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Neuroscience

मिर्गी के माउस मॉडल में गर्मी प्रेरित दौरे के लिए एक व्यवहार स्क्रीन

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62846
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, 2Department of Anatomy and Neurobiology, University of California

Summary

विधि का लक्ष्य माउस मॉडल में हाइपरथर्मिया या गर्मी-प्रेरित दौरे के लिए स्क्रीन करना है। प्रोटोकॉल शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी के साथ एक कस्टम-निर्मित कक्ष के उपयोग का वर्णन करता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या ऊंचा शरीर का तापमान दौरे की ओर जाता है।

Abstract

ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मिर्गी सहित मानव न्यूरोलॉजिकल विकारों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने में शक्तिशाली उपकरण साबित हुए हैं। SCN1A-संबद्ध आनुवंशिक मिर्गी में अपूर्ण पेनेट्रेंस और नैदानिक परिवर्तनशीलता के साथ जब्ती विकारों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम शामिल है। SCN1A उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप जब्ती फेनोटाइप की एक बड़ी विविधता हो सकती है, जिसमें सरल, आत्म-सीमित बुखार से जुड़े ज्वर के दौरे (एफएस), ज्वर के दौरे के साथ मध्यम स्तर की आनुवंशिक मिर्गी प्लस (जीईएफएस +) से लेकर अधिक गंभीर ड्रेवेट सिंड्रोम (डीएस) तक शामिल हैं। हालांकि एफएस आमतौर पर 6-7 वर्ष से कम उम्र के बच्चों में देखा जाता है, जिनके पास आनुवंशिक मिर्गी नहीं होती है, जीईएफएस + रोगियों में एफएस वयस्कता में जारी रहता है। परंपरागत रूप से, प्रयोगात्मक एफएस को चूहों में जानवर को सूखी हवा या हीटिंग लैंप की एक धारा में उजागर करके प्रेरित किया गया है, और शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर अक्सर अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं होती है। यहां, हम एक कस्टम-निर्मित हीटिंग चैंबर का वर्णन करते हैं, जिसमें एक plexiglass फ्रंट होता है, जो एक डिजिटल तापमान नियंत्रक और एक हीटर-सुसज्जित इलेक्ट्रिक फैन के साथ फिट होता है, जो तापमान-नियंत्रित तरीके से परीक्षण क्षेत्र में गर्म मजबूर हवा भेज सकता है। कक्ष में रखे गए माउस के शरीर के तापमान, एक रेक्टल जांच के माध्यम से निगरानी की जाती है, को कक्ष के अंदर तापमान बढ़ाकर पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से 40-42 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जा सकता है। हीटिंग अवधि के दौरान जानवरों की निरंतर दृश्य निगरानी शरीर के तापमान पर एक एफएस उत्परिवर्तन ले जाने वाले चूहों में गर्मी-प्रेरित बरामदगी के प्रेरण को दर्शाती है जो जंगली-प्रकार के कूड़े के साथी में व्यवहारिक दौरे को प्राप्त नहीं करती है। जानवरों को आसानी से कक्ष से हटाया जा सकता है और शरीर के तापमान को सामान्य करने के लिए तेजी से वापस करने के लिए एक शीतलन पैड पर रखा जा सकता है। यह विधि मिर्गी माउस मॉडल में गर्मी-प्रेरित दौरे की घटना के लिए एक सरल, तेजी से, और पुन: प्रस्तुत करने योग्य स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रदान करती है।

Introduction

मिर्गी, संयुक्त राज्य अमेरिका में न्यूरोलॉजिकल विकारों का चौथा सबसे आम परिवार 1, सीएनएस में उत्तेजक और निरोधात्मक ड्राइव के असंतुलन की विशेषता है जो आवर्तक दौरे की ओर जाता है। ज्वर के दौरे (एफएस) या बुखार से जुड़े दौरे सामान्य आबादी में हो सकते हैं, अक्सर 6-7 वर्ष की आयु के माध्यम से 3 महीने की शुरुआत में बच्चों में। हालांकि, आनुवांशिक उत्परिवर्तन वाले कुछ व्यक्तियों में, अक्सर सोडियम चैनल जीन में, एफएस वयस्कता में 7 साल की उम्र से परे जारी रह सकता है। इस स्थिति को ज्वर के दौरे के साथ-साथ या एफएस + के रूप में जाना जाता है। जीनोम अनुक्रमण में तेजी से प्रगति ने मानव सोडियम आयन चैनल जीन एससीएन 1 ए में 1,300 से अधिक उत्परिवर्तनों की पहचान की है, जो इसे मिर्गी उत्परिवर्तन के लिए एक हॉटस्पॉट बनाता है। SCN1A उत्परिवर्तन को जब्ती विकारों के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम से जोड़ा गया है, जिसमें ज्वर के दौरे (एफएस), ज्वर के दौरे के साथ आनुवंशिक मिर्गी प्लस (जीईएफएस +), और ड्रेवेट सिंड्रोम (डीएस) 2,3,4,5,6 शामिल हैं। SCN1A मिससेंस म्यूटेशन का लगभग 20% GEFS + 5,7,8 की ओर जाता है। बचपन में जटिल या लंबे समय तक एफएस का बाल चिकित्सा इतिहास बाद में मिर्गी के अधिक दुर्बल रूपों में विकसित हो सकता है जैसे कि टेम्पोरल लोब मिर्गी (टीएलई) 9,10,11। Dravet सिंड्रोम ट्रंकेशन उत्परिवर्तन या SCN1A में समारोह उत्परिवर्तन के नुकसान के कारण उत्पन्न होता है और असभ्य मिर्गी का एक गंभीर रूप है, ज्वर के दौरे की बचपन की शुरुआत के साथ जो दुर्दम्य दौरे में विकसित होते हैं, और अक्सर संज्ञानात्मक, विकासात्मक और मोटर हानि 2,5,12 के साथ जुड़ा होता है . चूंकि जीईएफएस + और / या डीएस वाले कई व्यक्ति ज्वर के दौरे का प्रदर्शन करते हैं, इसलिए इन जब्ती विकारों का बेहतर मुकाबला करने के लिए उपन्यास उपचार विकसित करना अनिवार्य हो जाता है।

