Dette manuskript beskriver en metode til brug af enkeltcellet fluorescensmikroskopi til at visualisere og kvantificere bakteriekonkurrence i coculture.
Interbakteriel konkurrence kan direkte påvirke strukturen og funktionen af mikrobiomer. Dette arbejde beskriver en fluorescensmikroskopi tilgang, der kan bruges til at visualisere og kvantificere konkurrencedygtige interaktioner mellem forskellige bakteriestammer på encellet niveau. Protokollen beskrevet her giver metoder til avancerede tilgange i dias forberedelse på både opretstående og omvendt epifluorescence mikroskoper, live-celle og time-lapse billeddannelse teknikker, og kvantitative billedanalyse ved hjælp af open source-software FIJI. Tilgangen i dette manuskript skitserer kvantificeringen af konkurrencedygtige interaktioner mellem symbiotiske Vibrio fischeri populationer ved at måle ændringen i området over tid for to coincubated stammer, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner fra stabile plasmider. Alternative metoder er beskrevet til optimering af denne protokol i bakterielle modelsystemer, der kræver forskellige vækstbetingelser. Selv om analysen beskrevet her bruger betingelser optimeret til V. fischeri, denne tilgang er meget reproducerbar og kan nemt tilpasses til at studere konkurrence blandt kultbare isolater fra forskellige mikrobiomer.
Denne artikel skitserer en metode til kvantificering bakterie konkurrence på encellet niveau ved hjælp af fluorescens mikroskopi. Strukturen og funktionen af mikrobielle samfund er ofte formet af konkurrencedygtige interaktioner mellem mikrober, og i mange tilfælde karakterisere disse interaktioner kræver observere forskellige bakteriestammer i coincubation1,2,3,4,5,6,7,8 . Traditionelt er bakteriekonkurrence kvantificeret på befolkningsniveau ved at tælle kolonidannende enheder (CFO’er) af hæmmer- og målstammer før og efter en møntperiode2,9. Mekanismerne til mikrobiel konkurrence er bredt fordelt mellem bakterier og kan stole på enten diffusion eller cellecellekontakt for at hæmmemålcellerne 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.
Selv om bakteriestammer ofte observeres i coincubation på befolkningsniveau, skitserer dette manuskript en analyse for kvantificering af bakteriel konkurrence. Endvidere omfatter dette arbejde forslag til tilpasning af protokollen til brug med andre bakteriearter. Mens de specifikke teknikker i denne artikel bruges til at studere kontaktafhængig intraspecifik konkurrence mellem stammer af den symbiotiske bakterie Vibrio fischeri20,21,22, kan de tilpasses til konkurrence mellem mange organismer. Denne artikel indeholder instruktioner til diasopsætning på både opretstående og omvendte mikroskoper, og al analyse beskrives ved hjælp af open source-softwaren FIJI23, så metoden kan bruges af forskere med adgang til forskellige billedopsætninger og analyseprogrammer. I betragtning af vigtigheden af at studere mikrobiel konkurrence på både befolkningsniveau og encellet niveau vil denne metode være en værdifuld ressource for forskere til at kvantificere konkurrencemæssige interaktioner, især dem, der ikke har adgang til proprietær analysesoftware.
Protokollen beskrevet ovenfor giver et kraftfuldt værktøj til kvantificering og karakterisering af interbakteriel konkurrence på enkeltcellet niveau. Denne analyse, som blev udviklet ved at ændre vores CFU-baserede konkurrence assay på agar plader1,2, tilladt for visualisering af enkeltcellet konkurrence blandt V. fischeri isolater og forslag er fastsat til optimering af metoden til en bred vifte af systemer og mikroskopi opsætninger. Selvom den metode, der er beskrevet her, var optimeret til lysorgan symbionten V. fischeri, kan den let ændres for at imødekomme mange forskellige, kultbare mikrober. Det er vigtigt at bemærke , at konkurrencemekanismer kan reguleres af et vilkårligt antal miljøvariabler , herunder temperatur , saltholdighed og viskositet30,31,32,33,34. Tidligere arbejde har bekræftet, at V. fischeri konkurrerer ved hjælp af et kontaktafhængigt Type VI Sekretionssystem, der er aktivt på overflader30, hvilket gør de betingelser, der er beskrevet i denne analyse, egnede til at studere konkurrence mellem eksempelstammerne. Det er også vigtigt at overveje den indledende tæthed af celler på diaset, når kvantificering bakterie konkurrence. I betragtning af at kontakt mellem mål- og hæmmerceller ofte er nødvendig for at dræbe, bør den blandede kultur koncentreres, således at cellecellekontakt maksimeres, og cellerne forbliver i et enkelt plan på diaset. Cellekulturer bør dyrkes til en lignende optisk tæthed (midten af log fase) og derefter koncentreret for at tvinge kontakt snarere end blot voksende kulturer til en højere optisk tæthed på grund af de fysiologiske ændringer af celler i forskellige vækstfaser. I andre systemer kan det være nødvendigt at ændre kulturbetingelserne og forsøgsopsætningen for at sikre, at konkurrencemekanismen er aktiv og kan påvises i møntsætningstilstanden.
