Summary
Automatiserade analyser med hjälp av mikroplattor med flera brunnar är fördelaktiga metoder för att identifiera vägregulatorer genom att möjliggöra bedömning av en mängd villkor i ett enda experiment. Här har vi anpassat det väletablerade makropinosombilds- och kvantifieringsprotokollet till ett 96-väl mikroplattaformat och ger en omfattande disposition för automatisering med hjälp av en flerlägesplattaläsare.
Abstract
Makropinocytos är en icke-specifik vätskefas upploppsväg som gör det möjligt för celler att internalisera stor extracellulär last, såsom proteiner, patogener och cellskräp, genom bulk endocytos. Denna väg spelar en viktig roll i en mängd cellulära processer, inklusive reglering av immunsvar och cancercellsmetabolism. Med tanke på denna betydelse i biologisk funktion kan undersökning av cellodlingsförhållanden ge värdefull information genom att identifiera tillsynsmyndigheter för denna väg och optimera villkor som ska användas vid upptäckten av nya terapeutiska metoder. Studien beskriver en automatiserad bild- och analysteknik med hjälp av standard laboratorieutrustning och en cellavbildningsplatta för snabb kvantifiering av makropinocytiskt index i vidhäftande celler. Den automatiserade metoden är baserad på upptag av fluorescerande dextran med hög molekylvikt och kan appliceras på 96-brunnsmikroplattor för att underlätta bedömningar av flera förhållanden i ett experiment eller fasta prover monterade på glasöverdrag. Detta tillvägagångssätt syftar till att maximera reproducerbarheten och minska experimentell variation samtidigt som den är både tidsbesparande och kostnadseffektiv.
Introduction
Den icke-specifika endocytiska vägen för makropinocytos gör det möjligt för celler att internalisera en mängd extracellulära komponenter, inklusive näringsämnen, proteiner, antigener och patogener, genom bulkupptag av extracellulär vätska och dess beståndsdelar1. Även om det är viktigt för biologin hos många celltyper, beskrivs makropinocytosvägen i allt högre grad spela en viktig roll i tumörbiologi, där tumörceller genom makropinocytisk upptaktning kan överleva och föröka sig i närvaro av en näringsfattig mikromiljö2,3. Upptaget av extracellulära makromolekyler, inklusive albumin och extracellulär matris, och nekrotiska cellrester, ger en alternativ näringskälla för biomassaproduktion genom att skapa aminosyror, sockerarter, lipider och nukleotider genom makropinosom och lysosom fusionsmedierad lastkatabolism4,5,6,7,8.
Induktion och reglering av makropinocytos är komplexa och kan variera beroende på cellulära sammanhang. Hittills har flera inducerare av makropinocytos identifierats och inkluderar ligands, såsom epidermal tillväxtfaktor (EGF), trombocyt-härledda tillväxtfaktor (PDGF), galectin-3 och Wnt3A9,10,11,12,13. Dessutom kan odlingsförhållanden som efterliknar tumörmikromiljön utlösa aktivering av vägen. Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDAC) tumörer är näringsfattiga, särskilt för aminosyran glutamin, vilket gör att både cancerceller och cancerassocierade fibroblaster (CAFs) förlitar sig på makropinocytos för överlevnad7,13,14,15. Dessutom kan tumörspänningar, såsom hypoxi och oxidativ stress, aktivera denna rensningsväg16. Förutom de många extrinsic påverkare som kan inducera macropinocytosis, en mängd intracellulära vägar kontrollera makropinosom bildas. Onkogen Rasmedierad transformation är tillräcklig för att initiera makropinocytiska maskineri, och flera cancertyper uppvisar onkogen Ras-driven konstituerande makropinocytos4,5,9,17. Alternativt har rasaktivering av vildtyp och Ras-oberoende vägar identifierats för att aktivera makropinocytos i cancerceller och CAFs10,11,15,18. Användningen av olika in vitro-modeller i kombination med inhibitorbehandlingar har resulterat i identifiering av flera makropinocytosmodulatorer, som inkluderar natrium-väteväxlare, den lilla GTPase Rac1, fosphoinositide 3-kinas (PI3K), p21-aktiverad kinas (Pak) och AMP-aktiverad proteinkinas (AMPK)4,13,15 . Med tanke på den mängd beskrivna faktorer och villkor som reglerar makropinocytos är det dock tänkbart att många fler modulatorer och stimuli förblir oupptäckta. Identifieringen av nya modulatorer och stimuli kan underlättas genom automatiserad bedömning av en mängd villkor i ett enda experiment. Denna metodik kan kasta ljus över de faktorer som är involverade i makropinosombildning och kan möjliggöra upptäckten av nya små molekyler eller biologiska läkemedel som riktar sig till denna väg.
Här har vi anpassat vårt tidigare etablerade protokoll för att bestämma omfattningen av makropinocytos i cancerceller in vitro till ett 96-brunns mikroplate format och automatiserad avbildning och kvantifiering19,20. Detta protokoll är baserat på fluorescerande mikroskopi, som har blivit en standard inom området för att bestämma makropinocytos in vitro och in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Makropinosomer kan särskiljas från andra endocytiska vägar genom sin förmåga att internalisera stora makromolekyler, såsom hög molekylvikt dextran (dvs. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Makropinosomer kan således definieras genom upptaget av extracellulärt administrerade fluorofor-märkta 70 kDa dextran. Som ett resultat manifesterar makropinocytiska blåsor som intracellulära kluster av fluorescerande punkter med storlekar från 0,2-5 μm. Dessa punkter kan avbildas mikroskopiskt och därefter kvantifieras för att bestämma omfattningen av makropinocytos i cellen - "det makropinocytiska indexet".
I detta protokoll beskrivs de viktigaste stegen för att visualisera makropinosomer i vidhäftande celler in vitro på en 96-väl mikroplatta och täckslipar med hjälp av standard laboratorieutrustning (figur 1). Dessutom tillhandahålls anvisningarna för att automatisera bildförvärvet och kvantifieringen av makropinocytiskt index med hjälp av en cellavbildningsplatta med flera lägen. Denna automatisering minskar tid, kostnad och ansträngning jämfört med våra tidigare beskrivna protokoll19,20. Dessutom undviker det oavsiktligt partisk bildförvärv och analys och förbättrar därmed reproducerbarhet och tillförlitlighet. Den här metoden kan enkelt anpassas till olika celltyper eller plattläsare eller användas för att bestämma alternativa makropinosomfunktioner, till exempel storlek, antal och plats. Den här beskrivs metoden är särskilt lämplig för screening av cellodling villkor som inducerar makropinocytos, identifiering av nya modulatorer eller optimering av läkemedelskoncentrationer av kända hämmare.
