - Bereid zuurgewassen coverslips voor.
- Gebruik een bekerglas en waterbad van 500 ml om 28 g borosilicaatglas afdekplaten met een diameter van 12 mm en een dikte van # 1,5 gedurende 24 uur bij 56 ° C te verwarmen in 100 ml van 1 M HCl. Sluit het bekerglas af met plasticfolie om uitgebreide verdamping te voorkomen.
LET OP: HCl is een sterk zuur dat zeer corrosief is en daarom met zorg moet worden behandeld en gebruikt in een chemische zuurkast om inademing te voorkomen. - Was de dekenslips met gedestilleerd water. Herhaal de wasbeurt 4 keer. Was vervolgens de hoesjes met 95% ethanol. Herhaal de wasbeurt 4 keer.
- Bewaar de met zuur gewassen coverslips in een celkweekschaal bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik door steriliteit te behouden door onderdompeling in 95% ethanol. Sluit de schaal af met parafilm om uitgebreide verdamping te voorkomen.
- Gebruik een bekerglas en waterbad van 500 ml om 28 g borosilicaatglas afdekplaten met een diameter van 12 mm en een dikte van # 1,5 gedurende 24 uur bij 56 ° C te verwarmen in 100 ml van 1 M HCl. Sluit het bekerglas af met plasticfolie om uitgebreide verdamping te voorkomen.
2. Bereiding van cellen
- Gebruik een samenvloeiende weefselkweekplaat van 10 cm met de aanhangende cellen van belang, zuig de media op en spoel de cellen met 5 ml DPBS, voorverwarmd bij 37 °C.
- Maak de cellen los van de plaat door 1,5 ml voorgewarmd 0,25% trypsine toe te voegen en te incuberen bij 37 °C.
OPMERKING: De trypsine-incubatietijd die nodig is om de cellen van belang los te maken, moet empirisch worden bepaald en kan worden bevestigd door loslating onder een conventionele lichtmicroscoop te observeren. - Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 ml en voeg 4,5 ml volledige media toe om de trypsine te doven.
- Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 3 minuten bij 200 x g en aspiraleer het supernatant.
- Resuspend de celkorrel in een voldoende volume voorgewarmde complete media om een enkele celsuspensie voor zaaien te verkrijgen.
- Ga verder met het zaaien van de cellen op een 24-well plaat met coverslips of een 96-well microplate formaat (Figuur 1).
OPMERKING: Het aantal cellen dat moet worden gezaaid, moet empirisch worden bepaald voor elke cellijn, aangezien proliferatiesnelheden en grootte variëren tussen cellijnen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor adherente kankercellen met 80% celconfluentie op de dag van macropinosoometikettering. Celconfluentie kan de macropinocytische capaciteit beïnvloeden en dit moet ook empirisch worden bepaald.- 24-wells plaat met coverslip formaat
- Voeg coverslips toe aan een 24-well tissuekweekplaat, gebruik een tang om een enkele coverslip van het ethanolbad vast te pakken. Tik de coverslip op de binnenwand van de plaat om overtollige ethanol te verwijderen en plaats de coverslip plat op de bodem van een put.
- Laat de ethanol verdampen en was de hoesjes 2 keer met DPBS.
- Zaai de cellen bovenop de coverslip door 500 μL van de celsuspensie aan elke put toe te voegen. Plaats de cellen in een celincubator van 37 °C met 5% CO2 totdat de celconfluentie 60%-80% bereikt op de dag vóór de macropinosoometikettering.
- Zuig de dag voor de macropinosoometikettering de media uit de putjes op en voeg 500 μL voorgewarmde serumvrije media toe aan elke put en plaats de cellen in een celincubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 16-24 uur.
OPMERKING: Afhankelijk van de te bestuderen omstandigheden worden serumvrije media aanbevolen om de effecten van groeifactoren die macropinocytose kunnen veroorzaken en die normaal in serum aanwezig zijn, te verminderen. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat serumgebrek andere cellulaire processen kan beïnvloeden, zoals proliferatie en autofagie. Omdat restserum de macropinocytische capaciteit van cellen kan beïnvloeden, evenals de remmeractiviteit, kan de verwijdering van serum worden verbeterd door de cellen 1 of 2 keer voorzichtig te spoelen met 500 μL voorgewarmde DPBS.
- 96-well microplate formaat
- Breng de celsuspensie over naar een reagensreservoir van 25 ml. Met behulp van een meerkanaalspipet (8 of 12 kanalen) zaait u 100 μL van de celsuspensie naar elke put van een zwarte 96-well high-content screening microplaat met optisch heldere cyclische olefine of glazen bodem.
- Plaats de cellen in een celincubator van 37 °C met 5% CO2 totdat de celconfluentie 60%-80% bereikt op de dag vóór de macropinosoometikettering.
- Verwijder de dag voor de macropinosoometikettering de media uit elke put en gooi deze weg met behulp van een meerkanaalspipet (8 of 12 kanalen) of een meerkanaals aspiratieadapter voor standaardtips die aan een vacuümpomp zijn bevestigd.
- Voeg met behulp van een reagensreservoir en een meerkanaalspiffpet (8 of 12 kanalen) voorzichtig 100 μL voorgewarmde serumvrije media toe aan elke put. Plaats de cellen in een celincubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 16-24 uur.
OPMERKING: Afhankelijk van de te bestuderen omstandigheden worden serumvrije media aanbevolen om de effecten van groeifactoren die macropinocytose kunnen veroorzaken en die normaal in serum aanwezig zijn, te verminderen. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat serumgebrek andere cellulaire processen kan beïnvloeden, zoals proliferatie en autofagie. Omdat restserum de macropinocytische capaciteit van cellen kan beïnvloeden, evenals de remmeractiviteit, kan de verwijdering van serum worden verbeterd door de cellen 1 of 2 keer voorzichtig te spoelen met 100 μL voorgewarmde DPBS.
- 24-wells plaat met coverslip formaat
3. Macropinosoom etikettering
- 24-wells plaat met coverslip formaat
- Zuig de putjes op en voeg 200 μL serumvrije media toe met 1 mg/ml fluorofoor-gelabeld hoog molecuulgewicht (70 kDa) dextran. Plaats de cellen gedurende 30 minuten in een celincubator van 37 °C.
