Summary

Konstruktion af Model Lipid Membraner indarbejde G-protein koblede receptorer (GPCRs)

Published: February 05, 2022
doi:

Summary

Denne protokol udnytter agarose hævelse som en kraftfuld og generaliserbar teknik til at indarbejde integrerede membranproteiner (IMP) i gigantiske unilamellar lipid vesikler (GUVs), som beskrevet her for rekonstitution af human 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), en af klasserne af farmakologisk vigtige G protein-koblede receptorer.

Abstract

Robuste in vitro-undersøgelser af strukturen og funktionen af integrerede membranproteiner har været en udfordring på grund af plasmamembranens kompleksitet og de mange faktorer, der påvirker proteinadfærden i levende celler. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er et biomimetisk og meget tunable in vitro-modelsystem til undersøgelse af protein-membraninteraktioner og sondering af proteinadfærd på en præcis, stimulusafhængig måde. I denne protokol præsenterer vi en billig og effektiv metode til fremstilling af GUVs med den menneskelige serotonin 1A receptor (5-HT1AR) stabilt integreret i membranen. Vi fremstiller GUVs ved hjælp af en modificeret hydrogel hævelse metode; ved at deponere en lipidfilm oven på en blanding af agarose og 5-HT1AR og derefter fugte hele systemet, kan vesikler dannes med korrekt orienteret og funktionel 5-HT1AR indarbejdet i membranen. Disse GUV’er kan derefter bruges til at undersøge protein-membran interaktioner og lokalisering adfærd via mikroskopi. I sidste ende kan denne protokol fremme vores forståelse af funktionaliteten af integrerede membranproteiner, hvilket giver dyb fysiologisk indsigt.

Introduction

Syntetiske modelmembraner er kraftfulde værktøjer i undersøgelsen af biomembranernes grundlæggende egenskaber og funktioner. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er en af de mest fremtrædende platforme til at studere en række plasmamembranegenskaber og kan konstrueres til at efterligne forskellige fysiologiske forhold1,2,3,4,5,6,7,8. Det er veletableret, at plasmamembranen og dens organisation spiller en central rolle i en lang række cellulære processer, såsom signaltransduktion, vedhæftning, endokytose og transport9,10,11,12,13,14,15.

GUVs er blevet fremstillet ved hjælp af forskellige metoder, herunder blid hydrering16, hydrogel hævelse17, elektroformation18, mikrofluidiske teknikker19,20,21,22, jetting23, og opløsningsmiddel udveksling24,25,26. På grund af udfordringer med håndtering af integrerede membranproteiner (IMP) har in vitro-platforme til at studere dem været begrænsede. GUV’er præsenterer en forenklet platform til at studere IMP i et miljø, der efterligner deres oprindelige miljø. Selv om der har været flere tilgange til proteinkonstitution i GUV’er, opstår der udfordringer ved at inkorporere proteiner med den korrekte orientering og opretholde proteinfunktionalitet27.

Den mest vellykkede proteinkonkonstitution i GUV’er kræver vaskemiddeludvekslingsmetoden; som indebærer at opløse proteinerne fra deres oprindelige miljø ved rengøringsmidler, efterfulgt af proteinrensning, og derefter erstatte vaskemiddelmolekylerne med lipider gennem forskellige metoder28. Mens vaskemidler tjener til at stabilisere den tertiære struktur af IMP under rensning, vaskemiddel micelles er et relativt unaturligt miljø for disse proteiner, som er bedre stabiliseret, især for funktionelle undersøgelser, i lipid bilayers28,29,30. Desuden har det været vanskeligt at inkorporere funktionelle transmembranproteiner i lipid-bilayeren ved hjælp af traditionelle GUV-fremstillingsteknikker på grund af størrelsen, delikatessen af disse proteiner og de ekstra vaskemiddeludvekslingstrin, der ville være nødvendige27,31,32,33. Brugen af organisk opløsningsmiddel til at fjerne rengøringsmidler forårsager protein aggregering og denaturering34. En forbedret vaskemiddelmedieret metode har været lovende, men forsigtighed er nødvendig for vaskemiddel fjernelse trin og optimering kan være nødvendig for specifikke proteiner31,35. Derudover, metoder, der udnytter elektroformation kunne begrænse valget af protein og kan ikke være egnet til alle lipid kompositioner særligt ladede lipider31,36,37. En anden teknik, der er blevet brugt, er peptid-induceret fusion af store unilamellar vesikler (LUVs), der indeholder det ønskede protein med GUVs, selv om det viste sig at være besværligt og kan føre til indsættelse af udenlandske molekyler-fusogenic peptider33,38,39. Giant plasmamembran vesikler (GPMVs), som er afledt af levende celler, kan bruges til at overvinde nogle af disse spørgsmål, men de giver minimal kontrol af den resulterende lipid og protein sammensætning14,40,41. Derfor udgør integrationen af IMP i bilipidlaget af GUV’er ved hjælp af vores modificerede agarose hævelsesmetode en pålidelig metode til yderligere at undersøge disse proteiner i membranmiljøet42,43,44,45.