Figur 1: Schematisk av den automatiserade analysen för att bestämma det "makropinocytiska indexet" i vidhäftande celler. Skapad med BioRender. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av material
- Lös upp 70 kDa dextran märkt med FITC eller tetrametylrhodamin (TMR) i PBS för att erhålla en 20 mg/ml-lösning. Förvara alikvoterna vid -20 °C.
- Lös dapi i ddH2O för att erhålla en 1 mg/ml-lösning. Förvara alikvoterna vid -20 °C.
VARNING: DAPI är ett potentiellt cancerframkallande ämne och bör hanteras varsamt. - På fixeringsdagen, förbered färsk 3,7% ACS-formaldehyd i PBS.
VARNING: Formaldehyd är ett fixativt, känt cancerframkallande ämne och är giftigt vid inandning. Gör lösningen i en kemisk rökhuv för att undvika inandning och hantera försiktigt. - Förbered syratvättade täckglas.
- Använd en 500 mL bägare och vattenbad för att värma 28 g borosilikatglas täckslip med en diameter på 12 mm och #1,5 tjocklek i 24 timmar vid 56 °C i 100 ml 1 M HCl. Försegla bägaren med plastfolie för att undvika omfattande avdunstning.
VARNING: HCl är en stark syra som är mycket frätande och bör därför hanteras varsamt och användas i en kemisk rökhuv för att undvika inandning. - Tvätta täcksläcket med destillerat vatten. Upprepa tvätten 4 gånger. Tvätta sedan täcksliparna med 95% etanol. Upprepa tvätten 4 gånger.
- Förvara de syratvättade täcksliparna i en cellodlingsskål vid rumstemperatur för framtida användning genom att bibehålla steriliteten genom nedsänkning i 95% etanol. Försegla skålen med parafilm för att undvika omfattande avdunstning.
- Använd en 500 mL bägare och vattenbad för att värma 28 g borosilikatglas täckslip med en diameter på 12 mm och #1,5 tjocklek i 24 timmar vid 56 °C i 100 ml 1 M HCl. Försegla bägaren med plastfolie för att undvika omfattande avdunstning.
2. Beredning av celler
- Använd en sammanflöde 10 cm vävnadsodlingsplatta med de vidhäftande cellerna av intresse, aspirera på mediet och skölj cellerna med 5 ml DPBS, förvarnat vid 37 °C.
- Lossa cellerna från plattan genom att tillsätta 1,5 ml förvarnad 0,25% trypsin och inkubera vid 37 °C.
OBS: Den trypsininkubationstid som krävs för att lossa cellerna av intresse bör bestämmas empiriskt och kan bekräftas genom att observera lösgöring under ett konventionellt ljusmikroskop. - Samla cellerna i ett 15 ml centrifugrör och tillsätt 4,5 ml komplett media för att släcka trypsin.
- Pellet cellerna genom centrifugering i 3 min vid 200 x g och aspirera supernatanten.
- Återsuspend cellpelleten i en tillräcklig volym förvarnad komplett media för att erhålla en enda cell suspension för sådd.
- Fortsätt att så cellerna på en 24-brunnsplatta med täckslipar eller ett 96-väl mikroplattaformat (figur 1).
OBS: Antalet celler som ska sås bör empiriskt bestämmas för varje cellinje eftersom spridningshastigheter och storlek varierar mellan cellinjer. Detta protokoll har optimerats för vidhäftande cancerceller med 80% cellkonfluens på dagen för makropinosom märkning. Cellkonfluens kan påverka makropinocytisk kapacitet, och detta bör också bestämmas empiriskt.- 24-välplatta med coverslip-format
- Tillsätt täcken till en 24-väl mjukpappersodlingsplatta, använd tång för att greppa ett enda täckslip från etanolbadet. Knacka täckdraget på plattans innervägg för att ta bort överflödig etanol och placera täckslipet platt på botten av en brunn.
- Låt etanolen avdunsta och tvätta täcket 2 gånger med DPBS.
- Så cellerna ovanpå täckslipet genom att tillsätta 500 μL av cellupphängningen till varje brunn. Placera cellerna i en 37 °C cellinkubator med 5% CO2 tills cellkonfluensen når 60-80% dagen före makropinosommärkning.
- Dagen före makropinosommärkningen, aspirera media från brunnarna och tillsätt 500 μL förvarnat serumfritt medium till varje brunn och placera cellerna i en 37 °C cellinkubator med 5% CO2 för 16-24 h.
OBS: Beroende på vilka villkor som ska studeras rekommenderas serumfria medier för att minska effekterna av tillväxtfaktorer som kan inducera makropinocytos och som normalt förekommer i serum. Det bör dock övervägas att serum svält kan påverka andra cellulära processer, såsom spridning och autofagi. Eftersom restserum kan påverka cellernas makropinocytiska kapacitet, liksom inhibitoraktiviteten, kan avlägsnandet av serum förbättras genom att försiktigt skölja cellerna 1 eller 2 gånger med 500 μL förvarnad DPBS.
- 96-väl mikroplatta format
- Överför cellfjädringen till en 25 ml reagensbehållare. Använd en flerkanalspipett (8 eller 12 kanaler), så 100 μL av cellfjädringen till varje brunn av en svart 96-väl höginnehållsscreeningsmikroplatta med optiskt klar cyklisk olefin eller glasbotten.
- Placera cellerna i en 37 °C cellinkubator med 5% CO2 tills cellkonfluensen når 60-80% dagen före makropinosommärkning.
- Dagen före makropinosommärkningen, ta bort och kassera mediet från varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett (8 eller 12 kanaler) eller en flerkanalig aspirationsadapter för standardspetsar som är fästa vid en vakuumpump.
- Använd en reagensbehållare och flerkanalspipett (8 eller 12 kanaler) och tillsätt försiktigt 100 μL förvarnat serumfritt medium till varje brunn. Placera cellerna i en 37 °C cellinkubator med 5% CO2 i 16-24 h.
OBS: Beroende på vilka villkor som ska studeras rekommenderas serumfria medier för att minska effekterna av tillväxtfaktorer som kan inducera makropinocytos och som normalt förekommer i serum. Det bör dock övervägas att serum svält kan påverka andra cellulära processer, såsom spridning och autofagi. Eftersom restserum kan påverka cellernas makropinocytiska kapacitet, liksom inhibitoraktiviteten, kan avlägsnandet av serum förbättras genom att försiktigt skölja cellerna 1 eller 2 gånger med 100 μL förvarnad DPBS.
