Summary
Protokollerne beskriver højtydende flydende kromatografi metoder koblet til brydningsindeks eller massespektrometrisk detektion til undersøgelse af metaboliske reaktioner i komplekse lysat-baserede celle-fri systemer.
Abstract
Engineering cellulære metabolisme til målrettet biosyntese kan kræve omfattende design-build-test-learn (DBTL) cykler som ingeniør arbejder omkring cellens overlevelse krav. Alternativt kan udførelse af DBTL-cyklusser i cellefrie miljøer fremskynde denne proces og afhjælpe bekymringer med værtskompatibilitet. En lovende tilgang til cellefri metabolisk teknik (CFME) udnytter metabolisk aktive råcelleekstrakter som platforme for biofremstilling og til hurtigt at opdage og prototyping modificerede proteiner og veje. Realisering af disse funktioner og optimering af CFME-ydeevne kræver metoder til at karakterisere metabolomet af lysatbaserede cellefrie platforme. Det vil sige, at analytiske værktøjer er nødvendige for at overvåge forbedringer i målrettede metabolitkonverteringer og til at belyse ændringer af metabolitstrøm, når man manipulerer lysatmetabolisme. Her blev metabolitanalyser ved hjælp af højtydende flydende kromatografi (HPLC) kombineret med enten optisk eller massespektrometrisk detektion anvendt til at karakterisere metabolitproduktion og flux i E. coli S30-lysater. Konkret beskriver denne rapport forberedelsen af prøver fra CFME-lysater til HPLC-analyser ved hjælp af brydningsindeksdetektering (RID) for at kvantificere produktionen af centrale metaboliske mellemprodukter og biprodukter i omdannelsen af billige substrater (dvs. glukose) til forskellige produkter af høj værdi. Analysen af metabolitkonvertering i CFME-reaktioner fodret med 13C-mærket glukose gennem omvendt fase flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (MS / MS), et kraftfuldt værktøj til at karakterisere specifikke metabolit udbytter og lysat metabolisk flux fra udgangsmaterialer, er også præsenteret. Alt i alt gør anvendelsen af disse analysemetoder til CFME lysatmetabolisme det muligt at fremme disse systemer som alternative platforme til udførelse af hurtigere eller nye metaboliske tekniske opgaver.
Introduction
Begrænsninger i tekniske mikrober til kemisk produktion kan løses ved at generobre biokemiske reaktioner in vitro, hvor konkurrerende cellulære overlevelsesfunktioner er fraværende1. Desuden er det åbne reaktionsmiljø (dvs. fravær af en cellemembran) mere modtageligt for manipulation og er lettere at overvåge sammenlignet med levende celler. Dette grundlæggende koncept for cellefri metabolisk teknik (CFME) er elegant blevet demonstreret ved rekonstitution af metaboliske veje til at syntetisere værdifulde kemikalier som brint og monoterpener med produktionsmålinger, der er størrelsesordener højere end præsenteret i mikrobielle cellefabrikker hidtil1,2,3 . Metoder til rensning af hele veje er imidlertid i øjeblikket begrænset af tid og omkostninger. Alternativt kan cellefrie metaboliske systemer udledes af råcelleekstrakter gennem hurtige og billige metoder i forhold til hele vejen rekonstitution4. Det centrale stofskifte, der opbevares i celleekstrakter, kan suppleres med energisubstrater (f.eks. glukose og enzymatiske cofaktorer) og salte i bufferede opløsninger til at generere centrale metaboliske prækursorer i over 24 timer5,6. Tilsætning af udefrakommende enzymer til den lysatbaserede CFME-reaktion giver mulighed for mere komplekse biotransformationer af glukose til mere værdifulde kemikalier ved høje titere4,6,7. Selvom udbyttet har tendens til at blive kompromitteret i disse systemer på grund af deres cellelignende metaboliske kompleksitet, er der og er ved at blive udviklet unikke metoder til at kuratere lysatproetomer til højere udbyttekonvertering7,8.
Den nemme at udføre metaboliske transformationer i lysatbaserede cellefrie systemer gør disse fremragende platforme til enten at flytte kemisk produktion uden for cellen helt eller til prototype af nye veje med høj gennemløb, før de bygger og tester disse designs in vivo2,9. For enten anvendelse, værktøjer til overvågning metaboliske konverteringer eller observere generelle ændringer til metabolisk flux i lysater er en integreret del af udviklingen af CFME. Højtydende flydende kromatografi (HPLC) kan anvendes til at adskille de kemiske bestanddele af CFME-reaktioner med høj opløsning og kan kobles til optiske eller massespektrometrære detektorer til metabolitkvantificering5,10. Det grundlæggende princip i HPLC er, at analytter opløst i et opløsningsmiddel (dvs. mobil fase) og pumpes gennem en kolonne vil interagere med den specifikke kolonne emballage materiale (dvs. stationær fase)11. Afhængigt af deres kemiske egenskaber udviser disse analytter varierende retentionstider, før de til sidst eluteres fra den stationære fase og bæres af den mobile fase til en detektor. Denne rapport beskriver udarbejdelsen og analysen af E. coli lysate-baserede CFME-reaktioner gennem HPLC-baserede metoder, der udnytter RID og MS/MS-detektion.
HPLC koblet til brydningsindeksdetektering (HPLC-RID) er en generelt tilgængelig metode til hurtigt at identificere centrale metaboliske prækursorer og slutprodukter. Kort sagt måler RID, hvordan analytter ændrer lysafbøjningen i den mobile fase12. RID-signaler svarende til målanaytter i prøver kan derefter kvantificeres ved sammenligninger med RID-signaler fra standardopløsninger. I CFME-programmer har denne detektionsmåde oftest været anvendt med HPLC-kolonner, der adskiller forbindelser baseret på en kombination af størrelsesudelukkelses- og ligandudvekslingsmekanismer eller ion-modereret partitionskromatografi5,6,8,13. Denne særlige teknik bruges til hurtigt at kvantificere forbruget af sukkersubstrater som glukose samt dannelsen af fermenteringsprodukter som succinate, laktat, format, acetat og ethanol i lysatbaserede CFME-reaktioner8. Registrering af koncentrationsændringerne af disse forbindelser via HPLC har været nyttig til både at belyse potentialet i råcelleekstrakter til at samle centrale metaboliske prækursorer og forstå, hvordan vejstrøm omdirigeres gennem fermentative veje under komplekse metaboliske konverteringer fra glukose i lysater6,8,14. Skelsættende CFME-undersøgelser i E. coli-celleekstrakter bekræfter, at fermenteringsforbindelser ophobes som slutprodukter af glukosekatabolisme og også forekommer som uønskede biprodukter i lysater, der overekspresserer eksogene enzymer6,15. Det foreslås, at fermentativ metabolisme spiller en nødvendig rolle i regenerering af redox ækvivalenter af cofaktorer (dvs. NAD (P)H og ATP) til at opretholde glykolytiske reaktioner8. Derfor er en HPLC-baseret optisk detektionsmetode designet til at adskille fermenteringsprodukter et nyttigt og almindeligt anvendt værktøj, når der udføres forskellige lysatbaserede CFME-opgaver.
