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Biology

एकल-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके इंटरबैक्टीरियल प्रतियोगिता का मात्राकरण

Published: September 2, 2021 doi: 10.3791/62851
Automatic Translation
1, 1
1Department of Earth, Marine, and Environmental Sciences, University of North Carolina

Summary

यह पांडुलिपि सहसंस्कृति में बैक्टीरियल प्रतियोगिता की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एकल-कोशिका फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन करती है।

Abstract

इंटरबैक्टीरियल प्रतियोगिता माइक्रोबायोम की संरचना और कार्य को सीधे प्रभावित कर सकती है। यह काम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का वर्णन करता है जिसका उपयोग एकल-कोशिका स्तर पर विभिन्न जीवाणु उपभेदों के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की कल्पना और मात्रा के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग करके ईमानदार और उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, लाइव-सेल और समय-चूक इमेजिंग तकनीकों, और मात्रात्मक छवि विश्लेषण दोनों पर स्लाइड तैयारी में उन्नत दृष्टिकोणों के लिए तरीके प्रदान करता है। इस पांडुलिपि में दृष्टिकोण दो कॉइनक्यूबैटेड उपभेदों के लिए समय के साथ क्षेत्र में परिवर्तन को मापने के द्वारा सहजीवी विब्रियो फिचेरी आबादी के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की मात्रा को रेखांकित करता है जो स्थिर प्लाज्मिड से विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं। बैक्टीरियल मॉडल सिस्टम में इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का वर्णन किया गया है जिसके लिए विभिन्न विकास स्थितियों की आवश्यकता होती है। यद्यपि यहां वर्णित परख वी फिचेरीके लिए अनुकूलित स्थितियों का उपयोग करती है, यह दृष्टिकोण अत्यधिक प्रजनन योग्य है और विविध माइक्रोबायोम से खेती करने योग्य आइसोलिट के बीच प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

यह लेख फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-कोशिका स्तर पर बैक्टीरियल प्रतिस्पर्धा की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि को रेखांकित करता है। माइक्रोबियल समुदायों की संरचना और कार्य को अक्सर रोगाणुओं के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत द्वारा आकार दिया जाता है, और कई मामलों में इन बातचीत की विशेषता के लिए सिक्का1,2, 3,4, 5,6,7, 8में विभिन्न जीवाणु उपभेदों को देखने की आवश्यकता होती है . परंपरागत रूप से, जीवाणु प्रतियोगिता को जनसंख्या स्तर पर अवरोधक की कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना करके निर्धारित किया जाता है और सिक्का संक्रमण अवधि2, 9से पहले और बाद में लक्ष्य उपभेदों का पता लगायाजाताहै। माइक्रोबियल प्रतिस्पर्धा के तंत्र मोटे तौर पर बैक्टीरिया के बीच वितरित किए जाते हैं और लक्षित कोशिकाओं 10 , 11 ,12,13,14 , 15 ,16,17,18 ,19 को बाधित करने के लिए या तो प्रसार या सेल-सेल संपर्क पर निर्भर हो सकते हैं।

यद्यपि जनसंख्या स्तर पर कॉइनक्यूबेशन में बैक्टीरियल उपभेदों को अक्सर देखा जाता है, यह पांडुलिपि बैक्टीरियल प्रतियोगिता के एकल-कोशिका मात्राकरण के लिए एक परख को रेखांकित करती है। इसके अलावा, इस काम में अन्य जीवाणु प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए सुझाव शामिल हैं। जबकि इस लेख में विशिष्ट तकनीकों का उपयोग सहजीवी जीवाणु विब्रियो फिचेरी20, 21, 22के उपभेदों के बीच संपर्क-निर्भर इंट्रास्पेसिफिक प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए कियाजाताहै, उन्हें कई जीवों के बीच प्रतिस्पर्धा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह लेख सीधे और उल्टे दोनों माइक्रोस्कोप पर स्लाइड सेटअप के लिए निर्देश प्रदान करता है, और सभी विश्लेषण को ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी23 का उपयोग करके वर्णित किया गया है ताकि विधि का उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा विभिन्न इमेजिंग सेटअप और विश्लेषण कार्यक्रमों तक पहुंच के साथ किया जा सके। दोनों जनसंख्या और एकल सेल स्तर पर माइक्रोबियल प्रतियोगिता का अध्ययन करने के महत्व को देखते हुए, इस विधि शोधकर्ताओं के लिए एक मूल्यवान संसाधन के लिए प्रतिस्पर्धी बातचीत की मात्रा, विशेष रूप से उन है कि मालिकाना विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग नहीं है होगा ।

Protocol

1. बैक्टीरियल उपभेदों का अनुकूलन

  1. एकल सेल बैक्टीरियल प्रतियोगिता परख के लिए दो जीवाणु उपभेदों का चयन करें। यहां, वी फिचेरी के दो उपभेदों का उपयोग किया जाता है: एक लक्ष्य तनाव (ES11424)और एक अवरोधक तनाव (MJ1125)जो गुणसूत्र द्वितीय (T6SS2)1पर टाइप VI स्राव प्रणाली का उपयोग करके लक्ष्य तनाव को मारने के लिए जाना जाता है, जो एक संपर्क-निर्भर हत्या तंत्र है।
  2. प्रयोग के लिए उचित नियंत्रण निर्धारित करें। इस उदाहरण में, उचित नियंत्रण के लिए दोनों जंगली प्रकार और T6SS उत्परिवर्ती अवरोधक तनाव लक्ष्य तनाव के साथ पैदा करने के लिए T6SS-मध्यस्थता हत्या के प्रभाव की मात्रा निर्धारित है ।
    नोट: अतिरिक्त नियंत्रणों में एक लक्ष्य तनाव शामिल हो सकता है जो T6SS-निर्भर हत्या या T6SS गतिविधि 1 को बहाल करने के लिए ट्रांस में उत्परिवर्तित जीन की जंगली प्रकार की प्रतियां व्यक्त करने के लिए आवश्यक प्रतिरक्षा जीन(एस)को व्यक्त करता है ।
  3. जब संभव हो, माइक्रोस्कोप पर नेत्रहीन तनाव प्रकार को अलग करने के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, जीएफपी या आरएफपी) के लिए स्थिर प्लाज्मिड्स एन्कोडिंग जीन के साथ उपभेदों को बदलें। यहां, अवरोधक तनाव को जीएफपी-एन्कोडिंग प्लाज्मिड (pVSV102) के साथ टैग किया गया है, और लक्ष्य तनाव को डीएसरेड-एन्कोडिंग प्लाज्मिड (pVSV208)26के साथ टैग किया गया है।
    नोट: यदि स्थिर प्लाज्मिड का उपयोग करना संभव नहीं है, तो फ्लोरोसेंट टैग को दृश्य27, 28के लिए बैक्टीरियल गुणसूत्र पर पेश किया जा सकता है।
  4. प्रारंभिक अनुकूलन अवधि के दौरान, प्रत्येक फ्लोरोसेंट फिल्टर के तहत टैग किए गए उपभेदों की छवि क्लोनल संस्कृतियां जिनका उपयोग प्रयोग के दौरान किया जाएगा ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं केवल इच्छित चैनल में दिखाई देती हैं। उदाहरण के लिए, यह सुनिश्चित करें कि GFP-टैग किया गया तनाव केवल फिटसी चैनल में दिखाई दे रहा है।

2. एगर उठे पैड की तैयारी

  1. 2% कम पिघलाएक (w/v) को mPBS में भंग करके एगरेग्यारेड पैड समाधान तैयार करें। समाधान को माइक्रोवेव और भंवर में संक्षेप में गर्म करें जब तक कि एगर उठी पूरी तरह से भंग न हो जाए। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखकर इस समाधान को गर्म रखें। एगरेज पैड तैयार करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
    नोट: यहां, mPBS मानक 1x PBS के लिए 20 g/L NaCl जोड़कर तैयार किया गया था ।
  2. पांच बार एक गिलास स्लाइड के चारों ओर प्रयोगशाला टेप का एक टुकड़ा लपेटें । इस प्रक्रिया को एक ही स्लाइड पर दूसरी बार दोहराएं ताकि टेप के दो टुकड़ों के बीच की दूरी कवर्लिप(चित्रा 1 ए)की चौड़ाई से थोड़ी छोटी हो। उदाहरण के लिए, यदि 25 मिमी2 कवर्लिप्स का उपयोग करते हैं, तो टेप के टुकड़ों को लगभग 20 मिमी अलग किया जाना चाहिए।
    नोट: जबकि स्लाइड के आसपास टेप लपेटा जाता है की संख्या agarose पैड की मोटाई को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, यह महत्वपूर्ण है कि टेप की परतों स्लाइड के दोनों ओर एक ही ऊंचाई है ताकि agarose पैड फ्लैट रहता है ।
  3. पिपेट गर्म टेप के दो टुकड़ों के बीच समाधान और तुरंत एक कवरलिप के साथ ऊपर इतना है कि यह टेप के टुकड़ों पर टिकी हुई है । इससे यह सुनिश्चित होगा कि एगरेग्याड पैड की सतह सपाट बनी रहे। इस चरण में एगर उठे समाधान की मात्रा पर्याप्त होनी चाहिए कि कवरस्लिप तरल के साथ संपर्क करता है और एगर उठे समाधान में किसी भी बुलबुले को धक्का देता है। इस विशेष सेटअप के लिए, गर्म एगरेज़ के 200 माइक्रोन पर्याप्त हैं।
  4. अगेन्ड पैड को कॉइनक्यूबेशन परख से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जमना चाहिए। चरण 2.2 लगभग 20मिमी2 के एग्राजेड पैड का उत्पादन करेगा।
  5. इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले चार, 5 एमएम2 पैड में रेजर ब्लेड के साथ इस एगर उठे पैड को काटें।
    नोट: Agarose पैड प्रयोग से पहले एक सप्ताह तक बनाया जा सकता है और सुखाने को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ सील एक खाली, बाँझ पेट्री प्लेट में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

3. सह-इनक्यूबेशन के लिए उपभेदों को तैयार करें

  1. प्रत्येक तनाव बाहर लकीर-80 डिग्री सेल्सियस से सिक्का परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एलबीएस आगर प्लेटों पर उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक और 24 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट । इस उदाहरण के लिए, तीन उपभेदों का उपयोग किया जाता है: जंगली प्रकार के अवरोधक तनाव, प्रकार VI स्राव प्रणाली उत्परिवर्ती, और लक्ष्य तनाव।
  2. अगले दिन, प्रत्येक तनाव से दो उपनिवेशों को उठाकर जैविक डुप्लिकेट में रातोंरात संस्कृतियों की शुरुआत करें और उन्हें एलबीएस माध्यम में पुनर्व्यवसंतवत करें उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 24 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. अगले सुबह, उपसंस्कृति प्रत्येक जैविक एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ताजा एलबीएस माध्यम में 1:1000 दोहराने और 4-5 घंटे के लिए मिलाते हुए या जब तक कोशिकाओं ~१.५ के एक OD ६०० तक पहुंचने के साथ 24 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    नोट: चरण 3.1, 3.2 और 3.3 के समय को विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि उनकी विकास दर काफी भिन्न हो सकती है। इस परख के लिए, कोशिकाओं को सिक्का परख की शुरुआत में मध्य लॉग चरण में होने का लक्ष्य था।

4. कॉइनक्यूबेट बैक्टीरियल उपभेदों

  1. चरण 3.3 से मध्य लॉग संस्कृतियों के साथ शुरू, उपाय और सभी नमूनों के लिए 600 एनएम (OD600)पर ऑप्टिकल घनत्व रिकॉर्ड।
  2. एलबीएस माध्यम के साथ संस्कृति को कमजोर करके, वी फिचेरीके लिए लगभग 109 सीएलयू/एमएल से मेल खाती है, जो प्रत्येक नमूने को एक ओडी600 = 1.0 से सामान्य करता है।
  3. एक लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक सामान्यीकृत तनाव के 30 μL जोड़कर मात्रा के आधार पर एक 1:1 अनुपात पर एक साथ दो प्रतिस्पर्धी उपभेदों मिश्रण। भंवर 1-2 एस के लिए मिश्रित तनाव संस्कृति ।
    नोट: कुछ मामलों में, विभिन्न अनुपातों में सहसंस्कृतियों को मिलाना उचित हो सकता है। उदाहरण के लिए, जब एक तनाव दूसरे की तुलना में बहुत तेजी से बढ़ता है, तो प्रतिस्पर्धा का निरीक्षण करने के लिए संख्यात्मक लाभ पर धीमी बढ़ती तनाव को शुरू करना आवश्यक हो सकता है। यदि ऑड600 दोनों उपभेदों के लिए समान सीएलयू/एमएल के अनुरूप नहीं है तो अनुकूलन की भी आवश्यकता हो सकती है।
  4. प्रत्येक जैविक दोहराने और उपचार के लिए चरण 4.3 दोहराएं। यहां दिखाए गए उदाहरण में, इसके परिणामस्वरूप कुल चार मिश्रित-तनाव ट्यूब होंगे: लक्ष्य तनाव के साथ मिश्रित जंगली प्रकार के अवरोधक तनाव के साथ दो जैविक प्रतिकृति और लक्ष्य तनाव के साथ मिश्रित प्रकार VI स्राव प्रणाली उत्परिवर्ती तनाव के साथ दो जैविक प्रतिकृति।
  5. प्रतिस्पर्धी कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए संपर्क के लिए पर्याप्त घने है agar पैड पर सिक्का में हत्या निर्भर, प्रत्येक मिश्रित संस्कृति 3 गुना एक मानक १.५ एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1 मिनट के लिए २१,१३० x gपर, supernatant त्यागने, और 20 μl एलबीएस माध्यम में प्रत्येक गोली reuspending द्वारा ध्यान केंद्रित । प्रत्येक नमूने के लिए दोहराएं।
    नोट: कुछ जीवाणु कोशिकाएं उच्च आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र द्वारा नुकसान के प्रति संवेदनशील होती हैं; ऐसे मामलों में मिश्रित संस्कृति 4600 एक्स जी29पर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज किया जा सकता है . इसके अतिरिक्त, जब संपर्क पर निर्भर प्रतिस्पर्धा की मात्रा निर्धारित करते हैं, तो हत्या का निरीक्षण करने के लिए स्लाइड पर पर्याप्त सेल घनत्व सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। इस लेख में, "भीड़" उपचार, जहां हत्या देखी जाती है, लगभग 10 कोशिकाओं/ अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।

