Summary
Dette manuskript beskriver en metode til brug af enkeltcellet fluorescensmikroskopi til at visualisere og kvantificere bakteriekonkurrence i coculture.
Abstract
Interbakteriel konkurrence kan direkte påvirke strukturen og funktionen af mikrobiomer. Dette arbejde beskriver en fluorescensmikroskopi tilgang, der kan bruges til at visualisere og kvantificere konkurrencedygtige interaktioner mellem forskellige bakteriestammer på encellet niveau. Protokollen beskrevet her giver metoder til avancerede tilgange i dias forberedelse på både opretstående og omvendt epifluorescence mikroskoper, live-celle og time-lapse billeddannelse teknikker, og kvantitative billedanalyse ved hjælp af open source-software FIJI. Tilgangen i dette manuskript skitserer kvantificeringen af konkurrencedygtige interaktioner mellem symbiotiske Vibrio fischeri populationer ved at måle ændringen i området over tid for to coincubated stammer, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner fra stabile plasmider. Alternative metoder er beskrevet til optimering af denne protokol i bakterielle modelsystemer, der kræver forskellige vækstbetingelser. Selv om analysen beskrevet her bruger betingelser optimeret til V. fischeri, denne tilgang er meget reproducerbar og kan nemt tilpasses til at studere konkurrence blandt kultbare isolater fra forskellige mikrobiomer.
Introduction
Denne artikel skitserer en metode til kvantificering bakterie konkurrence på encellet niveau ved hjælp af fluorescens mikroskopi. Strukturen og funktionen af mikrobielle samfund er ofte formet af konkurrencedygtige interaktioner mellem mikrober, og i mange tilfælde karakterisere disse interaktioner kræver observere forskellige bakteriestammer i coincubation1,2,3,4,5,6,7,8 . Traditionelt er bakteriekonkurrence kvantificeret på befolkningsniveau ved at tælle kolonidannende enheder (CFO'er) af hæmmer- og målstammer før og efter en møntperiode2,9. Mekanismerne til mikrobiel konkurrence er bredt fordelt mellem bakterier og kan stole på enten diffusion eller cellecellekontakt for at hæmmemålcellerne 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.
Selv om bakteriestammer ofte observeres i coincubation på befolkningsniveau, skitserer dette manuskript en analyse for kvantificering af bakteriel konkurrence. Endvidere omfatter dette arbejde forslag til tilpasning af protokollen til brug med andre bakteriearter. Mens de specifikke teknikker i denne artikel bruges til at studere kontaktafhængig intraspecifik konkurrence mellem stammer af den symbiotiske bakterie Vibrio fischeri20,21,22, kan de tilpasses til konkurrence mellem mange organismer. Denne artikel indeholder instruktioner til diasopsætning på både opretstående og omvendte mikroskoper, og al analyse beskrives ved hjælp af open source-softwaren FIJI23, så metoden kan bruges af forskere med adgang til forskellige billedopsætninger og analyseprogrammer. I betragtning af vigtigheden af at studere mikrobiel konkurrence på både befolkningsniveau og encellet niveau vil denne metode være en værdifuld ressource for forskere til at kvantificere konkurrencemæssige interaktioner, især dem, der ikke har adgang til proprietær analysesoftware.
Protocol
1. Optimering af bakteriestammer
- Vælg to bakteriestammer til encellede bakterie konkurrence assays. Her anvendes to stammer af V. fischeri: en målstamme (ES11424) og en hæmmerstamme (MJ1125),der er kendt for at dræbe målstammen ved hjælp af type VI sekretionssystemet på kromosom II (T6SS2)1, som er en kontaktafhængig drabsmekanisme.
- Find ud af, hvilke kontrolelementer der passer til eksperimentet. I dette eksempel er den passende kontrol at inkubere både de vilde og T6SS mutant inhibitor stammer med målet stamme til at kvantificere effekten af T6SS-medieret aflivning.
BEMÆRK: Yderligere kontroller kan omfatte en målstamme, der udtrykker det eller de nødvendige immunitetsgen(er) for at forhindre T6SS-afhængige aflivning eller en hæmmende mutantstamme, der udtrykker kopier af de muterede gener i trans for at genoprette T6SS-aktivitet1. - Når det er muligt, omdanne stammer med stabile plasmider kodning gener for forskellige fluorescerende proteiner (f.eks GFP eller RFP) til visuelt at skelne stamme typer på mikroskopet. Her er inhibitorstammen mærket med en GFP-kodning plasmid (pVSV102), og målstammen er mærket med en dsRed-kodning plasmid (pVSV208)26.
BEMÆRK: Hvis det ikke er muligt at bruge stabile plasmider, kan fluorescerende tags introduceres på bakteriekromosomet til visualisering27,28. - I den indledende optimeringsperiode er billedklonalkulturer af de mærkede stammer under hvert af de fluorescerende filtre, der vil blive brugt under eksperimentet for at sikre, at cellerne kun er synlige i den tilsigtede kanal. Sørg f.eks. for, at en GFP-mærket stamme kun er synlig i FITC-kanalen.