CFME kan implementeres for at akkumulere metaboliske slutprodukter, der ikke er kulhydrater, organiske syrer eller alkoholer4. Måling af mellemprodukter, der forbruges så hurtigt som de syntetiseres, kan også være ønskeligt10. Mens HPLC-RID er tilgængelig med hensyn til omkostninger og vanskeligheder, er denne metode begrænset af dens evne til kun at skelne metabolitter baseret på opbevaringstid. En bredere vifte af metabolitter kan analyseres, når flydende kromatografi kobles til MS/MS detection (LC-MS/MS)16. Ved denne metode er analytter i den mobile fase ioniseret og differentieret detekteret baseret på hvert molekyles masse- og opladningsegenskaber. Kendskab til både metabolitens masse-til-opladningsforhold (m/z) og opbevaringstid på kolonnen letter således adskillelsen af de fleste metaboliske mellemprodukter og slutprodukter med høj opløsning16. Denne detektionsteknik kan også kobles til nano-flydende kromatografi, som giver meget lavere strømningshastigheder og prøveindsprøjtningsmængder, hvilket giver mulighed for mere følsom påvisning af små molekyler i den komplekse lysatbaggrund17. LC-MS/MS kan desuden anvendes med isotopmærkning, da indbygget etiketter giver ændringer i analytes m/z-værdier18. Timepointmålinger udvundet af en CFME-reaktion suppleret med et 13C6-glukosesubstrat kan således bestemme de slut- eller biprodukter, der er afledt specifikt af suppleret glukose. Selvom denne isotopsporingsmetode endnu ikke anvendes almindeligt i CFME-undersøgelser, er det et effektivt værktøj til at forstå metaboliske konverteringer i lysatbaserede CFME-systemer, specifikt da salttællere (dvs. acetat og glutamat) i disse reaktioner også kataboliseres som sekundære substrater19. Udnyttelse af denne teknik kan således tegne et omfattende billede af glukosemetabolisme i lysater, som den dag i dag ikke er helt forstået. Her beskriver protokollen en metode til nano-flydende kromatografi koblet til nanoelektrosprayionisering (nano ESI) MS/MS, der kan bruges til at afhøre en mulig model for glukosemetabolisme, specielt i E. coli lysater (Figur 1). Modellen er baseret på rapporter om fermentative veje, og pentosephosphatvejen er aktiv i E. coli lysater, der stammer fra stammer, der dyrkes i rige medier5,6,8,14. Teknikken bruges desuden til at undersøge aminosyreproduktion, da den nuværende viden om aminosyre anabolisme fra glukose i lysater er begrænset til et par eksempler såsom syntesen af aromatiske aminosyrer7. I betragtning af den mest polære karakter af slutprodukter og mellemprodukter i disse veje (dvs. organiske syrer, sukkerphosphater og aminosyrer), blev omvendt faset flydende kromatografi udnyttet her. Denne teknik adskiller polarforbindelser ved elution fra en ikkepolær stationær fase. Disse forbindelser blev derefter ioniseret af nano ESI i negativ ion-tilstand, som gør det muligt at detektere analytter med mindst én negativ elementarladning og er derfor nyttig til påvisning af sure forbindelser. Denne teknik anvendes her til at analysere glukose-afledte 13C-indarbejde metabolitter og demonstrerer nytten af LC-MS / MS til forståelse af glukosemetabolisme i lysater.
Protocol
1. Start, standsning og behandlingstid cfme reaktioner for HPLC-RID kvantificering.
- Optø tidligere tilberedte E. coli lysater og forberede resten af reaktionskomponenterne på is.
BEMÆRK: De lysater, der er rapporteret her, stammer fra E. coli BL21DE3-Star dyrket i 2xYPTG (1,8 % glukose) medier til midten af logfasen.- Der fremstilles en passende mængde filtersteriliseret (0,20 μm porefilter) S30-buffer (1 M Tris-OAc justeret til pH 8,2 med iseddikesyre, 1,4 M Mg(OAc)2og 6 M KOAc).
- Forbered en energiblanding indeholdende glukose, glutamatsalte, ATP, Coenzym A, NAD+, Bis-Tris buffer og dipotassiumphosphat i S30-bufferen. Endelige koncentrationer i det ønskede reaktionsvolumen, der blev brugt til at forberede CFME-reaktioner her, var 100 mM glutamat, 18 mM magnesiumglutamat, 15 mM ammonium glutamat, 195 mM kaliumglutamat, 1 mM ATP, 0,2 mM Coenzym A, 1 mM NAD+, 150 mM Bis-Tris og 10 mM dipotassium fosfat.
- Kombiner komponenterne i 1,5 mL mikrocentrifugerør for at forberede endelige reaktioner med 4,5 mg/mL total lysatprotein. Her blev CFME-reaktioner forberedt med endelige mængder på 50 μL i tredobling pr. timepoint. Inkuberes ved 37 °C for deres respektive tidsrammer.
BEMÆRK: Arbejd hurtigt og tilsæt lysat som den sidste komponent i reaktionsmikset for at forhindre for tidlige metaboliske reaktioner med glukose og glutamatsalte. Minimalt glukoseforbrug kan forekomme afhængigt af, hvor lange reaktionsblandinger inkuberes på is. - Afslut reaktionerne, og behandl prøverne til HPLC-RID-analyse.
- For at afslutte trepartsreaktionerne på det rette tidspunkt skal der straks tilsættes et tilsvarende volumen på 5 % trichloreddikesyre til hver prøves endelige reaktionsvolumen (dvs. 50 μL 5 % trichloreddikesyre til en 50 μL-reaktion). Hver prøve fortyndes med sterilt vand ved 2x reaktionsvolumen (dvs. 100 μL).
- For at generobre tid nul skal det samme volumen på 5 % trichloreddikesyre blandes som det samlede endelige reaktionsvolumen (dvs. 50 μL) med lysatet, før resten af reaktionskomponenterne tilsættes. Dette forsuringstrin udfælder lysatenzymer, før de væsentligt metaboliserer glukose.
- Hvirvle prøverne og centrifuge på en bordplade mikrocentrifuge ved 11.600 x g i 5 min og overføre supernatants indeholdende de organiske analytter til at rense rør. Prøverne opbevares ved -20 °C, hvis HPLC-analyserne skal udføres på en anden dag. Sørg for at optø de lagrede prøver på is, før du går videre til næste trin.
- Filtrer hver supernatant med et 0,22 μm porefilter. Som et alternativ til sprøjter skal du bruge centrifugerørfiltre og centrifugere supernatanterne ved 16.300 x g i 1 min.
- Overfør hver filtrat til et rent HPLC-glasglasglas. Læg hætteglas på HPLC-autosamplerbakken.
- Forbered prøver til standardkurvegenerering.
- Forbered en lageropløsning af alle målanaytter opløst i S30-buffer ved equimolarmængder over startkoncentrationen af glukose i CFME-reaktionerne. Her blev der fremstillet en lageropløsning bestående af 150 μM glukose, succinate, laktat, format, acetat og ethanol. Udfør 1:1 (v/v) serielle fortyndinger fra lageropløsningen for at opnå tredelt 50 μL-opløsninger med endelige koncentrationer fra 0 μM til lagerkoncentrationen (dvs. 150 μM).
- Fortynd hver opløsning med 50 μL 5% trichloreddikesyre og 100 μL sterilt vand. Gentag trin 1.3.4-1.3.5.
BEMÆRK: Kør løsninger til standardkurvegenerering med hvert parti prøver for at sikre nøjagtig kvantificering af metabolitkoncentrationer.