OPMERKING: Afhankelijk van de te bestuderen omstandigheden kan, in plaats van verse media te gebruiken, de voorkeur hebben aan hergebruik van de geconditioneerde media voor dextran-belasting, omdat deze uitgescheiden of aangevulde factoren zou bevatten, zoals respectievelijk EGF- of remmerverbindingen, die de macropinocytische capaciteit van de cellen kunnen beïnvloeden. - Zuig de media aan en was de cellen voorzichtig maar snel 5 keer met ijskoude PBS met behulp van een voorgekoelde wasfles. Schud de plaat stevig met de hand tijdens het wassen om te helpen bij het ontwrichten van dextran-aggregaten die vast komen te zitten aan de coverslips.
- Fixeer de cellen door 350 μL 3,7% formaldehyde toe te voegen en gedurende 20 minuten te broeden. Aspiraleer vervolgens de fixatieoplossing en was de cellen tweemaal met PBS.
- Kleur de kernen met 350 μL van 2 μg/ml DAPI in PBS. Aspirateer na 20 minuten de DAPI-oplossing en was de cellen driemaal met PBS.
- Hecht siliconen isolatoren naast elkaar op een microscoopglaasje om een gelijkmatige afstand en reproduceerbare lokalisatie van de coverslips te verkrijgen, vereist voor beeldautomatisering (Figuur 2A, B).
OPMERKING: De hele microscoopglaas kan worden gevuld met in totaal 3 isolatoren. - Voeg voor elke coverslip een druppel verhardende fluorescentiemontagemedia toe aan de microscoopglaasjes in de open ruimte van de isolator (figuur 2C). Pak een coverslip op met een tang en verwijder overtollige PBS door voorzichtig op de zijkant van de coverslips te tikken op een pluisvrij doekje.
- Plaats de coverslip ondersteboven op de druppel van het bevestigingsmedium (figuur 2D). Tik voorzichtig op de deklip met een gesloten tang om bellen uit de bevestigingsmedia te verwijderen (figuur 2E).
- Bewaar de dia's in een donkere omgeving en laat de montagemedia drogen bij kamertemperatuur, meestal 16-24 uur. Dia's kunnen nu worden afgebeeld of maximaal 2 weken bij -20 °C worden bewaard.
- Verwijder voor het afbeelden de isolatoren uit het microscoopglaasje. Laat de glaasjes op kamertemperatuur komen en reinig de hoesjes met een applicator met katoenen punt, bevochtigd met ammoniakvrije glasreiniger. Gebruik vervolgens een schone applicator met katoenen punt, bevochtigd met 70% ethanol om de hoezen droog te maken en te laten.
- Zuig de putjes op en voeg 200 μL serumvrije media toe met 1 mg/ml fluorofoor-gelabeld hoog molecuulgewicht (70 kDa) dextran. Plaats de cellen gedurende 30 minuten in een celincubator van 37 °C.
Figuur 2: Het plaatsen van coverslips op een microscoopglaasje met siliconenisolatoren. (A) Siliconenisolatoren worden ingedrukt en vastgeplakt aan een microscoopglaasje. (B) De gehele microscoopglaas kan worden gevuld met in totaal 3 isolatoren, wat resulteert in een gelijkmatige afstand en reproduceerbare lokalisatie van de coverslips. (C) Voeg voor elke coverslip een druppel fluorescentiemontagemedia toe aan het microscoopglaasje in de open ruimte van de isolator. (D) Pak met een tang een afdekplaat van de 24-putplaat en plaats deze ondersteboven op de druppel van het montagemedium. (E) Wanneer er bubbels aanwezig zijn tussen de coverslip en het microscoopglaasje, tikt u voorzichtig op de coverslip met een gesloten tang om bubbels te verwijderen. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- 96-well microplate formaat
- Zuig de putten aan met behulp van een meerkanaals aspiratieadapter die aan een vacuüm is bevestigd en voeg 40 μL serumvrije media met 1 mg / ml fluorofoor-gelabeld hoog molecuulgewicht (70 kDa) dextran terug aan de putten. Incubeer de cellen in een celincubator van 37 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Afhankelijk van de te bestuderen omstandigheden kan, in plaats van verse media, het hergebruik van de geconditioneerde media voor dextran-belasting de voorkeur hebben, omdat het uitgescheiden of aangevulde factoren zou bevatten, zoals EGF of remmerverbindingen, respectievelijk die de macropinocytische capaciteit van de cellen kunnen beïnvloeden. - Gooi het medium in de microplaat weg door de plaat handmatig ondersteboven in een leeg bekerglas van 5 liter te vegen (figuur 3A).
- Spoel de cellen in de microplaat door de plaat langzaam verticaal, onder een lichte hoek, onder te dompelen in een bekerglas van 2 L gevuld met ijskoud PBS (figuur 3B) en gooi de PBS vervolgens in de microplaat weg door de plaat ondersteboven in het bekerglas van 5 L te vegen (figuur 3C). Herhaal dit 2 keer.
OPMERKING: Cellen die zich zwak hechten aan de microplaat van de beeldvorming kunnen tijdens dit proces losraken. Indien nodig kunnen putten ook worden aangezogen met een meerkanaals aspiratieadapter of voorzichtiger worden gewassen met PBS met behulp van een meerkanaalspipet. Voor het verwerken van één 96-well microplaat is ongeveer 2 L ijskoude PBS nodig. Als er meer platen moeten worden geanalyseerd, gebruik dan een groter bekerglas en voeg 1 L ijskoude PBS toe voor elke extra plaat of ververs de ijskoude PBS indien nodig. - Na het weggooien van de PBS van de laatste spoeling, fixeert u de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur door 100 μL 3,7% formaldehyde in PBS aan elke put toe te voegen met behulp van een reagensreservoir van 25 ml en een meerkanaalsppet (figuur 3D).
- Verwijder de fixatieoplossing en was de cellen tweemaal met PBS met behulp van de onderdompelings- en flikkertechniek. Kleur de kernen met 100 μL van 2 μg/ml DAPI in PBS per putje.
- Spoel de cellen na 20 minuten driemaal met ijskoud PBS met behulp van de hierboven beschreven onderdompelings- en flikkertechniek (stap 3.2.3). Verwijder eventuele resterende PBS door de microplaat ondersteboven op een pluisvrij doekje te tikken en voeg 100 μL verse PBS toe aan elke put met behulp van een reagensreservoir van 25 ml en een meerkanaalspipet. Stel de cellen nu in beeld of bewaar ze bedekt met licht bij 4 °C gedurende maximaal een week.