एससीएन 1 ए से जुड़े मिर्गी के पशु मॉडल ने विभिन्न प्रकार के दौरे (ज्वर बनाम सामान्यीकृत) की विशेषता और जब्ती पीढ़ी के न्यूरोनल तंत्र को विच्छेदन करने में अमूल्य साबित किया है13,14,15,16,17,18। जबकि कृंतक दिमाग में ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग के माध्यम से सहज दौरे का अध्ययन अच्छी तरह से स्थापित है और एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, केवल कुछ अध्ययनों ने माउस मॉडल में ज्वर के दौरे की नकल करने का प्रयास किया है14,16,19,20,21,22,23 . पिछले अध्ययनों ने गर्म सूखी हवा के जेट का उपयोग किया है, या एक थर्मल सिस्टम के साथ फिट एक मेथाक्रिलेट सिलेंडर, या संलग्न परीक्षण एरेनास 9,16,21,22,23,24 में तापमान नियंत्रक के साथ हीट लैंप हाइपरथर्मिया के माध्यम से दौरे को प्रेरित करने के लिए। अधिक नियंत्रित वातावरण में शरीर के तापमान को बढ़ाने के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल तापमान-नियंत्रित हीटिंग सिस्टम के साथ एक कस्टम-निर्मित कक्ष का उपयोग करता है जो कक्ष के अंदर माउस के शरीर के तापमान में वृद्धि की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दरों की अनुमति देता है। गर्मी कक्ष लकड़ी से बनाया गया था (लंबाई 40 सेमी x चौड़ाई 34 सेमी x ऊंचाई 31 सेमी) और एक के थर्मोकपल के साथ एक डिजिटल तापमान नियंत्रक के साथ फिट किया गया था। कक्ष के बैक पैनल पर एक हीटर से सुसज्जित एक छोटा अक्षीय प्रशंसक एक डिजिटल तापमान नियंत्रक द्वारा विनियमित कक्ष में गर्म हवा को निर्देशित करता है। यह मजबूर हवा हीटिंग सिस्टम एक दर को नियंत्रित करने में सक्षम बनाता है जिस पर कक्ष का तापमान बढ़ जाता है। (चित्र 1A, B)। लकड़ी की गर्मी कक्ष के अंदर स्थित कश्मीर थर्मोकपल डिजिटल तापमान नियंत्रक को प्रतिक्रिया भेजता है, परख के दौरान बॉक्स के अंदर निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए। डिजिटल तापमान नियंत्रक पर तापमान सेट करना, बिजली के पंखे को कक्ष को समान रूप से गर्म करने के लिए वेंट्स के माध्यम से गर्म मजबूर हवा भेजने में सक्षम बनाता है (चित्रा 1 ए)। हीट चैंबर के सामने पैनल परीक्षणों की आसान वीडियो रिकॉर्डिंग को सक्षम करने के लिए एक स्पष्ट plexiglass शीट है।

वयस्क (P30-P40) चूहों, SCN1A में एक missense उत्परिवर्तन के लिए विषमयुग्मजी है कि GEFS + और जंगली प्रकार के कूड़े के साथी की एक समान संख्या नियंत्रण समूह के रूप में सेवा करने के लिए कारण बनता है, प्रत्येक प्रयोग के लिए चुना गया था। इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले नर और मादा दोनों का वजन कम से कम 15 ग्राम था क्योंकि कम वजन वाले जंगली-प्रकार के चूहे एक ही उम्र के भारी जानवरों की तुलना में गर्मी से प्रेरित दौरे के प्रति अधिक संवेदनशील थे। पायलट अध्ययन में, उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के चूहों दोनों को पीछे की ओर कक्ष के कूलर कोनों की तलाश करने के लिए देखा गया था और लंबे समय तक वहां रहे। इसे दरकिनार करने के लिए, गर्मी कक्ष परीक्षण क्षेत्र के अंदर प्रभावी फर्श का आकार 16.5 सेमी x चौड़ाई 21.5 सेमी x ऊंचाई 27.5 सेमी लंबाई तक कम हो गया था, जो कक्ष के दाईं ओर लकड़ी के ब्लॉक बी (आयाम 20 सेमी x 8 सेमी x 7.2 सेमी) रखकर कम हो गया था (चित्रा 1 ए)। गर्मी कक्ष का निर्माण 1.9 सेमी मोटी प्लाईवुड (लंबाई 40 सेमी x चौड़ाई 34 सेमी x ऊंचाई 31 सेमी) से किया गया था, जो सफेद टुकड़े टुकड़े के साथ कवर किया गया था और एक के थर्मोकपल के साथ एक डिजिटल तापमान नियंत्रक के साथ फिट किया गया था। कक्ष की दीवारों की टुकड़े टुकड़े की सतह अपारगम्य है और 70% इथेनॉल के साथ पोंछकर परीक्षणों के बीच आसानी से साफ किया जा सकता है। गर्मी कक्ष का तापमान शुरू में 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया था और प्रयोग की शुरुआत से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए प्रीहीट किया गया था, ताकि चैंबर के अंदर समान हीटिंग सुनिश्चित की जा सके। प्रत्येक माउस को प्रयोग के दौरान शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी के लिए एक रेक्टल थर्मामीटर के साथ फिट किया गया था। एक बार में कक्ष में एक एकल माउस रखा गया था और तापमान को पहले-10 वें मिनट के बीच 50 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। तापमान को तब 11 वें-20 वें मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दिया गया था, और अंत में 21 वें-30 वें मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दिया गया था। इसके परिणामस्वरूप माउस शरीर के तापमान (चित्रा 2 ए) में वृद्धि की एक पुनरुत्पादक दर हुई। प्रत्येक परीक्षण को वीडियो-टेप किया गया था और व्यवहार विश्लेषण ऑफ़लाइन आयोजित किया गया था।

हीटिंग प्रोटोकॉल को गर्मी कक्ष के प्रारंभिक तापमान को बदलने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है और उस दर को बदलने के लिए जो कक्ष को गर्म किया जाता है, जो बदले में बदलता है कि परख के दौरान माउस के शरीर का तापमान कितनी जल्दी ऊंचा होता है। इस प्रकार, यह विधि गर्मी-प्रेरित दौरे से जुड़े व्यवहार स्क्रीन की स्थापना में पारंपरिक तरीकों पर अधिक लचीलापन प्रदान करती है। गर्मी-प्रेरित जब्ती प्रोटोकॉल का उपयोग एंटी-मिर्गी की दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए भी किया जा सकता है जो उत्परिवर्ती चूहों को गर्मी-प्रेरित दौरे के लिए अधिक प्रतिरोधी बनाते हैं या दहलीज तापमान को बढ़ाते हैं जिस पर दौरे देखे जाते हैं। इसी तरह, गर्मी से प्रेरित दौरे पर कीटो आहार जैसे प्रतिबंधात्मक आहार शासनों के लाभकारी प्रभावों की जांच सामान्य चाउ-फेड बनाम कीटो-खिलाए गए चूहों में की जा सकती है।

Figure 1
चित्र1: कस्टम-निर्मित माउस हीट चैंबर का विवरण। (A) लकड़ी के माउस हीट चैंबर का फ्रंट पैनल पावर ऑन / ऑफ स्विच वाले साइड कंट्रोल पैनल को दिखाता है जो डिजिटल तापमान नियंत्रक, के थर्मोकपल, फैन हीटर के चालू / बंद स्विच और गर्मी संकेतक को चालू करता है। बॉक्स के बाहरी आयाम और आंतरिक परीक्षण क्षेत्र को सेमी में दिखाया गया है। परीक्षण क्षेत्र की सतह को प्रभावी ढंग से कम करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक लकड़ी का ब्लॉक बी भी दिखाया गया है। परीक्षण क्षेत्र के निचले हिस्से को कोब बिस्तर के साथ कवर किया गया है ताकि चूहों को सीधे गर्म लकड़ी की सतहों के संपर्क में आने से रोका जा सके। (बी) गर्मी कक्ष का बैक पैनल शीर्ष हवा के वेंट पर घुड़सवार पंखे और कक्ष को बिजली की आपूर्ति करने के लिए पावर कॉर्ड को दिखाता है। इस आंकड़े को दास एट अल. 2021, eNeuro14 में चित्रा 3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. गर्मी प्रेरित जब्ती परख के लिए तैयारी

  1. गर्मी कक्ष पर पावर ऑन बटन पर स्विच करें, इसके बाद हीट ऑन बटन।
  2. डिजिटल तापमान नियंत्रक पर कीपैड का उपयोग करके गर्मी कक्ष का तापमान 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  3. कक्ष में पहले माउस को पेश करने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस पर कक्ष को प्रीहीट करने के लिए कम से कम 1 घंटे की प्रतीक्षा करें। प्रीहीटिंग कक्ष के अंदर एक समान हीटिंग सुनिश्चित करता है।
  4. कोब बिस्तर के साथ माउस गर्मी कक्ष के फर्श लाइन.
  5. प्रत्येक गर्मी प्रेरित जब्ती परख परीक्षण रिकॉर्डिंग के लिए गर्मी कक्ष के सामने एक वीडियो रिकॉर्डिंग कैमरा माउंट।
  6. टिशू पेपर की मोटी परतों के साथ एक 140 मिमी व्यास पेट्री डिश को लाइन करें और इसे कूलिंग पैड के रूप में सेवा करने के लिए बर्फ पर रखें।
    नोट: परख के अंत में, व्यक्तिगत माउस prechilled शीतलन पैड पर स्थानांतरित कर दिया जाएगा मदद करने के लिए उनके ऊंचा शरीर के तापमान को नीचे लाने के लिए.

2. गर्मी प्रेरित जब्ती परख के लिए माउस की तैयारी

  1. 10 वयस्क चूहों (P30-P40) का चयन करें, 5 है कि मिर्गी उत्परिवर्तन और गर्मी प्रेरित जब्ती स्क्रीनिंग परख के लिए जंगली प्रकार कूड़े के साथी के 5 के कारण ले.
    नोट: जंगली प्रकार के चूहों, किसी भी मिर्गी के कारण उत्परिवर्तन के कारण नहीं है, 44 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान पर गर्मी-प्रेरित दौरे का प्रदर्शन नहीं करते हैं और नियंत्रण समूह के रूप में कार्य करते हैं।
  2. स्क्रीनिंग परख के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रत्येक माउस वजन और अपने शरीर के वजन रिकॉर्ड. परख के लिए केवल 15 ग्राम या उससे अधिक वजन वाले चूहों का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. माउस गर्मी कक्ष में एक समय में एक माउस स्क्रीन.
  4. संक्षेप में एक घंटी जार के नीचे isoflurane की कुछ बूँदों का उपयोग कर 10-15 s के लिए माउस anesthetize.
  5. जानवर को बेल जार से बाहर निकालें और इसे एक पेपर तौलिया पर रखें।
  6. सुनिश्चित करें कि माउस पूरी तरह से anesthetized है कि माउस एक हानिकारक पैर की अंगुली चुटकी के लिए अनुत्तरदायी है की जाँच करके.
  7. एक स्नेहक (जैसे पेट्रोलियम जेली) के साथ मलाशय के तापमान की जांच की धातु की नोक को कोट करें और धीरे से इसे माउस में 2 सेमी से कम या बराबर की गहराई पर डालें।
  8. टेप के साथ माउस की पूंछ के लिए मलाशय की जांच को सुरक्षित करें, इसलिए जांच परख के दौरान बाहर नहीं आती है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक माउस अवरोधक शंकु में जानवर जगह और मलाशय तापमान जांच सम्मिलित करें। पूंछ पर टैप करके इसे सुरक्षित करें।
  9. सुनिश्चित करें कि रेक्टल प्रोब एक मल्टीमीटर से जुड़ा हुआ है जो माउस के आंतरिक शरीर के तापमान को प्रदर्शित करता है।
  10. जानवर को कोब बिस्तर के साथ पंक्तिबद्ध एक ताजा पिंजरे में रखें, यानी, वसूली पिंजरे।
  11. एक टाइमर शुरू करें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। माउस का निरीक्षण करें जब तक कि यह संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाए और माउस सक्रिय और सौंदर्य हो।
    1. साथ ही, माउस के कोर शरीर के तापमान की निगरानी करें जब तक कि यह 35-36 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर न हो जाए।
  12. 5 मिनट के अंत में, माउस के शरीर के तापमान पर ध्यान दें। यह समय "0" मिनट पर प्रारंभिक शरीर का तापमान है।
    नोट: यदि माउस के मुख्य शरीर का तापमान 35 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, तो संज्ञाहरण-प्रेरित हाइपोथर्मिया से उबरने के लिए जानवर के लिए अतिरिक्त समय की प्रतीक्षा करें।
  13. जल्दी से, व्यक्तिगत माउस को पहले से गर्म माउस कक्ष में स्थानांतरित करें। यह प्रयोग परीक्षण के प्रारंभ को चिह्नित करता है। किसी दिए गए समय में केवल एक माउस की जांच की जाती है।