5. स्लाइड सेटअप

  1. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय, एक मानक 1 मिमी ग्लास स्लाइड पर ~ 5 मिमी2 एग्राजेड पैड रखें। एगर उठे पैड पर मिश्रित संस्कृति का स्पॉट 2 माइक्रोन करें और मौके पर #1.5 कवरलिप(25 मिमी 2)रखें। एक उदाहरण के लिए चित्रा 1B देखें।
  2. एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय, 35 मिमी पेट्री डिश के #1.5 कवरलिप नीचे पर मिश्रित संस्कृति के 2 μL को स्पॉट करें और कॉइनक्यूबेशन स्पॉट पर ~5 मिमी 2 एग्राम पैड रखें। एग्राडेड पैड के ऊपर 12 एमएम का सर्कुलर ग्लास कवरलिप रखें। एक उदाहरण के लिए चित्रा 1C देखें।
  3. शेष तीन मिश्रित संस्कृतियों के लिए उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर चरण 5.1 या 5.2 दोहराएं, जिसके परिणामस्वरूप चार स्लाइड या व्यंजन इमेज किए जाते हैं।
  4. स्लाइड 6 कदम करने के लिए आगे बढ़ने से पहले लगभग 5 मिनट के लिए बेंचटॉप पर बैठने के लिए अनुमति दें । यह कोशिकाओं को आगर पैड पर व्यवस्थित करने की अनुमति देता है और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान आंदोलन को समाप्त करता है।

6. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

  1. फोटो-ब्लीचिंग के प्रभाव को कम करने के लिए सफेद प्रकाश (चरण विपरीत या डीआईसी) का उपयोग करके कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करके शुरू करें। एक एकल जीवाणु कोशिका के औसत आकार के आधार पर, 60x या 100x तेल उद्देश्य का उपयोग करें।
  2. प्रत्येक चैनल के लिए एक्सपोजर समय और अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि न्यूनतम पृष्ठभूमि का पता लगाने के साथ उपयुक्त चैनल में कोशिकाएं दिखाई दे सकें।
    नोट: विभिन्न चैनलों के लिए अलग-अलग एक्सपोजर समय का उपयोग करना उचित है, लेकिन किसी दिए गए चैनल के लिए सभी जैविक प्रतिकृति और उपचारों में एक ही एक्सपोजर समय का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए, कम से कम पांच फ़ील्ड ऑफ व्यू (एफओवी) चुनें और चरण 6.2 से अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक उपयुक्त चैनल में छवियां प्राप्त करें (चित्र 2में उदाहरण देखें)। प्रत्येक FOV से XY अंक सहेजें ताकि अंतिम समय बिंदु के दौरान एक ही FOV को इमेज किया जा सके। प्रत्येक समय बिंदु पर एक ही FOV इमेजिंग विश्लेषण चरणों के दौरान लक्ष्य या अवरोधक कोशिकाओं द्वारा कब्जा क्षेत्र के अनुपात का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है।
    नोट: इस उदाहरण में, जीएफपी के फ्लोरेसेंस का पता एक फिल्टर का उपयोग करके 467 - 498 एनएम की उत्तेजन तरंग दैर्ध्य और 513 - 556 एनएम का उत्सर्जन फ़िल्टर है और झूठा रंग का हरा है। डीएसरेड की फ्लोरेसेंस का पता 542 - 582 एनएम की उत्तेजन तरंग दैर्ध्य और 603 - 678 एनएम के उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक फिल्टर का उपयोग करके लगाया जाता है और यह झूठा रंग का मैजेंटा है।
  4. 2 घंटे के बाद, पहले सेव किए गए XY पॉइंट्स (अंजीर 2) का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए चरण6.3 दोहराएं।
    नोट: बाद की छवियों के समय को विभिन्न विकास दर या प्रतिस्पर्धी तंत्र वाले जीवों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