De agarose puder, der anvendes i denne analyse giver flere fordele: de giver stabilisering, så cellerne ikke bevæger sig rundt frit, og de forhindrer kulturen i at tørre ud i løbet af eksperimentet. Hvis der er behov for kemiske inducere, såsom isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), til forsøget, kan de desuden let føjes til agaroseopløsningen. Det er dog vigtigt at bemærke, at agarosepræparatet sandsynligvis skal justeres for forskellige systemer. I det ovenfor beskrevne eksempel blev agarosepuden fremstillet ved at opløse 2% agarose (w/v) i 20 psu mPBS, hvilket er den standard saltholdighed, der anvendes i V. fischeri vækstmedium. Desuden kan det i nogle tilfælde være nødvendigt at tilføje en kulstofkilde til agarosepuden, for at cellerne kan vokse og konkurrere om længere forsøg. I et sådant tilfælde kan mPBS i agarosepuder erstattes med ethvert vækstmedium, selv om næringsstofferne i vækstmediet kan komme med afvejningen af yderligere baggrundslyscens.
Uden proprietær billedanalysesoftware kan det være meget svært at få individuelle celletal, når cellecellekontakten er høj, hvilket som vi viser her er forpligtet til at observere kontaktafhængigt drab. Denne analyse var designet til at give en alternativ metode til kvantificering, der ikke er afhængig af individuelle celletal. I stedet bruges det samlede celleområde for hver fluorescenskanal til at kvantificere omfanget af drab mellem coincubated stammer. Da denne metode er afhængig af område i stedet for individuelle celletællinger, er standardtærskelindstillingerne typisk tilstrækkelige til at skitsere det samlede celleområde. Nøjagtigheden af fortæring kan kontrolleres ved at dividere det samlede objektområde for et repræsentativt synsfelt med modelorganismens gennemsnitlige cellestørrelse og sammenligne dette anslåede celletal med et manuelt celleantal for det samme billede.
I coincubations mellem en hæmmer og et mål (ikke-killer) stamme, nettovækst af hæmmeren er forudsagt. Som det ses i figur 4, hæmmer vækst kan være betydeligt højere i behandlinger, hvor drab observeres, sammenlignet med behandlinger, hvor drab ikke observeres, måske fordi næringsstoffer frigivet ved lysning målceller tillade inhibitor stamme til at vokse hurtigere. I eksemplet vist her observeres nettomåldød, fordi T6SS-medieret konkurrence resulterer i målcellelyse, hvor målet elimineres fysisk. Det er dog vigtigt at bemærke, at ikke alle konkurrencemekanismer resulterer i fysisk eliminering af målceller. Hvis et mål er uarbejdsdygtig af et toksin, der forårsager væksthæmning, kan den protokol, der er skitseret her, resultere i, at den synlige målgruppe forbliver stabil over tid, da målceller ikke længere vokser, men heller ikke lyse. I et sådant tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at sammenligne resultaterne af denne analyse med opfølgende test for målcellelevedygtighed, såsom plating for kolonidannende enheder (CFUs) eller ved at udføre levende døde analyser ved farvning med propidium jod eller SYTOX grøn35,36.
Sammenlignet med coincubation assays, der er afhængige af CFU tæller, denne analyse gør det muligt at observere og kvantificere den rumlige struktur af konkurrencen mellem stammer og spore ændringer i mål celle morfologi over tid. For eksempel er hæmmerceller, der dræber ved hjælp af en T6SS, kendt for at kode LysM-domæneproteiner, der nedbryder målcellevæggen, hvilket resulterer i indledende celleafrunding og derefter lysis13, som vi observerede i eksemplet vist i figur 2A. Desuden kan denne protokol bruges til at spore konkurrence i høj opløsning over meget korte tidsskalaer. I det eksempel, der er vist her, observeres et betydeligt fald i målområdet efter kun to timer, når celler er overfyldte, og cellecellekontakt tvinges mellem stammer (Figur 4). Den billedanalyse, der er beskrevet her, kunne også udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi, hvilket ville gøre det muligt at studere bakteriekonkurrence in vivo eller i komplekse biofilm uden at forstyrre den rumlige fordeling af coincubated stammer.
Sammenfattende har analysen beskrevet her til formål at give en tilgængelig og let modificeret tilgang til visualisering og kvantificering af bakteriekonkurrence på enkeltcelleniveau ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Denne metode kan anvendes på forskellige bakteriel isolater og kan bruges til at visualisere bakteriel konkurrence selv i komplekse miljøer som inden for en vært eller biofilm matrix.
The authors have nothing to disclose.
A.N.S blev støttet af NIGMS tilskud R35 GM137886 og S.N.S blev støttet af National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship Program.
1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
10 uL single channel pipette | |||
1000 uL single channel pipette | |||
20 uL single channel pipette | |||
200 uL single channel pipette | |||
Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
Calculator | |||
Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Razor Blades | Fisher | S65921 | |
Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
Spectrophotometer | |||
SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
Vortex | |||
Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
LBS media | |||
1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |