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Biology

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) viene utilizzata per bypassare il limite di diffrazione tipico della microscopia ottica e per visualizzare gli esosomi su scala nanometrica. Può essere impiegato sia in due che in tre dimensioni per caratterizzare gli esosomi.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) vengono rilasciate da tutti i tipi di cellule e svolgono un ruolo importante nella segnalazione cellulare e nell'omeostasi. La visualizzazione dei veicoli elettrici richiede spesso metodi indiretti a causa del loro piccolo diametro (40-250 nm), che è al di sotto del limite di diffrazione della tipica microscopia ottica. Abbiamo sviluppato una visualizzazione basata sulla microscopia a super-risoluzione dei veicoli elettrici per aggirare il limite di diffrazione in due e tre dimensioni. Usando questo approccio, possiamo risolvere la forma tridimensionale dei veicoli elettrici entro la risoluzione di +/- 20 nm sull'asse XY e la risoluzione di +/- 50 nm lungo l'asse Z. In conclusione, proponiamo che la microscopia a super-risoluzione sia considerata come un metodo di caratterizzazione dei veicoli elettrici, compresi gli esosomi, così come i virus avvolti.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono vescicole legate alla membrana rilasciate da tutti i tipi di cellule. Contengono lipidi, proteine, metaboliti e acidi nucleici e trasferiscono questi materiali localmente tra le cellule e distalmente tra tessuti e organi. Esistono tre sottotipi principali di veicoli elettrici: corpi apoptotici, microvescicole ed esosomi1,2. Qui, concentriamo la nostra discussione sugli esosomi e le loro proteine associate.

Gli esosomi sono vescicole secrete provenienti dal germogliamento verso l'interno dei primi endosomi nel corpo multivesicolare (MVB). L'MVB si fonde quindi con la membrana plasmatica, rilasciando gli esosomi nello spazio extracellulare per viaggiare verso altre cellule3,4. Gli esosomi esistono su uno spettro di dimensioni che va da 40 a 150 nm e sono arricchiti con proteine transmembrana endosomiali note come tetraspanine (CD9, CD63, CD81), complesso di selezione endosomiale legato alla membrana necessario per il trasporto (ESCRT) e proteine associate a zattere lipidiche1,2,5,6,7.

Caratterizzare la composizione biochimica degli esosomi è diventato un campo popolare per i ricercatori per comprendere meglio la loro natura funzionale. Esistono molti metodi per visualizzare e caratterizzare gli esosomi, tra cui la citometria a flusso su scala nanometrica, l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), la microscopia elettronica a scansione e trasmissione (TEM), la risonanza plasmonica di superficie, il rilevamento di impulsi resistivi e la microscopia ottica tradizionale, ognuno dei quali contiene pro e contro intrinseci8,9. TEM e cryo-EM possono raggiungere una risoluzione basata su nanometri, ma spesso richiedono fasi di disidratazione e congelamento-frattura, riducendo o lisando così i veicoli elettrici10,11. NTA si basa sulla diffusione della luce, consentendo la caratterizzazione di centinaia di veicoli elettrici alla volta, ma è una misura indiretta della dimensione delle particelle e non può facilmente distinguere tra EV, virus e aggregati proteici12,13,14,15,16. La citometria a flusso su scala nanometrica impiega la diffusione della luce da un percorso di eccitazione, che può quindi essere tradotto in misurazioni delle dimensioni, ma è una tecnologia emergente, e c'è poco consenso su quale dimensione delle particelle siano all'interno del range lineare di rilevamento per vari strumenti12,17,18.

La microscopia ottica tradizionale che utilizza proteine fluorescenti o coloranti è stata una delle tecniche più utilizzate per visualizzare compartimenti subcellulari, complessi proteici e macchinari di segnalazione all'interno di una cellula. Mentre questa tecnica si rivela utile nella visualizzazione della localizzazione di complessi, il limite di diffrazione della microscopia ottica tradizionale (circa 250-400 nm) impedisce la chiara risoluzione di proteine o strutture nell'intervallo di dimensioni tipiche di un esosoma (40-150 nm)12,19,20.

La microscopia a super-risoluzione, ovvero la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM), si distingue dalla microscopia ottica convenzionale impiegando le proprietà fotocommutabili di specifici fluorofori e rilevando questi eventi lampeggianti per ricostruire le immagini fino alla precisione nanometrica21. Gli eventi di photoswitching vengono raccolti utilizzando una telecamera di rilevamento ad alto framerate nel corso di decine di migliaia di esposizioni individuali e viene utilizzata una funzione di diffusione puntuale per mappare con elevata sicurezza la posizione esatta del fluoroforofotoregistratore 19,20,22. Ciò consente a dSTORM di aggirare il limite di diffrazione della microscopia ottica. Diversi gruppi hanno riportato l'uso di tecniche di super-risoluzione per visualizzare e tracciare gli esosomi e le loro proteine associate22,23,24,25. La risoluzione finale dipende dalle proprietà biofisiche del fluoroforo, ma spesso varia da +/-10-100 nm lungo l'asse XY, consentendo la risoluzione a singola molecola.

La capacità di risolvere singoli fluorofori su questa scala sull'asse XY ha rivoluzionato la microscopia. Tuttavia, ci sono pochi dati sul dSTORM tridimensionale (3-D) di un esosoma. Pertanto, abbiamo cercato di stabilire una procedura operativa standard (SOP) per la visualizzazione e la caratterizzazione basate su dSTORM di veicoli elettrici purificati, inclusi gli esosomi con precisione nanometrica in 3D.

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Protocol

1 Propagazione e manutenzione delle linee cellulari

  1. Acquisire cellule di osteosarcoma umano (U2OS) e posizionare le cellule nel mezzo di crescita integrato con siero bovino fetale privo di esosomi al 10% e 1 soluzione di penicillina / streptomicina.
    NOTA: Il siero bovino fetale privo di esosomi è stato generato seguendo il protocollo presentato in McNamara et. al.26.
  2. Mantenere le celle U2OS in un incubatore rivestito di rame a 37 °C nel 5% di CO2 e le celle di passaggio in palloni T17526,27. Le cellule devono essere mantenute nella fase di crescita logaritmica media per evitare l'insorgere di sottopopolazioni o dall'accumulo di detriti apoptotici durante la fase stazionaria.

2 Isolamento e purificazione degli esosomi

  1. Far crescere le linee cellulari U2OS fino alla piena confluenza in 10 palloni T175 separati con 50 ml di supporti per pallone. Rimuovere il surnatante cellulare e successivamente passarlo attraverso un apparato di filtrazione sottovuoto da 0,45 μm e 0,22 μm.
  2. Sottoporre il surnatante alla filtrazione a flusso incrociato (nota anche come filtrazione a flusso tangenziale) su un sistema di filtrazione dotato della cartuccia a fibra cava da 750 kDa al fine di rimuovere proteine o metaboliti più piccoli28.
    1. Passare il surnatante attraverso l'operatore di filtrazione a flusso tangenziale a una pressione in avanti costante di 30 psi, mantenendo una pressione di ritenzione di <20 psi per produrre una pressione Δ di 10 o più psi. Posizionare una barra di agitazione magnetica nel serbatoio del retentato e impostare su 150 rpm26.
    2. Mantenere la velocità di avanzamento a 40 ml/min o superiore. Raccogliere il permeato in un serbatoio e smaltirlo.
  3. Concentrare il surnatante a 30 ml e quindi equilibrare con quattro volumi di 1x PBS. Raccogliere la soluzione filtrata ed equilibrata a flusso incrociato in un tubo conico da 50 ml.
  4. Precipitare i veicoli elettrici a 4 °C durante la notte in una concentrazione finale di 40 mg/mL di polietilenglicole con un peso molecolare di 8.000 Da. Centrifugare i veicoli elettrici a 1.200 x g a 4 °C per 1 ora e risospendere in 500 μL di 1x PBS.
  5. Incubare i veicoli elettrici con 50 μg/mL di colorante intercalante a membrana rossa fotocomveggibile e 50 μg/mL di RNasi A in 1x PBS a 4 °C per 1 ora.
  6. Rimuovere il colorante in eccesso attraverso una colonna su un sistema di purificazione delle proteine collegato a un collettore di frazioni. Identificare le frazioni EV attraverso l'assorbanza UV e raggrupparle in un tubo microcentrifuga26.
  7. Affinità-selezionare un totale di 200 μL di veicoli elettrici utilizzando perline magnetiche anti-CD81 bilanciate in 1x PBS.
    1. Diluire 100 μL delle perle magnetiche anti-CD81 in 1x PBS per un volume totale di 1 mL e lasciarle legare a 4 °C per 2 ore in un tubo microcentrifuga da 2 mL con oscillazione continua.
  8. Lavare le perline anti-CD81 e EV tre volte con 1x PBS. Elute CD81+ EV dalla soluzione con 100 mM di glicina a pH 2,0 per 30 minuti a 37 °C.
  9. Pipettare il CD81+ EV purificato in un volume uguale di 100 mM Tris-HCl a pH 7,5 in 1x PBS.
    NOTA: Un'aliquota della soluzione purificata CD81+ EV può essere riservata all'analisi di tracciamento delle nanoparticelle o alla microscopia elettronica al fine di confermare la purezza della soluzione e la presenza di EV26.

3 Fissazione e preparazione

  1. Posizionare i veicoli elettrici purificati per affinità su lastre a 8 pozzetti con fondo di vetro μ-slide in un volume totale di 200 μL (può diluire il campione EV in 100 mM Tris-HCl a pH 7,5 in 1x PBS) e consentire di aderire alla superficie durante la notte a 4 °C.
  2. Senza rimuovere la soluzione esistente dalla piastra a 8 pozzetti, fissare i veicoli elettrici sulle piastre aggiungendo 200 μL di paraformaldeide al 4% in 1x PBS alla soluzione contenente EV in ciascun pozzetto e consentire l'incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente21.
  3. Rimuovere con attenzione la paraformaldeide e la soluzione in eccesso con una micropipetta per non disturbare i veicoli elettrici. Lavare l'EV con 1x PBS per rimuovere l'eccesso di paraformaldeide. Eseguire la procedura di lavaggio tre volte. Rimuovere l'eccesso di 1x PBS.
  4. Preparare 250 μL di soluzione tampone a cubetti di dSTORM B per campione creando una soluzione di 5 mM di protocatechuate diossigenasi (Parte A) diluita in tampone di imaging (Parte B) secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: la concentrazione dell'enzima nel tampone può essere raddoppiata a 10 mM se si verifica il fotosbiancamento.
    1. Aggiungere 250 μL del tampone preparato a ciascun pozzetto secondo il protocollo del produttore per 20 minuti a temperatura ambiente prima dell'imaging per eliminare le molecole ossidanti.
      NOTA: l'EV può quindi essere visualizzato immediatamente o conservato a 4 °C per un massimo di una settimana. Sostituire il buffer successivo all'archiviazione prima di ogni visualizzazione.

4 Calibrazione diretta al microscopio a ricostruzione ottica stocastica

  1. Preparare le perline necessarie per la calibrazione del microscopio a super-risoluzione diluendo microsfere da 100 nm ad una concentrazione dello 0,5% in acqua di grado di biologia molecolare e pipettando 200 μL in ciascun pozzetto di una piastra a 8 pozzetti con fondo di vetro μ vetrino.
    1. Lasciare che le perline si depositino nei pozzetti per 1 ora a temperatura ambiente.
  2. Senza rimuovere la soluzione esistente, aggiungere 200 μL di paraformaldeide al 4% in PBS a ciascun pozzetto alla soluzione di perline di calibrazione e consentire l'incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere con cura la paraformaldeide con una micropipetta per non disturbare le perline e lavare le perline tre volte con 1x PBS. Preparare il buffer secondo il passaggio 3.4.
  4. Rimuovere 1x PBS e aggiungere 250 μL del tampone preparato a ciascun pozzetto. Consentire al buffer di rimanere per 20 minuti prima della visualizzazione.
  5. Prima di posizionare qualsiasi cosa sul palco, collegarsi al microscopio 3D utilizzando il pulsante Collega il microscopio. Aggiungi olio 100x all'obiettivo e posiziona il centro del pozzo sopra l'obiettivo. Nell'impostazione Acquisisci, attiva i laser di eccitazione a 473 e 640 nm e fai clic su Visualizza.
    1. Senza l'obiettivo 3D attivato, visualizzare le perline sotto l'impostazione di saturazione dei fotoni facendo clic su Conteggi fotoni nelle opzioni di visualizzazione delle immagini. Impostare le potenze laser iniziali su 8,4 mW per il laser a 473 nm e a 11,6 mW per il laser a 640 nm.
    2. Ridurre la messa a fuoco del laser a circa -300 nm o il piano focale delle perle di calibrazione per produrre una chiara risoluzione delle singole perle. Una volta che il piano Z è focalizzato, regolare ulteriormente i livelli di potenza del laser per tenere conto della variazione in ciascun campo visivo.
  6. Sotto le funzioni dello strumento, completare la calibrazione della mappatura 3D e la calibrazione della mappatura dei canali per ottenere gli errori sugli assi X, Y e Z. Impostare il numero massimo di FOV su 20, il numero target di punti su 4.000, la distanza massima tra i canali a 5,0 pixel e il raggio di esclusione tra i canali a 10,0 pixel durante la calibrazione della mappatura dei canali.
  7. Assicurarsi che la calibrazione produca una copertura puntuale del >90% e una qualità di mappatura buona. Salvare i dati di calibrazione forniti per future acquisizioni di immagini.

5 Visualizzazione di EV in tre dimensioni

  1. Aggiungere olio 100x sull'obiettivo e posizionare i veicoli elettrici preparati nel microscopio. Senza l'obiettivo 3D attivato, accendere il laser di eccitazione a 640 nm e inizialmente sollevarlo tra 1,2 mW e 12,5 mW a seconda dell'intensità del segnale e del campo visivo per eccitare i veicoli elettrici colorati con colorante intercalante a membrana rossa.
    1. Nelle opzioni Visualizzazione immagine, cambia il metodo di visualizzazione dalla saturazione dei fotoni ai percentili per visualizzare meglio i veicoli elettrici. Regola la potenza del laser per ridurre al minimo il rumore, massimizzando al contempo il segnale. Mantenere tutti gli altri parametri.
    2. Regolate la messa a fuoco del piano Z facendo clic sull'icona su o giù sull'asse Z.
      NOTA: il piano Z deve essere focalizzato tra -200 e -350 nm, ma varia a seconda del campo visivo.
  2. Impostare il tempo di esposizione a 20 ms, l'acquisizione del fotogramma a 10.000 fotogrammi e la potenza laser iniziale tra 1,2 mW e 12,5 mW o la potenza laser determinata nel passaggio 5.1, a seconda dell'intensità del segnale e del campo visivo.
    1. Attivare l'obiettivo 3D utilizzando l'icona e avviare l'acquisizione facendo clic sul pulsante Acquisisci.
  3. Durante l'acquisizione delle immagini, aumentare la potenza del laser di 3 incrementi di 10 ogni 1000 fotogrammi, o abbastanza per mantenere un elevato rapporto segnale-rumore. Non regolare il piano Z durante l'acquisizione.
    NOTA: il laser può essere sollevato fino a un massimo di 90 mW di potenza laser.

6 Modifica post-acquisizione e tracciamento EV

  1. Dopo l'acquisizione dell'immagine, passare alla finestra di visualizzazione Analizza. Eseguire la correzione della deriva sull'immagine non filtrata, quindi attivare i filtri. Regolare il conteggio dei fotoni, la precisione di localizzazione, i sigma e l'indice del fotogramma in base alla Tabella 1.
  2. Sovrapporre uno strumento di visualizzazione piana XYZ lungo l'asse X dei singoli veicoli elettrici dal campo visivo ed esportare . File CSV di eventi di photoswitching.
  3. Taglia in due singoli veicoli elettrici sull'asse XY in un campo visivo X per Y utilizzando uno strumento di istogramma lineare, che raccoglie gli eventi di fotointerruttoria in gruppi di distanza impostati.
  4. Scatta immagini di singoli veicoli elettrici e salvali come file .tiff.
  5. Crea video 3D di singoli veicoli elettrici utilizzando uno strumento di visualizzazione 3D e colora in base al posizionamento lungo l'asse Z.