7. फिजी में छवि विश्लेषण

  1. यहां पाए गए निर्देशों का उपयोग करके फिजी इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें: https://imagej.net/Fiji/Downloads
  2. विश्लेषण के लिए फिजी खोलें और छवि फ़ाइलों का आयात करें।
    नोट: ज्यादातर मामलों में । झगड़ा फ़ाइलों का उपयोग छवि विश्लेषण के लिए किया जाएगा, हालांकि कुछ छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर मालिकाना फ़ाइल प्रकारों का उपयोग करके निर्यात करेगा। फिजी अधिकांश मालिकाना फ़ाइल प्रकारों को पहचान सकता है और छवियों को आयात और विश्लेषण किया जा सकता है।
  3. चरण 6.3 और 6.4 में प्राप्त प्रत्येक छवि के लिए, छवि को ग्रेस्केल में परिवर्तित करें, चैनलों को अलग करें, और थ्रेसिंग (सीटीआरएल + शिफ्ट + टी) द्वारा शुरू करें और प्रीप्रोसेस्ड छवि(चित्रा 3 ए,बी)का बाइनरी मास्क बनाएं।
    नोट: यहां, फिजी में डिफ़ॉल्ट थ्रेसहोल्डिंग सेटिंग्स का उपयोग किया जाता है। कुछ मामलों में, उन सेटिंग्स को बदलना आवश्यक हो सकता है, जिस स्थिति में उस प्रयोग में सभी छवियों के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. छवि पर स्केल सेट करें(| का विश्लेषण करें सेट स्केल) माइक्रोस्कोपी सेटअप23के लिए उपयुक्त मूल्यों का उपयोग करते हुए ।
  5. माप सेट करें(| विश्लेषण करें माप निर्धारित करें) और क्षेत्र का चयन करें।
    नोट: यदि वे प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं, तो अन्य माप जोड़े जा सकते हैं. यहां दिखाए गए उदाहरण विश्लेषण के लिए केवल ऑब्जेक्ट एरिया माप की आवश्यकता होती है।
  6. कणों का विश्लेषण करें(| का विश्लेषण करें डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स(चित्रा 3C)का उपयोग कर कणों का विश्लेषण करें। यदि नमूने में मलबे हैं, तो गैर-सेल कणों को फ़िल्टर करने के लिए आकार या गोलाकारता को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। शो | का चयन करें रूपरेखा ताकि इस विश्लेषण के उत्पादन में विश्लेषण किए गए सभी कणों की एक गिने-चुने रूपरेखा(चित्रा 3 डी)शामिल होंगे।
    नोट: चित्रा 3 डी में रूपरेखा की तुलना प्रारंभिक छवि से करना अनुकूलन चरण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि (1) सभी कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा रहा है, और (2) कि किसी भी मलबे को विश्लेषण से बाहर रखा गया है।
  7. आगे के विश्लेषण और रेखांकन के लिए एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में चरण7.4 (चित्रा 3E)से माप निर्यात करें।
  8. प्रयोग के दौरान प्राप्त सभी चैनलों और छवियों के लिए चरण 7.1 - 7.5 दोहराएं।

8. समय के साथ प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र के प्रतिशत की गणना

  1. धारा 7 में विश्लेषण किए गए प्रत्येक दृश्य के लिए, यह सुनिश्चित करें कि निर्यात की गई फ़ाइल में प्रत्येक कण के लिए एक व्यक्तिगत क्षेत्र माप हो, जिसका विश्लेषण किया गया था। लक्ष्य तनाव के फ्लोरेसेंस चैनल के साथ शुरुआत, देखने के प्रत्येक व्यक्तिगत क्षेत्र के लिए योग कण क्षेत्र की गणना । प्रत्येक पांच FOV के साथ दो जैविक प्रतिकृति के लिए, यह प्रत्येक समय बिंदु पर उपचार के प्रति दस राशि क्षेत्रों में परिणाम चाहिए ।
  2. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर प्रत्येक FOV के लिए समय के साथ प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र के प्रतिशत की गणना करें: Equation 1 ()
  3. सभी उपचारों के लिए इस गणना को दोहराएं और प्रत्येक उपचार(चित्रा 4A)के लिए प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र (चरण 8.2 से समीकरण का परिणाम) के प्रतिशत को ग्राफ करें।
  4. निर्धारित करें कि क्या लक्ष्य जनसंख्या (विकास का संकेत) में शुद्ध वृद्धि हुई है, लक्षित जनसंख्या में शुद्ध कमी (मृत्यु का संकेत है), या प्रत्येक उपचार के लिए कोई परिवर्तन (कोई वृद्धि या मृत्यु का संकेत नहीं) है।
    नोट: 100 से अधिक मूल्यों वाले प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र का प्रतिशत शुद्ध लक्ष्य वृद्धि का संकेत देता है, और 100 से कम मूल्य शुद्ध लक्ष्य मृत्यु का संकेत देते हैं। प्रारंभिक लक्ष्य मूल्यों का प्रतिशत है कि १०० पर रहने के लक्ष्य की आबादी में कोई शुद्ध परिवर्तन का संकेत मिलता है । सुझाए गए अनुवर्ती प्रयोगों के लिए चर्चा देखें.

9. समय के साथ प्रारंभिक अवरोधक क्षेत्र के प्रतिशत की गणना

  1. धारा 7 (चित्रा 4B) में अवरोधक तनाव के फ्लोरेसेंस चैनल से एकत्र माप का उपयोग करके इस बार चरण 8.1 से8.3 तक दोहराएं।
  2. यह निर्धारित करें कि क्या अवरोधक जनसंख्या (विकास) में शुद्ध वृद्धि हुई थी; अवरोधक जनसंख्या (मृत्यु) में शुद्ध कमी, या प्रत्येक उपचार के लिए कोई परिवर्तन नहीं। 100 से अधिक मूल्य शुद्ध अवरोधक विकास का संकेत देते हैं, और 100 से कम मूल्य शुद्ध अवरोधक मृत्यु का संकेत देते हैं।

Representative Results

एकल-कोशिका स्तर पर बैक्टीरिया के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमारे अच्छी तरह से स्थापित सीएलयू-आधारित परख1,2को संशोधित करके वी फिचेरी के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया गया था। यह विधि वी फिचेरीके विभिन्न उपभेदों को नेत्रहीन रूप से अलग करने के लिए जीएफपी-और डीएसरेड-एन्कोडिंग स्थिर प्लाज्मिड का उपयोग करती है। ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग करके इस परख से प्राप्त छवियों का विश्लेषण करके इन इंटरैक्शन के प्रतिस्पर्धी परिणामों की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। एक उदाहरण के रूप में, निम्नलिखित प्रयोग वी फिचेरी आइसोले का उपयोग करके किया गया था। एक अवरोधक तनाव ने एक प्लाज्मिड को आश्रय दिया जो जीएफपी को एन्कोड करता है, और एक लक्ष्य तनाव ने एक प्लाज्मिड को आश्रय दिया जो डीएसरेड को एन्कोड करता है। यह देखते हुए कि अवरोधक द्वारा एन्कोडेड T6SS2 एक संपर्क-निर्भर हत्या तंत्र है, उपचार शामिल थे जहां कोशिकाओं को या तो भीड़ (उच्च सेल-सेल संपर्क) या तितर-बितर (कम सेल-सेल संपर्क) एक स्लाइड पर इस परख के अंतिम परिणामों पर प्रयोगात्मक सेटअप के प्रभाव को उजागर करने के लिए किया गया था । नमूना डेटा में, प्रतिस्पर्धी उपभेदों को 1:1 अनुपात में मिलाया गया था और 2 घंटे के लिए एक एगरेज़ पैड पर इनक्यूबेटेड किया गया था, और प्रारंभिक और अंतिम (2 एच) दोनों छवियां ली गई थीं। एक नियंत्रण के रूप में, एक T6SS2 उत्परिवर्ती तनाव भी भीड़ और तितर-बितर दोनों स्थितियों में लक्ष्य तनाव के साथ सिक्का था । प्रत्येक तनाव की संस्कृतियां तैयार की जाती थीं और ऊपर वर्णित सिक्के और स्लाइड तैयार किए गए थे जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया था ।