2. Forberedelse af HPLC-systemet til metabolitdetektering.
- Under en røghætte fremstilles en steriliseret 5 mM svovlsyreopløsning fra deioniseret og filtersteriliseret vand. Tilsæt ~550 μL af en 98% HPLC-kvalitet svovlsyreopløsning til 2 L vand for at forberede 5 mM svovlsyre.
FORSIGTIG: Svovlsyre er et farligt kemikalie, og at arbejde under en røghætte med korrekt laboratorie-PPE forhindrer indånding, hudkontakt og øjenkontakt. Koncentreret svovlsyre reagerer kraftigt med vand og bør tilsættes direkte til vand, ikke omvendt. Opbevar i et køligt, tørt område væk fra direkte sollys og følg ordentlige affaldsbortskaffelsesforanstaltninger, der er fastsat af laboratoriet. - Hold 2 L-flasken med 5 mM svovlsyre inkuberet i et vandbad ved siden af HPLC-instrumentet. Sæt vandbadet til 35 °C. Placer slanger med et opløsningsmiddelfilter i opløsningsmiddelflasken, og fastgør den anden ende til et degassermodul i overensstemmelse med pumpemodulet.
BEMÆRK: Udrensning af systemet med et frisklavet opløsningsmiddel før montering af kolonnen er god instrumenthåndteringspraksis. - Udstyr HPLC-instrumentet med HPLC-kolonnen i overensstemmelse med RID-modulet. Placer kolonnen i 35 °C-vandbadet, hvis der ikke er en kolonnetermostat til rådighed.
- Forbered RID-modulet til analyse ved 35 °C i CDS-software (Chromatography Data System), der er installeret på systemcomputeren.
- Vælg metode i menuen Vis , og kør kontrolvisning. Højreklik på pumpmodulet > metode. Indstil strømningshastighed til 0,55 mL·min-1, og vælg knappen Til for at starte pumpen.
BEMÆRK: Hvis kolonnen var på lager, før den blev udstyret på HPLC, skal strømningshastigheden skrues op til 0,55mL·min-1 efter ekvilibrering af kolonnen efter fabrikantens anvisninger. - Højreklik på panelet svarende til RID Module > Metode. Indstil temperaturen på RI-detektormodulet til 35 °C, og vælg Til for at begynde at opvarme RI-detektormodulet.
- Højreklik på panelet RID Module > Control. Vælg Til for purge referencecellen i mindst 15 min, når du bruger et frisk opløsningsmiddel eller 1 time, hvis forskellige opløsningsmidler flød gennem RI-detektoren før denne opsætning. Klik på knappen Til.
BEMÆRK: Hold pumpen og RI-detektoren tændt for at opnå en stabil baseline på online plottet. Dette påvirkes af temperaturudsving i laboratoriet og kan tage op til 4 timer eller længere. Hold systemet tændt natten over før prøveindlæsning.
- Vælg metode i menuen Vis , og kør kontrolvisning. Højreklik på pumpmodulet > metode. Indstil strømningshastighed til 0,55 mL·min-1, og vælg knappen Til for at starte pumpen.
3. Oprettelse af en metode til isokratisk HPLC-adskillelse af organiske fermenteringsprodukter i CDS.
- Vælg Metode > ny metode påmenulinjen . Vælg metode > Gem metode som [MethodName].M. Vælg metode > Rediger hele metoden > Instrument/Anskaffelse
- Angiv flowet til 0,55 mL·min-1under fanen Binær pumpe. Under Opløsningsmidlerskal du vælge det bogstav, der svarer til opløsningsmiddeltilførslen på pumpemodulet, og indstille det til 100 % for isokratisk fortynding. Indstil trykgrænser til 0 og 400 bar og input 30 min som Stoptime.
- Angiv injektionsvolumenet til 50 μL under fanen Sampler. Angiv indstillingerne for avanceret auxillary for trækhastighed, udslyngningshastighedog tegnposition til 200 μL·min-1, 200 μL·min-1og -0,5 mm.
- Angiv optisk enhedstemperatur til 35 °C under fanen RID. Vælg Hent for Signal og >0,2 min. for Peakwidthunder Signal. Vælg indstillingen Som pumpe/injektor for Stoptime.
- Under Avanceret under fanen RID skal du indstille Analog output til 5 % nulforskydning og 500.000 nRIU til dæmpning. Vælg indstillingen Positiv for signalpolaritet og indstillingen Til for Automatisk nul før analyse.
- Gem metoden ved at vælge Metode > Gem metode. Indlæs metoden ved at vælge Metode > Load Method > [MethodName]. M.
4. Oprettelse af en sekvenstabel til automatiskampling og start af HPLC-RID-systemet til dataindsamling.
- Vælg Sekvens > ny sekvensskabelon påmenulinjen . Vælg Sekvens > Gem sekvensskabelon som [SequenceTemplateName]. S.
- Vælg sekvens > sekvenstabel. Tilføj 'n' rækker svarende til 'n' hætteglas, og derefter input hætteglas positioner og prøve navne under Hætteglas og Sample Navn, henholdsvis i henhold til deres arrangement på autosampler bakken. Vælg den metode, der genereres i trin 3, i rullemenuen Metodenavn, og indtast 50 μL som Inj/Hætteglas (injektion pr. hætteglas) for hver række.
- Klik på Anvend, og gem sekvensskabelonen ved at vælge Sekvensskabelon > Gem sekvensskabelon. Kontroller, at sekvensskabelonen indlæses ved at vælge Sekvens > Indlæs sekvensskabelon > [SequenceTemplateName]. S.
- Når du har opnået en stabil baseline på online plottet, skal du højreklikke på panelet RID Module > Control > Off Recycling Valve for at lede opløsningsmiddelstrømmen gennem RID-detektoren til affald. Hvis du vil starte dataindsamlingen, skal du vælge Sekvens på menulinjen, Sekvens > Kør.
5. Udpakning og analyse af data efter kørslen.
- Vælg dataanalyse i menuen Vis. Find sekvensfilnavnet på fillisten i venstre side af skærmen. Gå til markering af signalvisning > RID-signal i det midterste panel på skærmen for at få vist eksempelkromamatogrammet.
- Vælg en række, der svarer til en standardprøve med høj koncentration, fra det øverste panel på skærmen. Vær opmærksom på opbevaringstiderne for målanaysandtoppene på det viste kromatogram. Toppe svarende til målanalytterne vil blive arrangeret langs retentionstidsaksen som glukose, succinate, laktat, format, acetat og ethanol (supplerende figur 1).
BEMÆRK: Den første store top på kromatogrammet svarer til trichloreddikesyre. Dens RI-enheder skal være konsistente på tværs af alle standardkurveprøver. Valider opbevaringstiden for hver målanaysand ved at køre hver forbindelse som en separat prøve. - Uddrag spidsområder for hvert mål analysand fra kromatogrammer af standarderne og reaktionsprøverne.
- Skelne, om toppe-af-interesse er godt integreret af softwaren. Tegn den røde linje som bunden af hver top for at opnå et præcist integreret område under kurven. Hvis automatisk integration mislykkes (dvs. rød linje er skæv), skal du vælge knappen Manuel integration fra integrationsværktøjssættet og manuelt tegne en topbase for at integrere spidsområdet.