2. Forberedelse af Agarosepude
- Forbered agarose pad opløsning ved at opløse 2% lav-smelte agarose (w / v) i mPBS. Varm opløsningen kortvarigt i mikrobølgeovnen og hvirvlen, indtil agarose er helt opløst. Hold denne opløsning varm ved at placere den i et 55 °C vandbad, indtil den er klar til brug. Se afsnittet Diskussion for at få flere oplysninger om forberedelse af agarosepuder.
BEMÆRK: Her blev mPBS udarbejdet ved at tilføje 20 g / L NaCl til standard 1x PBS. - Pak et stykke laboratorietape rundt om en glasrutschebane fem gange. Gentag denne proces en anden gang på det samme dias, så afstanden mellem de to stykker tape er lidt mindre end bredden af en coverlip (Figur 1A). For eksempel, hvis du bruger 25 mm2 coverlips, skal båndstykkerne være fordelt ca. 20 mm fra hinanden.
BEMÆRK: Mens det antal gange båndet er viklet rundt om diaset kan ændres for at justere tykkelsen af agarose pad, er det vigtigt, at lag af tape er den samme højde på begge sider af diaset, så agarose pad forbliver flad. - Pipette varm agarose opløsning mellem de to stykker tape og straks top med en coverlip, så det hviler på stykker af tape. Dette vil sikre, at overfladen af agarose pad forbliver flad. Mængden af agaroseopløsning, der pipeses i dette trin, skal være nok til, at dækslerne kommer i kontakt med væsken og skubber eventuelle bobler i agaroseopløsningen ud. Til denne særlige opsætning er 200 μL varm agarose tilstrækkelig.
- Lad agarosepuden størkne ved stuetemperatur i mindst 1 time før coincubationsanalysen. Trin 2.2 vil producere en agarose pad på ca. 20 mm2.
- Skær denne agarose pad med et barberblad i fire, 5 mm2 puder, der skal bruges til billeddannelse.
BEMÆRK: Agarosepuder kan laves op til en uge før forsøget og opbevares ved 4 °C i en tom, steril petriplade forseglet med parafilm for at forhindre tørring.
3. Forbered stammer til co-inkubation
- Stime hver stamme, der skal anvendes i coincubation assay fra -80 °C lagre på LBS agar plader suppleret med passende antibiotika og inkubere natten over ved 24 ° C. I dette eksempel anvendes tre stammer: den vilde hæmning stamme, typen VI sekretionssystem mutant, og målet stamme.
- Den næste dag, start natten kulturer i biologiske duplikat ved at plukke to kolonier fra hver stamme og genoplive dem i LBS medium suppleret med de relevante antibiotika og inkubere natten over ved 24 ° C med rysten ved 200 rpm.
- Den følgende morgen, subkultur hver biologisk replikere 1:1000 i frisk LBS medium uden antibiotika og inkubere ved 24 ° C med rysten i 4-5 timer eller indtil cellerne når en OD600 på ~ 1,5.
BEMÆRK: Tidspunktet for trin 3.1, 3.2 og 3.3 skal muligvis optimeres til forskellige bakteriearter, da deres vækstrate kan variere betydeligt. Til denne analyse, celler var rettet mod at være i midten af log fase i starten af coincubation assay.
4. Coincubate bakteriestammer
- Start med mid-log kulturer fra trin 3.3, måle og registrere den optiske tæthed ved 600 nm (OD600)for alle prøver.
- Normaliser hver prøve til en OD600 = 1,0, hvilket svarer til ca. 109 CFU/mL for V. fischeri, ved at fortynde kulturen med LBS medium.
- Bland de to konkurrerende stammer sammen ved et 1:1-forhold baseret på volumen ved at tilføje 30 μL af hver normaliseret stamme til et mærket 1,5 mL rør. Vortex den blandede stamme kultur for 1-2 s.
BEMÆRK: I nogle tilfælde kan det være hensigtsmæssigt at blande cocultures i forskellige nøgletal. For eksempel, når den ene stamme vokser meget hurtigere end den anden, kan det være nødvendigt at starte den langsommere voksende stamme med en numerisk fordel for at observere konkurrencen. Optimering kan også være påkrævet, hvis OD600 ikke svarer til lignende CFU / mL for begge stammer. - Gentag trin 4.3 for hver biologisk likation og behandling. I eksemplet vist her, vil dette resultere i i alt fire blandet stamme rør: to biologiske kopier med den vilde type hæmmer stamme blandet med målet stamme og to biologiske replikater med type VI sekretion system mutant stamme blandet med målet stamme.
- For at sikre, at konkurrerende celler er tilstrækkeligt tætte til kontaktafhængige drab i mønten på agarpuden, skal du koncentrere hver blandet kultur 3 gange ved at centrifugere den blandede kultur i et standard 1,5 mL centrifugerør i 1 min ved 21.130 x g, kassere supernatanten og genudsende hver pille i 20 μL LBS medium. Gentag for hvert eksempel.