- 24-välplatta med coverslip-format
3. Makropinosom märkning
- 24-välplatta med coverslip-format
- Aspirera på brunnarna och tillsätt tillbaka 200 μL serumfritt medium med 1 mg/ml fluoroformärkt hög molekylvikt (70 kDa). Placera cellerna i en 37 °C cellinkubator i 30 min.
OBS: Beroende på de villkor som ska studeras, i stället för att använda nya medier, kan återanvändning av de konditionerade medierna för dextranbelastning föredras eftersom det skulle innehålla utsöndrade eller kompletterade faktorer, såsom egf eller inhibitorföreningar, som kan påverka cellernas makropinocytiska kapacitet. - Aspirera på mediet och tvätta cellerna försiktigt men snabbt 5 gånger med iskall PBS med en förkyld tvättflaska. Skaka plattan ordentligt för hand under tvättar för att underlätta lossning av dextranaggregat som fastnar på täcksliparna.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 350 μL 3,7% formaldehyd och inkubera i 20 min. Aspirera sedan fixeringslösningen och tvätta cellerna med PBS två gånger.
- Färga kärnorna med 350 μL av 2 μg/mL DAPI i PBS. Efter 20 min, aspirera DAPI-lösningen och tvätta cellerna med PBS-tre gånger.
- Fäst silikonisolatorer sida vid sida på en mikroskopbild för att få jämnt avstånd och reproducerbar lokalisering av täcksliparna, som krävs för avbildningsautomation (figur 2A,B).
OBS: Hela mikroskopbilden kan fylls med totalt 3 isolatorer. - För varje täckslip, tillsätt en droppe härdande fluorescensmonteringsmedium på mikroskopbilden i isolatorns öppna utrymme (figur 2C). Ta upp ett täckdrag med tång och ta bort överflödig PBS genom att försiktigt knacka på sidan av täcksläparna på en luddfri våtservett.
- Placera täckdraget upp och ner på droppen av monteringsmediet (bild 2D). Knacka försiktigt på täcket med slutna tångar för att avlägsna bubblor från monteringsmediet (figur 2E).
- Förvara rutschkanorna i en mörk miljö och låt monteringsmediet torka i rumstemperatur, vanligtvis med 16-24 timmar. Bilder kan nu avbildas eller lagras vid -20 °C i upp till 2 veckor.
- Innan du avbildar, ta bort isolatorerna från mikroskopbilden. Låt rutschkanorna balansera till rumstemperatur och rengör täcksänkningarna med hjälp av en bomullsspetsad applikator fuktad med ammoniakfri glasrengörare. Använd därefter en ren bomullsspetsad applikator fuktad med 70% etanol för att rengöra och lämna täcket torrt.
- Aspirera på brunnarna och tillsätt tillbaka 200 μL serumfritt medium med 1 mg/ml fluoroformärkt hög molekylvikt (70 kDa). Placera cellerna i en 37 °C cellinkubator i 30 min.
Bild 2: Placera täckglas på en mikroskopbild med silikonisolatorer. (A) Silikonisolatorer pressas och fästs vid en mikroskopbild. (B) Hela mikroskopbilden kan befolkas med totalt 3 isolatorer, vilket resulterar i jämnt avstånd och reproducerbar lokalisering av täcksliparna. (C) För varje täckslip, tillsätt en droppe fluorescensmonteringsmedium på mikroskopglaset i isolatorns öppna utrymme. (D) Använd tång, ta upp ett täckglas från 24-brunnsplattan och placera den upp och ner på droppen av monteringsmedia. (E) När det finns bubblor mellan täcket och mikroskopbilden, knacka försiktigt på täcket med slutna tångar för att avlägsna bubblor. Skapad med BioRender. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- 96-väl mikroplatta format
- Aspirera brunnarna med hjälp av en flerkanalig aspirationsadapter fäst vid ett vakuum och tillsätt 40 μL serumfritt medium med 1 mg/ml fluoroformärkt hög molekylvikt (70 kDa) dextran tillbaka till brunnarna. Inkubera cellerna i en 37 °C cellinkubator i 30 min.
OBS: Beroende på de villkor som ska studeras, i stället för att använda nya medier, kan återanvändning av de konditionerade medierna för dextranbelastning föredras eftersom det skulle innehålla utsöndrade eller kompletterade faktorer, såsom egf eller inhibitorföreningar, som kan påverka cellernas makropinocytiska kapacitet. - Kasta mediet i mikroplattan genom att manuellt snärta plattan upp och ner i en tom 5 L-bägare (figur 3A).
- Skölj cellerna i mikroplattan genom att långsamt sänka plattan vertikalt, i en liten vinkel, till en 2 L bägare fylld med iskall PBS (figur 3B) och kassera sedan PBS i mikroplattan genom att snärta plattan upp och ner i 5 L-bägaren (figur 3C). Upprepa 2 gånger.
OBS: Celler som svagt fäster på avbildningsmikroplattan kan lossna under denna process. Vid behov kan brunnar också aspireras med en flerkanalig aspirationsadapter eller mer försiktigt tvättas med PBS med en flerkanalspipett. Bearbetning av en 96-brunns mikroplatta kommer att kräva cirka 2 L iskall PBS. Om fler plattor ska analyseras, använd en större bägare och tillsätt 1 L iskall PBS för varje extra platta eller uppdatera den iskalla PBS vid behov. - Efter bortskaffandet av PBS från den senaste sköljningen, fixera cellerna i 20 min vid rumstemperatur genom att tillsätta 100 μL 3,7% formaldehyd i PBS till varje brunn med hjälp av en 25 ml reagensbehållare och en flerkanalspipett (figur 3D).
- Ta bort fixeringslösningen och tvätta cellerna med PBS två gånger med hjälp av nedsänknings- och snärttekniken. Färga kärnorna med 100 μL av 2 μg/mL DAPI i PBS per brunn.
- Skölj cellerna tre gånger med iskall PBS efter 20 minuter med hjälp av den nedsänknings- och snärtteknik som beskrivs ovan (steg 3.2.3). Ta bort eventuell kvarvarande PBS genom att knacka mikroplattan upp och ner på en luddfri rensning och tillsätt 100 μL färsk PBS till varje brunn med hjälp av en 25 ml reagensbehållare och flerkanalspipett. Avbilda cellerna nu eller förvara dem täckta från ljus vid 4 °C i upp till en vecka.
OBS: Alternativt kan en lösning av glycerol i PBS (istället för PBS) användas för avbildning och lagring för att bättre stabilisera fluorescensen (figur 4A). - Låt plattan balansera till rumstemperatur före avbildning. Torka av mikroplattan torr med en luddfri våtservett.