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Representative Results

L'obiettivo di questo studio era valutare l'efficacia della microscopia a super-risoluzione nella visualizzazione di singoli veicoli elettrici con risoluzione nanometrica in tre dimensioni (3-D). Per analizzare la forma e le dimensioni dei singoli veicoli elettrici, abbiamo impiegato un colorante fotointercabilibile e incubato i veicoli elettrici con un colorante intercalante a membrana di colore rosso lontano e rimosso il colorante in eccesso attraverso la cromatografia29. I veicoli elettrici anti-CD81 e colorati di rosso catturati per affinità sono stati poi visualizzati al microscopio a super-risoluzione sotto il laser di eccitazione a 640 nm. A seguito della calibrazione del microscopio che ha prodotto un errore medio di 16 nm sull'asse XY e 38 nm sull'asse Z(Figura 1A,B),i veicoli elettrici U2OS purificati sono stati visualizzati con successo con una risoluzione fino a 20 nm sull'asse XY e 50 nm lungo l'asse Z.

I singoli veicoli elettrici visualizzati tramite dSTORM in fotocceduto 3D durante l'esposizione di 10.000 fotogrammi mentre la potenza del laser aumentava ed erano facilmente evidenti nell'immagine acquisita (Figure 2A, B). La correzione dell'immagine post-acquisizione del piano Z, il conteggio dei fotoni, i sigma e la precisione di localizzazione dell'immagine ricostruita hanno permesso la chiara risoluzione dell'EV in 3-D (Figura 2C, D). L'EV nella Figura 2C è stato fotografato solo durante i primi 7.000 fotogrammi, come si vede dalla legenda nell'angolo in alto a destra. Questo è il risultato del fotosbiancamento che potrebbe essere stato causato dall'aumento della potenza del laser troppo rapidamente. L'istogramma conferma che la maggior parte degli eventi di fotointerruttoria si è verificata entro un raggio di 100 nm (Figura 2E), convalidando che l'EV visualizzato è un esosoma e che l'isolamento di veicoli elettrici di piccolo diametro ha avuto successo.

L'analisi della distribuzione dimensionale è stata eseguita su altri veicoli elettrici tracciati individualmente utilizzando uno strumento di istogramma di linea e uno strumento di visualizzazione piana XYZ per confermare che la maggior parte degli eventi di fotointerruttoria si è verificata entro un raggio di 100 nm dal centro(Figura 3A,C),convalidando ulteriormente la capacità di dSTORM di visualizzare veicoli elettrici di piccolo diametro. Come si vede da uno strumento di visualizzazione 3D, l'errore lungo l'asse Z è aumentato, producendo un'immagine finale allungata dell'EV lungo l'asse assiale (Figura 3D, Video 1). Gli eventi di fotointerruttoria non sono stati correlati con le dimensioni ev (Figura 3E), dimostrando che la caratterizzazione basata su dSTORM può essere utilizzata per piccoli veicoli elettrici come esosomi e piccoli virus avvolti di diametro inferiore a 100 nm.

I parametri corretti per Z-plane e sigma sono parte integrante della corretta risoluzione della membrana in 3-D. Inoltre, il tempo di esposizione corretto, il numero di fotogrammi catturati e il livello laser iniziale sono cruciali per produrre un'immagine di un singolo EV con una membrana risolta. Ulteriori indagini dovrebbero essere fatte su come ottimizzare il microscopio e impostare parametri sia pre che post-acquisizione per catturare le immagini a più alta risoluzione dei veicoli elettrici.