OPMERKING: Als alternatief kan een oplossing van glycerol in PBS (in plaats van PBS) worden gebruikt voor beeldvorming en opslag om de fluorescentie beter te stabiliseren (figuur 4A). - Laat de plaat voor het afbeelden op kamertemperatuur balanceren. Veeg de microplaat droog met een pluisvrij doekje.
- Zuig de putten aan met behulp van een meerkanaals aspiratieadapter die aan een vacuüm is bevestigd en voeg 40 μL serumvrije media met 1 mg / ml fluorofoor-gelabeld hoog molecuulgewicht (70 kDa) dextran terug aan de putten. Incubeer de cellen in een celincubator van 37 °C gedurende 30 minuten.
Figuur 3: Spoel de 96-well microplaat om zich voor te bereiden op fixatie. (A) Leeg de microplaat van media in een bekerglas van 5 liter door handmatig te vegen. (B) Dompel de microplaat verticaal en onder een lichte hoek langzaam onder in een bekerglas van 2 liter gevuld met ijskoud PBS. (C) Leeg de microplaat van PBS in het bekerglas van 5 liter door handmatig te vegen. Herhaal de wasstappen zoals beschreven in B twee keer. (D) Voeg na het voor de laatste keer legen van de PBS in de microplaat 100 μL 3,7% formaldehyde toe aan de putten met behulp van een meerkanaalsppet. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Geautomatiseerde macropinosoom beeldvorming
Beelden van macropinosomen kunnen worden vastgelegd met een standaard fluorescerende microscoop, zoals eerder beschreven19,20. Een dergelijke procedure kan echter worden verbeterd in termen van efficiëntie door automatisering, vooral bij het beoordelen van tal van verschillende celkweekomstandigheden. Automatisering van beeldacquisitie kan worden bereikt via een multi-mode plaatlezer voor celbeeldvorming, die de inspanning vermindert door de verwerkingsprocedures te verminderen en, belangrijker nog, de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van gegevens verhoogt door afbeeldingen op een onbevooroordeelde manier te verwerven. Meerdere beeldvormingssystemen zijn in de handel verkrijgbaar en de richtingen zullen per instrument verschillen. Hier wordt het verkrijgen van afbeeldingen met behulp van een Cytation 5 beschreven. Het onderstaande protocol kan echter worden aangepast aan elk afzonderlijk instrument door zich te houden aan de volgende richtlijnen:
- Maak een automatiseringsprotocol om de beelden te verkrijgen met een 40x luchtobjectief in het golflengtekanaal van de dextran fluorofoor (FITC / TMR) en DAPI.
OPMERKING: De veelgebruikte macropinocytoseremmer EIPA vertoont autofluorescentie in het FITC-kanaal, vooral wanneer deze eerder geëxciteerd is in het DAPI-kanaal. Andere verbindingen die worden getest, kunnen ook autofluorescentie vertonen. Om dit probleem te omzeilen, helpt het instellen van de beeldacquisitie op het eerst in het kanaal met de hoogste excitatiegolflengte (FITC/TMR) en vervolgens in het DAPI-kanaal om dit optreden te voorkomen. - Optimaliseer de blootstellingsinstellingen met behulp van een monster waarvan wordt voorspeld dat het het hoogste niveau van macropinocytose heeft om overmatige blootstelling te voorkomen, wat kan leiden tot verzadiging van het signaal en verlies van intensiteitsgegevens. Gebruik focusinstellingen die het voorbeeld gemakkelijk en consistent lokaliseren om afbeeldingen van hoge kwaliteit te produceren.
- Verkrijg meerdere afbeeldingen in elke put of coverslip om rekening te houden met de variabiliteit van het monster en een nauwkeurige weergave van het monster te verkrijgen.
- Zodra de beeldinstellingen zijn bepaald, gebruikt u dezelfde instellingen voor elk monster in het experiment.
- Volg deze instructies voor macropsoombeeldacquisitie bij gebruik van Cytation 5- en Gen5-software:
- 24-wells plaat met coverslip formaat
- Start de plaatlezer en plaats de microscoopglaasjes ondersteboven met behulp van de diahouder.
- Open de microplaatlezer en beeldbewerkingssoftware, maak een nieuw protocol door op Protocollen te klikken en Nieuw maken. Dubbelklik op Procedure en selecteer het type plaat.
OPMERKING: Als het plaattype niet beschikbaar is, voegt u het plaattype toe aan de software door te klikken op Systeem > plaattypen > Plaat toevoegen en de plaatafmetingen te gebruiken zoals opgegeven door de fabrikant. Voor het gebruiksgemak is de sjabloon voor twee microscoopglaasjes met drie coverslips verdeeld met behulp van de siliconenisolatoren in aanvullend bestand 1. - Om toegang te krijgen tot de beeldinstellingen, selecteert u Acties > Afbeelding > Omgekeerde imager en klikt u op OK. Gebruik het 40x, PL FL Phase objectief met Wide FOV en Autofocus Binning.
- Selecteer voor het eerste kanaal de LED-kubus die overeenkomt met het dextran fluorofoor-label (GFP of RFP). Verwijder de klik op Automatische belichting en klik op de knop met het microscooppictogram om de belichtingsinstellingen te optimaliseren. Wanneer de juiste belichtingsinstellingen zijn bepaald, klikt u op Instellingen opslaan.
OPMERKING: Pas de belichtingsinstellingen aan met behulp van een monster waarvan wordt voorspeld dat het het hoogste niveau van macropinocytose heeft om overbelichte beelden te voorkomen, wat kan leiden tot verzadiging van het signaal en verlies van intensiteitsgegevens. - Herhaal de vorige stap voor het tweede kanaal met behulp van de DAPI LED-kubus.
- Stel de autofocusinstellingen voor elk fluorescentiekanaal in en selecteer Focusopties. Schakel de standaardfocusmethode uit en gebruik Autofocus met optionele scan en autofocus zonder optionele scan voor respectievelijk het dextran-fluorofoor- en DAPI-kanaal. Klik op OK om de instellingen op te slaan.