- Aspirera brunnarna med hjälp av en flerkanalig aspirationsadapter fäst vid ett vakuum och tillsätt 40 μL serumfritt medium med 1 mg/ml fluoroformärkt hög molekylvikt (70 kDa) dextran tillbaka till brunnarna. Inkubera cellerna i en 37 °C cellinkubator i 30 min.
Figur 3: Skölja 96-brunnsmikroplattan för att förbereda för fixering. A) Töm mikroplattan på media i en 5 L-bägare genom att snärta manuellt. B) Vertikalt och i en liten vinkel, sänk långsamt ned mikroplattan i en 2 L-bägare fylld med iskall PBS. C) Töm mikroplattan på PBS i 5 L-bägaren genom att snärta manuellt. Upprepa tvättstegen enligt beskrivningen i B två gånger. D) Efter tömning av PBS i mikroplattan för sista gången, tillsätt 100 μL 3,7% formaldehyd till brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett. Skapad med BioRender. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
4. Automatiserad makropinosom avbildning
Bilder av makropinosomer kan tas med hjälp av ett vanligt fluorescerande mikroskop, som tidigare beskrivits19,20. Ett sådant förfarande kan dock förbättras när det gäller effektivitet genom automatisering, särskilt vid bedömning av många olika cellodlingsförhållanden. Automatisering av bildförvärv kan utföras via en multilägesplåtläsare med flera lägen, vilket minskar ansträngningen genom att minska hanteringsförfarandena och, viktigast av allt, ökar data reproducerbarheten och tillförlitligheten genom att förvärva bilder på ett opartiskt sätt. Flera bildsystem är kommersiellt tillgängliga och riktningarna skiljer sig åt mellan instrumenten. Här beskrivs förvärv av bilder med en Cytation 5. Protokollet nedan kan dock skräddarsys för varje enskilt instrument genom att följa följande riktlinjer:
- Skapa ett automatiseringsprotokoll för att förvärva bilderna med ett 40x luftmål i våglängdskanalen för dextran fluorophore (FITC/TMR) och DAPI.
OBS: Den vanliga makropinocytoshämmaren EIPA uppvisar autofluorescens i FITC-kanalen, särskilt när den tidigare upphetsades i DAPI-kanalen. Andra föreningar som testas kan också visa autofluorescens. För att kringgå det här problemet hjälper inställningen av bildförvärvet att ske först i kanalen med den högsta excitationsvåglängden (FITC/TMR) och den andra i DAPI-kanalen att undvika den här förekomsten. - Optimera exponeringsinställningarna med hjälp av ett prov som förutspås ha den högsta nivån av makropinocytos för att undvika överexponering, vilket kan leda till mättnad av signalen och förlust av intensitetsdata. Använd fokusinställningar som enkelt och konsekvent hittar exemplet för att producera bilder av hög kvalitet.
- Skaffa flera bilder över varje brunn eller täckblad för att ta hänsyn till provvariationer och få en korrekt representation av provet.
- När avbildningsinställningarna har fastställts använder du samma inställningar för varje prov i experimentet.
- Följ dessa instruktioner för makropinosombildförvärv när du använder en Cytation 5- och Gen5-programvara:
- 24-välplatta med coverslip-format
- Starta plattläsaren och sätt in mikroskopbilderna upp och ner med hjälp av skjuthållaren.
- Öppna mikroplattans läsare och bildbehandlingsprogram, skapa ett nytt protokoll genom att klicka på Protokoll och Skapa nytt. Dubbelklicka på Procedur och välj plåttyp.
OBS: Om plåttypen inte är tillgänglig, lägg till plåttypen i programvaran genom att klicka på System > Plate Types > Add Plate och använda plåtmåtten enligt tillverkarens. För enkel användning finns mallen för två mikroskopbilder med tre täcken fördelade med silikonisolatorerna i kompletterande fil 1. - Om du vill komma åt bildinställningarna väljer du Åtgärder > Bild > inverterad bildspelare och klickar på OK. Använd 40x, PL FL Phase-målet med Wide FOV och Autofocus Binning.
- För den första kanalen väljer du led-kuben som motsvarar dextran fluoroforetiketten (GFP eller RFP). Ta bort automatisk exponering och klicka på mikroskopikonknappen för att optimera exponeringsinställningarna. När lämpliga exponeringsinställningar har fastställts klickar du på Spara inställningar.
OBS: Justera exponeringsinställningarna med hjälp av ett prov som förutspås ha den högsta nivån av makropinocytos för att undvika överexponerade bilder, vilket kan leda till mättnad av signalen och förlust av intensitetsdata. - Upprepa föregående steg för den andra kanalen med DAPI LED-kuben.
- Ställ in autofokusinställningarna för varje fluorescenskanal och välj Fokusalternativ. Avmarkera standardfokusmetoden och använd Autofokus med valfri skanning och autofokus utan valfri skanning för dextran-fluorofor respektive DAPI-kanal. Klicka på OK för att spara inställningarna.
OBS: Skanningsavståndet kan minskas till 200 μm och ökningen till 20 μm för att öka autofokuseffektiviteten. Den valfria skanningen krävs för adekvat autofokus på prover med låg fluorescens. Detta inträffar normalt när man analyserar förhållanden med låg makropinocytos, till exempel när makropinocytos hämmas eller inte är medfödd närvarande. - Använd alternativet Definiera beacons för att automatisera anskaffningen av bilder i olika regioner i omslagsslipet. Klicka på mikroskopikonen och lägg till fyrar genom att klicka i bildfönstret och flytta scenen till nästa region. När lämpligt antal regioner har valts går du till nästa täckbesked och upprepar processen. För att slutföra, klicka på Spara inställningar.
OBS: För att få en bra representation av makropinocytos över provet, välj cirka 20 fyrar som är jämnt fördelade över täckslipet (figur 4B). Färre fyrar kan användas, men vissa bilder kan behöva uteslutas från bildanalys efter förvärv på grund av kvalitetsskillnader, till exempel när bilden är ur fokus eller innehåller bubblor eller fluorescerande fläckar och fläckar. - För att slutföra justeringen av bildinställningarna, klicka på OK. Om du vill avbilda omslagsbilderna väljer du Skapa ett nytt experiment och Läs nu i protokollverktygen. Spara protokollet och experimentet när du uppmanas att göra det.