Figure 1
Figura 1: Calibrazione del microscopio a super-risoluzione in tre dimensioni utilizzando microsfere a 100 nm. (A) Campo visivo in scala di grigi dalla calibrazione del microscopio con microsfere dopo correzioni di immagini post-acquisizione. Barra delle scale in basso a destra. (B) Gli errori assoluti di calibrazione sull'asse XY e sull'asse Z sono stati ottenuti rispettivamente attraverso la calibrazione della mappatura dei canali e la calibrazione della mappatura 3D. N = 10 repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: dSTORM di un singolo EV in tre dimensioni. (A) Campo visivo in scala di grigi di veicoli elettrici purificati per affinità CD81+ colorati con colorante intercalante a membrana rossa fotointercavizzabile ed eccitati con il laser di eccitazione a 640 nm. Barra delle scale in basso a destra. (B) Campo visivo da A etichettato in base al colore del canale. (C) Singolo EV dalla vista ingrandita della casella bianca in A, etichettata in base all'indice del fotogramma. La mappa di calore in alto a destra indica la cornice in cui sono stati registrati gli eventi di fotoregistrazione. Barra delle scale in basso a destra. (D) EV da C etichettato in base al colore del canale. (E) L'analisi della distribuzione delle dimensioni è stata creata bisecando l'EV sulla linea tratteggiata mostrata in D e separando l'evento di fotoccelerazione in contenitori da 15,4 nm utilizzando uno strumento di istogramma di linea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Distribuzione degli eventi di fotointerruttoria durante l'acquisizione di un singolo EV in tre dimensioni. (A) Immagine ricostruita di un EV purificato per affinità CD81+ etichettato con colorante intercalante a membrana rossa fotointercavibile ed eccitato con il laser di eccitazione a 640 nm. Barra delle scale in basso a destra. (B) Box e whisker plot dei diametri medi dei veicoli elettrici purificati per affinità CD81+ ottenuti utilizzando lo strumento di istogramma lineare del microscopio lungo l'asse XY. (media = 104 nm, deviazione standard = 28 nm). (C)Posizione dei singoli eventi di fotoregistrazione lungo la dimensione XY dell'EV in A, registrati durante l'esposizione di 10.000 fotogrammi. (D) Posizione dei singoli eventi di fotoccedienza lungo l'asse XZ dell'EV in A, registrati durante l'esposizione di 10.000 fotogrammi. (E) Grafico a dispersione del numero di eventi di fotocclusività registrati su singoli veicoli elettrici di diametro variabile. Il valore R-quadrato di 0,1065 non dimostra alcuna correlazione tra il numero di eventi di fotointerruttoria rilevati e il diametro EV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Immagine 3D di un singolo EV purificato per affinità CD81+ etichettato con colorante intercalante a membrana rossa fotointercabilibile ed eccitato con il laser di eccitazione a 640 nm. La combinazione di colori è etichettata in base alla profondità lungo l'asse Z. L'errore lungo l'asse Z è allungato. Clicca qui per scaricare questo video.

Variabile Oi, Max
Conteggio dei fotoni 200 10,000,000
Posizione Z (nm) -300 300
Precisione di localizzazione X (nm) 0 40
Precisione di localizzazione Y (nm) 0 40
Precisione Sigma X (nm) 0 40
Precisione Sigma Y (nm) 0 40
Sigma X (nm) (Canale 0, laser 640 nm) 100 350
Sigma Y (nm) (Canale 0, laser 640 nm) 100 350
Sigma X (nm) (canale 1, 473, laser 561 nm) 100 350
Sigma Y (nm) (canale 1, 473, laser 561 nm) 100 350
Indice frame 0 10,000

Tabella 1: Parametri per il microscopio a super-risoluzione durante l'acquisizione 3D dSTORM.