OPMERKING: De scanafstand kan worden teruggebracht tot 200 μm en de toename tot 20 μm om de autofocusefficiëntie te verhogen. De optionele scan is vereist voor voldoende autofocus op monsters met een lage fluorescentie. Dit gebeurt normaal gesproken bij het analyseren van aandoeningen met lage macropinocytose, zoals wanneer macropinocytose wordt geremd of niet van nature aanwezig is. - Gebruik de optie Bakens definiëren om de acquisitie van afbeeldingen in verschillende regio's van de coverslip te automatiseren. Klik op het microscooppictogram en voeg bakens toe door in het afbeeldingsvenster te klikken en het werkgebied naar het volgende gebied te verplaatsen. Wanneer het juiste aantal regio's is geselecteerd, gaat u naar de volgende coverslip en herhaalt u het proces. Om het af te ronden, klikt u op Instellingen opslaan.
OPMERKING: Om een goede weergave van macropinocytose over het monster te verkrijgen, selecteert u ongeveer 20 bakens die gelijkmatig over de coverslip zijn verdeeld (figuur 4B). Er kunnen minder bakens worden gebruikt, maar sommige afbeeldingen moeten mogelijk worden uitgesloten van beeldanalyse na acquisitie vanwege kwaliteitsverschillen, zoals wanneer het beeld onscherp is of bubbels of fluorescerende vlekken en vlekken bevat. - Om de aanpassing van de beeldinstellingen te voltooien, klikt u op OK. Als u een afbeelding van de coverslips wilt weergeven, selecteert u Een nieuw experiment maken en Nu lezen in de Protocolhulpprogramma's. Sla het protocol en het experiment op wanneer daarom wordt gevraagd.
- 24-wells plaat met coverslip formaat
Figuur 4: Optimalisatie van de voorwaarden voor beeldacquisitie. (A) Het verhogen van de glycerolconcentratie verhoogt de TMR-dextran-fluorescentie, zoals bepaald in AsPC-1-cellen die met EGF zijn behandeld. (B) Voorbeeldcoördinaten van beeldbakens voor automatische beeldacquisitie bij gebruik van de 24-putplaat met coverslips-formaat. Het staafdiagram toont de gemiddelde relatieve fluorescentie met SEM van 5 experimenten. Statistische significantie werd bepaald door tweerichtings-ANOVA, ten opzichte van PBS. ** p < 0,01; p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- 96-well microplate formaat
- Start de plaatlezer en plaats de microplaat.
- Open de microplaatlezer en beeldbewerkingssoftware, maak een nieuw protocol door op Protocollen te klikken en Nieuw maken. Dubbelklik op Procedure en selecteer het type plaat.
OPMERKING: Als het plaattype niet beschikbaar is, voegt u het plaattype toe aan de software door op Systeem > plaattypen > Plaat toevoegen te klikken en de plaatafmetingen te gebruiken zoals opgegeven door de fabrikant. Voor het gebruiksgemak is de sjabloon voor de CellCarrier-96 Ultra Microplates van PerkinElmer beschikbaar in Aanvullend bestand 2. - Om toegang te krijgen tot de beeldinstellingen, selecteert u Acties > Afbeelding > Omgekeerde imager en klikt u op OK. Gebruik het 40x PL FL Fase objectief met Wide FOV en Autofocus Binning.
- Selecteer voor het eerste kanaal de LED-kubus die overeenkomt met het dextran fluorofoor-label (GFP of RFP). Verwijder de klik op Automatische belichting en klik op de knop met het microscooppictogram om de belichtingsinstellingen te optimaliseren. Wanneer de juiste belichtingsinstellingen zijn bepaald, klikt u op Instellingen opslaan.
OPMERKING: Tijdens de optimalisatie van de belichtingsinstellingen kan aanzienlijke fluorescentiebleking optreden. Dit kan resulteren in instellingen die overbelichting veroorzaken wanneer een nieuw veld wordt afgebeeld. Valideer daarom de belichtingsinstellingen door een nog onbelicht veld te controleren en ervoor te zorgen dat er geen verzadiging van het signaal optreedt bij de geselecteerde instellingen. Neem de putten die worden gebruikt voor de optimalisatie van de belichtingsinstelling niet op in de macropinosoomkwantificering, omdat de fluorescentie is afgenomen als gevolg van bleken tijdens de optimalisatie. Pas de belichtingsinstellingen aan met behulp van een monster waarvan wordt voorspeld dat het het hoogste niveau van macropinocytose heeft om overbelichte beelden te voorkomen, wat kan leiden tot verzadiging van het signaal en verlies van intensiteitsgegevens. - Herhaal de vorige stap voor het tweede kanaal met behulp van de DAPI LED-kubus.
- Stel de autofocusinstellingen voor elk fluorescentiekanaal in en selecteer Focusopties. Schakel de standaardfocusmethode uit en gebruik Laser autofocus. Leg een referentiescan vast na het bepalen van het brandpuntsvlak voor optimale visualisatie van macropinosomen en kernen. Klik op OK om de instellingen op te slaan.
OPMERKING: De scanafstand kan worden teruggebracht tot 400 μm en de toename tot 3 μm om de autofocusefficiëntie te verhogen. Om de laser-autofocusoptie goed te laten werken, reinigt u de onderkant van de plaat, droogt u en veegt u de plaat af met een pluisvrij doekje voordat u gaat fotograferen. De laser autofocus is een superieure methode voor focus omdat het minimale tijd nodig heeft om het brandpuntsvlak te vinden. Andere focusmethoden kunnen worden gebruikt, maar omdat er geen anti-fade aan de putten is toegevoegd, kunnen deze methoden een aanzienlijke verbleking van de monsters veroorzaken, wat een negatieve invloed zal hebben op het verzamelen van gegevens. - Stel de horizontale en verticale verschuiving in op nul en selecteer onder Eén afbeelding montage zonder overlap en gebruik 3 x 3 afbeeldingen, afhankelijk van het gewenste aantal cellen dat in de analyse moet worden opgenomen.
OPMERKING: Afhankelijk van de grootte en dichtheid van de cellen, kunnen meer of minder afbeeldingen worden gemaakt om een representatieve beoordeling van macropinocytose in het hele monster te verkrijgen. Bij beoordeling van macropinocytose in AsPC-1- of MIA PaCa-2-cellen onder verschillende omstandigheden worden geen verschillen in gegevensinterpretatie tussen een fotolijst van 2 x 2 of 4 x 4 waargenomen, hoewel de variatie tussen replicatiemonsters kan toenemen wanneer minder foto's worden gemaakt (figuur 5A, B). Het vergroten of verkleinen van het frame heeft invloed op de tijd die nodig is om de plaat te scannen. Afhankelijk van de belichtingstijd duurt het ongeveer 1-1,5 uur voordat een volledige 96-well microplaat volledig scant met behulp van een frame van 3 x 3. Een frame van 2 x 2 en 4 x 4 zal die tijd respectievelijk halveren of verdubbelen. - Om de aanpassing van de beeldinstellingen te voltooien, klikt u op OK.
- Als u een afbeelding van de plaat wilt weergeven, selecteert u Een nieuw experiment maken en Nu lezen in de Protocolhulpprogramma's. Sla het protocol en het experiment op wanneer daarom wordt gevraagd.
Figuur 5: Controlevoorwaarden voor het beoordelen van macropinocytose in PDAC-cellen. (A) AsPC-1-cellen vertonen macropinocytose als reactie op 100 ng / ml EGF-stimulatie gedurende 5 minuten of glutaminedeprivatie gedurende 24 uur. Voor beeldacquisitie werden fotolijsten van 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 of 2 x 2 genomen om de invloed van het aantal foto's op de datakwaliteit te bepalen. (B) MIA PaCa-2-cellen vertonen constitutieve macropinocytose die wordt geremd door een behandeling van 30 minuten met 75 μM EIPA of een behandeling van 2 uur met 10 μM EHop-016. Fotolijstjes werden genomen zoals in A. Schaalbalk = 25 μm. Staafdiagrammen tonen de gemiddelde relatieve macropinocytische index met SD van 1 experiment met 4 replicaties. Statistische significantie werd bepaald door tweerichtings-ANOVA ten opzichte van de +Q of voertuigconditie. p < 0.001 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
5. Bepaling van de macropinocytische index
De 'macropinocytische index' is de mate van cellulaire macropinocytose die wordt bepaald door fluorescerende dextranopname per cel te kwantificeren met behulp van microscopische beeldvorming19. Hiertoe worden de verkregen beelden gebruikt om de hoeveelheid geïnternaliseerd dextran te bepalen door de totale fluorescentie-intensiteit of fluorescentiepositief gebied en het totale aantal cellen te meten zoals bepaald door DAPI-kleuring. Deze analyse kan worden uitgevoerd met open-source beeldverwerkings- en analysesoftware, zoals Cell Profiler of FIJI/ImageJ, zoals eerder beschreven19,20. Bij het werken met een multi-mode plaatlezer kan de software die bij het instrument wordt geleverd echter ingebouwde analysetoepassingen bevatten die kunnen worden gebruikt voor het berekenen van de macropinocytische index. In sommige gevallen is de ingebouwde pijplijn voor software-analyse mogelijk niet volledig zichtbaar voor de gebruiker. Het wordt daarom aanbevolen om de software in een vroeg stadium te valideren in vergelijking met een niet-geautomatiseerde procedure, zoals Cell Profiler of FIJI/ImageJ. Dit protocol kan worden aangepast aan andere beeldverwerkings- en analysesoftwaretools door zich te houden aan de volgende algemene instructies:
- Trek voor de DAPI en de bijbehorende dextran-afbeelding de achtergrond af door de juiste functie toe te passen, vaak de rolling ball-functie genoemd. Pas de instellingen aan zodat de achtergrondruis wordt geminimaliseerd en er een minimaal tot geen aftrekkingseffect is op het DAPI- en dextran-signaal.
- Bepaal met behulp van een veld met een hoog dextran-signaal de intensiteitssignaalinstellingen, vaak de drempelfunctie genoemd, om de kernen te selecteren en de minimale intensiteitssignaalinstelling te bepalen die nodig is om alleen de macropinosomen te selecteren.
- Bereken voor het dextranbeeld de totale fluorescentie binnen de gecreëerde macropinosomeselectie of gebruik de selectie om het totale gebied positief voor dextran te bepalen.
- Gebruik voor de DAPI-afbeelding de selectie om het aantal kernen in de afbeelding te bepalen om het aantal aanwezige cellen weer te geven.
- Om de macropinocytische index te bepalen, deelt u de totale dextranfluorescentie of -oppervlakte door het aantal cellen bepaald door DAPI.
- Herhaal deze analysestappen voor alle verkregen afbeeldingen en pas overal dezelfde numerieke instellingen toe.
- Volg deze instructies voor het bepalen van de macropinocytische index bij het gebruik van Gen5-software:
OPMERKING: De ingebouwde analysepijplijn is gevalideerd en detecteerde geen verschillen in berekening ten opzichte van Fiji/ImageJ (Figuur 6A).- Nadat de beeldvorming is voltooid, selecteert u een afbeelding met een hoog niveau van macropinocytose. Verwijder het achtergrondsignaal, klik op Proces (aanvullende afbeelding 1A) en selecteer de optie Afbeeldingsvoorbewerking .
- Schakel voor het dextran-kanaal Auto uit en gebruik een rolbaldiameter van 5 μm, geef prioriteit aan fijne resultaten en maak het beeld glad met 1 cyclus.
- Gebruik voor het DAPI-kanaal Auto preprocessing en 1 smooth cycle. Klik op OK en voeg de voorbewerkingsstap van de afbeelding toe aan het protocol; klik op STAP TOEVOEGEN. Selecteer vervolgens de verwerkte afbeelding onder de afbeeldingsuitrol (aanvullende afbeelding 1B) en klik op de knop Analyseren (aanvullende afbeelding 1C).
- Stel onder ANALYSE-INSTELLINGEN het type in op Cellulaire analyse. Selecteer het DAPI-kanaal en klik op Opties (aanvullende figuur 2A).
- Maak voor het primaire masker met behulp van de verwerkte DAPI-afbeelding een masker om enkele kernen te selecteren. Gebruik de donkere achtergrond en de optie Automatisch . Bepaal bovendien welke instellingen maskerselectie van enkele kernen toestaan en klik, wanneer u klaar bent, op de knop Toepassen om te bepalen of het masker op de juiste manier wordt toegepast.
OPMERKING: Het activeren van de opties Objecten splitsen en Gaten opvullen in maskers werkt mogelijk het beste voor het selecteren van enkele kernen. Minimale en maximale objectgroottes moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de cellijn en worden meestal ingesteld in het bereik van 5-40 μm. Primaire randobjecten kunnen worden opgenomen en de hele afbeelding moet worden geanalyseerd. De schuifregelaar kan worden toegepast om de maskerselectie aan te passen aan de signaalintensiteit. - Pas vervolgens een secundair masker toe om de instellingen voor het selecteren van de macropinosoom fluorescerende puncta te optimaliseren. Gebruik de functie Meten in een secundair masker en breid het primaire masker uit met 40 μm, afhankelijk van de grootte van de cellen.
- Gebruik de functie Threshold en de methode Threshold in Mask om de positieve dextran-gebieden te selecteren. Klik op Toepassen om te bepalen of de instellingen correct zijn toegepast.
OPMERKING: Om de drempelwaarde te bepalen, gebruikt u het gereedschap Lijnprofiel weergeven (aanvullende figuur 2B) en trekt u een lijn over een dextran-positief gebied (aanvullende figuur 2C). Gebruik de gemeten intensiteit om de beste instelling te bepalen om een masker te maken dat macropinosomen selecteert en het achtergrondsignaal uitsluit (aanvullende figuur 2D). - Nadat u de juiste maskers hebt gemaakt om kernen en macropinosomen te selecteren, klikt u op het tabblad Berekende statistieken en selecteert u Interesserende statistieken op objectniveau selecteren of maken.
- Verwijder alle aanwezige statistieken en voeg de metrische gegevens Integraal en Gebied toe voor analyse van het secundaire masker. Klik op OK en selecteer Berekenen en weergeven voor de nieuwe statistieken. Als u klaar bent, klikt u op OK en selecteert u STAP TOEVOEGEN om de analyse en berekeningen aan het protocol toe te voegen.
- Sla het voltooide protocol op voor toekomstig gebruik, klik op Bestand en Protocol opslaan als.
- Nadat de gegevensanalyse is voltooid, selecteert u de relevante statistieken en exporteert u de gegevens om de macropinocytische index te bepalen. Bepaal de macropinocytische index als volgt:
Dextran fluorescentie per cel = Object Int_2[Dextran fluorofoor]
Dextran oppervlakte per cel = Object Area_2[Dextran fluorofoor]
OPMERKING: Voor het formaat van de 24-putplaat met coverslips weerspiegelen de statistieken het gemiddelde van de gemiddelde macropinocytische index per afbeelding. Als alternatief kan de macropinocytische index handmatig worden berekend voor het hele monster door de som van de 'Area' of 'Integral' voor alle afbeeldingen te delen door de totale 'Cell Count'. Het verschil tussen deze benaderingen bij het berekenen van de macropinocytische index is in de meeste instellingen minimaal. Voor het 96-well microplate-formaat wordt de macropinocytische index berekend als het gemiddelde voor het hele monster. - Sla het protocol op voor beeldvorming en de daaropvolgende geautomatiseerde analyse. Hergebruik het protocol voor toekomstige experimenten met dezelfde fluoroforen.
OPMERKING: Bij gebruik van de laser autofocus functie, moet een nieuwe referentie scan worden genomen wanneer een andere cellijn moet worden geanalyseerd, omdat kernen en macropinosomen mogelijk gelokaliseerd zijn op een ander vlak. Telkens wanneer een nieuw experiment wordt uitgevoerd met behulp van een vooraf bepaald protocol, moeten de belichtingsinstellingen voor dat experiment worden geoptimaliseerd.
6. Toevoeging van behandelingen
Celbehandelingen (kleine moleculen, biologische geneesmiddelen, groeifactoren, metabolieten enz.) kunnen in elk stadium van het protocol worden opgenomen en de precieze timing hangt af van de doelen en doelstellingen van de studie.
- Bereid de cellen voor zoals in rubriek 2.
- Vlak voordat u de interessante behandelingen toevoegt, bereidt u de behandelingen en de juiste controles voor op tweemaal hun uiteindelijke concentraties in serumvrije media. Bereid de behandelingen voor in een volume dat gelijk is aan het volume van het aantal replicerende putten dat wordt beoordeeld.
OPMERKING: Gezien de rol die uitgescheiden factoren kunnen spelen bij het beheersen van cellulaire functies, kan het de voorkeur hebben om de behandelingen die van belang zijn in geconditioneerde media te verdunnen. Voor deze doeleinden kan het nuttig zijn om extra platen te zaaien, zoals celkweekschalen van 6 cm of 10 cm, bij het bereiden van cellen zoals beschreven in sectie 2 om de geconditioneerde media voor de bereiding van de behandelingsoplossingen te genereren. - Zonder de media uit de put te verwijderen, voegt u één putvolume behandelingsoplossing toe aan elke put. Schud de plaat om te zorgen voor een goede menging. Incubeer de cellen voor de gewenste hoeveelheid tijd.
- Ga verder met sectie 3.
OPMERKING: Bij het toevoegen van de dextran veroorzaakt het gebruik van verse media de verwijdering van de toegevoegde behandelingen, die het niveau van macropinocytose kunnen beïnvloeden. Daarom kan het de voorkeur hebben om dextran rechtstreeks aan de putten toe te voegen zonder de behandelingen aan te zuigen of opnieuw toe te voegen of de geconditioneerde media opnieuw te gebruiken om de dextran-oplossing te bereiden.