- 24-välplatta med coverslip-format
Figur 4: Optimering av villkoren för bildförvärv. (A) Ökad glycerolkoncentration ökar TMR-dextran fluorescens, enligt vad som fastställts i AsPC-1-celler som behandlats med egf. (B) Exempelkoordinater för bildfyrar för automatisk bildförvärv vid användning av 24-brunnsplattan med coverslips-format. Stapeldiagrammet visar den genomsnittliga relativa fluorescensen med SEM av 5 experiment. Statistisk signifikans fastställdes av tvåvägs ANOVA, i förhållande till PBS. ** p < 0,01; p < 0,001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- 96-väl mikroplatta format
- Starta plattläsaren och sätt in mikroplattan.
- Öppna mikroplattans läsare och bildbehandlingsprogram, skapa ett nytt protokoll genom att klicka på Protokoll och Skapa nytt. Dubbelklicka på Procedur och välj plåttyp.
OBS: Om plåttypen inte är tillgänglig lägger du till plåttypen i programvaran genom att klicka på System > Plate Types > Add Plate och använda plåtmåtten enligt tillverkarens anvisningar. För enkel användning finns mallen för CellCarrier-96 Ultra Microplates från PerkinElmer i Kompletterande fil 2. - Om du vill komma åt bildinställningarna väljer du Åtgärder > Bild > Inverterad bild av bild och klickar på OK. Använd 40x PL FL Fasmålet med Wide FOV och Autofocus Binning.
- För den första kanalen väljer du led-kuben som motsvarar dextran fluoroforetiketten (GFP eller RFP). Ta bort automatisk exponering och klicka på mikroskopikonknappen för att optimera exponeringsinställningarna. När lämpliga exponeringsinställningar har fastställts klickar du på Spara inställningar.
OBS: Under optimeringen av exponeringsinställningarna kan betydande fluorescensblekning uppstå. Detta kan resultera i inställningar som orsakar överexponering när ett nytt fält avbildas. Verifiera därför exponeringsinställningarna genom att kontrollera ett ännu oexponerat fält och försäkra dig om att signalen inte mättnad sker vid de valda inställningarna. Inkludera inte de brunnar som används för optimering av exponeringsinställningen i makropinosomkvantifieringen, eftersom fluorescensen har minskat till följd av blekning under optimeringen. Justera exponeringsinställningarna med hjälp av ett prov som förutspås ha den högsta nivån av makropinocytos för att undvika överexponerade bilder, vilket kan leda till mättnad av signalen och förlust av intensitetsdata. - Upprepa föregående steg för den andra kanalen med DAPI LED-kuben.
- Ställ in autofokusinställningarna för varje fluorescenskanal och välj Fokusalternativ. Avmarkera standardfokusmetoden och använd Laser autofokus. Fånga en referenssökning efter att ha fastställt fokalplanet för optimal visualisering av makropinosomer och kärnor. Klicka på OK för att spara inställningarna.
OBS: Skanningsavståndet kan minskas till 400 μm och ökningen till 3 μm för att öka autofokuseffektiviteten. För att laserautofokusalternativet ska fungera korrekt, rengör botten av plattan, torka och torka av plattan med en luddfri våtservett före avbildning. Laserautofokus är en överlägsen metod för fokus eftersom det kräver minimal tid för att hitta fokalplanet. Andra fokusmetoder kan användas, men eftersom ingen anti-fade har lagts till brunnarna kan dessa metoder orsaka betydande blekning av proverna, vilket kommer att påverka insamlingen av data negativt. - Ställ in vågrät och lodrät förskjutning på noll och välj Montage utan överlappning under En bild och använd 3 x 3 bilder, beroende på hur många celler som önskas ingå i analysen.
OBS: Beroende på cellernas storlek och densitet kan mer eller mindre bilder tas för att få en representativ bedömning av makropinocytos i hela provet. Bedömning av makropinocytos i AsPC-1- eller MIA PaCa-2-celler under olika förhållanden, inga skillnader i datatolkning mellan en 2 x 2 eller 4 x 4 fotoram observeras, även om variationen mellan replikerade prover kan öka när du tar färre bilder (figur 5A,B). Att öka eller minska ramens storlek kommer att påverka den tid det tar att skanna plattan. Beroende på exponeringstiden tar en full 96-brunns mikroplatta cirka 1-1,5 h att skanna helt med en 3 x 3 ram. En 2 x 2 och 4 x 4 ram halveras respektive fördubblas den tiden. - För att slutföra justeringen av bildinställningarna, klicka på OK.
- Om du vill avbilda plattan väljer du Skapa ett nytt experiment och läs nu i protokollverktygen. Spara protokollet och experimentet när du uppmanas att göra det.
Figur 5: Kontrollvillkor för bedömning av makropinocytos i PDAC-celler. (A) AsPC-1 celler visar makropinocytos som svar på 100 ng/mL EGF stimulering för 5 min eller glutamin deprivation för 24 h. För bildförvärv togs bildramar på 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 eller 2 x 2 för att bestämma påverkan av antalet foton på datakvaliteten. (B) MIA PaCa-2-celler visar konstituerande makropinocytos som hämmas av 30-minuters behandling med 75 μM EIPA eller 2- h behandling med 10 μM EHop-016. Bildramar togs som i A. Skalstång = 25 μm. Stapeldiagram visar det genomsnittliga relativa makropinocytiska indexet med SD av 1 experiment med 4 replikat. Statistisk signifikans fastställdes av tvåvägs ANOVA i förhållande till +Q eller fordonets skick. p < 0.001 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Bestämning av makropinocytiskt index
Det "makropinocytiska indexet" är omfattningen av cellulär makropinocytos som bestäms genom kvantifiering av fluorescerande dextranupptag per cell med hjälp av mikroskopisk avbildning19. För detta ändamål används de förvärvade bilderna för att bestämma mängden internaliserad dextran genom att mäta den totala fluorescensintensiteten eller fluorescenspositiva området och det totala antalet celler som bestäms av DAPI-färgning. Denna analys kan utföras med programvara för bildbehandling och analys med öppen källkod, till exempel Cell Profiler eller FIJI/ImageJ, som tidigare beskrivits19,20. Vid arbete med en flerlägesplåtläsare kan dock programvaran som medföljer instrumentet innehålla inbyggda analysapplikationer som kan användas för att beräkna makropinocytindexet. I vissa fall kanske den inbyggda pipelinen för programvaruanalys inte är helt uppenbar för användaren. Det rekommenderas därför att validera programvaran i ett tidigt skede i jämförelse med ett icke-automatiserat förfarande, till exempel Cell Profiler eller FIJI / ImageJ. Detta protokoll kan anpassas till andra verktyg för bildbehandling och analys genom att följa följande allmänna instruktioner:
- För DAPI och motsvarande dextran-bild subtraherar du bakgrunden genom att använda lämplig funktion, ofta kallad rullande kulfunktion. Justera inställningarna så att bakgrundsljudet minimeras och det finns minimal eller ingen subtraktionseffekt på DAPI- och dextransignalen.
- Med hjälp av ett fält med hög dextransignal bestämmer du intensitetssignalinställningarna, ofta kallad tröskelvärdesfunktionen, för att välja kärnorna och bestämma den minsta intensitetssignalinställning som krävs för att välja endast makropinosomerna.
- För dextranbilden beräknar du den totala fluorescensen inom det skapade makropinosomvalet eller använder markeringen för att bestämma det totala området positivt för dextran.
- För DAPI-bilden använder du markeringen för att bestämma antalet kärnor i bilden för att återspegla antalet celler som finns.
- För att bestämma det makropinocytiska indexet, dividera den totala dextranfluorescensen eller området med antalet celler som bestäms av DAPI.
- Upprepa dessa analys steg för alla förvärvade bilder som tillämpar samma numeriska inställningar hela tiden.
- Följ dessa instruktioner för att bestämma makropinocytindexet när du använder Gen5-programvaran:
OBS: Den inbyggda analyspipelinen validerades och upptäckte inga skillnader i beräkning i förhållande till Fiji/ImageJ (Figur 6A).- När avbildningen är klar väljer du en bild med en hög nivå av makropinocytos. Ta bort bakgrundssignalen, klicka på Bearbeta (kompletterande bild 1A) och välj alternativet Förbearbetning av bild .
- För dextrankanalen avmarkerar du Auto och använder en rullande kuldiameter på 5 μm, prioriterar fina resultat och jämnar ut bilden med 1 cykel.
- För DAPI-kanalen använder du Automatisk förbearbetning och 1 jämn cykel. Klicka på OK och lägg till steget för förbearbetning av bilden i protokollet; Klicka på LÄGG TILL STEG. Välj sedan den bearbetade bilden under bildlansering (kompletterande bild 1B) och klicka på knappen Analysera (kompletterande bild 1C).
- Ställ in typen Typ på Cellanalys under ANALYSINSTÄLLNINGAR. Välj DAPI-kanalen och klicka på Alternativ (Kompletterande figur 2A).
- För den primära masken skapar du en mask med den bearbetade DAPI-bilden för att välja enstaka kärnor. Använd den mörka bakgrunden och alternativet Auto . Ta dessutom reda på vilka inställningar som tillåter maskval av enstaka kärnor och när du är klar klickar du på knappen Använd för att avgöra om masken används på rätt sätt.
Om du aktiverar alternativen Split Touch Objects och Fill Holes in Masks kan det fungera bäst för att välja enstaka kärnor. Minsta och högsta objektstorlekar kan behöva justeras beroende på cellinjen och anges oftast i intervallet 5-40 μm. Primära kantobjekt kan inkluderas och hela bilden ska analyseras. Skjutreglaget kan användas för att justera maskvalet till signalintensiteten. - Använd sedan en sekundär mask för att optimera inställningarna för att välja makropinosom lysrörspunkta. Använd måttet i en sekundär maskfunktion och expandera den primära masken med 40 μm beroende på cellernas storlek.
- Använd metoden Tröskelvärde och Tröskelvärde i mask för att välja de positiva dextran-områdena. Klicka på Verkställ för att avgöra om inställningarna tillämpas korrekt.
OBS: För att bestämma tröskelvärdet använder du verktyget Visa linjeprofil (kompletterande figur 2B) och ritar en linje över ett dextranpositivt område (kompletterande figur 2C). Använd den uppmätta intensiteten för att bestämma den bästa inställningen för att skapa en mask som väljer makropinosomer och utesluter bakgrundssignal (kompletterande figur 2D). - När du har skapat lämpliga masker för att välja kärnor och makropinosomer klickar du på fliken Beräknade mått och väljer Välj eller skapa objektnivåmått av intresse.
- Ta bort alla mått som finns och lägg till måtten Integral och Area för analys av den sekundära masken. Klicka på OK och välj Beräkna och Visa för de nya måtten. När du är klar klickar du på OK och väljer LÄGG TILL STEG för att lägga till analys och beräkningar i protokollet.
- Spara det slutförde protokollet för framtida användning, klicka på Arkiv och Spara protokoll som.
- När dataanalysen är klar väljer du mått av intresse och exporterar data för att bestämma makropinocytindexet. Bestäm det makropinocytiska indexet på följande sätt:
Dextran fluorescence per cell = Objekt Int_2[Dextran fluorofor]
Dextran område per cell = Objekt Area_2[Dextran fluorophore]
OBS: För 24-brunnsplattan med coverslips-format återspeglar måtten medelvärdet för det genomsnittliga makropinocytiska indexet per bild. Alternativt kan det makropinocytiska indexet beräknas manuellt för hela provet genom att dividera summan av "Area" eller "Integral" för alla bilder med det totala antalet celler. Skillnaden mellan dessa metoder vid beräkning av makropinocytiskt index är minimal i de flesta inställningar. För mikroplateformatet med 96 brunnar beräknas det makropinocytiska indexet som medelvärdet för hela provet. - Spara protokollet för avbildning och efterföljande automatiserad analys. Återanvänd protokollet för framtida experiment med samma fluoroforer.
OBS: Vid användning av laserautofokusfunktionen måste en ny referenssökning göras när en annan cellinje ska analyseras eftersom kärnor och makropinosomer eventuellt är lokaliserade till ett annat plan. Varje gång ett nytt experiment utförs med ett tidigare fastställt protokoll måste exponeringsinställningarna för det experimentet optimeras.
6. Tillägg av behandlingar
Cellbehandlingar (små molekyler, biologiska läkemedel, tillväxtfaktorer, metaboliter etc.) kan införlivas i vilket skede som helst i protokollet, och den exakta tidpunkten beror på studiens mål och mål.
- Förbered cellerna som i avsnitt 2.
- Strax innan du lägger till de behandlingar som är av intresse, förbered behandlingarna och lämpliga kontroller vid dubbla deras slutliga koncentrationer i serumfria medier. Förbered behandlingarna i en volym som motsvarar volymen av antalet replikerade brunnar som bedöms.
OBS: Med tanke på den roll som utsöndrade faktorer kan spela för att kontrollera cellulära funktioner, kan det föredras att späda ut behandlingarna av intresse för konditionerade medier. För dessa ändamål kan det vara till hjälp att så ytterligare plattor, såsom 6 cm eller 10 cm cellodlingsrätter, när man förbereder celler enligt beskrivningen i avsnitt 2 för att generera det konditionerade mediet för beredning av behandlingslösningarna. - Utan att ta bort mediet från brunnen, lägg till en brunnsvolym behandlingslösning till varje brunn. Skaka plattan för att säkerställa korrekt blandning. Inkubera cellerna under önskad tid.
