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Bioengineering

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

Published: September 23, 2021 doi: 10.3791/62852

Summary

プロトコルは、複雑な溶解物ベースの無細胞系における代謝反応を研究するための屈折率または質量分析検出に結合された高速液体クロマトグラフィー法を記述する。

Abstract

標的生合成のための細胞代謝工学は、エンジニアが細胞の生存要件を回避する際に、広範な設計構築-テスト学習(DBTL)サイクルを必要とする可能性があります。あるいは、セルフリー環境で DBTL サイクルを実行することで、このプロセスを加速し、ホストの互換性に関する懸念を軽減できます。無細胞代謝工学(CFME)への有望なアプローチは、代謝活性粗細胞抽出物をバイオマニュファクチャリングのプラットフォームとして、また、変化したタンパク質や経路を迅速に発見し、プロトタイピングするためのプラットフォームとして活用します。これらの機能を実現し、CFMEのパフォーマンスを最適化するには、lysateベースの無細胞プラットフォームのメタロームを特徴付ける方法が必要です。すなわち、分析ツールは、ターゲット代謝物の変換の改善を監視し、リセート代謝を操作する際の代謝物束への変化を解明するために必要です。ここでは、光学または質量分析の検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた代謝産物分析を適用し、 大腸菌 S30溶解物における代謝産物の産生およびフラックスを特徴付けるために適用した。具体的には、低コストの基質(すなわち、グルコース)から様々な高価値産物への転換における中枢代謝中間体および副産物の生成を定量化するために、屈折率検出(RID)を用いたHPLC分析用のCFMEライセートからのサンプルの調製について説明する。また、特定の代謝産物収量を特徴付け、原料からのリゼート代謝フラックスを特徴付ける強力なツールである逆相液体クロマトグラフィーを介して 13C標識されたグルコースを供給したCFME反応における代謝物変換の解析も提示される。全体として、これらの分析方法をCFMEライセート代謝に適用することで、これらのシステムをより速くまたは新規の代謝工学タスクを実行するための代替プラットフォームとしての進歩が可能になります。

Introduction

化学生産のための工学微生物の限界は、競合する細胞生存機能が存在しないインビトロで生化学的反応を再現することによって対処することができる1。また、開放反応環境(すなわち、細胞膜の存在)は、操作に対してより適性であり、生細胞に比べて監視が容易である。この無細胞代謝工学(CFME)の基礎的概念は、これまで微生物細胞工場で提示された数桁の生産指標を用いて水素やモノテルペンのような貴重な化学物質を合成するための代謝経路の再構成によってエレガントに実証されています1,2,3.しかし、経路全体を浄化する方法は、現在時間とコストによって制約されています。あるいは、無細胞代謝系は、経路再構成4全体に対する迅速かつ安価な方法を通じて粗細胞抽出物から誘導することができる。細胞抽出物に保持される中央代謝は、エネルギー基質(例えば、グルコースおよび酵素的補因子)および塩を緩衝溶液中に補い、24時間5,6を超える中央代謝前駆体を生成する。外因性酵素をライゼベースのCFME反応に加えることは、グルコースをより複雑なバイオトランスフォーメーションで高力価4、6、7でより価値のある化学物質にすることを可能にする。これらの系では、細胞様代謝の複雑さのために降伏が損なわれる傾向があるが、より高い収率変換のためにライセートプロテオームをキュレーションする独自の方法が7,8に開発されている。

ライセートベースの無細胞システムで代謝変換を行う容易さは、細胞の外で化学製造を完全に移動させるか、または生体内これらの設計を構築してテストする前に、高スループットで新しい経路を試作するためのこれらの優れたプラットフォームを作ります2,9.どちらのアプリケーションでも、代謝変換をモニタリングしたり、リセート中の代謝フラックスの全体的な変化を観察するためのツールは、CFMEの進歩に不可欠です。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、CFME反応の化学成分を高解像度で分離するために使用することができ、代謝産物定量化用の光学または質量分析検出器に結合することができます5,10.HPLCの根底にある原理は、検体が溶媒に溶解し(すなわち、移動相)カラムを通してポンプで送り込まれ、特定のカラムパッキング材料(すなわち、定常相)11と相互作用するということである。これらの分析物は、その化学的性質に応じて、最終的に静止相から溶出し、移動相によって検出器に運ばれる前に、様々な保持時間を示す。このレポートでは、RIDおよびMS/MS検出を利用したHPLCベースの方法による大腸菌系CFME反応の調製と分析について詳しく説明します。