Figuur 6: Het uitvoeren van een dosis-responscurve voor macropinocytoseremmers. Voorbeeldgegevens verkregen bij het testen van bekende macropinocytoseremmers in een nieuwe cellijn. PATU8998T-cellen werden gebruikt voor het 96-well microplate-formaat en gedurende 2 uur en 30 minuten behandeld met de aangegeven concentraties van respectievelijk (A) EHop-16 en (B) EIPA. Vergelijking van resultaten verkregen door beeldanalyse door de Gen5-software of ImageJ toont geen significante verschillen tussen de twee benaderingen zoals aangegeven door ns in (A). Schaalbalk = 25 μm. Staafdiagrammen tonen het gemiddelde en de SD van een enkel experiment met 4 replicaties. Statistische significantie werd bepaald door een- of tweerichtings-ANOVA, vergeleken met onbehandelde omstandigheden. * p < 0,05; p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer de stappen en aanpassing van het hierboven beschreven protocol dienovereenkomstig worden gevolgd, moeten de uiteindelijke experimentele resultaten informatie verschaffen over de vraag of de bestudeerde celkweekomstandigheden of -remmers macropinocytose in de betreffende cellijn induceren of verminderen. Om de validiteit van deze bevindingen te versterken, zal de opname van controlevoorwaarden het mogelijk maken om de resultaten te onderzoeken om te bepalen of het experiment met succes is voltooid. Macropinocytose-inductiecontroles zullen informatie verschaffen over het relatieve niveau van macropinocytose. Voor dit doel wordt het ligand EFG het meest gebruikt13. In AsPC-1 PDAC-cellen activeert het toevoegen van EGF bij 100 ng / ml gedurende 5 minuten voordat het dextran wordt toegevoegd, macropinocytose (figuur 5A). Bovendien kan autocriene EGF-activering van macropinocytose worden geïnduceerd door de cellen gedurende 16-24 uur van glutamine te beroven (figuur 5A). Als alternatief kunnen andere inductoren worden opgenomen, afhankelijk van het celtype en de beschikbare literatuur; deze kunnen PDGF of Wnt3A10,11,12 omvatten. Niet alle cellen gedragen zich op dezelfde manier en KRAS-mutante cellen kunnen constitutieve macropinocytose vertonen13. Een voorbeeld is de MIA PaCa-2 PDAC-cellijn, die niet reageert op EGF-behandeling. Hier zal de toevoeging van bekende macropinocytoseremmers valideren dat de waargenomen en gekwantificeerde fluorescerende puncta inderdaad macropinosomen zijn. De meest gebruikte remmende controles zijn de natrium-waterstofwisselaarremmer EIPA, een specifieke macropinocytoseremmer (figuur 5B)4. Andere controles kunnen ook worden opgenomen, zoals de Rac1-remmer EHop-016 (figuur 5B), de Pak-remmer FRAX597 of de PI3K-remmer LY294002; hun effect op macropinocytose kan echter modelspecifiek zijn13.
Voor cellijnen die niet eerder zijn beoordeeld op macropinocytose en remmers, zijn dosis-responscurven een uitstekende benadering om macropinocytose te bevestigen en om de optimale geneesmiddelconcentratie voor toekomstig gebruik te bepalen. Voor deze doeleinden werd het 96-well microplate format protocol gebruikt om constitutieve macropinocytose te bepalen in een cellijn die eerder niet in het laboratorium werd beoordeeld, de PATU8998T PDAC-cellen. Om te bepalen of deze cellen macropinocytose vertonen, werd het effect van twee bekende remmers van dextranopname (EHop-016 en EIPA) bestudeerd. Zoals geïllustreerd, verlaagde het dosis-responsexperiment geleidelijk de macropinocytische index bij hogere geneesmiddelconcentraties (figuur 6A,B), waardoor het bestaan van constitutieve Rac1-afhankelijke macropinocytose in deze cellen werd bevestigd. Bovendien bieden de resultaten informatie voor optimale medicijnconcentraties die kunnen worden gebruikt voor toekomstige experimenten bij het bestuderen van macropinocytose in deze cellijn.
Figuur 7: Problemen met het oplossen van problemen die kunnen optreden. (A) Het beeld is overbelicht, zoals aangegeven in roze. (B) Het beeld is onscherp. (C) De afbeelding bevat dextran vlekken of vlekken. (D) De afbeelding bevat residu. (E) De afbeelding bevat een bubbel. (F) De cellen vertonen geneesmiddel-geïnduceerde autofluorescentie. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Screenshot van de voorbewerking van afbeeldingen. (A) Knop Verwerken . (B) Uitrol van afbeeldingen. (C) Knop Analyseren . Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Schermafbeelding van de instellingen voor beeldkwantificering. (A) ANALYSE-INSTELLINGEN. (B) Gereedschap Lijnprofiel weergeven. (C) Lijn over dextran positief gebied. (D) Bekijk de resultaten van het lijnprofiel Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kwaliteit van de experimenten en gegevensverzameling hangt sterk af van de kwaliteit van de reagentia, de optimalisatie van de instellingen en de netheid van de coverslips en microplaat. De eindresultaten moeten een minimale variatie tussen de replicaties geven; biologische variaties komen echter van nature voor of kunnen anderszins worden veroorzaakt door een aantal factoren. Celdichtheid kan ervoor zorgen dat cellen meer of minder reageren op macropinocytose-inductoren of -remmers. Het is daarom van cruciaal belang om vast te houden aan de 80% confluency zoals hier in het protocol wordt voorgesteld. Als alternatief is het goed gedocumenteerd door fabrikanten van microplaten dat mediaverdamping optreedt op een 96-well microplaat. Hier zijn de buitenste putten onderhevig aan meer verdamping ten opzichte van de binnenputten en kunnen daardoor macropinocytose beïnvloeden. Er kan dus voor worden gekozen om de buitenputten niet mee te nemen in de analyse en in plaats daarvan deze putten te vullen met PBS om een 'buffermuur' te bouwen om de binnenputten te beschermen tegen uitgebreide verdamping.
Het wordt ten zeerste aanbevolen om afbeeldingen voor elke voorwaarde visueel te inspecteren om te bepalen of de acquisitie met succes is voltooid. Dit kan worden gedaan tijdens de beeldvorming van de eerste reeks voorwaarden om vast te stellen of de toegepaste instellingen inderdaad correct zijn en indien nodig ingrijpen mogelijk te maken. Specifieke problemen die zich kunnen voordoen zijn als volgt; de beelden zijn overbelicht (figuur 7A), de beelden zijn onscherp (figuur 7B), de beelden bevatten vlekken van fluorescerend dextran (figuur 7C) of residu (figuur 7D), de beelden bevatten bellen (figuur 7E) of autofluorescentie is zichtbaar in het dextran- of DAPI-kanaal (figuur 7F). Voor de eerste twee problemen, overbelichting en onscherp (figuur 7A,B), moeten de instellingen voor beeldacquisitie worden aangepast en moet de acquisitie worden herhaald. Bovendien moeten de plaat en coverslips worden gereinigd om de autofocus goed te laten werken. Als slechts enkele beelden onscherp zijn, kunnen de specifieke beelden of de hele put ook worden uitgesloten van de analyse met behulp van de beeldfunctie 'Maskeren'. Dezelfde functie kan worden toegepast om afbeeldingen uit te sluiten die vlekken in het dextran-kanaal (figuur 7C), onzuiverheden (figuur 7D) of bellen (figuur 7E) bevatten. Zorg er bovendien voor dat de monsters goed zijn gewassen, dat de dextran volledig is opgelost, wat kan worden verbeterd door de dextran-oplossing bij 37 °C en vortexing te verwarmen, en dat het experiment wordt uitgevoerd met vers bereide en schone reagentia. Ten slotte kan geneesmiddelgeïnduceerde autofluorescentie optreden en is vrij gebruikelijk voor de macropinocytoseremmer EIPA die fluoresceert in het FITC- en DAPI-kanaal, vooral wanneer eerder geëxciteerd in het DAPI-kanaal. Een tijdelijke oplossing is de acquisitie van het FITC-kanaal vóór DAPI. Als alternatief kan TMR-dextran worden gebruikt in plaats van FITC-dextran, of voor de belichtingsinstellingen kunnen de lichtintensiteit en belichtingstijd worden verlaagd terwijl de winst wordt verhoogd.
Om de macropinocytische index te berekenen, wordt nucleaire DAPI-kleuring gebruikt om het celnummer in elke afbeelding te bepalen. Deze kleuringsprocedure is eenvoudig toe te passen en is een betrouwbare uitlezing voor het aantal cellen en dus voor de berekening van de relatieve dextranopname per cel. Een kanttekening bij deze benadering is dat het geen rekening houdt met verschillen in celgrootte, die kunnen optreden bij het vergelijken van verschillende cellijnen of als reactie op farmacologische behandelingen. In deze gevallen, waarbij wordt vermoed dat de celgrootte de macropinocytische index beïnvloedt, kan het celgebied worden gebruikt voor normalisatie van dextranopname, zoals eerder beschreven4. Dit kan worden bereikt door het protocol enigszins aan te passen om een celmaskervlek na fixatie op te nemen of door fasecontrast of heldere veldbeeldvorming op te nemen. Het wordt ook ten zeerste aanbevolen om eventuele bevindingen op te volgen met behulp van de beschreven test om te evalueren of macropinocytose een voedingstoevoerroute is die bijdraagt aan cellulaire fitheid in het specifieke celgebaseerde systeem dat wordt gebruikt. Dit kan worden bereikt door het proliferatieve vermogen, de overleving of de levensvatbaarheid te beoordelen in door voedingsstoffen uitgeputte omstandigheden met en zonder de toevoeging van extracellulair albumine4,7. Bovendien kan een DQ-BSA-pulsachtervolgingstest bewijs leveren voor de vraag of de veranderingen in macropinocytose zich vertalen in veranderingen in albumineafbraak in lysosomen. Net als dextran met een hoog molecuulgewicht wordt DQ-BSA geïnternaliseerd door macropinocytose en wordt het afgeleverd aan de lysosomen, waar het fluoresceert na proteolytische spijsvertering4. Gezien de overeenkomsten met fluorescerende dextranopname, kan de beschreven methode worden aangepast om de opname van DQ-BSA te beoordelen. Evenzo kan dit protocol worden gebruikt om de opname van andere fluorescerend gelabelde lading te evalueren, zoals albumine, lipiden of necrotisch celafval waarvan bekend is dat het cellen binnendringt via macropinocytose. In alle gevallen moeten deze aanpassingen in overeenstemming zijn met de protocollen van de fabrikant en moeten experimentele controles worden gebruikt om de test te valideren.
Microscopische beeldanalyse en kwantificering is een favoriete benadering om macropinocytose te beoordelen en is de standaard geworden in het veld4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20 ,21,22. Het maakt de visuele inspectie van de monsters mogelijk en kan aanvullende informatie geven over het aantal macropinosomen, de grootte en de locatie. Bovendien maakt de mogelijkheid om beelden visueel te inspecteren de beoordeling van de geschiktheid en levensvatbaarheid van cellen en identificatie van artefacten en / of autofluorescentie veroorzaakt door toediening van geneesmiddelen mogelijk. In vergelijking met andere voorgestelde kwantificeringsmethoden, zoals flowcytometrie, kunnen deze gegevens anders verloren gaan of over het hoofd worden gezien en kunnen ze vals positieven of negatieven veroorzaken23. Beeldvorming is echter arbeidsintensiever en vatbaarder voor bevooroordeelde gegevensverzameling als flowcytometrie. Hier hebben we deze obstakels overwonnen door automatisering van het protocol, waardoor vooroordelen, arbeid, kosten en tijd worden verminderd.
Veel modulatoren van macropinocytose blijven hoogstwaarschijnlijk onontdekt en, gezien het belang van de macropinocytische route in bepaalde pathologieën, zoals kanker, zou hun ontdekking mogelijk van groot belang kunnen zijn voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen2,3. De identificatie van deze modulatoren kan worden bereikt door middel van screening van verbindingen met een hoog gehalte, waarvoor de hierin voorgestelde methode als hoeksteen kan fungeren. Het geschetste protocol is gericht op het uitvoeren van de experimenten met standaard laboratoriumapparatuur. Het 96-well plaatformaat kan echter worden geoptimaliseerd en aangepast voor screening met een hoog gehalte. Door het putformaat te verhogen tot microplaten met 384 of 1536 putten, kan de gebruiker het aantal verbindingen dat op één plaat kan worden getest, vergroten. Bovendien zou robotisering van cell seeding, plate washing, compound en dextran toediening de handmatige hantering en well-to-well variabiliteit verminderen en daardoor de schaalbaarheid verbeteren. Uiteindelijk zou een aanpassing van dit protocol aan screening met een hoog gehalte het identificeren van nieuwe factoren die macropinocytose reguleren, aanzienlijk vergemakkelijken.
Al met al is de hierin voorgestelde methode een uitstekende benadering om het niveau van macropinocytose in interessante cellen te bepalen, de identificatie van regulatoren van het proces en de optimalisatie van medicijnconcentraties voor bekende remmers. Ook kan het protocol dienen als uitgangspunt voor het beoordelen van macropinocytische opname van andere lading naast dextran, en screening met een hoog gehalte gericht op het identificeren van loodverbindingen die mogelijk kunnen resulteren in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.C. is een uitvinder van een uitgegeven patent met de titel ''Kankerdiagnostiek, therapeutica en medicijnontdekking geassocieerd met macropinocytose'', Patent nr.: 9.983.194.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH /NCI-subsidies (R01CA207189, R21CA243701) aan C.C. KMO.G. is een ontvanger van een TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). De BioTek Cytation 5 maakt deel uit van de Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, die financiële steun ontvangt van de NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Figuren 1-3 zijn gemaakt met behulp van BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
References
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21 (2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
- Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
- Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
- Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
- Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
- Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
- Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
- Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).
- Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).
- Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