चित्रा 2 एक प्रारंभिक और अंतिम समय बिंदु पर इमेज्ड दृश्य के एक ही क्षेत्र के साथ प्रत्येक प्रयोगात्मक उपचार के प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों को दिखाता है। प्रत्येक उपचार के लिए, या तो एक जंगली प्रकार अवरोधक या T6SS उत्परिवर्ती तनाव एक GFP-एन्कोडिंग प्लाज्मिड शरण एक 1:1 अनुपात में एक dsRed-एन्कोडिंग प्लाज्मिड शरण लक्ष्य तनाव के साथ मिलाया गया था । इस प्रायोगिक सेटअप के साथ 2 घंटे के सिक्का काल के दौरान, बढ़ती वी फिचेरी कोशिकाएं 1-2 डिवीजनों(चित्रा 2और ग्रे तीर)के माध्यम से जा सकती हैं। चित्रा 2Aमें, सेल सेल संपर्क स्लाइड पर खोलना से पहले मिश्रित संस्कृति ध्यान केंद्रित करके लक्ष्य और अवरोधक के बीच मजबूर किया गया था । कई लक्षित कोशिकाओं को गोल हो जाते है और/या 2 घंटे के दौरान गायब हो जाते हैं, लक्ष्य कोशिकाओं के अनुरूप अवरोधक(चित्रा 2)सफेद तीरद्वारा समाप्त किया जा रहा है । गोलाई या लक्ष्य कोशिकाओं की व्याख्या या lysing के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें । चित्रा 2Bमें, एक ही सिक्का एक स्लाइड पर देखा गया था, मिश्रित संस्कृति ध्यान केंद्रित किए बिना इस बार इतना है कि कोशिकाओं को तितर-बितर रहे और स्लाइड पर उपभेदों के बीच ंयूनतम संपर्क था । यहां, कोई लक्ष्य कोशिकाओं को गायब या गोल करने के लिए मनाया जाता है, यह सुझाव देते हुए कि इस उपचार में लक्ष्य तनाव बाधित नहीं था। चित्रा 2C और चित्रा 2D एक ही भीड़ और तितर-बितर उपचार ऊपर वर्णित दिखाने के लिए, इस बार अवरोधक तनाव के रूप में एक T6SS उत्परिवर्ती का उपयोग कर । लक्ष्य कोशिकाओं को गायब या गोल करने के लिए नहीं देखा गया था जब या तो भीड़ या तितर-बितर स्थितियों में T6SS उत्परिवर्ती के साथ सिक्का, फिर से सुझाव है कि लक्ष्य या तो उपचार में बाधित नहीं था ।

चित्र 3 इस प्रोटोकॉल में प्रतिस्पर्धा की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फिजी विश्लेषण वर्कफ़्लो को दिखाता है। लक्ष्य चैनल से एक प्रतिनिधि छवि(चित्रा 3 ए)का चयन किया गया था और फिजी(चित्रा 3 बी)में डिफ़ॉल्ट सीमा सेटिंग्स का उपयोग करके एक बाइनरी मास्क बनाया गया था। इस माइक्रोस्कोपी सेटअप के लिए छवि पैमाने को उचित रूप से निर्धारित किया गया था। कणों का विश्लेषण आकार पैरामीटर = 0 - अनंत, परिपत्रता पैरामीटर = 0.00 - 1.00 का उपयोग करके किया गया था, और शो आउटलाइन का चयन किया गया था(चित्रा 3C)। इस कण विश्लेषण के परिणामों को प्रत्येक कण(चित्रा 3 डी)की एक गिने-चुने रूपरेखा के रूप में दिखाया गया है, और कण संख्या, फ़ाइल नाम (लेबल), और μm2 (क्षेत्र)(चित्रा 3E)में कण क्षेत्र के लिए स्तंभों के साथ एक तालिका के रूप में दिखाया गया है।

चित्र 4में, चित्रा 3E से प्राप्त डेटा को ग्राफ किया जाता है और विश्लेषण किया जाता है। चित्रा 4Aमें, अंतिम समय बिंदु पर प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र का प्रतिशत चरण 8.2 के अनुसार प्रत्येक उपचार के लिए प्रस्तुत किया जाता है। यदि प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र का प्रतिशत 100 से अधिक है, तो यह लक्ष्य (यानी, विकास) में शुद्ध वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है और उन परिस्थितियों में मनाया जाता है जहां लक्षित जनसंख्या को काफी संकोच नहीं किया जाता है। हालांकि, यदि प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र का प्रतिशत 100 से कम है, तो यह परिणाम लक्ष्य (यानी मृत्यु) में शुद्ध कमी को इंगित करता है और उन स्थितियों में मनाया जाता है जहां लक्षित आबादी काफी बाधित होती है। जब लक्ष्य को भीड़-भाड़ वाली स्थितियों में जंगली प्रकार के अवरोधक के साथ सिक्का दिया गया था, तो डेटा लक्ष्य क्षेत्र में शुद्ध कमी दिखाता है। इसके विपरीत, जब लक्ष्य को या तो तितर-बितर स्थितियों में एक जंगली प्रकार अवरोधक या भीड़ या तितर-बितर स्थितियों में T6SS उत्परिवर्ती के साथ सिक्का किया गया था, डेटा लक्ष्य क्षेत्र में शुद्ध वृद्धि दिखाते हैं । प्रारंभिक लक्ष्य क्षेत्र का प्रतिशत जब लक्ष्य भीड़ की स्थिति में एक जंगली प्रकार अवरोधक के साथ coincubated था १०० से नीचे था और काफी एक तरह से ANOVA के अनुसार अंय सभी उपचार की तुलना में कम है एक Tukey सभी उपचार(पी < ०.०००१)भर में एक Tukey कई तुलना परीक्षण के बाद । इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि लक्ष्य सेल मृत्यु अवरोधक में एक कार्यात्मक T6SS पर निर्भर है और एक प्रयोगात्मक सेटअप के महत्व को रेखांकित करता है जो पर्याप्त सेल-सेल संपर्क की अनुमति देता है, ताकि संपर्क-निर्भर हत्या तंत्र से सेल मृत्यु का पता लगाया जा सके।