BEMÆRK: Hvis manuel integration skal udføres for en målanalysand i én prøve, skal du holde ensartet og manuelt integrere den samme analysand på tværs af alle prøver. - Vælg værktøjet Cursor i det fælles værktøjssæt for at klikke på korrekt integrerede toppe. Spidsområdet og den tilsvarende opbevaringstid for den valgte spids fremhæves som en tabelrække i skærmens nederste panel.
- Hvis du vil eksportere spidsbelastningsområder, skal du vælge Filer > Eksportere > integrationsresultater.
- Skelne, om toppe-af-interesse er godt integreret af softwaren. Tegn den røde linje som bunden af hver top for at opnå et præcist integreret område under kurven. Hvis automatisk integration mislykkes (dvs. rød linje er skæv), skal du vælge knappen Manuel integration fra integrationsværktøjssættet og manuelt tegne en topbase for at integrere spidsområdet.
- Kvantificer målanaysandkoncentrationerne ved hjælp af standardkurver.
- Afbilde topområdeværdier i forhold til kendte koncentrationer af prøver i et regneark. Højreklik på de afbildede data, Tilføj tendenslinje > Format trendline > Display equation i diagrammet.
- I et separat regneark skal du bruge ligninger af standardkurvetendenslinjer til at konvertere topområdeværdier til koncentrationer for hver analysand fra hver prøve. Beregn de gennemsnitlige spidsbelastningsområder og standardfejlværdier på tværs af tredoliceringer til datavisualisering.
6. Start, standsning og behandlingstid kursus isotop sporing CFME reaktioner for LC-MS / MS kvantificering.
- Opsætning af trelicate reaktioner pr. tidspunkt (undtagen tid nul) på is som beskrevet i punkt 1.1-1.2. Men i stedet for glukose, bruge en endelig koncentration på 100 mM 13C6-glukose i reaktionerne. Inkuberes ved 37 °C i 1 time, 2 timer og 3 timer.
- For at afslutte, flash fryse reaktionerne i flydende nitrogen og opbevare dem på -80 °C. Spring dette lagertrin over for at få foretaget en analyse samme dag.
BEMÆRK: Trichloreddikesyre blev ikke brugt til at stoppe reaktioner på grund af interferens fra syren ved påvisning af nogle centrale kulstofmetabolitter via LC-MS/MS. I stedet blev ekstraktionsmiddel indeholdende myresyre (trin 6.3) anvendt til at udfælde metaboliske proteiner, da myresyrens masse ligger under detektionsgrænsen for den rapporterede MS/MS-metode. - 50 mL af ekstraktionsopløsningsmidlet forberedes. Kombiner og vortex 20 ml acetonitril, 20 ml methanol og 10 ml vand (alle LC-MS-kvaliteter) i et 50 ml centrifugerør sammen med 0,199 ml myresyre for at lave en 0,1 M opløsning. Opløsningsmidlet afkøles til 4 °C under udvinding, og opløsningsmidlet opbevares ved -20 °C, når det ikke er i brug.
- Behandling af prøver til LC-MS/MS-analyse
- På analysedagen pipetteres et tilsvarende volumen af ekstraktionsopløsningsmidlet (dvs. 50 μL) til hver prøve. Hvis prøverne blev frosset, tilsættes ekstraktionsmiddel, før prøverne helt optøs for at forhindre reaktivering af glukosemetabolisme. Udfør alle prøvebehandlingstrin på is.
- For at generobre tid nul skal det endelige volumen ekstraktionsmiddel (dvs. 50 μL) pipettes til et passende lysatvolumen for den ønskede endelige koncentration i reaktionen (dvs. 4,5 mg/mL i 50 μL-reaktionsvolumen). Resten af reaktionskomponenterne tilføjes som i trin 1.2. Dette forsuringstrin udfælder lysatenzymer, før de væsentligt metaboliserer glukose.
- Prøverne inkuberes i ekstraktionsmiddel på is i 30 min med skånsom rysten, og centrifugere derefter prøverne ved 21.000 x g i 15 min ved 4 °C for at adskille supernatanten fra det udfældede protein. Supernatantens 50 μL overføres til autosamplerglassetaler, og hætteglasset på bakken i 4 °C autosampleren. Opbevar resten af supernatanten ved -20 °C til fremtidige analyser.
7. Opsætning af remburs-systemet til LC-MS/MS-analyse.
- 1 L opløsningsmiddel A opløses fuldstændigt ved helt at opløse 77,08 mg ammoniumacetat i 950 ml vand og 50 ml isopropanol. 1 L opløsningsmiddel B med 650 ml acetonitril, 300 ml vand og 50 ml isopropanol samt 77,08 mg ammoniumacetat. Sørg for, at alle opløsningsmidler er LC-MS-kvalitet.
- Tilslut de opløsningsmiddelflasker, der indeholder opløsningsmidler A og B, til pumpemodulet. Udrens systemet med en høj strømningshastighed for at fjerne/begrænse enhver luftforurening, der måtte være opstået under opløsningsmidlernes udstyr til remburssystemet.
- Udstyr systemet med en C18 omvendt faset kolonne (30 cm kolonnelængde, 75 μm indre diameter og 5 μm partikeldiameter). Kondition kolonnen til LC-MS-systemet ved at flyde 100% opløsningsmiddel B og langsomt strømme op solvent A til 100%.
BEMÆRK: Kolonnespidser blev forberedt internt ved hjælp af en mikropipettetrækker og fyldt med trykceller og helium.
8. Oprettelse af en metode til LC-MS/MS-dataindsamlings- og fortolkningssoftware til det LC-system, der er knyttet til Fourier Transform og Ion Trap Mass Spectrometers.
- Åbn Tune Plus-softwaren for at redigere en tunefil til MS-metoden.
- Åbn en forudinstalleret tunefil i negativ tilstand på menulinjen.
- Vælg ScanMode på menulinjen, og vælg derefter Definer scanningsvindue. Indstil microscan tidsindstillingen for MSn til 1 for både Ion Trap og FT.
- Gå til indstillinger for Nano-ESI Source, og indstil Sprøjtespænding til 4 kV. Modulere dette, indtil der genereres en acceptabel elektrospray; acceptabel elektrospray kan typisk opnås inden for intervallet 2-5 kV.
- Gem tunefilen.
- Generer en ny rembursmetode ved hjælp af guiden Installation af instrumentets software til dataindsamling og fortolkning. Åbn guiden > Sekvensopsætning >. Da disse metoder ikke kræver brug af en kolonnevarmer, skal du springe temp control-trinnet over.
- Vælg Multistepunder Flow Gradient Pump Options. I det næste vindue skal du indsætte 7 linjer og indstille strømningshastigheden for hver række til 0,1 mL·min-1. Input følgende parametre for hver række: fra 0-3 min, levere 100% opløsningsmiddel A; fra 3-9 min, indføre en gradient fra 100% opløsningsmiddel A til 20% opløsningsmiddel B; fra 9-19 min, indføre en ny gradient fra 20% opløsningsmiddel B til 100% opløsningsmiddel B; fra 19-27 min, hold ved 100% opløsningsmiddel B; fra 27-28 min, sæt gradienten tilbage til 100% opløsningsmiddel A; fra 28-44 min, skyl og istandsættelse af kolonnen til efterfølgende kørsler ved at holde ved 100% opløsningsmiddel A. Medtag et sidste trin for at sænke strømningshastigheden til 0,03 mL·min-1 efter afslutningen af kørslen for at bevare opløsningsmidlet, når rembursen ikke er i brug.
- Anvend standardindstillinger for eksempelindstillinger > pumpetryk som anskaffelsesmulighed, og brug standarderhvervelsestid, og brug standardindstillingerne for pumpetryk.
- Opret en MS/MS-metode ved at vælge ikonet Orbitrap Velos Pro MS i sidepanelet i vinduet Instrumentopsætning.
- Klik på Ny metode > dataafhængig MS/MS. Indstil Hent tid til længden af LC-kørslen (dvs. 44 min), Segment til 1 og Scan begivenheder til 11. Vælg den redigerede fil fra trin 8.1 for Tune File.
BEMÆRK: Den første hændelse er en MS1-forløberscanning ved hjælp af Fourier Transform MS (FTMS). De efterfølgende 10 hændelser vil være MS2 scanninger vælge de 10 mest intense og unikke ioner i hver prækursor scanning for MS2 fragmentering. - I forbindelse med hændelse 1 skal du under Scanningsbeskrivelse angive Analyzer til FTMS og polaritet til negativ. Under MSn-indstillinger skal du bruge en opløsning på 30.000 og en normaliseret kollisionsenergi på 35 V. Indstil scanningsintervaller til 50 m/z til første masse og 1800 m/z til sidste masse for at fange små molekyler.
- For hændelser 2 til 11, under Scan Beskrivelse indstille Analyzer til Ion Trap. Vælg Afhængig scanning, og klik på Indstillinger > Global > dynamisk udeladelse, og vælg Aktiver. indstille en gentagelsesvarighed på 30 s og 120 sekunders udelukkelse for at eliminere gentagne scanninger i nærheden.
- Gå til Scan Hændelsesindstillinger, og angiv Masse bestemt fra scanningshændelse til 1 for alle MS2-hændelser (2 til 11). Hvis du vil scanne efter de 10 mest intense ioner, skal du indstille hver MS2-scanningshændelse til at registrere en nth Most Intense Ion fra1. til 10. Indstil derfor hændelse 2 til at registrere 1 som denmest intense ion, hændelse 3 for at registrere 2 osv.
- Luk opsætningsvinduet, og gå til Filer > Gem som [Method_Name].meth.
BEMÆRK: For generel brug, vedligeholdelse og kalibrering af rembursinstrumentet og massespektrometeret henvises til betjeningsvejledningen og manualerne fra producenten.
- Klik på Ny metode > dataafhængig MS/MS. Indstil Hent tid til længden af LC-kørslen (dvs. 44 min), Segment til 1 og Scan begivenheder til 11. Vælg den redigerede fil fra trin 8.1 for Tune File.
9. Opsætning af en kørselssekvens og start af LC-MS/MS-kørslen.
- Konfigurer en kørselssekvens ved hjælp af LC-MS/MS-systemets dataindsamlings- og fortolkningssoftware. Højreklik på tabellen i Roadmap > Sequence Setupfor at indsætte lige så mange rækker som eksempler. For hver række skal du indstille Inj Vol til 5 μL og positionen til hætteglasets respektive position på autosamplerbakken. Input filnavne som eksempelnavne og angiv den ønskede filsti til kørselsresultater.
BEMÆRK: Tomme hætteglas, der indeholder opløsningsmiddel A, kan køres i starten af sekvensen og mellem hvert sæt trepartsprøver (hvert sæt tidspunkter) for at skylle kolonnen. - Hvis du vil starte kørslen, skal du fremhæve alle filnavne i sekvensen. Vælg Handlinger > Kør sekvens > OK påmenulinjen .
10. Konsolidering af filer og søgning efter foreløbige anmærkninger på MZmine 2.53.
- Åbn MZmine, og importer outputfilerne '.raw' fra trin 9.1. Vælg Raw Data Methods > Raw Data Import påmenulinjen . Vælg filer, der svarer til eksemplerne.
- Opret en liste over toppe, der skelner mellem MS1- og MS2-scanninger. Rå datametoder > registrering af funktioner > MS/MS Peaklist Builder påmenulinjen. De relevante indstillinger omfatter m/z-vinduet, der er angivet til 0,01, og tidsvinduet er indstillet til længden af kørslen. Under indstillede filtre skal du vælge Negativ som polaritet og Centroided som spektrumtypen.
- Gå til Funktionslistemetoder > Funktionsregistrering > Peak Extender påmenulinjen. Indstil m/z Tolerance til 0,005 m/z eller 10 ppm og Minimum Højde til 1E3. Dette trin vil skabe fuldt konkretiserede toppe.
- Fjern dublerede toppe. Gå tilbage til funktionslistemetoder > filtrering > duplikeret spidsfilter. De relevante indstillinger omfatter m/z Tolerance, der er angivet til 0,005 m/z eller 10 ppm, og RT Tolerancen er angivet til 5 min.
- Hvis du vil justere toppe i lignende datafiler (dvs. tre ganges reaktioner), skal du gå tilbage til funktionslistemetoder > normalisering > kalibreringstid . Sørg for at behandle tredelt prøver sammen og udelade emner. Relevante indstillinger omfatter m/z Tolerance indstillet til 0,005 m/z eller 10 ppm, RT Tolerance indstillet til 3 min absolut (min) og Minimum StandardIntensitet indstillet til 1E3.
- Juster toppe fra alle filer efter m/z og opbevaringstid fra funktionslistemetoder > Justering > RANSAC Aligner. Angiv m/z Tolerance til henholdsvis 0,005 m/z eller 10 sider pr. minut, RT Tolerance og RT-tolerance efter korrektion til henholdsvis 44 og 39 min, RANSAC-gentagelser til 0, minimumantal point til 10 % og tærskelværdi til 1. Marker indstillingen Kræv samme gebyrtilstand.
- Korrekt for alle datapunkter, der kan være gået tabt i tidligere trin i funktionslistemetoder > Gap Filling > Peak Finder. De relevante indstillinger omfatter intensitetstolerance, der er angivet til 50 %, m/z Tolerance, der er angivet til 0,005 m/z eller 10 ppm, og RT Tolerance indstillet til 3 min. Aktiver RT-korrektion.
11. Beregning af negative modemasser på 13C-mærkede glukoseafledte metabolitter og søgning efter m/z-funktionerne i disse analytter i filtrerede data.
- Beregn masserne af 13C-mærkede metabolitter fra glukosemetabolisme til den målrettede søgning.
- Den monoisotopiske masse af hvert målforbindelse beregnes ud fra antallet af atomer i forbindelsens molekylære formel og de monoisotopiske masser af hvert element20.
- Beregn forbindelsens negative tilstandsmasse [M-H]- ved at trække massen af 1 proton (1,007276 Da) fra den monoisotopiske masse. Dette er den masse, der detekteres ved negativ tilstand MS detektion efter molekyler er frataget en hydrogen ion under ionisering.
- Fra den negative tilstand masse, beregne massen af 13C-indarbejde metabolit. Her blev masserne af isotopologer, der maksimalt inkorporerer glukose-afledte 13C-etiketter, beregnet.
- Brug beregnede masser af 13C-mærkede metabolitter til at søge og anmærke m/z-funktioner fra MZmine-resultater. For hvert muligt hit skal du beregne massefejlen (ppm) ved hjælp af følgende ligning:
BEMÆRK: Eksperimentelle m/z-værdier med <15 ppm-massefejl blev betragtet som putative anmærkninger i den aktuelle analyse. - Kontroller manuelt spektre af putative anmærkninger i en kvalitetsbrowser for at bekræfte anmærkninger.
- Åbn køreplan > Qual Browser. Åbn rå fil fra værktøjslinjen for at importere rå MS-data for hvert eksempel.
- Tegn en linje under det ønskede interval af opbevaringstider (dvs. svarende til den putative anmærkning) på det samlede ionkromatogram (øverste panel) for at se et massespektrum (bundpanel). Højreklik på spektret og input en række masser, der omfatter målet analysand m / z. Kontroller, om de putative anmærkninger har tydelige spidssignaler, der ligger betydeligt over støjen (supplerende figur 2).
- Beregn de gennemsnitlige spidsbelastningsområder og standardfejlene for positive anmærkninger på tværs af biologiske replikeringer for hvert gangpunkt. Visualiser dataene (dvs. på en søjlegraf) for at observere tendenser i glukosemetabolismen.
Representative Results
For at kvantificere den lysatbaserede cellefri syntese af almindelige fermenteringsprodukter fra glukose blev lysater fremstillet af stammer, der blev dyrket i 2xYPTG-medier, fodret med 100 μM glukose som primær kulstofkilde8. Reaktionerne blev stoppet over et 24 timers tidsforløb ved proteinforsuring. Filtrerede supernatanter, der indeholder pyruvat, succinate, laktat, format, acetat og ethanol fremstillet af glukosekafi, blev indlæst på autosamplermodulet i et HPLC-system udstyret med et RID-modul. Hætteglas med filtrerede blandinger af fermentative slutprodukter og glukose ved 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM og 150 μM koncentrationer i S30 buffer blev læsset på instrumentet som standard. Analytter blev udvundet isocratically fra en HPLC kolonne til RID. Toppe for glukose, succinate, laktat, format, acetat og ethanol inden for 1 til 150 μM-området kunne løses ved HJÆLP. Spidsbelastningsområder for glukose blev afledt af manuel integration fra RID-dataene for tidskurs- og standardkurveprøver. Udvundne spidsområder for succinate, laktat, format, acetat og ethanol blev taget fra automatisk integrerede signaler. Alle standardkurver (spidsareal vs. kendt koncentration) havde R2-værdier >0,99 og var lineære i hele det koncentrationsområde, der anvendes her.
Molarkoncentrationer for alle målanaytter blev beregnet ud fra deres respektive standardkurver. Glukose blev indtaget inden for de første 3 timer af reaktionen og hovedsagelig fermenteret til laktat (Figur 2A, B). Ethanolakkumuleringen forekom også signifikant inden for de første 3 timer af reaktionen og stoppede derefter (Figur 2C). Observationen af en betydelig produktion af laktat og ethanol med et betydeligt glukoseforbrug efter 3 timer var ikke uden fortilfælde, da laktat- og ethanolproduktionsveje gør det muligt at regenerere 1 netto mol NAD+ fra glykolytisk NADH, der kræves til fortsat glukoseforbrug gennem glykolyse (figur 1). Laktat og ethanol kan således betragtes som de vigtigste fermenteringsprodukter i lysatbaseret cellefri glukosemetabolisme. Acetat var oprindeligt til stede i reaktionerne som en del af S30-bufferen og uventet kun akkumuleret på grund af stofskiftet efter 6 timer, når glukoseforbruget var bremset (Figur 2D). Dette resultat tyder på, at acetatgæring ikke nødvendigvis muliggør hurtig glykolytisk flux i tidligere tidspunkter. I mellemtiden blev format og succinate syntetiseret som mindre fermenteringsprodukter (Figur 2E, F). Alt i alt muliggjorde metoden den absolutte kvantificering af sukkersubstratudtømning og fermentativ produktdannelse i E. coli S30 lysater.
MS detektion til profil lysat glukose metabolisme specifikt blev anvendt her. Lysater afledt af stammer dyrket i 2xYPTG medier blev fodret 13C6-glukose som en kulstofkilde. CFME-reaktioner blev kørt i tredotel i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer. Prøver fra hvert timepoint blev indlæst på et LC-system udstyret med en omvendt fase kolonne og koblet til Fourier transformering og ion fælde massespektrometre. Negative ion mode spektre blev opnået og behandlet til at analysere organiske syrer, sukker fosfater, og aminosyrer. Beregnede teoretiske masser af 13C-mærkede arter, der tilhører central carbon metabolisme blev søgt for at identificere specifikt glukose-afledte forbindelser. Baseret på de udnyttede kildestamme dyrkningsforhold og tidligere rapporter om aktive veje i E. coli CFME, antages det her, at lysat proteomet omfatter et metabolisk netværk, der føder glukose i glykolytisk gæring, pentosephosphat vej, og muligvis aminosyre anabolisme5,6,7,8,14 ( Figur1). Derfor blev søgningen indsnævret til medlemmer af disse veje, hvoraf 16 metabolitter, der inkorporerer glukose-afledte 13C-etiketter, utvetydigt blev kommenteret (supplerende tabel 1).
13 C6- glukose blev observerbart forbrugt gennem glykolyse, som det fremgår af udsvingene i glykolytiske mellemliggende overfloder (Figur 3A-E). I overensstemmelse med HPLC-RID-dataene akkumulerede glukose til 13C3-laktat og blev også fermenteret til 13C3-succinate inden for de første 3 timer af reaktionen (figur 4A, B). Dannelsen af 13C3-succinate isotopolog understøtter den foreslåede model for lysat glukosemetabolisme (Figur 1), hvor succinate sandsynligvis vil blive genereret af carboxylation af 3-carbon fosfoenolpyruvat (PEP) molekyle og ikke fra indgangen af et 2-carbon acetyl-CoA-molekyle til TCA-cyklussen. Aktivering af TCA-cyklussen er blevet antaget i tidligere CFME-undersøgelser , men andre 13C-mærkede mellemprodukter af TCA blev ikke påvist her8,19,21. 13 C3-aspartatsyntese forekom dog inden for første h og blev forbrugt, hvilket forstærkede ideen om, at PEP omdannes direkte til oxaloacetat (figur 1, figur 6C). Dataene afspejler et lysat proteom fra kildestammer høstet under fermentativ vækst på glukoserige medier (2xYPTG). Dette ville endvidere indebære, at resten af TCA-enzymerne, der ikke deltager i succinateproduktionen, udgør en oxidativ TCA-gren (figur 1). Ingen af metabolitterne i denne vej blev imidlertid opdaget, muligvis fordi høje koncentrationer af glutamat tilsat CFME-reaktionen som en salttællerion forhindrer udviklingen af denne gren.
HPLC-RID-dataene suppleres desuden af manglen på 13C2-acetatdetektering inden for 3 timers reaktionstidsramme, hvilket tyder på, at der ikke opbygges et acetat fra glukose op til 3 timer (figur 2B). Imidlertid akkumuleres den direkte forløber for acetatat, acetylphosphat (acetyl-P), hvilket tyder på, at Pta-AckA-stien til acetatasyntese fra acetyl-CoA er aktiv (Figur 4C, D). AckA katalyseret dephorylation af 13C2-acetyl-P til 13C2-acetat forekommer sandsynligvis ikke inden for denne tidsramme, fordi acetat er en vigtig del af den S30-buffer, der anvendes i reaktionerne (Figur 1, Figur 2B).