BEMÆRK: Nogle bakterieceller er følsomme over for skader ved centrifugering ved høj rcf; i sådanne tilfælde kan den blandede kultur centrifugeres i 3 min ved 4600 x g29. Derudover er det vigtigt at sikre tilstrækkelig celletæthed på diaset til at observere drab, når der kvantificeres kontaktafhængig konkurrence. I denne artikel havde "overfyldte" behandlinger, hvor der observeres aflivning, ca. 10 celler/20 μm2; Yderligere oplysninger finder du i afsnittet Diskussion.
5. Opsætning af dias
- Når du bruger et opretstående mikroskop, skal du placere en ~ 5 mm2 agarose pad på en standard 1 mm glasrutschebane. Spot 2 μL af en blandet kultur på agarose pad og placere en # 1,5 coverslip (25 mm2)over stedet. Se figur 1B for eksempel.
- Når du bruger et omvendt mikroskop, skal du placere 2 μL af en blandet kultur på # 1,5 coverslip bunden af en 35 mm petriskål og placere en ~ 5 mm2 agarose pad over coincubation stedet. Placer en 12 mm cirkulær glasbetræk over agarosepuden. Se figur 1C for eksempel.
- Gentag trin 5.1 eller 5.2, afhængigt af det anvendte mikroskopopsætning, for de resterende tre blandede kulturer, hvilket resulterer i fire dias eller retter, der skal afbildes.
- Lad dias sidde på bordpladen i ca. 5 minutter, før du fortsætter til trin 6. Dette gør det muligt for celler at bosætte sig på agar pad og eliminerer bevægelse under billeddannelsesprocessen.
6. Fluorescensmikroskopi
- Begynd med at fokusere på celler ved hjælp af hvidt lys (fase kontrast eller DIC) for at minimere virkningerne af foto-blegning. Baseret på den gennemsnitlige størrelse af en enkelt bakteriecelle, skal du bruge en 60x eller 100x olie mål.
- Juster eksponeringstiden og anskaffelsesindstillingerne for hver kanal, så cellerne er synlige i den relevante kanal med minimal baggrundsregistrering.
BEMÆRK: Det er hensigtsmæssigt at bruge forskellige eksponeringstider for forskellige kanaler, men den samme eksponeringstid bør anvendes på tværs af alle biologiske replikater og behandlinger for en given kanal. - For hvert eksempel skal du vælge mindst fem synsfelter (FOV) og hente billeder i hver passende kanal ved hjælp af anskaffelsesindstillingerne fra trin 6.2 (se eksempler i figur 2). Gem XY-punkterne fra hver FOV, så den samme FOV kan afbildes i løbet af det sidste tidspunkt. Billeddannelse af den samme FOV på hvert tidspunkt er nødvendig for at bestemme andelen af areal besat af mål- eller hæmmerceller under analysetrinnene.
BEMÆRK: I dette eksempel registreres GFP's fluorescens ved hjælp af et filter med en excitationsbølgelængde på 467 - 498 nm og et emissionsfilter på 513 - 556 nm og er falskfarvet grønt. Fluorescens af dsRed detekteres ved hjælp af et filter med en excitation bølgelængde på 542 - 582 nm og et emissionsfilter på 603 - 678 nm og er falsk-farvet magenta. - Efter 2 timer gentages trin 6.3 for hver prøve ved hjælp af de tidligere gemte XY-punkter (Fig. 2).
BEMÆRK: Timingen af efterfølgende billeder skal muligvis optimeres til organismer med forskellige vækstrater eller konkurrencemekanismer.
7. Billedanalyse i FIJI
- Download og installer FIJI-billedbehandlingssoftwaren ved hjælp af de instruktioner, der findes her: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- Åbn FIJI, og importer billedfiler til analyse.
BEMÆRK: I de fleste tilfælde . TIFF filer vil blive brugt til billedanalyse, selv om nogle billede erhvervelse software vil eksportere ved hjælp af proprietære filtyper. FIJI kan genkende de fleste proprietære filtyper og billeder kan importeres og analyseres som følger. - For hvert billede, der er hentet i trin 6.3 og 6.4, skal du konvertere billedet til gråtoneskala, adskille kanalerne og begynde med at tærskel (Ctrl + Skift + T) og oprette en binær maske af det forbehandlede billede (Figur 3A, B).
BEMÆRK: Her bruges standardtærskelindstillingerne i FIJI. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at ændre disse indstillinger, i hvilket tilfælde de samme indstillinger skal bruges til alle billeder i det pågældende eksperiment. - Angiv skala på billedet (Analyser | Angiv skala) ved hjælp af de relevante værdier for mikroskopiopsætningen23.
- Angive målinger (Analyser | Angiv målinger), og vælg Område.
BEMÆRK: Andre målinger kan tilføjes, hvis de passer til eksperimentet. Det er kun målområdet for objektet, der kræves til den eksempelanalyse, der vises her. - Analyser partikler (Analyser | Analyser partikler) ved hjælp af standardindstillingerne (Figur 3C). Hvis der er snavs i prøven, kan det være nødvendigt at justere størrelsen eller cirkulariteten for at bortfiltrere ikke-cellepartikler. Vælg Vis | Konturer, så resultatet af denne analyse vil omfatte en nummereret oversigt over alle partikler analyseret (Figur 3D).