चित्रा 4B प्रत्येक उपचार के लिए अंतिम समय बिंदु पर प्रारंभिक अवरोधक क्षेत्र का प्रतिशत प्रस्तुत करता है । इस उदाहरण में, सभी उपचारों में अवरोधक तनाव का शुद्ध विकास देखा गया था। हालांकि, प्रारंभिक अवरोधक क्षेत्र का प्रतिशत काफी अधिक था जब एक जंगली प्रकार के अवरोधक को भीड़ की स्थिति में लक्ष्य के साथ एक तरह से ANOVA के अनुसार अन्य सभी उपचारों की तुलना में सिक्का दिया गया था जिसके बाद सभी उपचारों में एक तुकी की कई तुलना परीक्षण(पी < 0.0001)। प्रारंभ में, हमने माना कि अवरोधक क्षेत्र में शुद्ध वृद्धि उपलब्ध स्थान में वृद्धि से प्रेरित हो सकती है क्योंकि लक्ष्य कोशिकाओं को समाप्त कर दिया जाता है । हालांकि, अवरोधक विकास में यह एक ही वृद्धि तितर-बितर उपचार में नहीं देखी गई, जहां अवरोधक कोशिकाओं को सिक्का की शुरुआत से बढ़ने के लिए कमरे थे। वैकल्पिक रूप से, यह परिणाम यह सुझाव दे सकता है कि लक्ष्य कोशिकाओं को lysing से जारी पोषक तत्व अवरोधक आबादी में अधिक वृद्धि के लिए अनुमति देते हैं। एक साथ लिया, इन परिणामों का सुझाव है कि अवरोधक तनाव एक T6SS पर निर्भर तरीके से लक्ष्य को समाप्त ही जब उच्च सेल सेल संपर्क स्लाइड पर भीड़ कोशिकाओं द्वारा मजबूर किया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1:एगरेग्मेंट पैड तैयार करने और सिक्का के लिए स्लाइड सेटअप परखता है। (A)2% एगरेग्मेंट पैड बनाने के लिए सेटअप। प्रयोगशाला टेप (हरे) की पांच परतों को लगभग 20 मिमी के अलावा दो बिंदुओं पर एक कवर स्लिप के चारों ओर लपेटा जाता है। इसके बाद, एमपीबीएस (पीला) में गर्म 2% एग्राम को टेप के टुकड़ों के बीच पिपेट किया जाता है और तुरंत 25 मिमी 2 कवर स्लिप के साथ कवर कियाजाता है और कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए जमना करने की अनुमति दी जाती है। एक रेजर ब्लेड का उपयोग ~ 5 मिमी2 टुकड़ों में agarose पैड में कटौती और इमेजिंग के लिए एक नई स्लाइड करने के लिए पैड हस्तांतरण के लिए चिमटी का उपयोग करें। (ख)जब एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग, 5 मिमी2 agarose पैड सीधे स्लाइड पर जगह है, मिश्रित संस्कृति (नीला) और एक 12 मिमी परिपत्र #1.5 कवर पर्ची के बाद । (ग)जब एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग, मिश्रित संस्कृति सीधे #1.5 ग्लास कवर पर हाजिर एक ३५ मिमी पेट्री डिश के नीचे पर्ची, और संस्कृति के शीर्ष पर एक agarose पैड जगह के बाद एक दूसरे 12 मिमी परिपत्र कवर पर्ची के बाद agarose पैड समतल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:भीड़ या तितर-बितर स्थितियों में कॉइनकबेशन स्पॉट की समय चूक छवियां । (ए)प्रारंभिक और अंतिम समय बिंदुओं पर प्रतिनिधि छवियां जहां लक्ष्य और जंगली प्रकार अवरोधक की मिश्रित संस्कृति को स्लाइड पर खोलना से पहले 3x केंद्रित किया गया था ताकि उपभेदों के बीच सेल-सेल संपर्क को बल दिया जा सके । TRITC चैनल में सफेद तीर लक्ष्य कोशिकाओं के उदाहरण ों का संकेत देते हैं जो प्रयोग के दौरान गोल या lyse करते हैं। (ख)प्रतिनिधि छवियां जहां लक्ष्य और जंगली प्रकार के अवरोधक की मिश्रित संस्कृति को ध्यान केंद्रित किए बिना देखा गया ताकि कोशिकाएं तितर-बितर हों और उपभेदों के बीच न्यूनतम सेल-सेल संपर्क हो । फिटसी और ट्राइटीसी चैनलों में ग्रे तीर प्रयोग के दौरान सेल डिवीजन के उदाहरणों का संकेत देते हैं। (ग)प्रतिनिधि छवियां जहां लक्ष्य और T6SS की मिश्रितसंस्कृति-उत्परिवर्ती 3x स्लाइड पर खोलना करने के लिए उपभेदों के बीच सेल सेल संपर्क बल से पहले केंद्रित किया गया था । (घ)प्रतिनिधि छवियां जहां लक्ष्य और T6SS की मिश्रितसंस्कृति-उत्परिवर्ती ध्यान केंद्रित किए बिना देखा गया था ताकि कोशिकाओं को तितर-बितर कर रहे है और वहां उपभेदों के बीच ंयूनतम सेल सेल संपर्क है । स्केल बार = 5 माइक्रोन और सभी छवियों में सुसंगत हैं; TRITC चैनल झूठे रंग का मजेंटा है, फिटसी चैनल झूठे रंग का हरा है। सभी छवियों पर डेकॉन्वोल्यूशन किया गया था; पृष्ठभूमि घटाया गया था, और चमक/इसके विपरीत सभी छवियों में समान रूप से समायोजित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:फिजी विश्लेषण कार्यप्रवाह। ( विश्लेषणकेलिए प्रतिनिधि छवि। यह कार्यप्रवाह सभी चैनलों के लिए दृश्य और नमूनों के सभी क्षेत्रों में दोहराया जाता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन और सभी छवियों में सुसंगत हैं; TRITC चैनल झूठे रंग का मजेंटा है, फिटसी चैनल झूठे रंग का हरा है। (ख)फिजी में डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके छवि को थ्रेसहोल्ड करके बनाया गया बाइनरी मास्क। (ग)इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले कण विश्लेषण के लिए सेटिंग्स का उदाहरण। आकार सीमा = 0 - अनंत μm2; गोलाकारता = 0.00 - 1.00; शो = रूपरेखा। (घ) कण की रूपरेखा (सी)में कण विश्लेषण के उत्पादन के रूप में बनायागया । (डी)में कण रूपरेखा मूल छवि (ए) की तुलना में यह सुनिश्चित करने के लिए की जानी चाहिए कि सभी कोशिकाओं को कण विश्लेषण में कब्जा कर लिया गया था। (ई)परिणाम तालिका में कण विश्लेषण से एक उत्पादन के रूप में बनाया(सी)। ऑब्जेक्ट नंबर (कॉलम 1) अलग-अलग कणों (एक या अधिक कोशिकाओं) से मेल खाता है जो लाल इन पैनल(डी)में उल्लिखित और लेबल किया गया है। लेबल = विश्लेषण छवि का फ़ाइल नाम; क्षेत्र = μm2में कुल कण क्षेत्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:लक्ष्य तनाव बाधित है या नहीं, इसका आकलन करने के लिए नमूना डेटा। लक्ष्य तनाव(ए)और अवरोधक तनाव(बी)के लिए अंतिम समय बिंदुओं पर प्रारंभिक क्षेत्र का प्रतिशत, विभिन्न प्रारंभिक कोशिका घनत्व पर। स्लाइड घनत्व या तो एक शुरुआती सेल घनत्व को इंगित करता है जो भीड़ (उपभेदों के बीच उच्च कोशिका संपर्क), या चित्र 2में वर्णित अधिक फैलाया गया (उपभेदों के बीच कम सेल संपर्क) है। अवरोधक जीनोटाइप इंगित करता है कि या तो एक जंगली प्रकारया T6SS उत्परिवर्ती (T6SS-) तनाव लक्ष्य तनाव के साथ सिक्का था । तारांकन सभी उपचारों की तुलना में % परिवर्तन में एक महत्वपूर्ण अंतर का संकेत देता है (एक तरह से एनोवा के बाद सभी उपचारों की तुलना करने वाले तुकी के कई तुलना परीक्षण; (p< 0.0001)। धराशायी रेखा प्रारंभिक और अंतिम समय बिंदु के बीच तनाव क्षेत्र में कोई शुद्ध परिवर्तन इंगित करता है; 100 > एक% परिवर्तन शुद्ध वृद्धि (यानी, विकास) और 100 <% परिवर्तन शुद्ध कमी (यानी, सेल मृत्यु) इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एकल-कोशिका स्तर पर अंतर-व्यवहारिक प्रतिस्पर्धा की मात्रा और विशेषता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। यह परख, जिसे हमारे क्लिफप्लेट्स 1,2पर हमारे क्लिफू-आधारित प्रतियोगिता परख को संशोधित करके विकसित किया गया था, जिसे वी फिचेरी आइसोले के बीच एकल-सेल प्रतियोगिता के दृश्य के लिए अनुमति दी गई थी और सिस्टम और माइक्रोस्कोपी सेटअप की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विधि को अनुकूलित करने के लिए सुझाव प्रदान किए जाते हैं। यद्यपि यहां वर्णित विधि को प्रकाश-अंग सहजीवी वी फिचेरीके लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन इसे कई विविध, कृषि योग्य रोगाणुओं को समायोजित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिस्पर्धी तंत्र को तापमान,लवणता और चिपचिपाहट30, 31, 32, 33, 34सहित किसी भी पर्यावरणीय चर द्वारा विनियमित किया जासकताहै। पिछले काम ने पुष्टि की है कि वी फिचेरी एक संपर्क-निर्भर प्रकार VI स्राव प्रणाली का उपयोग करके प्रतिस्पर्धा करता है जो सतहों पर सक्रिय है30,उदाहरण उपभेदों के बीच प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त इस परख में वर्णित शर्तों को बनाता है। बैक्टीरियल प्रतियोगिता की मात्रा बताते समय स्लाइड पर कोशिकाओं के प्रारंभिक घनत्व पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है। यह देखते हुए कि लक्ष्य और अवरोधक कोशिकाओं के बीच संपर्क अक्सर हत्या होने के लिए आवश्यक है, मिश्रित संस्कृति इस तरह ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए कि सेल सेल संपर्क अधिकतम है और कोशिकाओं स्लाइड पर एक ही विमान में रहते हैं । सेल संस्कृतियों को एक समान ऑप्टिकल घनत्व (मध्य-लॉग चरण) में उगाया जाना चाहिए और फिर विभिन्न विकास चरणों में कोशिकाओं के शारीरिक परिवर्तनों के कारण उच्च ऑप्टिकल घनत्व के लिए संस्कृतियों को बढ़ाने के बजाय संपर्क को मजबूर करने के लिए केंद्रित किया जाना चाहिए। अन्य प्रणालियों में, संस्कृति की स्थिति और प्रायोगिक सेटअप को यह सुनिश्चित करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है कि प्रतिस्पर्धी तंत्र सक्रिय है और सिक्का की स्थिति में इसका पता लगाया जा सकता है।

इस परख में उपयोग किए जाने वाले एगरेज़ पैड कई लाभ प्रदान करते हैं: वे स्थिरीकरण प्रदान करते हैं ताकि कोशिकाएं स्वतंत्र रूप से घूमें नहीं, और वे संस्कृति को प्रयोग के दौरान सूखने से रोकते हैं। इसके अतिरिक्त, यदि प्रयोग के लिए आइसोप्रोपिल-β-डी-थिओगाल्टोसाइड (आईपीटीजी) जैसे रासायनिक प्रेरकों की आवश्यकता होती है, तो उन्हें आसानी से एग्रिजिंग समाधान में जोड़ा जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एजीआरडब्ल्यू की तैयारी को विभिन्न प्रणालियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी। ऊपर वर्णित उदाहरण में, एगरेग्डेड पैड को 2% एगरेज (डब्ल्यू/वी) को 20 पीएसयू mPBS में भंग करके तैयार किया गया था, जो वी फिचेरी ग्रोथ मीडियम में इस्तेमाल होने वाला मानक लवणता है । इसके अलावा, कुछ मामलों में एक कार्बन स्रोत को कोशिकाओं को बढ़ने और लंबे प्रयोगों पर प्रतिस्पर्धा करने के लिए एगरेग्मेंट पैड में जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है। ऐसे मामले में, एगरॉज पैड्स में एमपीएस को किसी भी विकास माध्यम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि विकास माध्यम में पोषक तत्व अतिरिक्त पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के ट्रेडऑफ के साथ आ सकते हैं।

मालिकाना छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के बिना, सेल-सेल संपर्क अधिक होने पर व्यक्तिगत सेल काउंट प्राप्त करना बहुत मुश्किल हो सकता है, जैसा कि हम यहां दिखाते हैं कि संपर्क-निर्भर हत्या का निरीक्षण करना आवश्यक है। इस परख को मात्राकरण के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जो व्यक्तिगत सेल काउंट पर भरोसा नहीं करता है। इसके बजाय, प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए कुल सेल क्षेत्र का उपयोग सिक्का उपभेदों के बीच हत्या की सीमा को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। क्योंकि यह विधि व्यक्तिगत सेल काउंट के बजाय क्षेत्र पर निर्भर करती है, डिफ़ॉल्ट थ्रेसहोल्डिंग सेटिंग्स आमतौर पर कुल सेल क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए पर्याप्त होती हैं। थ्रेसिंग की सटीकता को मॉडल जीव के लिए औसत सेल आकार द्वारा एक प्रतिनिधि क्षेत्र के लिए कुल वस्तु क्षेत्र को विभाजित करके और इस अनुमानित सेल नंबर की तुलना एक ही छवि के लिए मैनुअल सेल काउंट से करके सत्यापित किया जा सकता है।