- Fortsätt med avsnitt 3.
OBS: Vid tillsats av dextran orsakar användningen av färska medier avlägsnandet av de tillagda behandlingarna, vilket kan påverka nivån av makropinocytos. Därför kan det föredras att tillsätta dextran direkt till brunnarna utan att aspirera eller alternativt lägga till behandlingarna eller återanvända det betingade mediet för att förbereda dextranlösningen.
Figur 6: Utföra en dos-responskurva för makropinocytoshämmare. Exempeldata som erhålls vid testning av kända makropinocytoshämmare i en ny cellinje. PATU8998T celler användes för 96-brunn microplate format och behandlades för 2 h och 30 min med de angivna koncentrationerna av (A) EHop-16 respektive (B) EIPA. Jämförelse av resultat som erhållits genom bildanalys av Gen5-programvaran eller ImageJ visar inga signifikanta skillnader mellan de två tillvägagångssätten som anges av ns i (A). Skalstång = 25 μm. Stapeldiagram visar medelvärdet och SD för ett enda experiment med 4 replikat. Statistisk signifikans fastställdes av en- eller tvåvägs ANOVA, jämfört med obehandlade tillstånd. * p < 0,05; p < 0,001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När stegen och justeringen av ovannämnda protokoll följs i enlighet därmed, bör de slutliga experimentella resultaten ge information om huruvida de studerade cellodlingsförhållandena eller hämmarna inducerar eller minskar makropinocytos i den cellinje som är av intresse. För att stärka giltigheten av dessa resultat kommer införandet av kontrollvillkor att möjliggöra granskning av resultaten för att avgöra om experimentet har slutförts framgångsrikt. Makropinocytosis induktionskontroller kommer att ge information om den relativa nivån av makropinocytos. För detta ändamål används ligand EGF oftast13. I AsPC-1 PDAC-celler aktiveras makropinocytos (figur 5A) genom att tillsätta EGF vid 100 ng/ml i 5 minuter innan dextran tillsätts makropinocytos (figur 5A). Dessutom kan autokrin EGF aktivering av makropinocytos induceras genom att beröva cellerna av glutamin i 16-24 h (figur 5A). Alternativt kan andra inducerare införlivas beroende på celltyp och tillgänglig litteratur. dessa kan inkludera PDGF eller Wnt3A10,11,12. Inte alla celler beter sig på samma sätt, och KRAS mutanta celler kan uppvisa konstituerande macropinocytosis13. Ett exempel är MIA PaCa-2 PDAC-cellinjen, som inte svarar på EGF-behandling. Här kommer tillägget av kända makropinocytoshämmare att validera att den observerade och kvantifierade fluorescerande puncta verkligen är makropinosomer. De hämmande kontrollerna som oftast används är natrium-väteväxlarhämmaren EIPA, som är en specifik makropinocytoshämmare (figur 5B)4. Andra kontroller kan också inkluderas, såsom Rac1-hämmaren EHop-016 (figur 5B), Pak-hämmaren FRAX597 eller PI3K-hämmaren LY294002; Deras effekt på makropinocytos kan dock vara modellspecifik13.
För cellinjer som tidigare inte har bedömts för makropinocytos och hämmare är dos-responskurvor ett utmärkt tillvägagångssätt för att bekräfta makropinocytos och för att bestämma optimal läkemedelskoncentration för framtida användning. För dessa ändamål användes 96-brunns microplate format protokollet för att bestämma konstituerande makropinocytos i en cellinje som tidigare inte bedömts i labbet, PATU8998T PDAC celler. För att avgöra om dessa celler uppvisar makropinocytos studerades effekten av två kända hämmare av dextranupptag (EHop-016 och EIPA). Som illustreras minskade dos-respons experimentet gradvis makropinocytic indexet vid högre läkemedelskoncentrationer (figur 6A,B), vilket bekräftar förekomsten av konstituerande Rac1-beroende makropinocytos i dessa celler. Dessutom ger resultaten information om optimala läkemedelskoncentrationer som ska användas för framtida experiment när man studerar makropinocytos i denna cellinje.
Bild 7: Felsökningsförhållanden som kan uppstå. (A) Bilden är överexponerad, enligt bilden i rosa. (B) Bilden är ur fokus. (C) Bilden innehåller dextranfläckar eller fläckar. D) Bilden innehåller rester. (E) Bilden innehåller en bubbla. (F) Cellerna visar läkemedelsinducerad autofluorescens. Skalstreck = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Skärmbild av förbearbetning av bilder. (A) Knappen Bearbeta. (B) Bildlansering. (C) Knappen Analysera. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Skärmbild av bildkvantifieringsinställningar. A) ANALYSINSTÄLLNINGAR. (B) Verktyget Visa linjeprofil. C) Linje över dextran positivt område. (D) Visa resultat för linjeprofil Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvaliteten på experimenten och datainsamlingen beror i hög grad på reagensernas kvalitet, optimeringen av inställningarna och renheten hos täcksliparna och mikroplattan. De slutliga resultaten bör ge minimal variation mellan replikat. Biologiska variationer förekommer dock naturligt eller kan på annat sätt orsakas av ett antal faktorer. Celldensitet kan orsaka att celler reagerar mer eller mindre på makropinocytosinducerare eller hämmare. Det är därför mycket viktigt att hålla fast vid det 80-procentiga sammanflöde som föreslås här i protokollet. Alternativt är det väl dokumenterat av mikroplatetillverkare att mediaavdunstning sker på en 96-brunns mikroplatta. Här är de yttre brunnarna föremål för mer avdunstning i förhållande till de inre brunnarna och kan därmed påverka makropinocytos. Således kan valet göras att inte inkludera de yttre brunnarna i analysen och istället fylla dessa brunnar med PBS för att bygga en "buffertvägg" för att skydda de inre brunnarna från omfattande avdunstning.