BEMÆRK: Det er især vigtigt at sammenligne dispositionen i figur 3D med det oprindelige billede i optimeringstrinnet for at sikre, at (1) alle celler analyseres, og (2) at eventuelle snavs er udelukket fra analysen. - Eksporter målingerne fra trin 7.4 (Figur 3E) til et regnearkssoftware til yderligere analyse og graftegning.
- Gentag trin 7.1 - 7.5 for alle kanaler og billeder, der er erhvervet under eksperimentet.
8. Beregning af procentdelen af det oprindelige målområde over tid
- For hvert visningsfelt, der analyseres i afsnit 7, skal du sikre dig, at den eksporterede fil indeholder en individuel områdemåling for hver partikel, der blev analyseret. Begynd med målstammens fluorescenskanal, beregne sumpartikelområdet for hvert enkelt synsfelt. For to biologiske kopier med fem FOV hver, dette bør resultere i ti sum områder pr behandling på hvert tidspunkt.
- Beregn procentdelen af det oprindelige målområde over tid for hver FOV ved hjælp af følgende ligning: (
) - Gentag denne beregning for alle behandlinger, og graf procentdelen af det oprindelige målområde (resultatet af ligningen fra trin 8.2) for hver behandling (Figur 4A).
- Bestem, om der er en nettostigning i målgruppen (angiver vækst), et nettofald i målpopulationen (angiver død) eller ingen ændring (indikerer ingen vækst eller død) for hver behandling.
BEMÆRK: Procent af det oprindelige målområde med værdier på over 100 angiver nettomålvækst, og værdier under 100 angiver nettomåldød. Procent af de oprindelige målværdier, der forbliver på 100, angiver ingen nettoændring i målpopulationen. Se diskussion for foreslåede opfølgende eksperimenter.
)9. Beregning af procentdelen af det oprindelige hæmmerområde over tid
- Gentag trin 8.1 til 8.3, denne gang ved hjælp af de målinger, der er indsamlet fra hæmmerstammens fluorescenskanal i afsnit 7 (Figur 4B).
- Afgøre, om der var en netto stigning i hæmmer befolkning (vækst); et nettofald i hæmmerpopulationen (død) eller ingen ændring for hver behandling. Værdier større end 100 indikerer nettohæmmervækst, og værdier lavere end 100 indikerer nettohæmmerdød.
Representative Results
For at visualisere og kvantificere konkurrencemæssige interaktioner mellem bakterier på enkeltcelleniveau blev der udviklet og optimeret en protokol til V. fischeri ved at ændre vores veletablerede CFU-baserede assay1,2. Denne metode udnytter GFP- og dsRed-kodning stabil plasmids til visuelt at skelne forskellige stammer af V. fischeri. Det konkurrencemæssige resultat af disse interaktioner kan kvantificeres ved at analysere de billeder, der er erhvervet fra denne analyse ved hjælp af open source-softwaren FIJI. Som et eksempel blev følgende eksperiment udført ved hjælp af V. fischeri isolater. En hæmmer stamme husede en plasmid, der koder GFP, og et mål stamme husede en plasmid, der koder dsRed. I betragtning af at T6SS2 kodet af hæmmeren er en kontakt-afhængige drab mekanisme, behandlinger blev inkluderet, hvor cellerne var enten overfyldt (høj celle-celle kontakt) eller sprede (lav celle-celle kontakt) på et dias for at fremhæve virkningen af eksperimentelle setup på de endelige resultater af denne analyse. I stikprøvedataene blev konkurrerende stammer blandet med et 1:1-forhold og inkuberet på en agarosepude i 2 timer, og der blev taget både indledende og sidste (2 h) billeder. Som en kontrol, en T6SS2 mutant stamme blev også coincubated med målet stamme i både overfyldte og sprede forhold. Kulturer af hver stamme blev forberedt og coincubated som beskrevet ovenfor og dias blev udarbejdet som vist i figur 1.