3. गर्मी प्रेरित जब्ती परख

  1. धीरे से माउस को पूर्व-गर्म माउस गर्मी कक्ष के फर्श पर रखने के बाद, plexiglass दरवाजा बंद करें और प्रयोग की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए कैमरा शुरू करें।
  2. स्टॉपवॉच शुरू करें। प्रयोग की अवधि के लिए 1 मिनट के अंतराल पर रेक्टल थर्मामीटर से माउस के शरीर के तापमान को रिकॉर्ड करें।
  3. नियमित अंतराल पर, माउस गर्मी कक्ष के तापमान को बढ़ाएं ताकि माउस के शरीर का तापमान 0.25-0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से बढ़ जाए।
    नोट: शरीर के तापमान में तेजी से वृद्धि से हीट स्ट्रोक या मृत्यु हो सकती है और इससे बचा जाना चाहिए।
  4. इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, माउस गर्मी कक्ष के तापमान को हर 10 मिनट में 5 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाया गया है।
  5. 9.5 मिनट पर, गर्मी कक्ष के तापमान को 55 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, गर्मी कक्ष के तापमान को 10 वें मिनट तक 55 डिग्री सेल्सियस तक स्थिर करने के लिए, जैसा कि डिजिटल तापमान प्रदर्शन पर दिखाया गया है।
  6. इसी तरह, 20 वें मिनट तक गर्मी कक्ष के तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस तक स्थिर करने के लिए 19.5 मिनट पर तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं। प्रत्येक जब्ती स्क्रीनिंग परीक्षण 30 मिनट तक रहता है।
  7. यदि माउस में एक जब्ती है (vocalizes, सिर हिलाना दिखाता है, forelimb clonus, hindlimb विस्तार, इसके पक्ष में गिरता है, या सामान्यीकृत टॉनिक / क्लोनिक आक्षेप का अनुभव करता है), तो निम्नलिखित जानकारी रिकॉर्ड करें।
    1. रेक्टल तापमान थर्मामीटर से जब्ती (जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान) के दौरान माउस के शरीर के तापमान को रिकॉर्ड करें।
    2. जब्ती व्यवहार विशेषताओं जैसे कि सिर हिलाना, अग्रभाग क्लोनस, हिंद अंग विस्तार, पक्ष पर गिरना, और / या माउस द्वारा प्रदर्शित सामान्यीकृत टॉनिक / क्लोनिक बरामदगी (जीटीसीएस) रिकॉर्ड करें।
  8. जल्दी से लेकिन धीरे से कक्ष से माउस उठाओ और इसे चरण 1.6 में तैयार कूलिंग पैड पर रखें।
    नोट: यदि एक माउस Racine पैमाने 5 बरामदगी का अनुभव कर रहा है और अनियंत्रित कूद प्रदर्शन कर रहा है, तो गर्मी कक्ष से जानवर को उठाना मुश्किल हो सकता है और बाहर कूलिंग पैड पर स्थानांतरित किया जा सकता है। हालांकि, एक विशिष्ट गर्मी-प्रेरित जब्ती 30 s से 60 s के बीच रहती है इस प्रकार, माउस को गर्मी-कक्ष से बाहर निकाला जाना चाहिए और गर्मी-प्रेरित जब्ती प्रकरण की शुरुआत के 60 s के भीतर कूलिंग पैड पर रखा जाना चाहिए।
  9. माउस शरीर के तापमान को 36-37 डिग्री सेल्सियस तक नीचे आने के लिए प्रतीक्षा करें, इसे एक वसूली पिंजरे में स्थानांतरित करने से पहले। एक समय में केवल एक माउस को एक वसूली पिंजरे में रखा जाता है।
    नोट: चूहों को मिश्रण न करें जो अभी तक माउस के साथ गर्मी-प्रेरित स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले हैं जो पहले से ही गर्मी-प्रेरित जब्ती प्रयोग परीक्षण का अनुभव कर चुके हैं।
  10. धीरे से और ध्यान से, माउस से रेक्टल जांच को हटाने के लिए कैंची की एक जोड़ी के साथ माउस पूंछ और रेक्टल जांच तार के बीच टेप को काटें।
  11. अगले परीक्षण के लिए तैयार रखने के लिए 70% अल्कोहल और नरम ऊतक पोंछे के साथ मलाशय की जांच की धातु की नोक को साफ करें।
  12. वसूली पिंजरे में माउस का निरीक्षण करना जारी रखें जब तक कि यह माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस करने से पहले सामान्य गतिविधि (चलना, सौंदर्य, आदि) को फिर से शुरू नहीं करता है। यह इस माउस के लिए प्रयोग परीक्षण के अंत को चिह्नित करता है।
  13. परख के बाद पशु की स्थिति रिकॉर्ड-जीवित और परीक्षण सत्र या मृत से बरामद. अनियंत्रित कूद और सामान्यीकृत टॉनिक / क्लोनिक दौरे से जुड़े उच्च तीव्रता वाले दौरे कभी-कभी माउस की मृत्यु के परिणामस्वरूप हो सकते हैं।
  14. यदि एक माउस 30 मिनट की अवलोकन अवधि के भीतर गर्मी-प्रेरित दौरे का अनुभव नहीं करता है या माउस के शरीर का तापमान 44 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, तो माउस को गर्मी कक्ष से हटा दें और माउस के शरीर का तापमान 36-37 डिग्री सेल्सियस तक लौटने तक शीतलन पैड पर रखें।
  15. माउस गर्मी कक्ष के तापमान को 50 डिग्री सेल्सियस पर रीसेट करें और इसे तब तक संतुलित करने की अनुमति दें जब तक कि डिजिटल तापमान नियंत्रक पर प्रदर्शन तापमान 50 डिग्री सेल्सियस नहीं दिखाता है।
  16. अलग-अलग माउस परीक्षणों के बीच कोब बिस्तर बदलें।
  17. अनुभाग 2 में वर्णित के रूप में स्क्रीनिंग परीक्षण के लिए अगले माउस को तैयार करें और अनुभाग 3 से चरणों को दोहराएँ।