HPLC結合して屈折率検出(HPLC-RID)は、中枢代謝前駆体および末端産物を迅速に同定するための一般にアクセス可能な方法である。簡単に言えば、RID は、移動相12によって光のたわみを検数がどのように変化するかを測定します。サンプル中の標的分析物に対応するRID信号は、標準ソリューションのRID信号との比較により定量化できます。CFMEアプリケーションにおいて、この検出モードは、サイズ排除とリガンド交換機構、またはイオンモデレートパーティションクロマトグラフィー5、6、8、13の組み合わせに基づいて化合物を分離するHPLCカラムで最も一般的に使用されてきた。この特定の技術は、グルコースのような糖基質の消費を迅速に定量化するとともに、コハク酸、乳酸、formate、酢酸、およびエタノールなどの発酵産物の形成を、リセートベースのCFME反応8に含む。HPLCを介してこれらの化合物の濃度変化を記録することは、粗細胞抽出物が中央代謝前駆体をプールする可能性を解明し、ライセート6,8,14におけるグルコースからの複雑な代謝変換中に発酵経路を介して経路フラックスがどのようにリダイレクトされるかを理解するのに有用であった。大腸菌細胞抽出物におけるセミナルCFME研究は、発酵化合物がグルコース異化の終わりの産物として蓄積し、また外因性酵素6,15を過剰発現するライセート中の望ましくない副産物として生じることを確認した。発酵代謝は、糖分解反応を持続させるコファクター(すなわちNAD(P)HおよびATP)のレドックス等価物を再生する上で必要な役割を果たしていることを示唆している。そのため、発酵製品を分離するように設計されたHPLCベースの光学検出方法は、さまざまなライセートベースのCFMEタスクを実行する際に有用で一般的に適用されるツールです。

CFMEは、炭水化物、有機酸、またはアルコールではない代謝エンド製品を蓄積するために実装することができます4.合成されるのと同じくらい速く消費される中間体の測定も望ましい10であってもよい。HPLC-RIDはコストと難易度の面でアクセス可能ですが、この方法は保持時間に基づいて代謝産物のみを区別する能力によって制約されます。液体クロマトグラフィーが MS/MS 検出 (LC-MS/MS)16に結合されている場合、より広範な代謝産物を分析できます。この方法により、移動相中の分析物は、各分子の質量と電荷特性に基づいてイオン化され、微分検出される。このように、カラム上の代謝産物の質量電荷(m/z)比および保持時間の両方に関する知識は、ほとんどの代謝中間体と高分解能16の終末産物の分離を容易にする。この検出技術は、ナノ液体クロマトグラフィーに結合することもできるが、これは、はるかに低い流量およびサンプル注入量を与え、複雑な溶解物の背景17における小分子のより敏感な検出を可能にする。LC-MS/MS は、組み込まれたラベルが、検体の m/z 値18に変化を与えるので、同位体のラベリングで加えることができます。13C6-グルコース基質を補ったCFME反応から抽出されたタイムポイント測定は、このようにして、補充されたグルコースから特異的に誘導される末端または副産物を決定することができる。この同位体トレーシング法はCFME研究ではまだ一般的には適用されていないが、これらの反応における塩対イオン(すなわち、酢酸塩およびグルタミン酸)が二次基質としても代謝されるため、特にリセートベースのCFME系における代謝変換を理解するための強力なツールである。この技術を活用すると、ライセートの糖代謝の包括的な画像を描くことができますが、これは完全には理解されていません。ここで、プロトコルは、グルコース代謝の可能性のあるモデル、特に大腸菌溶解物に関して問い合わせるに使用できるナノエレクトロスプレーイオン化(ナノESI)MS/MSに結合したナノ液体クロマトグラフィーの方法を詳述する(図1)。このモデルは、発酵経路およびペントースリン酸経路が、リッチメディア5、6、8、14で増殖した株に由来する大腸菌リセートで活性であるという報告に基づいている。この技術は、糖類中のグルコースからのアミノ酸同化に関する現在の知識が芳香族アミノ酸合成例として数例に限定されているためアミノ酸の産生を調べるのに加えて使用される。これらの経路における末端産物および中間体(すなわち、有機酸、リン酸糖、およびアミノ酸)の主に極性の性質を考えると、逆相液体クロマトグラフィーがここで利用された。この技術は、非極定常相からの溶出によって極性化合物を分離する。これらの化合物は、少なくとも1つの負の初代電荷で検体の検出を可能にする陰イオンモードでナノESIによってイオン化され、酸性化合物の検出に有用である。この技術は、糖由来の13C組み込み代謝産物を分析するためにここで使用され、ライセートにおける糖代謝を理解するためのLC-MS/MSの有用性を示す。

Protocol

1. HPLC-RID定量化のためのCFME反応の開始、停止、および処理時間の経過。

  1. 以前に調製した 大腸菌 のライセートを解凍し、残りの反応成分を氷上で調製する。
    注:ここで報告されたライセートは、2xYPTG(1.8%グルコース)培地で成長した 大腸菌 BL21DE3-Starから中ログ相に由来した。
    1. 適切な量のフィルター滅菌(0.20 μmの細孔フィルター)S30バッファー(1 Mトリス-OAcは、氷酢酸、1.4 M Mg(OAc)2、および6 MKOAcでpH 8.2に調整)を準備します。
    2. グルコース、グルタミン酸塩、ATP、補酵素A、NAD+、ビストリスバッファー、およびリン酸ジカリウムを含むエネルギーミックスをS30バッファーに調製します。ここでCFME反応を調製するために使用された所望の反応量の最終濃度は、100 mMグルコース、18 mMマグネシウムグルタミン酸、15mMグルタミン酸、195 mMカリウムグルタミン酸、1mM ATP、0.2 mM補酵素A、1 mMNAD+、150 mMビストリス、および10mのリン酸ジミン酸である。
  2. 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに成分を組み合わせて、4.5 mg/mLの全ライセートタンパク質で最終的な反応を調製します。ここで、CFME反応は、時間単位の3重化で50μLの最終体積で調製した。それぞれの時間枠の37 °Cで反応をインキュベートします。
    注:速く働き、グルコースおよびグルタミン酸塩との早期代謝反応を防ぐために反応ミックスの最終成分としてリゼートを加えます。最小限のグルコース消費量は、反応ミックスが氷上でインキュベートされる時間に応じて発生する可能性があります。
  3. 反応を終了し、HPLC-RID分析のためにサンプルを処理します。
    1. 適切な時点で三重反応を終了するには、各サンプルの最終反応量に5%のトリクロロ酢酸の等量を直ちに加えます(5%トリクロロ酢酸50μLの50μLを50μL反応に)。各サンプルを無菌水で2倍の反応量(すなわち、100 μL)で希釈します。
    2. 時間ゼロを再現するには、残りの反応成分を添加する前に、5%トリクロロ酢酸と全最終反応量(すなわち50μL)と同じ量のリクロロ酢酸をリセートと混合します。この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。
    3. 11,600 x g のベンチトップマイクロ遠心分離機上のサンプルと遠心分離機を5分間ボルテックスし、有機検体を含む上清をチューブを洗浄します。HPLC分析を別の日に行う場合は、-20 °Cでサンプルを保存してください。次のステップに進む前に、氷の上に保存されたサンプルを解凍することを確認してください。
    4. 0.22 μmの細孔フィルターで各上清をフィルターします。シリンジの代わりに、遠心チューブフィルターを使用し、16,300 x g で上澄み物を1分間遠心分離します。
    5. 各濾液をクリーンなHPLCガラスバイアルに移します。バイアルを HPLC オートサンプラー トレイに積み込みます。
  4. 標準曲線生成用サンプルを準備します。
    1. CFME反応においてグルコースの開始濃度を上回る等量でS30バッファーに溶解した全ての標的検体のストック溶液を調製する。ここで、150μMグルコースからなるストック溶液を、コハク酸塩、乳酸塩、formate、酢酸塩、およびエタノールからなる、調製した。ストック溶液から1:1(v/v)シリアル希釈を行い、0 μMからストック濃度までの最終濃度(すなわち150 μM)までの3重50 μL溶液を得ます。
    2. 5%トリクロロ酢酸50μL、滅菌水100μLで各溶液を希釈します。ステップ 1.3.4 から 1.3.5 を繰り返します。
      注: サンプルの各バッチで標準曲線生成のためのソリューションを実行して、代謝物の濃度を正確に定量化します。