Figur 2 viser repræsentative fluorescensmikroskopibilleder af hver eksperimentel behandling med samme synsfelt afbildet på et indledende og sidste tidspunkt. For hver behandling, enten en vild-type hæmmer eller T6SS mutant stamme huser en GFP-kodning plasmid blev blandet på en 1:1 forhold med målet stamme huser en dsRed-kodning plasmid. I løbet af en 2 timers møntcubationsperiode med denne eksperimentelle opsætning kan voksende V. fischeri-celler gennemgå 1-2 divisioner (Figur 2; grå pile). I figur 2Ablev cellecellekontakt tvunget mellem målet og hæmmeren ved at koncentrere den blandede kultur, før der blev spottet på diaset. Flere målceller observeres at blive afrundede og/eller forsvinder i løbet af 2 timer, i overensstemmelse med at målcellerelimineresaf hæmmeren (Figur 2; hvide pile ). Yderligere oplysninger om fortolkning af afrundings- eller lysing af målceller finder du i afsnittet Diskussion. I figur 2B, den samme coincubation blev spottet på et dias, denne gang uden at koncentrere den blandede kultur, således at cellerne forblev spredt, og der var minimal kontakt mellem stammer på diaset. Her observeres ingen målceller at forsvinde eller runde, hvilket tyder på, at målstammen ikke blev hæmmet i denne behandling. Figur 2C og Figur 2D viser de samme overfyldte og sprede behandlinger, der er beskrevet ovenfor, denne gang ved hjælp af en T6SS mutant som hæmmer stamme. Målceller blev ikke observeret at forsvinde eller runde, når coincubated med en T6SS mutant i enten overfyldte eller sprede betingelser, igen tyder på, at målet ikke var hæmmet i enten behandling.
Figur 3 viser fijianalysearbejdsgangen, der anvendes til at kvantificere konkurrencen i denne protokol. Der blev valgt et repræsentativt billede fra destinationskanalen (Figur 3A), og der blev oprettet en binær maske ved hjælp af standardtærskelindstillingerne i FIJI (Figur 3B). Billedskalaen blev indstillet korrekt til denne mikroskopiopsætning. Partikler blev analyseret ved hjælp af størrelsesparameteren = 0 - uendelig, cirkularitetsparameter = 0,00 - 1,00, og Vis konturer blev valgt (Figur 3C). Resultaterne af denne partikelanalyse vises både som en nummereret kontur af hver partikel (Figur 3D) og som en tabel med kolonner for partikelnummer, filnavn (etiket) og partikelareal i μm2 (område) (Figur 3E).
I figur 4afbildes og analyseres data fra figur 3E. I figur 4Apræsenteres procentdelen af det oprindelige målområde ved det endelige tidspunkt for hver behandling i henhold til trin 8.2. Hvis procentdelen af det oprindelige målområde er større end 100, repræsenterer dette nettostigning i målet (dvs. vækst) og observeres under forhold, hvor målgruppen ikke er væsentligt hæmmet. Men hvis procentdelen af det oprindelige målområde er lavere end 100, indikerer dette resultat et nettofald i målet (dvs. død) og observeres under forhold, hvor målgruppen er betydeligt hæmmet. Når målet blev coincubated med en vild-type hæmmer i overfyldte forhold, data viser et nettofald i målområdet. Når målet derimod blev coincubated med enten en vild-type hæmmer i spredningsforhold eller en T6SS mutant i overfyldte eller sprede forhold, viser dataene en nettostigning i målområdet. Procentdelen af det oprindelige målområde, hvor målet blev coincubated med en vild-type hæmmer i overfyldte forhold var under 100 og betydeligt lavere end alle andre behandlinger i henhold til en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey flere sammenligninger test på tværs af alle behandlinger (p < 0,0001). Disse data indikerer, at målcelledød er afhængig af en funktionel T6SS i hæmmeren og understreger vigtigheden af en eksperimentel opsætning, der giver tilstrækkelig cellecellekontakt, for at opdage celledød fra en kontaktafhængig drabsmekanisme.
Figur 4B præsenterer procentdelen af det oprindelige hæmmerområde ved det sidste tidspunkt for hver behandling. I dette eksempel blev nettovæksten af inhibitorstammen observeret på tværs af alle behandlinger. Men, procentdelen af indledende hæmmer område var betydeligt højere, når en vild-type hæmmer blev coincubated med målet i overfyldte forhold i forhold til alle andre behandlinger i henhold til en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey flere sammenligninger test på tværs af alle behandlinger (p < 0,0001). I første omgang mente vi, at nettostigningen i inhibitorområdet kan være drevet af stigningen i den tilgængelige plads til at vokse ind i takt med, at målceller elimineres. Men, den samme stigning i hæmmer vækst blev ikke observeret i dispergere behandlinger, hvor hæmmer celler havde plads til at vokse fra begyndelsen af coincubation. Alternativt kan dette resultat tyde på, at næringsstoffer frigivet fra lysing målceller giver mulighed for en større stigning i hæmmer befolkning. Samlet set tyder disse resultater på, at inhibitorstammen kun eliminerer målet på en T6SS-afhængig måde, når høj cellecellekontakt tvinges af fortrængning af celler på diaset.