4. जानवरों Euthanizing

  1. यद्यपि अधिकांश जानवर गर्मी-प्रेरित दौरे के बाद ठीक हो जाते हैं, हमारे अनुभव में, कुछ चूहों को गर्मी से प्रेरित दौरे के 24-48 घंटों के भीतर अपने घर के पिंजरे में SUDEP (EPilepsy में अचानक अस्पष्टीकृत मौत) से गुजरना पड़ता है। 30 मिनट के परीक्षण के बाद गर्मी से प्रेरित दौरे के लिए व्यक्तिगत रूप से सभी चूहों पर स्क्रीनिंग का समापन करने के बाद, संस्था के आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार सभी चूहों को euthanize करें।

5. गर्मी प्रेरित जब्ती डेटा का विश्लेषण

  1. जानवरों के एक समूह की स्क्रीनिंग को पूरा करने के बाद, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके दौरे दिखाने वाले किसी दिए गए जीनोटाइप में चूहों के प्रतिशत की गणना करें:
    Equation 1
  2. उस जीनोटाइप में सभी चूहों के जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान (चरण 3.7 में नोट किया गया) के औसत से किसी दिए गए जीनोटाइप के भीतर चूहों के औसत जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान का अनुमान लगाएं जो गर्मी-प्रेरित दौरे का प्रदर्शन करते हैं।
  3. जबकि अभी भी पहचान और जीनोटाइप के लिए अंधा किया जा रहा है, एक कंप्यूटर स्क्रीन पर गर्मी प्रेरित जब्ती परख स्क्रीनिंग के दौरान माउस में से प्रत्येक के वीडियो रिकॉर्डिंग को फिर से चलाने के लिए जब्ती मुकाबलों की गंभीरता स्कोर.
  4. पिछले अध्ययन13,14 द्वारा वर्णित संशोधित Racine scale13 का उपयोग करके गर्मी-प्रेरित जब्ती व्यवहार प्रदर्शित करने वाले व्यक्तिगत माउस को स्कोर दें। विवरण के लिए तालिका 1 देखें।
  5. यदि एक माउस, गर्मी से प्रेरित दौरे का अनुभव करते हुए, केवल सिर हिलाता हुआ दिखाता है, तो इसे 2 का स्कोर दें। यदि एक माउस सिर हिलाने के साथ एक जब्ती प्रकरण शुरू करता है, लेकिन यह भी forelimb clonus प्रदर्शित करता है, पर गिरने, और / या कूदने से इसे 5 का स्कोर मिलता है।
  6. ऊपर वर्णित के रूप में संशोधित Racine scale13 का उपयोग कर प्रत्येक माउस के लिए अधिकतम स्कोर रिकॉर्ड करें।
  7. किसी दिए गए जीनोटाइप में सभी चूहों द्वारा प्रदर्शित अधिकतम रैसिन स्कोर का एक स्कैटर ग्राफ प्लॉट करें।
  8. सांख्यिकीय रूप से विभिन्न माउस समूहों के बीच अधिकतम रैसीन स्कोर की तुलना एक विधि के रूप में करें ताकि गर्मी-प्रेरित दौरे जैसे व्यवहार संबंधी दौरे की गंभीरता को निर्धारित किया जा सके।
    नोट: विभिन्न उत्परिवर्ती चूहों के समूहों या जीनोटाइप के बीच जब्ती विशेषताओं की तुलना करने के लिए रैसिन स्कोर सहायक हैं। यह उम्मीद की जाती है कि जंगली-प्रकार के चूहों को गर्मी-प्रेरित दौरे से नहीं गुजरना होगा और रैसिन स्कोर तुलना के लिए विचार नहीं किया जाना चाहिए।
  9. प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, यह निर्धारित करने के लिए उचित सांख्यिकीय विश्लेषण करें कि जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों के बीच दौरे का प्रदर्शन करने वाले चूहों का प्रतिशत, और उनके औसत जब्ती दहलीज तापमान मूल्य एक दूसरे से काफी अलग हैं या नहीं।
Racine स्कोर जब्ती विशेषताएं
0 कोई बरामदगी नहीं
1 मुंह और चेहरे की गतिविधियों
2 सिर हिलाना
3 फोरलिम्ब क्लोनस, आमतौर पर एक अंग
4 पालन के साथ फोरलिम्ब क्लोनस
5 सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनिक जब्ती, पालन, कूद, पर गिर

तालिका 1: Racine स्कोर.

Representative Results

ज्वर जब्ती उत्परिवर्तन वाले पशु मॉडल को ऊंचा शरीर के तापमान पर गर्मी से प्रेरित दौरे से गुजरने की उम्मीद है जो जंगली-प्रकार के कूड़े के साथियों में दौरे को प्रेरित नहीं करते हैं। SCN1A उत्परिवर्तन को ज्वर के दौरे से जोड़ा गया है, जिसमें K1270T GEFS + रोगी शामिल हैं, जो ज्वर और एफेब्राइल दोनों सामान्यीकृत दौरे प्रदर्शित करते हैं। हमने CRISPR उत्पन्न SCN1A K1270T GEFS + उत्परिवर्ती चूहों को हाल ही में दो आनुवंशिक पृष्ठभूमि में गर्मी के दौरे की घटना के लिए एक अध्ययन 14 में वर्णित किया है - जब्ती प्रतिरोधी 129X1 / SvJ (129X1) और जब्ती अतिसंवेदनशील C57BL / NJ (B6N) पृष्ठभूमि। माउस हीट चैंबर में आयु मिलान किए गए जंगली प्रकार के कूड़े के साथी जो किसी भी जीईएफएस + उत्परिवर्तन को हार्बर नहीं करते हैं और इस प्रकार, गर्मी-प्रेरित दौरे को प्रदर्शित करने की उम्मीद नहीं है, नियंत्रण समूह के रूप में कार्य करते हैं। समय के साथ शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर का मूल्यांकन परख के दौरान हर मिनट दर्ज किए गए चूहों के औसत शरीर के तापमान की साजिश रचकर किया गया था। विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों और जंगली प्रकार के कूड़े के साथियों के बीच शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर में कोई अंतर नहीं था, जो संबंधित 129X1 और B6N आनुवंशिक पृष्ठभूमि (चित्रा 2B, C) में परीक्षण किया गया था। इससे पता चलता है कि थर्मोरेगुलेशन K1270T GEFS + विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों में नहीं बदला गया है।

129X1 (n = 15) या B6N (n = 9) आनुवंशिक पृष्ठभूमि से सभी विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों ने गर्मी से प्रेरित दौरे (चित्रा 2 डी) का प्रदर्शन किया। 129X1 समृद्ध पृष्ठभूमि (एन = 13) में जंगली प्रकार के चूहों में से कोई भी गर्मी-प्रेरित दौरे (चित्रा 2 डी) का प्रदर्शन नहीं करता है। इसके विपरीत, जब्ती संवेदनशील B6N पृष्ठभूमि में परीक्षण किए गए चूहों के एक तिहाई (n = 9 चूहों में से 3) ने गर्मी-प्रेरित दौरे का प्रदर्शन किया। सांख्यिकीय तुलना से पता चलता है कि गर्मी से प्रेरित बरामदगी का प्रदर्शन करने वाले विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों का प्रतिशत 129X1 और B6N आनुवंशिक पृष्ठभूमि दोनों में उनके संबंधित जंगली-प्रकार के समकक्ष चूहों की तुलना में काफी अधिक था (चित्रा 2 डी, फिशर का सटीक परीक्षण, 129X1 पी < 0.0001); B6NJ p = 0.009)। 129X1 और B6N आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों के बीच औसत जब्ती दहलीज तापमान समान था। 129X1 उत्परिवर्ती चूहों में 42.6 ± 0.20 डिग्री सेल्सियस का औसत जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान होता है, जो B6N चूहों में देखे गए 42.7 ± 0.06 डिग्री सेल्सियस के औसत जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान से काफी अलग नहीं था (चित्रा 2E; दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड छात्र का टी-टेस्ट, पी = 0.782)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि गर्मी से प्रेरित दौरे का प्रदर्शन करने वाले तीन B6N जंगली-प्रकार के चूहों का औसत जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान 43.7 ± 0.08 डिग्री सेल्सियस था और B6N विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों द्वारा प्रदर्शित 42.7 ± 0.06 डिग्री सेल्सियस की औसत जब्ती सीमा से काफी अधिक था (चित्रा 2E, दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड छात्र का टी-टेस्ट, पी < 0.0001)।

कक्ष के plexiglass सामने यह परख है कि बाद में एक संशोधित Racine पैमाने पर प्रत्येक माउस में जब्ती गंभीरता के लिए स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के दौरान निरंतर वीडियो रिकॉर्डिंग करने के लिए संभव बनाता है के रूप में पहले वर्णित 14,20. एक ठेठ परख के दौरान, विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों vocalization और / या सिर सिर सिर (Racine स्कोर 2) के साथ गर्मी प्रेरित दौरे प्रदर्शित करेंगे, और तेजी से forelimb क्लोनस के लिए संक्रमण, पक्ष पर गिरने, कूद, hindlimb विस्तार, और / या सामान्यीकृत टॉनिक / क्लोनिक बरामदगी (Racine स्कोर 3-5) जब शरीर का तापमान के बारे में 42 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया. अधिकतम Racine स्कोर उत्परिवर्ती चूहों के बीच सबसे गंभीर गर्मी प्रेरित जब्ती व्यवहार का प्रतिनिधित्व करता है। 129X1 समृद्ध पृष्ठभूमि (n = 15) में विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों का अधिकतम रेसीन स्कोर B6N (n = 9) आनुवंशिक पृष्ठभूमि (चित्रा 2F) में विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों से अलग नहीं है; मान-व्हिटनी परीक्षण, पी > 0.9999)। इससे पता चलता है कि K1270T GEFS + उत्परिवर्ती चूहों में गर्मी-प्रेरित जब्ती व्यवहार विशेषताएं तनाव पृष्ठभूमि से स्वतंत्र हैं।

एक साथ लिया गया, डेटा प्रदर्शित करता है कि सभी उत्परिवर्ती चूहे समान आवृत्ति, जब्ती दहलीज तापमान और व्यवहारिक जब्ती गंभीरता के साथ तनाव-स्वतंत्र तरीके से गर्मी-प्रेरित दौरे प्रदर्शित करते हैं। जंगली प्रकार के कूड़े के अधिकांश साथी 44 डिग्री सेल्सियस पर या उससे नीचे इस तरह के दौरे का प्रदर्शन नहीं करते हैं। एक जब्ती संवेदनशील बी 6 एन पृष्ठभूमि में जंगली प्रकार के नियंत्रण चूहों के बारे में एक तिहाई ने गर्मी-प्रेरित दौरे (संभवतः आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रभावों के कारण) प्रदर्शित किया था, लेकिन जब्ती दहलीज तापमान एक ही पृष्ठभूमि में उत्परिवर्ती चूहों की तुलना में काफी अधिक था। इन परिणामों से पता चलता है कि B6N आनुवंशिक पृष्ठभूमि में उत्परिवर्ती चूहों को SCN1A GEFS + उत्परिवर्तन के कारण कम तापमान थ्रेसहोल्ड पर गर्मी-प्रेरित दौरे के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कोई मिर्गी उत्परिवर्ती चूहों में गर्मी-प्रेरित दौरे का मूल्यांकन कर सकता है और जंगली-प्रकार के कूड़े के साथी चूहों से अलग कर सकता है, जो या तो गर्मी-प्रेरित दौरे से नहीं गुजरते हैं या काफी अधिक तापमान पर गर्मी के दौरे प्रदर्शित करते हैं।