Inkorporeringen af 13C6-glucose-afledte kulstof i sukkerphosphater 6-fosfogluconolaktone (6PGL), 6-fosfogluconat (6PG), ribulose-5-fosfat (Ru5P) og sedoheptulose-7-fosfat (S7P) blev også observeret (figur 5). Disse resultater bekræfter deltagelsen af pentosephosphatvejen i lysatglukosemetabolisme og giver sandsynligvis 13C9-tyrosinsyntese, som tidligere er blevet foreslået af en proteomisk undersøgelse, samtidig med at den giver en forløber for 13C5-histidinproduktion (Figur 6A, B)7. Mærket phenylalanin og tryptofan blev ikke observeret her, og heller ikke var de fleste af de essentielle aminosyrer. Dette er dog ikke helt overraskende, da aminosyreanabolisme sandsynligvis vil blive beriget med lysater afledt af celler dyrket i næringsrige forhold eller i den stationære fase7,22. Desuden tyder de hidtidige data på, at mellemprodukter af glykolyse og gæring kanaliseres mod cofaktorregenererende slutreaktioner, hvilket må udelukke syntese af mange aminosyrer, der stammer fra glyceraldehyd-3-fosfat, pyruvat og acetyl-CoA (dvs. glycin, cystein, serin, alanin, valin, leucin og lysin) (figur 1). Som nævnt blev der produceret 13C3-aspartat inden for den første time, mens aspartat afledte 13C-inkorporerede aminosyrer (dvs. threonine, isoleucin, methionin og asparagine) ikke blev observeret muligvis fordi glukose-afledt aspartat deltager i gæring (figur 1, figur 6C). Endelig kan flux mod mærkede glutamat- og aminosyrer, der stammer fra glutamat, være blevet hæmmet af høje niveauer af glutamat i reaktionsmiljøet (figur 1).
Figur 1: En putativ metabolisk model af lysater afledt af E. coli BL21DE3-Star vokser eksponentielt i høje glukosekoncentrationer. Mellemprodukter og slutprodukter af glykolyse (grøn), pentosephosphatvejen (mørk orange) og fermentative veje (blå) fra acetyl-CoA er blevet rapporteret i lysatbaseret CFME. Tilstedeværelsen af succinate gæring indebærer aktivering af den oxidative TCA gren (grå). Aminosyre anabolisme (guld) i lysater er ikke veldefineret og undersøges her. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: HPLC-RID-data til glukoseforbrug og fermentativ syntese af slutproduktet i CFME-reaktioner tilberedt med E. coli-råekstrakter. (A) Glukoseforbrug og (B) laktat, (C) ethanol, (D) acetat, (E)format og (F) succinateproduktion i CFME-reaktioner blev overvåget over 24 timer. Gennemsnitlige mM-koncentrationer og fejllinjer (SE) kvantificeret med standardkurver præsenteres (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tidsforløbstendenser på 13C6- glucose og 13C-mærkede glykolytiske mellemprodukter i E. coli lysate CFME. Relativ forekomst af (A) 13C6-glucose, (B) 13C6-glucose-6-fosfat/fructose-6-fosfat, (C) 13C6-fructose-1,6-bisphosphat, (D) 13C3-glyceraldehyd-3-fosfat/dioxyhydracetonephosphat, og (E) 13C6 -pyruvat i CFME-reaktioner over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tidskurstendenser for mellemprodukter og slutprodukter i 13C6- glukosegæring i E. coli lysate CFME. Relativ forekomst af (A) 13C3-laktat, (B) 13C3-succinate, (C) 13C2-acetyl-fosfat og (D) 13C2-acetyl-CoA i CFME reaktioner over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Tidsforløbstendenser på 13C6- glukose afledt pentosephosphat pathway mellemprodukter i E. coli lysate CFME. Relativ forekomst af (A) 13C6-6-fosfogluconolactone, (B) 13C6-6-fosfogluconat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfat og (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfat over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Tidskurstendenser for påviste 13C6-glucose afledte aminosyrer i E. coli lysate CFME. Relative overfloder af (A) 13C9-tyrosin, (B) 13C5-histidin, og (C) 13C3-aspartate over 3 timer. Rå spidsområder udvundet af mzMINE-software blev brugt til at beregne gennemsnit og fejllinjer (SE) for positive anmærkninger (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Repræsentativt HPLC-RID kromatogram, der viser toppe for større fermentative produkter i en CFME-reaktion inkuberet ved 37 °C i 24 timer. Glukose, succinate, laktat, format, acetat og ethanoltoppe kan i tilstrækkelig grad skelnes fra deres retentionstider på en HPLC-kolonne under isokratisk elution med 5 mM svovlsyreopløsningsmiddel. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Repræsentativt massespektre for 13C-mærkede metabolitter, specifikt (A) laktat,(B) glukose og (C) 6-fosfogluconat (6PG) i en CFME-reaktion inkuberet ved 37 °C i 1 time. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Liste over fundne 13C-mærkede metabolitter, retentionstider (justeret på tværs af prøver ved hjælp af MZmine), teoretisk fuldt 13C-mærket negativ tilstand m /z værdier, m / z værdier af registrerede funktioner, og beregnede massefejl. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Den skitserede HPLC-RID-tilgang kan bruges til at kvantificere forbruget af sukkersubstrat og efterfølgende konverteringer til større organiske syre- og alkoholprodukter af lysatcentral metabolisme over tid. Desuden anvender denne protokol en simpel isokratisk metode ved hjælp af en enkelt mobil fase, kræver minimal prøveforberedelse og giver mulighed for en simpel målrettet downstream-analyse. Analytter målt ved HPLC-RID-metoden skelnes udelukkende af deres opbevaringstider og dermed deres interaktioner med den valgte kolonneharpiks. HPLC kolonne anvendes her var specielt designet til at adskille kulhydrater, organiske syrer, og alkoholer ved at kombinere størrelse-udelukkelse og ligand udveksling (dvs. ion-modereret partition kromatografi). Den beskrevne metode er derfor nyttig til mere målrettet analyse af kulhydratsubstrater og udvalgte slutprodukter af glukosefermenteringsveje, som primært forventes at lette og energize lysatebaserede biotransformationer8,15,21. Men, denne protokol ikke tegner sig for aktivering af andre metaboliske veje i celle ekstrakter. Rørledninger, der anvender andre kromatografiske separationsteknikker (dvs. hydrofil interaktionskromatografi), gradient elution metoder, mere kompliceret prøve forberedelse (dvs. derivatisering), og forskellige optiske detektorer (f.eks ultraviolet lys eller fordampningslys spredning detektorer) kunne anvendes til at opdage andre metabolitter såsom aminosyrer og sukker fosfater23,24 . Alternativt kan en global tilgang til undersøgelse af lysatmetabolisme tages ved hjælp af LC-MS/MS.
Den beskrevne LC-MS/MS-metode er en enkelt arbejdsgang til måling og identifikation af en bredere vifte af metabolitter. LC-MS/MS er et topmoderne analyseværktøj til metabolomprofilering på grund af dets følsomhed og evne til at skelne metabolitter efter retentionstid og m/z-nøgletal med høj opløsning16. Med fokus på centrale kulstof metaboliske veje og aminosyre anabolisme, negativ tilstand MS / MS blev gennemført for specifikt at opdage polære organiske syrer, sukker fosfater, og aminosyrer. Kombineret med en nano-flydende kromatografi teknik, metoden giver høj følsomhed til påvisning af små molekyler i den komplekse lysat baggrund17. Med hensyn til profilering af lysatbaseret CFME-metabolisme er en begrænsning af den beskrevne LC-MS/MS-protokol imidlertid dens nedre detektionsgrænse på 50 m/z, hvilket udelukker måling af ethanol, et vigtigt produkt i lysat glucosemetabolisme, samt format, som begge ellers let kvantificeres efter den detaljerede HPLC-RID-metode. Sammenlignet med LC-MS/MS har HPLC-RID den ekstra fordel, at den relative tilgængelighed med hensyn til omkostninger og vanskeligheder. Til sidstnævnte punkt kan fejlfinding af den LC-MS/MS-metode, der er beskrevet her, kræve en vis grad af ekspertise inden for massespektrometri. Ikke desto mindre har MS-detektion unikt tiltalende applikationer over RID, da det desuden kan skelne mærkede isotoper i metabolomer, en fremragende teknik til at forstå kulstofbevægelse fra supplerede substrater gennem det komplekse lysat metaboliske netværk18. En sådan tilgang blev anvendt her ved at supplere reaktioner med 13C6-glukose og analysere de relative overflodsværdier af downstream 13C-inkorporerende metabolitter. Analysen gjorde det muligt at definere aktive og inaktive veje, støtte tidligere rapporterede antagelser og give ny indsigt om metabolisk flux i lysater. Der kan også foretages ændringer inden for metoden til specifikke analyser. For eksempel kan standardopløsninger af 13C-mærkede målforbindelser analyseres sammen med prøver for at opnå absolutte kvantitative målinger af glukose-afledte molekyler over tid og drage konklusioner om fluxfordelinger. Bedre registrering af positivt ladede forbindelser kan også aktiveres i den aktuelle arbejdsproces ved at køre sekvenser med .meth-filer justeret til registrering af positiv tilstand.
Analytisk prøveudtagning i begge beskrevne metoder er bekvemt automatiseret, hvilket sikrer høj reproducerbarhed. Desuden kan der forventes glatte analytiske kørsler, så længe der overholdes korrekt instrumenthåndteringspraksis og vedligeholdelse. Ved brug af disse værktøjer til at analysere CFME-reaktioner bør der tages mere kritiske overvejelser opstrøms og nedstrøms af prøveudtagning. Under prøveforberedelse er det vigtigt, at tidskurskontroller er repræsentative for time-zero. Her blev proteiner udfældet i lysater ved forsuring for at stoppe metaboliske reaktioner. Til tid-nul prøver blev syreopløsningsmidlet kombineret med lysat, før reaktionsmikset indeholdt glukose. Forsuring med trichloreddikesyre sikrede effektivt, at glukose ikke metaboliseres på tid-nul, som vist i HPLC-RID-dataene (Figur 2). Mens en lignende procedure for at slukke glukosemetabolisme blev udført i den rapporterede LC-MS/MS-analyse, blev der påvist 13C-mærkede metabolitter i time-zero-prøver, om end ved betydeligt lave overflodsværdier i forhold til prøver, der blev udvundet på senere tidspunkt. Desuden var disse observationer begrænset til parprodukter af glykolyse. Dataene tyder på, at reaktionerne bevarer en vis grad af glykolytisk aktivitet efter forsuring med ekstraktionsopløsningsmidlet, der detekteres ved denne meget følsomme metode. Omfanget af denne aktivitet bør dog kvantificeres. En tidligere undersøgelse rapporterede , at sure ekstraktionsmidler ikke i tilstrækkelig grad må slukke mellemliggende glykolytiske reaktioner, men kan stoppe et betydeligt glukoseforbrug10. Mens dette stadig skal undersøges yderligere i det system, der anvendes her, drastiske ændringer i relative overflod værdier mellem tid-nul og senere timepoint prøver kan fortolkes som tendenser i glukose metabolisme. Undersøgelse af alternative slukningsmetoder anbefales dog i lignende applikationer, specielt til opnåelse af absolutte mængder metaboliske mellemprodukter10. Desuden bør der også overholdes god praksis i forbindelse med downstream-softwareanalyser. Konsistens er afgørende, når du manuelt integrerer spidsområder fra RID-signaler for at reducere menneskelige fejl. Manuel integration bør også anvendes på spidsbelastningsområder af standarder, når der anvendes manuelt integrerede spidsområder til at kvantificere metabolitkoncentrationer i prøver. I hele den målrettede LC-MS/MS-analyse bør foreløbige anmærkninger fra MZmine-analyse valideres ved manuel topkontrol ved hjælp af en MS-kvalitetsbrowser, og m/z-funktioner bør kun kommenteres, når beregnede massefejl er acceptable. Her blev disse analyser udført manuelt for et begrænset sæt mål, da omfattende og robust software til isotopsøgning endnu ikke er etableret. Men sådanne automatiserede metoder til søgning 13C mærket metabolitter er i øjeblikket ved at opstå og ville strømline mere komplicerede analyser samt, ligesom profilering lysater ud central kulstof metabolisme25.
Avanceret flydende kromatografi er en robust og bredt anvendt metode til adskillelse af små molekyler i komplekse metaboliske blandinger11. De beskrevne metoder parerer denne separationsteknik med brydningsindekset eller massespektrometrisk detektion for at kunne analysere metabolitkonverteringer i lysatbaserede CFME-reaktioner. HPLC-RID og LC-MS/MS er individuelt effektive værktøjer til profilering af aktiv lysatmetabolisme, og deres komplementaritet kan yderligere udnyttes til at håndtere hver tekniks iboende begrænsninger. De rapporterede metoder gør det muligt at anvende og udvikle CFME, da de kan udnyttes til at forstå lysatmetabolisme, overvåge forbedringer i målrettede metabolitkonverteringer og belyse ændringer til metabolitstrøm, når de manipulerer lysatmetabolisme.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev sponsoreret af Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del af Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory administreres af UT-Battelle, LLC, for det amerikanske energiministerium på kontrakt DE-AC05-00OR22725. Dette manuskript er blevet forfattet af UT-Battelle, LLC i henhold til kontrakt DE-AC05-00OR22725 med det amerikanske energiministerium. Den amerikanske regering bevarer og udgiveren, ved at acceptere artiklen til offentliggørelse, anerkender, at den amerikanske regering bevarer en ikke-klam, betalt, uigenkaldelig, verdensomspændende licens til at offentliggøre eller gengive den offentliggjorte form af dette manuskript, eller tillade andre at gøre det, for usa's regering formål. Department of Energy vil give offentligheden adgang til disse resultater af føderalt sponsoreret forskning i overensstemmelse med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
| 13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
| 500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
| Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
| Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
| Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
| Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
| Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
| Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
| D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
| Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
| Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
| LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
| Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
| Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
| Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
| Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
| OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
| Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
| Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
| Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
| Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |
References
- Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
- Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
- Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
- Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).
- Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
- Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
- Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
- Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).
- Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
- Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).
- Coskun, O. Separation Tecniques: Chromatography. 3, Kare Publishing. Istanbul. (2016).
- Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
- Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
- Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
- Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
- Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
- Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
- Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
- Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
- Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).
- Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
- Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
- Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).