Figur 1: Forberedelse og slideopsætning af Agarose pad til oplagsanalyser. (A) Opsætning til fremstilling af 2% agarosepuder. Fem lag laboratorietape (grøn) er viklet omkring et dæksel slip på to punkter ca 20 mm fra hinanden. Dernæst ledes varm 2% i mPBS (gul) mellem båndstykkerne og dækkes straks med et 25 mm2 dæksel og får lov til at størkne i mindst 1 time ved stuetemperatur. Brug et barberblad til at skære agarose pad i ~ 5 mm2 stykker og bruge pincet til at overføre puden til en ny slide til billeddannelse. (B) Når du billeddannelse på en opretstående mikroskop, placere 5 mm2 agarose pad direkte på diaset, fulgte den blandede kultur (blå) og en 12 mm cirkulær # 1,5 dække slip. (C) Når billeddannelse på en omvendt mikroskop, spot den blandede kultur direkte på # 1,5 glasdæksel slip bunden af en 35 mm Petri parabol, og placere en agarose pad på toppen af kulturen efterfulgt af en anden 12 mm cirkulær dække slip til flade agarose pad. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tidsforudsnit af møntpladser under enten overfyldte eller spredte forhold. (A) Repræsentative billeder på indledende og sidste tidspunkter, hvor en blandet målkultur og wild-type-hæmmer var koncentreret 3x før spotting på diaset for at tvinge cellecellekontakt mellem stammer. Hvide pile i TRITC-kanalen angiver eksempler på målceller, der runder eller lyse i løbet af eksperimentet. (B) Repræsentative billeder, hvor en blandet kultur af mål- og vildhæmmer blev spottet uden at koncentrere sig, så cellerne spredes, og der er minimal cellecellekontakt mellem stammer. Grå pile i FITC- og TRITC-kanaler angiver eksempler på celledeling i løbet af eksperimentet. (C) Repræsentative billeder, hvor blandet kultur af mål og T6SS- mutant var koncentreret 3x før spotting på diaset for at tvinge celle-celle kontakt mellem stammer. (D) Repræsentative billeder, hvor blandet kultur af mål og T6SS- mutant blev spottet uden at koncentrere sig, så cellerne er spredt, og der er minimal celle-celle kontakt mellem stammer. Skalastænger = 5 μm og er konsistente på tværs af alle billeder; TRITC kanal er falsk-farvet magenta, FITC kanal er falsk-farvet grøn. Deconvolution blev udført på alle billeder; baggrund blev trukket fra, og lysstyrke/kontrast justeret ensartet på tværs af alle billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: FIJI analysearbejdsgang. (A) Repræsentativt billede til analyse. Denne arbejdsproces gentages for begge kanaler på tværs af alle visningsfelter og eksempler. Skalastænger = 5 μm og er konsistente på tværs af alle billeder; TRITC kanal er falsk-farvet magenta, FITC kanal er falsk-farvet grøn. (B) Binær maske, der er oprettet ved at tærskel billedet ved hjælp af standardindstillingerne i FIJI. (C) Eksempel på indstillinger for partikelanalyse, der anvendes i dette manuskript. Størrelsesområde = 0 - uendelig μm2; cirkularitet = 0,00 - 1,00; show = dispositioner. (D) Partikeldisposition skabt som en effekt af partikelanalyse i (C). Partikelkonturen i (D) skal sammenlignes med det oprindelige billede (A) for at sikre, at alle celler blev fanget i partikelanalysen. (E) Resultattabel oprettet som en output fra partikelanalyse i (C). Objektnummer (kolonne 1) svarer til individuelle partikler (en eller flere celler), der er skitseret og mærket med rødt i panelet (D). Etiket = filnavn på analyseret billede; Areal = samlet partikelareal i μm2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Stikprøvedata til vurdering af, om målstammen er hæmmet. Procentdelen af det oprindelige område ved den endelige tid peger for målstammen (A) og inhibitorstammen (B) ved forskellige indledende celletætheder. Slidetæthed angiver enten en startcelletæthed, der er overfyldt (høj cellekontakt mellem stammer) eller mere spredning (lav cellekontakt mellem stammer) som beskrevet i figur 2. Inhibitor genotype angiver, at enten en vild-type eller T6SS mutant (T6SS-) stamme blev coincubated med målet stamme. Stjerner angiver en signifikant forskel i % ændring sammenligne alle behandlinger (envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey flere sammenligninger test sammenligne alle behandlinger; (s < 0,0001). Stiplet linje angiver ingen nettoændring i stammeområdet mellem det oprindelige og det endelige tidspunkt. en ændring i % > 100 indikerer nettostigning (dvs. vækst) og % ændring < 100 indikerer nettofald (dvs. celledød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor giver et kraftfuldt værktøj til kvantificering og karakterisering af interbakteriel konkurrence på enkeltcellet niveau. Denne analyse, som blev udviklet ved at ændre vores CFU-baserede konkurrence assay på agar plader1,2, tilladt for visualisering af enkeltcellet konkurrence blandt V. fischeri isolater og forslag er fastsat til optimering af metoden til en bred vifte af systemer og mikroskopi opsætninger. Selvom den metode, der er beskrevet her, var optimeret til lysorgan symbionten V. fischeri, kan den let ændres for at imødekomme mange forskellige, kultbare mikrober. Det er vigtigt at bemærke , at konkurrencemekanismer kan reguleres af et vilkårligt antal miljøvariabler , herunder temperatur , saltholdighed og viskositet30,31,32,33,34. Tidligere arbejde har bekræftet, at V. fischeri konkurrerer ved hjælp af et kontaktafhængigt Type VI Sekretionssystem, der er aktivt på overflader30, hvilket gør de betingelser, der er beskrevet i denne analyse, egnede til at studere konkurrence mellem eksempelstammerne. Det er også vigtigt at overveje den indledende tæthed af celler på diaset, når kvantificering bakterie konkurrence. I betragtning af at kontakt mellem mål- og hæmmerceller ofte er nødvendig for at dræbe, bør den blandede kultur koncentreres, således at cellecellekontakt maksimeres, og cellerne forbliver i et enkelt plan på diaset. Cellekulturer bør dyrkes til en lignende optisk tæthed (midten af log fase) og derefter koncentreret for at tvinge kontakt snarere end blot voksende kulturer til en højere optisk tæthed på grund af de fysiologiske ændringer af celler i forskellige vækstfaser. I andre systemer kan det være nødvendigt at ændre kulturbetingelserne og forsøgsopsætningen for at sikre, at konkurrencemekanismen er aktiv og kan påvises i møntsætningstilstanden.
