Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von allen Zelltypen freigesetzt und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und Homöostase. Die Visualisierung von EVs erfordert aufgrund ihres geringen Durchmessers (40-250 nm), der unterhalb der Beugungsgrenze der typischen Lichtmikroskopie liegt, oft indirekte Methoden. Wir haben eine hochauflösende mikroskopiebasierte Visualisierung von Elektrofahrzeugen entwickelt, um die Beugungsgrenze sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen zu umgehen. Mit diesem Ansatz können wir die dreidimensionale Form von Elektrofahrzeugen auf eine Auflösung von +/- 20 nm auf der XY-Achse und eine Auflösung von +/- 50 nm entlang der Z-Achse auflösen. Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die hochauflösende Mikroskopie als Charakterisierungsmethode für EVs, einschließlich Exosomen, sowie von behüllten Viren betrachtet wird.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Vesikel, die von allen Zelltypen freigesetzt werden. Sie enthalten Lipide, Proteine, Metaboliten und Nukleinsäuren und übertragen diese Materialien lokal zwischen Zellen und distal zwischen Geweben und Organen. Es gibt drei primäre Subtypen von EVs: apoptotische Körper, Mikrovesikel und Exosomen1,2. Hier konzentrieren wir unsere Diskussion auf Exosomen und ihre assoziierten Proteine.
Exosomen sind sezernierte Vesikel, die aus dem nach innen gerichteten Austrieb früher Endosomen in den multivesikulären Körper (MVB) stammen. Das MVB verschmilzt dann mit der Plasmamembran und setzt die Exosomen in den extrazellulären Raum frei, um zu anderen Zellen zu gelangen3,4. Exosomen existieren in einem Spektrum von Größen von 40 bis 150 nm und sind angereichert mit endosomalen Transmembranproteinen, die als Tetraspanine (CD9, CD63, CD81), membrangebundener endosomaler Sortierkomplex, der für den Transport erforderlich ist (ESCRT), und Lipid-Raft-assoziierten Proteinen1,2,5,6,7.
Die Charakterisierung der biochemischen Zusammensetzung von Exosomen ist zu einem beliebten Feld für Forscher geworden, um ihre funktionelle Natur besser zu verstehen. Es gibt viele Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung von Exosomen, einschließlich nanoskaliger Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Oberflächenplasmonresonanz, resistiver Pulserfassung und traditioneller Lichtmikroskopie, von denen jede intrinsische Vor- und Nachteileenthält 8,9. TEM und Kryo-EM können eine nanometerbasierte Auflösung erreichen, erfordern jedoch häufig Dehydratisierungs- und Gefrierbruchschritte, wodurch EVs10,11geschrumpft oder lysiert werden. NTA beruht auf Lichtstreuung, die die Charakterisierung von Hunderten von EVs gleichzeitig ermöglicht, ist aber eine indirekte Messung der Partikelgröße und kann nicht leicht zwischen EVs, Viren und Proteinaggregatenunterscheiden 12,13,14,15,16. Die nanoskalige Durchflusszytometrie verwendet Lichtstreuung aus einem Anregungspfad, der dann in Größenmessungen übersetzt werden kann, ist aber eine aufkommende Technologie, und es gibt wenig Konsens darüber, welche Größe der Partikel innerhalb des linearen Detektionsbereichs für verschiedene Instrumente12,17,18 liegt.
Die traditionelle Lichtmikroskopie mit fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen war eine der am häufigsten eingesetzten Techniken zur Visualisierung subzellulärer Kompartimente, Proteinkomplexe und Signalmaschinen innerhalb einer Zelle. Während sich diese Technik bei der Visualisierung der Lokalisation von Komplexen als nützlich erweist, verhindert die Beugungsgrenze der traditionellen Lichtmikroskopie (etwa 250-400 nm) die klare Auflösung von Proteinen oder Strukturen im typischen Größenbereich eines Exosoms (40-150 nm)12,19,20.
Die hochauflösende Mikroskopie, nämlich die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM), unterscheidet sich von der konventionellen Lichtmikroskopie dadurch, dass sie die photoschaltbaren Eigenschaften bestimmter Fluorophore nutzt und diese blinkenden Ereignisse detektiert, um Bilder bis zu einer Nanometergenauigkeit zu rekonstruieren21. Photoswitching-Ereignisse werden mit einer Kamera mit hoher Bildrate im Verlauf von Zehntausenden von Einzelbelichtungen gesammelt, und eine Punktspreizfunktion wird verwendet, um den genauen Standort des photoswitching Fluorophors19,20 , 22mithoher Sicherheitabzubilden. Dadurch kann dSTORM die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie umgehen. Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von hochauflösenden Techniken zur Visualisierung und Verfolgung von Exosomen und ihren assoziierten Proteinen berichtet22,23,24,25. Die endgültige Auflösung hängt von den biophysikalischen Eigenschaften des Fluorophors ab, liegt aber oft zwischen +/-10-100 nm entlang der XY-Achse, was eine Einzelmolekülauflösung ermöglicht.
Die Fähigkeit, einzelne Fluorophore in dieser Größenordnung auf der XY-Achse aufzulösen, hat die Mikroskopie revolutioniert. Es gibt jedoch nur wenige Daten über den dreidimensionalen (3-D) dSTORM eines Exosoms. Daher haben wir versucht, eine Standardarbeitsanweisung (SOP) für die dSTORM-basierte Visualisierung und Charakterisierung von gereinigten Elektrofahrzeugen, einschließlich Exosomen mit Nanometer-Genauigkeit in 3-D, zu etablieren.
EVs sind aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei vielen intrazellulären Prozessen und der Zell-zu-Zell-Signalgebung zueinembeliebten Untersuchungsgebiet geworden 1,30. Ihre Visualisierung erweist sich jedoch als schwierig, da ihre geringe Größe unter die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie fällt. Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) ist eine direkte Visualisierungsmethode, die die Beugungsgrenze umgeht, indem sie Photoschaltereigni…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Oxford Nanoimaging für das konstruktive Feedback und die Anleitung. Diese Arbeit wurde durch die 5UM1CA121947-10 an R.P.M. und die 1R01DA040394 an D.P.D. finanziert.
15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
RNase A | Promega | A797C | |
T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |