Summary

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Published: August 26, 2021
doi:

Summary

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von allen Zelltypen freigesetzt und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und Homöostase. Die Visualisierung von EVs erfordert aufgrund ihres geringen Durchmessers (40-250 nm), der unterhalb der Beugungsgrenze der typischen Lichtmikroskopie liegt, oft indirekte Methoden. Wir haben eine hochauflösende mikroskopiebasierte Visualisierung von Elektrofahrzeugen entwickelt, um die Beugungsgrenze sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen zu umgehen. Mit diesem Ansatz können wir die dreidimensionale Form von Elektrofahrzeugen auf eine Auflösung von +/- 20 nm auf der XY-Achse und eine Auflösung von +/- 50 nm entlang der Z-Achse auflösen. Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die hochauflösende Mikroskopie als Charakterisierungsmethode für EVs, einschließlich Exosomen, sowie von behüllten Viren betrachtet wird.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Vesikel, die von allen Zelltypen freigesetzt werden. Sie enthalten Lipide, Proteine, Metaboliten und Nukleinsäuren und übertragen diese Materialien lokal zwischen Zellen und distal zwischen Geweben und Organen. Es gibt drei primäre Subtypen von EVs: apoptotische Körper, Mikrovesikel und Exosomen1,2. Hier konzentrieren wir unsere Diskussion auf Exosomen und ihre assoziierten Proteine.

Exosomen sind sezernierte Vesikel, die aus dem nach innen gerichteten Austrieb früher Endosomen in den multivesikulären Körper (MVB) stammen. Das MVB verschmilzt dann mit der Plasmamembran und setzt die Exosomen in den extrazellulären Raum frei, um zu anderen Zellen zu gelangen3,4. Exosomen existieren in einem Spektrum von Größen von 40 bis 150 nm und sind angereichert mit endosomalen Transmembranproteinen, die als Tetraspanine (CD9, CD63, CD81), membrangebundener endosomaler Sortierkomplex, der für den Transport erforderlich ist (ESCRT), und Lipid-Raft-assoziierten Proteinen1,2,5,6,7.

Die Charakterisierung der biochemischen Zusammensetzung von Exosomen ist zu einem beliebten Feld für Forscher geworden, um ihre funktionelle Natur besser zu verstehen. Es gibt viele Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung von Exosomen, einschließlich nanoskaliger Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Oberflächenplasmonresonanz, resistiver Pulserfassung und traditioneller Lichtmikroskopie, von denen jede intrinsische Vor- und Nachteileenthält 8,9. TEM und Kryo-EM können eine nanometerbasierte Auflösung erreichen, erfordern jedoch häufig Dehydratisierungs- und Gefrierbruchschritte, wodurch EVs10,11geschrumpft oder lysiert werden. NTA beruht auf Lichtstreuung, die die Charakterisierung von Hunderten von EVs gleichzeitig ermöglicht, ist aber eine indirekte Messung der Partikelgröße und kann nicht leicht zwischen EVs, Viren und Proteinaggregatenunterscheiden 12,13,14,15,16. Die nanoskalige Durchflusszytometrie verwendet Lichtstreuung aus einem Anregungspfad, der dann in Größenmessungen übersetzt werden kann, ist aber eine aufkommende Technologie, und es gibt wenig Konsens darüber, welche Größe der Partikel innerhalb des linearen Detektionsbereichs für verschiedene Instrumente12,17,18 liegt.

Die traditionelle Lichtmikroskopie mit fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen war eine der am häufigsten eingesetzten Techniken zur Visualisierung subzellulärer Kompartimente, Proteinkomplexe und Signalmaschinen innerhalb einer Zelle. Während sich diese Technik bei der Visualisierung der Lokalisation von Komplexen als nützlich erweist, verhindert die Beugungsgrenze der traditionellen Lichtmikroskopie (etwa 250-400 nm) die klare Auflösung von Proteinen oder Strukturen im typischen Größenbereich eines Exosoms (40-150 nm)12,19,20.

Die hochauflösende Mikroskopie, nämlich die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM), unterscheidet sich von der konventionellen Lichtmikroskopie dadurch, dass sie die photoschaltbaren Eigenschaften bestimmter Fluorophore nutzt und diese blinkenden Ereignisse detektiert, um Bilder bis zu einer Nanometergenauigkeit zu rekonstruieren21. Photoswitching-Ereignisse werden mit einer Kamera mit hoher Bildrate im Verlauf von Zehntausenden von Einzelbelichtungen gesammelt, und eine Punktspreizfunktion wird verwendet, um den genauen Standort des photoswitching Fluorophors19,20 , 22mithoher Sicherheitabzubilden. Dadurch kann dSTORM die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie umgehen. Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von hochauflösenden Techniken zur Visualisierung und Verfolgung von Exosomen und ihren assoziierten Proteinen berichtet22,23,24,25. Die endgültige Auflösung hängt von den biophysikalischen Eigenschaften des Fluorophors ab, liegt aber oft zwischen +/-10-100 nm entlang der XY-Achse, was eine Einzelmolekülauflösung ermöglicht.

Die Fähigkeit, einzelne Fluorophore in dieser Größenordnung auf der XY-Achse aufzulösen, hat die Mikroskopie revolutioniert. Es gibt jedoch nur wenige Daten über den dreidimensionalen (3-D) dSTORM eines Exosoms. Daher haben wir versucht, eine Standardarbeitsanweisung (SOP) für die dSTORM-basierte Visualisierung und Charakterisierung von gereinigten Elektrofahrzeugen, einschließlich Exosomen mit Nanometer-Genauigkeit in 3-D, zu etablieren.

Protocol

1 Vermehrung und Erhaltung von Zelllinien Erwerben Sie humane Osteosarkomzellen (U2OS) und legen Sie die Zellen in das Wachstumsmedium, ergänzt mit 10% exosomenfreiem fetalem Rinderserum und 1x Penicillin / Streptomycin-Lösung.HINWEIS: Exosomenfreies fetales Rinderserum wurde nach dem in McNamara et. al.26. Halten Sie die U2OS-Zellen in einem kupferbeschichteten Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 und Passagezellen in T175-Kolben26,</sup…

Representative Results

Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit der hochauflösenden Mikroskopie bei der Visualisierung einzelner EVs mit Nanometerauflösung in drei Dimensionen (3-D) zu bewerten. Um die Form und Größe einzelner EVs zu analysieren, verwendeten wir photosschaltbaren Farbstoff und inkubierten die EVs mit einem fernroten, membraninterkalierenden Farbstoff und entfernten überschüssigen Farbstoff durch Chromatographie29. Die affinitätsgefangenen Anti-CD81- und rotgefärbten EVs wurden dann im hochaufl…

Discussion

EVs sind aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei vielen intrazellulären Prozessen und der Zell-zu-Zell-Signalgebung zueinembeliebten Untersuchungsgebiet geworden 1,30. Ihre Visualisierung erweist sich jedoch als schwierig, da ihre geringe Größe unter die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie fällt. Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) ist eine direkte Visualisierungsmethode, die die Beugungsgrenze umgeht, indem sie Photoschaltereigni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Oxford Nanoimaging für das konstruktive Feedback und die Anleitung. Diese Arbeit wurde durch die 5UM1CA121947-10 an R.P.M. und die 1R01DA040394 an D.P.D. finanziert.

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

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