Det rekommenderas starkt att visuellt inspektera bilder för varje villkor för att avgöra om förvärvet slutfördes framgångsrikt. Detta kan göras under avbildningen av den första uppsättningen villkor för att säkerställa att de tillämpade inställningarna verkligen är korrekta och möjliggöra ingripande vid behov. Specifika problem som kan uppstå är följande; bilderna är överexponerade (figur 7A), bilderna är ur fokus (figur 7B), bilderna innehåller fläckar av fluorescerande dextran (figur 7C) eller rester (figur 7D), bilderna innehåller bubblor (figur 7E) eller autofluorescens är synlig i dextran- eller DAPI-kanalen (figur 7F). För de två första emissionerna, överexponering och out-of-focus (figur 7A,B), måste bildförvärvsinställningarna justeras och förvärvet måste upprepas. Dessutom bör plattan och täcksliparna rengöras för att autofokusen ska fungera korrekt. Om bara ett fåtal bilder är ur fokus kan de specifika bilderna eller hela brunnen också uteslutas från analysen med hjälp av bildfunktionen "Mask". Samma funktion kan tillämpas för att utesluta bilder som innehåller fläckar i dextrankanalen (figur 7C), orenheter (figur 7D) eller bubblor (figur 7E). Se dessutom till att proverna har tvättats väl, att dextran har lösts upp helt, vilket kan förbättras genom uppvärmning av dextranlösningen vid 37 °C och virvel, och att experimentet utförs med nyberedda och rena reagenser. Slutligen kan läkemedelsinducerad autofluorescens uppstå och är ganska vanligt för makropinocytoshämmaren EIPA som fluorescerar i FITC- och DAPI-kanalen, särskilt när den tidigare upphetsades i DAPI-kanalen. En lösning är förvärvet av FITC-kanalen före DAPI. Alternativt kan TMR-dextran användas istället för FITC-dextran, eller för exponeringsinställningarna kan ljusintensiteten och exponeringstiden sänkas samtidigt som förstärkningen ökar.
För att beräkna makropinocytiskt index används nukleär DAPI-färgning för att bestämma cellnumret i varje bild. Denna färgning förfarande är lätt att tillämpa och är en tillförlitlig avläsning för antalet celler och därmed för beräkning av den relativa dextran upptag per cell. En varning till detta tillvägagångssätt är att det inte tar hänsyn till skillnader i cellstorlek, vilket kan uppstå vid jämförelse av olika cellinjer eller som svar på farmakologiska behandlingar. I dessa fall, där cellstorleken misstänks påverka det makropinocytiska indexet, kan cellområdet användas för normalisering av dextranupptag, som tidigare beskrivits4. Detta kan uppnås genom att något ändra protokollet så att det inkluderar en cellmaskfläck efter fixering eller införliva faskontrast eller ljusfältsavbildning. Det rekommenderas också starkt att följa upp eventuella resultat med hjälp av den beskrivna analysen för att utvärdera om makropinocytos är en näringstillförselväg som bidrar till cellulär kondition i det specifika cellbaserade systemet som används. Detta kan uppnås genom att bedöma proliferativ kapacitet, överlevnad eller livskraft i näringsfattiga förhållanden med och utan tillsats av extracellulärt albumin4,7. Dessutom kan en DQ-BSA puls-chase analys ge bevis för huruvida förändringarna i makropinocytos översättas till förändringar i albumin nedbrytning i lysosomer. Liksom hög molekylvikt dextran internaliseras DQ-BSA genom makropinocytos och levereras till lysosomerna, där det fluorescerar efter proteolytisk matsmältning4. Med tanke på likheterna med fluorescerande dextranupptag kan den beskrivna metoden anpassas för att bedöma DQ-BSA-upptag. På samma sätt kan detta protokoll användas för att utvärdera upptaget av annan fluorescerande taggad last, såsom albumin, lipider eller nekrotiska cellrester som är kända för att komma in i celler genom makropinocytos. Dessa anpassningar bör vid alla tillfällen vara i linje med tillverkarens protokoll, och experimentella kontroller bör användas för att validera analysen.
Mikroskopisk bildanalys och kvantifiering är ett gynnat tillvägagångssätt för att bedöma makropinocytos och har blivit standard inom fältet4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20 ,21,22. Det möjliggör visuell inspektion av proverna och kan ge ytterligare information om makropinosomnummer, storlek och plats. Dessutom tillåter möjligheten att visuellt inspektera bilder bedömningen av cellens lämplighet och livskraft och identifiering av artefakter och/eller autofluorescens orsakad av läkemedelsadministration. Jämfört med andra föreslagna kvantifieringsmetoder, såsom flödescytometri, kan dessa data annars gå förlorade eller förbises och kan orsaka falska positiva eller negativa effekter23. Avbildning är dock mer arbetsintensivt och mer benägna att partisk datainsamling som flödescytometri. Här har vi övervunnit dessa hinder genom automatisering av protokollet, vilket minskar partiskhet, arbetskraft, kostnad och tid.
Många modulatorer av makropinocytos är sannolikt fortfarande oupptäckta och med tanke på vikten av makropinocytic vägen i vissa patologier, såsom cancer, deras upptäckt kan potentiellt vara av stor betydelse för utvecklingen av nya terapeutiska metoder2,3. Identifieringen av dessa modulatorer kan uppnås genom screening av föreningar med hög halt, för vilka den föreslagna metoden i detta kan fungera som en hörnsten. Det skisserade protokollet syftar till att utföra experimenten med standard laboratorieutrustning. 96-brunnsplåtformatet kan dock optimeras och anpassas för screening med högt innehåll. Att öka brunnsformatet till 384 eller 1536-brunns mikroplattor skulle göra det möjligt för användaren att öka antalet föreningar som kan testas på en tallrik. Dessutom skulle robotisering av cellsådd, platttvätt, sammansättning och dextranadministration minska manuell hantering och väl till väl variabilitet och därmed förbättra skalbarheten. I slutändan skulle en anpassning av detta protokoll till screening med högt innehåll i hög grad underlätta identifieringen av nya faktorer som reglerar makropinocytos.
Sammantaget är den här föreslagna metoden ett utmärkt tillvägagångssätt för att bestämma nivån av makropinocytos i celler av intresse, identifiering av regulatorer av processen och optimering av läkemedelskoncentrationer för kända hämmare. Protokollet kan också fungera som utgångspunkt för bedömning av makropinocytiskt upptag av annan last förutom dextran, och screening med högt innehåll som syftar till att identifiera blyföreningar som potentiellt kan leda till utveckling av nya terapeutiska strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.C. är uppfinnare på ett utfärdat patent med titeln ''Cancerdiagnostik, terapier och läkemedelsupptäckt i samband med makropinocytos', patent nr: 9 983 194.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH/NCI-bidrag (R01CA207189, R21CA243701) till C.C. KMO.G. är mottagare av en TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). BioTek Cytation 5 är en del av Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, som får ekonomiskt stöd från NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Figurerna 1-3 skapades med BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
References
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21 (2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
- Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
- Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
- Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
- Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
- Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
- Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
- Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).
- Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).
- Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