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Discussion

I veicoli elettrici sono diventati un'area di studio popolare a causa del loro importante ruolo in molti processi intracellulari e nella segnalazione da cellula a cellula1,30. Tuttavia, la loro visualizzazione si rivela difficile in quanto le loro piccole dimensioni scendono al di sotto del limite di diffrazione della microscopia ottica. La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) è un metodo diretto di visualizzazione che aggira il limite di diffrazione catturando eventi di fotoregistrazione di singoli fluorofori nel tempo e ricostruendo un'immagine basata su questi eventi lampeggianti21,31. La microscopia a super-risoluzione è stata eseguita con successo in 3-D su diverse strutture cellulari come filamenti di actina, microtubuli, recettori incorporati nella membrana plasmatica e proteine virali in cellule infette32,33,34,35,36. Lo scopo di questo studio era quello di valutare l'efficacia della microscopia a super-risoluzione, in particolare dSTORM, per visualizzare i veicoli elettrici in 3D con risoluzione nanometrica. Abbiamo utilizzato coloranti intercalativi a membrana fotointercabili per visualizzare con successo singoli veicoli elettrici da cellule U2OS attraverso dSTORM con risoluzione fino a +/- 20 nm sull'asse XY e risoluzione +/- 50 nm sull'asse Z. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che i veicoli elettrici provenienti da più linee cellulari e fluidi primari hanno profili di distribuzione delle dimensioni simili a quelli analizzati da NTA e TEM26,37. L'uso di una caratterizzazione dei veicoli elettrici basata su dSTORM può aggiungere ulteriore fiducia a questo fenomeno, oltre a identificare potenzialmente sottopopolazioni in un singolo campo visivo. È giustificato un ulteriore perfezionamento di questo metodo. Un notevole vantaggio di dSTORM è che la preparazione del campione non richiede passaggi duri o dannosi che possono alterare la struttura dei veicoli elettrici. I nostri risultati dimostrano ulteriormente che la natura biochimica dei veicoli elettrici viene mantenuta durante la purificazione EV con perline anti-CD81 e glicina acida26,37. Abbiamo fissato i veicoli elettrici con paraformaldeide per evitare permeabilizzazioni di membrana causate da altri fissativi come metanolo ed etanolo. Questo ci ha permesso di concludere che dSTORM cattura con precisione la morfologia dei veicoli elettrici così come esistono in soluzione. L'uso di Capto Core 700 è necessario, tuttavia, per purificare efficacemente i veicoli elettrici lontano da contaminanti come albumina e polietilenglicole al di sotto dei requisiti normativi38. Una notevole limitazione del protocollo è che l'efficienza di legame tra l'EV e le diapositive non è del 100%, quindi alcuni veicoli elettrici vengono persi durante la preparazione del campione. Ulteriori indagini dovrebbero essere fatte sull'efficacia dei vetrini rivestiti di adesivo per legare meglio i veicoli elettrici.

Mentre la preparazione dei veicoli elettrici per la visualizzazione è semplice, i parametri durante l'acquisizione e soprattutto durante le modifiche post-acquisizione variano sostanzialmente da campione a campione, a seconda dell'intensità e della stabilità dei veicoli elettrici e del fluoroforo. Un'area di variabilità nell'esperimento è l'intensità dei laser di eccitazione che devono essere delicatamente sollevati durante l'esposizione per massimizzare il segnale ma prevenire il fotosbiancamento. Il fotosbiancamento, o quando un fluoroforo perde la sua capacità di fluorescenza, è una limitazione significativa in tutta la microscopia a super-risoluzione12,39. Per prevenire il fotosbiancamento, la concentrazione dell'enzima nel tampone può essere aumentata a 10 mM per eliminare meglio le molecole ossidanti e prevenire il fotosbiancamento. Inoltre, impostare la potenza del laser di eccitazione su un livello iniziale basso e sollevarla lentamente durante l'esposizione per mantenere un segnale elevato è fondamentale per prevenire il fotosbiancamento.

Abbiamo scelto un colorante fotointerruttore rosso per macchiare i veicoli elettrici grazie alla sua lunghezza d'onda di eccitazione, alla durata e alla capacità di resistere alla fissazione29. Tuttavia, il colorante che abbiamo scelto può presentare problemi durante la microscopia a super-risoluzione quando eccitato troppo velocemente o ad un'intensità troppo alta. I fluorofori nel colorante a membrana rossa fotointerruttuoso possono fotosbiancare dopo 10.000 fotogrammi o dopo che la potenza del laser supera i 75,6 mW. Inoltre, l'intensità e la capacità di fluorescenza del colorante a membrana diminuiscono sostanzialmente dopo una settimana di conservazione a 4 °C. Infine, è stato dimostrato che i coloranti intercalanti a membrana formano micelle in una soluzione acquosa, quindi qualsiasi colorante in eccesso ancora presente nel campione EV dopo la purificazione può essere rilevato e scambiato per un EV se non esiste un altro marcatore per identificare l'EV, come una tetraspanina. Ulteriori indagini dovrebbero essere fatte utilizzando altri coloranti intercalanti a membrana per ottimizzare la fotostabilità31,40. Gli anticorpi fluorescenti coniugati all'EV possono essere un'opzione più adatta in quanto tendono ad essere più resistenti al fotosbiancamento e possono amplificare il segnale41. Tuttavia, lo svantaggio degli anticorpi è che il segnale dal fluoroforo è leggermente compensato dall'EV a causa della distanza dall'epitopo e dal fluoroforo sull'anticorpo.