De agarose puder, der anvendes i denne analyse giver flere fordele: de giver stabilisering, så cellerne ikke bevæger sig rundt frit, og de forhindrer kulturen i at tørre ud i løbet af eksperimentet. Hvis der er behov for kemiske inducere, såsom isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), til forsøget, kan de desuden let føjes til agaroseopløsningen. Det er dog vigtigt at bemærke, at agarosepræparatet sandsynligvis skal justeres for forskellige systemer. I det ovenfor beskrevne eksempel blev agarosepuden fremstillet ved at opløse 2% agarose (w/v) i 20 psu mPBS, hvilket er den standard saltholdighed, der anvendes i V. fischeri vækstmedium. Desuden kan det i nogle tilfælde være nødvendigt at tilføje en kulstofkilde til agarosepuden, for at cellerne kan vokse og konkurrere om længere forsøg. I et sådant tilfælde kan mPBS i agarosepuder erstattes med ethvert vækstmedium, selv om næringsstofferne i vækstmediet kan komme med afvejningen af yderligere baggrundslyscens.
Uden proprietær billedanalysesoftware kan det være meget svært at få individuelle celletal, når cellecellekontakten er høj, hvilket som vi viser her er forpligtet til at observere kontaktafhængigt drab. Denne analyse var designet til at give en alternativ metode til kvantificering, der ikke er afhængig af individuelle celletal. I stedet bruges det samlede celleområde for hver fluorescenskanal til at kvantificere omfanget af drab mellem coincubated stammer. Da denne metode er afhængig af område i stedet for individuelle celletællinger, er standardtærskelindstillingerne typisk tilstrækkelige til at skitsere det samlede celleområde. Nøjagtigheden af fortæring kan kontrolleres ved at dividere det samlede objektområde for et repræsentativt synsfelt med modelorganismens gennemsnitlige cellestørrelse og sammenligne dette anslåede celletal med et manuelt celleantal for det samme billede.
I coincubations mellem en hæmmer og et mål (ikke-killer) stamme, nettovækst af hæmmeren er forudsagt. Som det ses i figur 4, hæmmer vækst kan være betydeligt højere i behandlinger, hvor drab observeres, sammenlignet med behandlinger, hvor drab ikke observeres, måske fordi næringsstoffer frigivet ved lysning målceller tillade inhibitor stamme til at vokse hurtigere. I eksemplet vist her observeres nettomåldød, fordi T6SS-medieret konkurrence resulterer i målcellelyse, hvor målet elimineres fysisk. Det er dog vigtigt at bemærke, at ikke alle konkurrencemekanismer resulterer i fysisk eliminering af målceller. Hvis et mål er uarbejdsdygtig af et toksin, der forårsager væksthæmning, kan den protokol, der er skitseret her, resultere i, at den synlige målgruppe forbliver stabil over tid, da målceller ikke længere vokser, men heller ikke lyse. I et sådant tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at sammenligne resultaterne af denne analyse med opfølgende test for målcellelevedygtighed, såsom plating for kolonidannende enheder (CFUs) eller ved at udføre levende døde analyser ved farvning med propidium jod eller SYTOX grøn35,36.
Sammenlignet med coincubation assays, der er afhængige af CFU tæller, denne analyse gør det muligt at observere og kvantificere den rumlige struktur af konkurrencen mellem stammer og spore ændringer i mål celle morfologi over tid. For eksempel er hæmmerceller, der dræber ved hjælp af en T6SS, kendt for at kode LysM-domæneproteiner, der nedbryder målcellevæggen, hvilket resulterer i indledende celleafrunding og derefter lysis13, som vi observerede i eksemplet vist i figur 2A. Desuden kan denne protokol bruges til at spore konkurrence i høj opløsning over meget korte tidsskalaer. I det eksempel, der er vist her, observeres et betydeligt fald i målområdet efter kun to timer, når celler er overfyldte, og cellecellekontakt tvinges mellem stammer (Figur 4). Den billedanalyse, der er beskrevet her, kunne også udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi, hvilket ville gøre det muligt at studere bakteriekonkurrence in vivo eller i komplekse biofilm uden at forstyrre den rumlige fordeling af coincubated stammer.