Figure 2
चित्र 2: उत्परिवर्ती चूहे गर्मी-प्रेरित दौरे का प्रदर्शन करते हैं। (ए) चूहों में गर्मी-प्रेरित दौरे की व्यवहारिक स्क्रीनिंग के लिए हीटिंग प्रोटोकॉल। (B-C) जंगली प्रकार (Scn1a + / + - काले त्रिकोण) और विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती (Scn1aKT / + - नारंगी हलकों) चूहों में दो आनुवंशिक पृष्ठभूमि 129X1 और B6N में चूहों में समय भर में चूहों के शरीर का औसत तापमान, क्रमशः। (घ) दोनों आनुवांशिक पृष्ठभूमि में ऊष्मा-प्रेरित दौरे दिखाने वाले चूहों का प्रतिशत। जंगली प्रकार (Scn1a +/+) और विषमयुग्मजी (Scn1aKT/+) चूहों को क्रमशः काले और नारंगी सलाखों द्वारा दर्शाया जाता है। 129X1 और B6N पृष्ठभूमि में विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती क्रमशः नारंगी ठोस सलाखों और काली धारियों के साथ नारंगी सलाखों में दिखाए गए हैं। (ई) दोनों उपभेदों में जंगली-प्रकार (Scn1a +/+) और विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती (Scn1aKT/+) चूहों में गर्मी-प्रेरित बरामदगी के लिए जब्ती तापमान दहलीज। (च) दोनों आनुवांशिक पृष्ठभूमि में विषमयुग्मजी (Scn1aKT/+) चूहों द्वारा प्रदर्शित ऊष्मा-प्रेरित बरामदगी के अधिकतम रैसीन स्कोर का तितर-बितर वितरण। प्रत्येक बिंदु एक माउस में अधिकतम Racine स्कोर का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक जीनोटाइप में जानवरों की संख्या कोष्ठक के भीतर दिखाई जाती है। पैनल बी-एफ में दिखाए गए डेटा का अर्थ एसई.M ± है। इस आंकड़े को दास एट अल. 2021, eNeuro14 में चित्रा 3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हम चूहों में गर्मी से प्रेरित दौरे की घटना के लिए स्क्रीन करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो मानव रोगियों में ज्वर के दौरे के व्यवहार के बराबर है। परख कई मापदंडों का मूल्यांकन करता है - जिसमें दौरे, जब्ती सीमा, एक रैसिन पैमाने पर दौरे की गंभीरता दिखाने वाले चूहों के प्रतिशत सहित, शरीर के तापमान में वृद्धि के लिए नियंत्रण और परीक्षण चूहों के समूहों की संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम में माउस के शरीर के तापमान की लगातार निगरानी करते हुए कक्ष में गर्मी को बढ़ाना शामिल है। यह आवश्यक है कि इन assays में चूहों का अनुभव होने वाला अधिकतम शरीर का तापमान 44 डिग्री सेल्सियस है क्योंकि जंगली प्रकार के जानवर शरीर के तापमान >44 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी से प्रेरित दौरे से गुजर सकते हैं। सामान्य संज्ञाहरण या एनाल्जेसिक के साथ pretreatment जानवरों के मुख्य शरीर के तापमान को कम कर सकता है या थर्मोरेगुलेशन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो बदले में जब्ती दहलीज तापमान डेटा संग्रह को भ्रमित करेगा। इस प्रकार, इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के तहत चूहों को 30 मिनट की परीक्षण विंडो के दौरान इन एजेंटों के साथ प्रदान नहीं किया जा सका। सभी प्रक्रियाओं को संस्थान की IACUC समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। परख के दौरान माउस के कोर शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी सुनिश्चित करने के लिए, सुरक्षित रूप से चूहों की पूंछ के लिए मलाशय तापमान जांच टेप। यदि परख के दौरान, माउस शरीर का तापमान माउस कक्ष के तापमान को बढ़ाने के बाद भी लंबे समय तक अपरिवर्तित रहने के लिए पाया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि रेक्टल तापमान जांच माउस से बाहर नहीं आई है या पूंछ से शिथिल रूप से जुड़ी हुई है।

माउस मॉडल की आनुवंशिक पृष्ठभूमि SCN1A उत्परिवर्तन और औषधीय रूप से प्रेरित बरामदगी 18,25,26,27 के प्रति संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकती है। जैसा कि ऊपर दिए गए परिणामों में चर्चा की गई है, चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि गर्मी से प्रेरित दौरे के लिए उनकी संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकती है। Scn1a K1270T GEFS + उत्परिवर्ती चूहों को दो आनुवंशिक पृष्ठभूमि में परीक्षण किया गया था - 129X1 और B6NJ, और जब्ती संवेदनशील B6NJ पृष्ठभूमि में जंगली प्रकार के चूहों (33%) का एक छोटा प्रतिशत, गर्मी-प्रेरित दौरे से गुजरने के लिए भी देखा गया था। हालांकि, विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती Scn1aKT / + चूहों की तुलना में, B6NJ जंगली प्रकार के चूहों ने काफी अधिक तापमान सीमा पर गर्मी-प्रेरित दौरे का अनुभव किया। यह पुष्टि करता है कि आनुवंशिक उत्परिवर्तन (Scn1a K1270T) जिसे CRISPR नॉक-इन द्वारा पेश किया गया था, उत्परिवर्ती चूहों को हाइपरथर्मिया-प्रेरित दौरे के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है।