I metodi esistenti di visualizzazione e caratterizzazione EV, come NTA, citometria a flusso o EM, possono richiedere fasi di preparazione dannose o sono metodi indiretti di visualizzazione. dSTORM richiede poca preparazione del campione, conservando la naturale natura biochimica dei veicoli elettrici, ed è un metodo diretto di visualizzazione che può bypassare il limite di diffrazione e visualizzare EV di piccolo diametro8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,21, 26. Altre tecniche di microscopia a super-risoluzione possono essere ottimizzate per la caratterizzazione EV come l'esaurimento delle emissioni stimolate (STED), la microscopia confocale a disco rotante (SDCM) e la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)42,43. L'attuale studio si concentra esclusivamente su dSTORM, ma il lavoro futuro sull'ottimizzazione della microscopia a super-risoluzione e sul confronto / contrasto di queste tecniche è giustificato. I veicoli elettrici sono recentemente diventati un'area di ricerca popolare poiché il loro ruolo nella progressione del virus è diventato più evidente. Molti virus evolutivamente distinti, come il virus di Epstein Barr, l'HIV e il virus dell'epatite A, si sono evoluti per sfruttare le vie di segnalazione EV per promuovere la progressione della malattia ed eludere la risposta immunitaria del corpo37,44,45,46,47,48,49,50 . Questi virus hanno dimostrato di incorporare fattori virali, come mRNA o proteine virali, in EV che possono quindi trasferire questi componenti a cellule non infette, mentre sfuggono al rilevamento immunitario6,51,52,53. Questi fattori virali associati agli esosomi possono essere rilevati ed eventualmente impiegati come biomarcatori per la progressione della malattia54,55. Pertanto, la visualizzazione basata su dSTORM dei singoli EV e delle loro proteine associate può essere esplorata come piattaforma per i biomarcatori della malattia e, forse, la progressione della malattia di alcuni virus54,55. Ulteriori ricerche dovrebbero essere fatte per valutare l'utilità di dSTORM nel visualizzare sia il contenuto all'interno di un EV che le proteine sulla sua membrana.

In conclusione, abbiamo dimostrato che la microscopia a super-risoluzione dovrebbe essere considerata una tecnica efficace per la visualizzazione di veicoli elettrici in 3D con risoluzione nanometrica. I risultati ottenuti da dSTORM sono coerenti con altre tecniche di caratterizzazione EV. Un netto vantaggio di dSTORM è la capacità di visualizzare direttamente le particelle al di sotto del limite di diffrazione della luce senza disidratazione o fasi di frattura da congelamento che possono alterare la natura biochimica dei veicoli elettrici.

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Disclosures

M.G.C. non ha conflitti di interesse da dichiarare. R.P.M e D.P.D. ricevono supporto materiale da Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. e Cytiva Inc. (ex GE Healthcare). R.P.M. e D.P.D. dichiarano interessi concorrenti per l'eventuale commercializzazione di alcune delle informazioni presentate. Questi sono gestiti dall'Università della Carolina del Nord. Le fonti di finanziamento non sono state coinvolte nelle interpretazioni o nella scrittura di questo manoscritto.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Oxford Nanoimaging per il loro feedback costruttivo e la guida. Questo lavoro è stato finanziato dal 5UM1CA121947-10 a R.P.M. e dal 1R01DA040394 al D.P.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

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Biologia Numero 174
Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni
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