एक अवरोधक और एक लक्ष्य (गैर-हत्यारा) तनाव के बीच कॉइनक्यूबेशन में, अवरोधक के शुद्ध विकास की भविष्यवाणी की जाती है। जैसा कि चित्र 4में देखा गया है, अवरोधक विकास उन उपचारों में काफी अधिक हो सकता है जहां हत्या देखी जाती है, उपचार की तुलना में जहां हत्या नहीं देखी जाती है, शायद इसलिए कि लक्ष्य कोशिकाओं को lysing द्वारा जारी पोषक तत्व अवरोधक तनाव को अधिक तेजी से बढ़ने की अनुमति देते हैं। यहां दिखाए गए उदाहरण में नेट टारगेट डेथ देखी जाती है क्योंकि T6SS-मध्यस्थता प्रतियोगिता के परिणामस्वरूप लक्ष्य सेल लाइसिस होता है जहां लक्ष्य शारीरिक रूप से समाप्त हो जाता है । हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी प्रतिस्पर्धी तंत्र ों के परिणामस्वरूप लक्ष्य कोशिकाओं का भौतिक उन्मूलन नहीं होता है। यदि कोई लक्ष्य एक विष से अक्षम है जो विकास अवरोध का कारण बनता है, तो यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप दृश्यमान लक्ष्य जनसंख्या समय के साथ स्थिर रह सकती है क्योंकि लक्ष्य कोशिकाएं अब नहीं बढ़ती हैं लेकिन यह भी नहीं होती हैं । ऐसे मामले में, इस परख के परिणामों की तुलना लक्ष्य सेल व्यवहार्यता के लिए अनुवर्ती परीक्षणों के साथ करना उचित होगा, जैसे कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के लिए चढ़ाना या प्रोपिडियम आयोडाइड या SYTOX ग्रीन35,36के साथ धुंधला करके लाइव-डेड परख का प्रदर्शन करके।

सिक्का परख की तुलना में जो सीएफयू की गिनती पर भरोसा करते हैं, यह परख समय के साथ लक्षित सेल आकृति विज्ञान में उपभेदों और ट्रैक परिवर्तनों के बीच प्रतिस्पर्धा की स्थानिक संरचना का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करना संभव बनाती है। उदाहरण के लिए, T6SS का उपयोग करके मारने वाली अवरोधक कोशिकाओं को लिस्म-डोमेन प्रोटीन को एन्कोड करने के लिए जाना जाता है जो लक्ष्य सेल दीवार को नीचा दिखाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रारंभिक सेल गोलाई और फिर लाइसिस13होता है, जिसे हमने चित्र 2 एमें दिखाए गए उदाहरण में देखा था। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग बहुत कम समय के तराजू पर उच्च संकल्प पर प्रतिस्पर्धा को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। यहां दिखाए गए उदाहरण में, लक्ष्य क्षेत्र में केवल दो घंटे के बाद एक महत्वपूर्ण कमी देखी जाती है जब कोशिकाओं की भीड़ होती है और सेल-सेल संपर्क उपभेदों(चित्रा 4)के बीच मजबूर होता है। यहां वर्णित छवि विश्लेषण को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके भी किया जा सकता है, जिससे कॉइनक्यूबैटेड उपभेदों के स्थानिक वितरण को बाधित किए बिना वीवो में या जटिल बायोफिल्म्स में बैक्टीरियल प्रतिस्पर्धा का अध्ययन करना संभव होगा।

संक्षेप में, यहां वर्णित परख का उद्देश्य फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-कोशिका स्तर पर बैक्टीरियल प्रतियोगिता की कल्पना और मात्रा के लिए एक सुलभ और आसानी से संशोधित दृष्टिकोण प्रदान करना है। इस विधि को विविध बैक्टीरियल आइसोलेट पर लागू किया जा सकता है और इसका उपयोग जटिल वातावरण में भी बैक्टीरियल प्रतिस्पर्धा की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है जैसे कि मेजबान या बायोफिल्म मैट्रिक्स के भीतर।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

ए.एन.एस. NIGMS अनुदान R35 GM137886 द्वारा समर्थित था और S.N.S. राष्ट्रीय रक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग स्नातक फैलोशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher 05-408-129
10 uL single channel pipette
1000 uL single channel pipette
20 uL single channel pipette
200 uL single channel pipette
Agarose Fisher BP165-25 Low melting agarose
Calculator
Cellvis 35 mm Dish Fisher NC0409658 #1.5 cover glass bottom
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
DAPI Nucleic Acid Stain Fisher EN62248 optional (if not using stable plasmids)
FIJI image analysis sofware ImageJ https://imagej.net/Fiji/Downloads open-source software
Fisherbrand Cover Glasses: Circles Fisher 12-545-81P #1.5 cover glass; 12 mm diameter
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Lens Cleaning Tissue Paper Fisher S24530
Parafilm Fisher 13-374-12
Petri Plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Razor Blades Fisher S65921
Semi-micro Cuvettes VWR 97000-586
Spectrophotometer
SYBR Green Nucleic Acid Stain Fisher S7563 optional (if not using stable plasmids)
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides Fisher 12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass Fisher 22-050-235 #1.5 cover glass, 25 mm2
Type F Immersion Oil Fisher NC0297589
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. 
Vortex
Water bath Used to keep agarose warm prior to pipetting
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g
mPBS (marine PBS) Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad
10X PBS Fisher ICN1960454
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS1-160P Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here
Sterile Vacuum Filter Units Fisher SCGVU01RE Used to filter-sterilize mPBS
Vacuum pump Used to filter-sterilize mPBS

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References

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जीव विज्ञान अंक 175 फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एकल कोशिका बैक्टीरियल प्रतियोगिता एलीविब्रियो फिचेरी,इंटरबैक्टीरियल किलिंग संपर्क-निर्भर लाइव-सेल इमेजिंग मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण
एकल-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके इंटरबैक्टीरियल प्रतियोगिता का मात्राकरण
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Smith, S., Septer, A. N. Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (175), e62851, doi:10.3791/62851 (2021).

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