Cellulær signalering og kommunikation involverer en familie af proteiner kendt som G protein-koblede receptorer (GPCRs); GPCR er blandt de største familie af proteiner og er forbundet med modulerende humør, appetit, blodtryk, hjerte-kar-funktion, åndedræt, og søvn blandt mange andre fysiologiske funktioner46. I denne undersøgelse, Vi brugte human serotonin 1A receptor (5-HT1AR), som er et prototypisk medlem af GPCR familien. 5-HT1AR kan findes i centralnervesystemet (CNS) og blodkar; det påvirker mange funktioner såsom hjerte-kar-, gastrointestinale, endokrine funktioner, samt deltager i reguleringen af mood47. En stor barriere for GPCR forskning stammer fra deres komplekse amfifile struktur, og GUVs præsentere en lovende platform for undersøgelsen af forskellige egenskaber af interesse, lige fra protein funktionalitet, lipid-protein interaktioner, og protein-protein interaktioner. Forskellige tilgange er blevet brugt til at studere lipid-protein interaktioner såsom overflade plasmon resonans (SPR)48,49, nuklear magnetisk resonans spektroskopi (NMR)50,51, protein lipid overlay (PLO) assay51,52,53,54, native massespektrometri55, isotermisk titrering calorimetri (ITC) 56,57, og liposom sedimenteringsanalyse58,59. Vores laboratorium har brugt den forenklede GUV-tilgang til at undersøge effekten af lipid-protein interaktioner på proteinfunktionalitet ved at indkapsle BODIPY-GTPγS, som binder sig til Giα-underenheden i receptorens aktive tilstand. Deres bindende løsner fluorophoren, der producerer et fluorescenssignal, der kunne detekteres over tid45. Desuden undersøgte forskellige undersøgelser Lipid-protein interaktioner og proteiners rolle i at mærke eller stabilisere membrankrumningen60,61, og ved hjælp af en mulig GUV-tilgang kunne det være en vigtig fordel.

Denne protokol viser en enkel metode til at indarbejde GPCR’er i membranen af GUV’er ved hjælp af et modificeret agarose hydrogelsystem17,42. Desuden kan vores metode på baggrund af vores tidligere arbejde være velegnet til IMP, der kan bære kortvarig eksponering for 30-40 °C. Kort, vi sprede en tynd film af agarose kombineret med membran fragmenter, der indeholder GPCR af interesse. Efter gelering af dette lag deponerer vi en lipidopløsning oven på agarose og tillader opløsningsmidlet at fordampe. Rehydrering af systemet blev derefter udført med en vandig buffer, hvilket resulterede i dannelsen af GUVs med protein indarbejdet i lipid bilayer.

Protocol

1. Proteinmærkning Tillad NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragmenter og en 7 K MWCO spin afsaltningskolonne at ekvilibrere ved stuetemperatur. 1 mg NHS-rhodamin opløses i 100 μL dimethylsulfoxid (DMSO). Der tilsættes 5 μL 1 M natriumbicarbonatopløsning for at øge pH-5-HT1AR-opløsningen til pH 8. Der tilsættes 3,66 μL af NHS-rhodaminopløsningen til 50 μL af 5-HT1AR-opløsningen og pipetten forsigtigt op og ned i et mikrocentrifugerør.BE…

Representative Results

Koncentrationen af protein blev målt, og mærkningsgraden blev beregnet som molarforholdet mellem farvestoffet og proteinet til 1:1. Ved at undersøge GUV’erne ved hjælp af konfokal mikroskopi var vi i stand til at bekræfte vellykket dannelse og proteinintegration af vesiklerne. Lipiderne blev mærket med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, og proteinet blev kovalent mærket via rhodamin NHS-ester modifikation af primære aminer. Figur 2a og figur 2b viser en proteininst…

Discussion

Vi har identificeret to trin, der er afgørende for succesen af den samlede protokol: plasmabehandling og lipidaflejring. Plasmarensning udretter to ting: For det første fjerner det spor af organisk materiale fra glasoverfladen; For det andet aktiverer den coverlip-overfladen, hvilket giver mulighed for en stigning i vådbarheden, da glasoverfladen hydrofilitet øges62,63. Berøring af dækslet overflade efter plasmarensning vil inaktivere og forurene den ultrar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Matthew Blosser for værdifuld diskussion og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) og National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum’s lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -. Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. , (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -. H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Play Video

Cite This Article
Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

View Video