Sammenfattende har analysen beskrevet her til formål at give en tilgængelig og let modificeret tilgang til visualisering og kvantificering af bakteriekonkurrence på enkeltcelleniveau ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Denne metode kan anvendes på forskellige bakteriel isolater og kan bruges til at visualisere bakteriel konkurrence selv i komplekse miljøer som inden for en vært eller biofilm matrix.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
A.N.S blev støttet af NIGMS tilskud R35 GM137886 og S.N.S blev støttet af National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 uL single channel pipette | |||
| 1000 uL single channel pipette | |||
| 20 uL single channel pipette | |||
| 200 uL single channel pipette | |||
| Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
| Calculator | |||
| Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
| FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Razor Blades | Fisher | S65921 | |
| Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| Spectrophotometer | |||
| SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
| Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
| Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
| Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
| Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
| Vortex | |||
| Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
| mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
| 10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
| Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
| Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |
References
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (36), 8528-8537 (2018).
- Speare, L., Septer, A. N. Coincubation assay for quantifying competitive interactions between Vibrio fischeri isolates. Journal of Visualized Experiments. (149), e59759 (2019).
- Frost, I., et al. Cooperation, competition and antibiotic resistance in bacterial colonies. The ISME journal. 12 (6), 1582-1593 (2018).
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial communities: interactions to scale. Frontiers in Microbiology. 7, 1234 (2016).
- Souza, D. P., et al. Bacterial killing via a type IV secretion system. Nature Communications. 6 (1), 1-9 (2015).
- Anderson, M. C., Vonaesch, P., Saffarian, A., Marteyn, B. S., Sansonetti, P. J. Shigella sonnei encodes a functional T6SS used for interbacterial competition and niche occupancy. Cell Host and Microbe. 21 (6), 769-776 (2017).
- Basler, M., Ho, B., Mekalanos, J. Tit-for-tat: Type VI secretion system counterattack during bacterial cell-cell interactions. Cell. 152 (4), 884-894 (2013).
- Guillemette, R., Ushijima, B., Jalan, M., Häse, C. C., Azam, F. Insight into the resilience and susceptibility of marine bacteria to T6SS attack by Vibrio cholerae and Vibrio coralliilyticus. PloS One. 15 (1), 0227864 (2020).
- Hachani, A., Lossi, N. S., Filloux, A. A visual assay to monitor T6SS-mediated bacterial competition. Journal of Visualized Experiments. (73), e50103 (2013).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Ruhe, Z. C., Low, D. A., Hayes, C. S. Bacterial contact-dependent growth inhibition. Trends in Microbiology. 21 (5), 230-237 (2013).
- Wood, D. W., Pierson, L. S. The phzI gene of Pseudomonas aureofaciens 30-84 is responsible for the production of a diffusible signal required for phenazine antibiotic production. Gene. 168 (1), 49-53 (1996).
- Smith, W. P., et al. The evolution of the type VI secretion system as a disintegration weapon. PLoS Biology. 18 (5), 3000720 (2020).
- Chen, L., Zou, Y., She, P., Wu, Y. Composition, function, and regulation of T6SS in Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research. 172, 19-25 (2015).
- Sana, T. G., Lugo, K. A., Monack, D. M. T6SS: The bacterial "fight club" in the host gut. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006325 (2017).
- Basler, M. Type VI secretion system: secretion by a contractile nanomachine. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1679), 20150021 (2015).
- Joshi, A., et al. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in Microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 589-600 (2016).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of Bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Septer, A. N. The Vibrio-squid symbiosis as a model for studying interbacterial competition. Msystems. 4 (3), (2019).
- Tischler, A. H., Hodge-Hanson, K. M., Visick, K. L. Vibrio fischeri-squid symbiosis. eLS. , 1-9 (2019).
- Mandel, M. J., Dunn, A. K. Impact and influence of the natural Vibrio-squid symbiosis in understanding bacterial-animal interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1982 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Boettcher, K., Ruby, E. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna Scolopes. Journal of Bacteriology. 172 (7), 3701-3706 (1990).
- Doino, J. A., McFall-Ngai, M. J. A transient exposure to symbiosis-competent bacteria induces light organ morphogenesis in the host squid. The Biological Bulletin. 189 (3), 347-355 (1995).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environmental Microbiology. 6 (7), 726-732 (2004).
- Koch, B., Jensen, L. E., Nybroe, O. A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. Journal of Microbiological Methods. 45 (3), 187-195 (2001).
- Peterson, B. W., Sharma, P. K., Van Der Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial cell surface damage due to centrifugal compaction. Applied and Environmental Microbiology. 78 (1), 120-125 (2012).
- Speare, L., Smith, S., Salvato, F., Kleiner, M., Septer, A. N. Environmental viscosity modulates interbacterial killing during habitat transition. MBio. 11 (1), (2020).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), 61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (34), 5044-5051 (2016).
- Bachmann, V., et al. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (8), 0004031 (2015).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and Immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15 (1), 36 (2015).