इस प्रोटोकॉल को अपनाने के कई फायदे हैं, जिन्हें नीचे संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। सबसे पहले, सूखी हवा या गर्म लैंप की धारा के उपयोग के विपरीत, एक संलग्न स्थान के भीतर स्थापित एक तापमान-नियंत्रित मजबूर हवा प्रयोगकर्ता को वांछित दर पर परीक्षण क्षेत्र को गर्म करने पर अधिक नियंत्रण प्रदान करती है। हीटिंग प्रोटोकॉल में चरणों को आसानी से शुरुआती तापमान, प्रत्येक चरण की अवधि, आदि को बढ़ाने / कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है ताकि पुराने चूहों को स्क्रीन किया जा सके जो चूहों जैसे भारी या बड़े कृन्तक हैं। दूसरा, संलग्न रेक्टल जांच के माध्यम से माउस शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी, परख के दौरान व्यक्तिगत माउस में शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर के बारे में मूल्यवान जानकारी देता है। यह प्रयोगकर्ता को बारीकी से यह देखने की अनुमति देता है कि माउस में तापमान परिवर्तन की दर 0.25-0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट (जो जानवरों के लिए तनावपूर्ण हो सकती है) से अधिक नहीं है, जब इस प्रोटोकॉल को अन्य परीक्षण एरेनास के अनुकूल बनाया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न चूहों के समूहों में समय के साथ शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर थर्मोरेग्युलेट करने की उनकी क्षमता पर प्रकाश डाल सकती है और यह समझने में सहायक हो सकती है कि क्या ज्वर की जब्ती उत्परिवर्तन के कारण चूहों में थर्मोरेगुलेशन भी बदल जाती है। तीसरा, निरंतर शरीर के तापमान की निगरानी यह सुनिश्चित करती है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान माप सटीक हैं, क्योंकि वे माउस द्वारा अनुभव किए गए जब्ती के पहले मुकाबले के साथ समवर्ती रूप से दर्ज किए जाते हैं। यदि जानवर के शरीर के तापमान की लगातार निगरानी नहीं की जाती है या जानवर को परीक्षण क्षेत्र से बाहर निकालने के बाद जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान मापा जाता है, तो जब्ती थ्रेशोल्ड मान दौरे के बाद चूहों को संभालने में लगने वाले समय के कारण भिन्न हो सकते हैं। अंत में, यह विधि मानव रोगियों में ज्वर के दौरे की नकल करने के लिए चूहों में बुखार (रोगजनकों को इंजेक्ट करके) को प्रेरित करने के लिए आक्रामक तरीकों का उपयोग करने की आवश्यकता को दरकिनार करती है।

इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक यह है कि गर्मी से प्रेरित दौरे के लिए किशोर (उम्र में पी 30 से कम) चूहों को स्क्रीन करना मुश्किल है। प्रोटोकॉल को वयस्क चूहों (P30-P40 और उससे ऊपर) की संवेदनशीलता के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया था, गर्मी- या हाइपरथर्मिया-प्रेरित दौरे के लिए। हमारे अनुभव में, छोटे जंगली-प्रकार के चूहों, विशेष रूप से 15 ग्राम से कम वजन वाले, गर्मी से प्रेरित दौरे से गुजरने की अधिक संभावना रखते हैं, जो अविकसित थर्मोरेगुलेशन तंत्र, शारीरिक थर्मल तनाव, या दोनों के संयोजन के कारण हो सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके किशोर चूहों पर गर्मी-प्रेरित जब्ती स्क्रीन करना आदर्श नहीं है।

भविष्य के अध्ययन जो माउस को गर्मी से प्रेरित दौरे के अधीन करते हुए ईईजी निगरानी को जोड़ते हैं, वे पिछले अध्ययन 19 के समान गर्मी-प्रेरित दौरे के ईईजी जब्ती पैटर्न पर प्रकाश डाल सकते हैं। माउस मस्तिष्क में विशिष्ट क्षेत्रों में न्यूरोनल गतिविधि को मस्तिष्क के ऊतकों की कटाई के बाद ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री-आधारित अध्ययनों के संयोजन से पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, ज्वर के दौरे को कम करने पर कीटो आहार जैसे प्रतिबंधात्मक आहार के प्रभावों का मूल्यांकन कीटो-फेड चूहों और सामान्य चाउ-फेड चूहों को गर्मी-प्रेरित जब्ती प्रोटोकॉल के अधीन करके किया जा सकता है। इसी तरह, मिर्गी दवा स्क्रीनिंग प्रतिमानों को उम्मीदवार विरोधी मिर्गी की दवाओं का परीक्षण करने और पहचानने के लिए विकसित किया जा सकता है जो वाहन-खिलाया या नियंत्रण चूहों की तुलना में दवा-खिलाया या इलाज किए गए चूहों में गर्मी-प्रेरित दौरे को सुधारते हैं या दबाते हैं।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम अनुकूलित माउस गर्मी कक्ष के निर्माण में उनकी मदद के लिए कॉनर जे स्मिथ को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम परख विकास के शुरुआती चरणों के दौरान हीटिंग प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने के लिए O'Dowd प्रयोगशाला के सदस्यों, लिशा ज़ेंग और एंड्रयू साल्गाडो की मदद को स्वीकार करते हैं। हम पांडुलिपि के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया के कुछ हिस्सों की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए डैनी बेनाविड्स और कुमार पेरिनबाम को भी धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को NIH अनुदान (NS083009) द्वारा समर्थित किया गया था, जो D.O.D. को सम्मानित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axial fan Farnam AF20-200-120-xx10-3.1 Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan
Digital temperature controller Inkbird ITC-100RH Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple
Mouse rectal temperature probe ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc RET-3 Mouse rectal temperature probe with thermometer

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मिर्गी के माउस मॉडल में गर्मी प्रेरित दौरे के लिए एक व्यवहार स्क्रीन
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