2. 代謝物検出のためのHPLCシステムの準備

  1. ヒュームフードの下で、脱イオンおよびフィルター滅菌水から殺菌された5 mM硫酸溶液を調製します。約550μLのHPLCグレードの硫酸溶液を2Lの水に加え、5mM硫酸を調製します。
    注意:硫酸は有害な化学物質であり、適切なラボPPEでヒュームフードの下で働くことは吸入、皮膚接触、および眼の接触を防ぐ。濃縮硫酸は水と激しく反応し、逆ではなく水に直接添加する必要があります。直射日光を避けて涼しく乾燥した場所に保管し、実験室で設定された適切な廃棄物処理対策に従ってください。
  2. HPLC装置の隣の水浴で5mM硫酸の2 Lボトルをインキュベートしてください。水浴を35°Cに設定します。 溶剤ボトルに溶剤フィルターを入れ、ポンプモジュールに沿ってもう一方の端を脱ガッサーモジュールに取り付けます。
    メモ:コラムを取り付ける前に、準備したての溶剤でシステムをパージするのは、楽器の取り扱いの練習です。
  3. Rid モジュールに沿って HPLC カラムを HPLC 装置に装備します。カラムサーモスタットが利用できない場合は、35°Cの水浴にカラムを置きます。
  4. システムコンピュータにインストールされているクロマトグラフィーデータシステム(CDS)ソフトウェアで35 °Cで分析するためにRIDモジュールを準備します。
    1. [表示] メニューの [メソッド] をクリックし、[コントロール ビュー] を実行します。ポンプモジュール>メソッドを右クリックします。流量を0.55 mL·min-1に設定し、ポンプを開始するには[オン]ボタンを選択します。
      注:HPLCに取り付ける前にカラムがストレージに入っていた場合は、メーカーの指示に従ってカラムを平衡化した後、流量を0.55 mL·min-1に上げます。
    2. RID モジュールに対応するパネルを右クリックし 、>メソッド。RI検出器モジュールの温度を35°Cに設定し 、[オン]を 選択してRI検出器モジュールのウォーミングアップを開始します。
    3. パネルの RID モジュール > コントロールを右クリックします。新鮮な溶媒を使用する場合は少なくとも15分間、またはこのセットアップの前にRI検出器を通して異なる溶媒が流れた場合は1時間パージ参照セルしてオンを選択します。[オン] ボタンをクリックします。
      注: ポンプと RI 検出器 をオンに して、オンライン プロットで安定したベースラインを達成します。これは、実験室の温度変動の影響を受け、4時間以上かかることがあります。サンプルの読み込み前にシステムを 一晩オン にします。

3. CDSで有機発酵製品のアイソクラティックHPLC分離法を作成する。

  1. メニュー バーで 、[新しいメソッド>]を選択します。方法> [メソッド名].Mとして保存方法を > >選択します。
  2. [バイナリ ポンプ]タブで、流れを 0.55 mL·min-1に設定します。[ソルベント]で、ポンプモジュールの溶媒入力に対応する文字を選択し、アイソクラティック溶出の場合は100%に設定します。圧力制限を 0 と 400 バーに設定し、入力 30 分をストップタイムとして設定します。
  3. [サンプラー ]タブで、[注入量]を50 μLに設定します。[描画速度]、[取り出し速度]、[ドローポジション高度な補助設定]を 200 μL·min-1、200 μL·min-1、および -0.5 mm に設定します。
  4. [RID]タブで、光学ユニット温度を35 °Cに設定します。 [シグナル] で、[シグナル] の[取得]を選択し、[ピーク幅] で >0.2 分を選択します。[停止時間] の [ポンプ/インジェクタとして] オプションを選択します。
  5. [RID]タブの [詳細設定] で、[アナログ出力] を [減衰の場合は 5% ゼロ オフセット] と 500,000 nRIUに設定します。[シグナル極性] の[正] オプションを選択し、[分析前に自動ゼロ] の [オン] オプションを選択します。
  6. [メソッドを保存>方法] を選択して 、メソッドを保存します。[メソッド名] > [メソッド>読み込み方法] を選択して、メソッドを読み込みます。M.

4. 自動サンプリング用のシーケンステーブルを作成し、データ取得用のHPLC-RIDシステムを起動します。

  1. メニュー バーで、[シーケンス] をクリックして [新しいシーケンス テンプレート>します。 [シーケンステンプレート名]としてシーケンス>保存シーケンステンプレートを選択します。S.
  2. シーケンス>シーケンステーブルを選択します。オートサンプラートレイ上の配置に従って、'n'バイアルに対応する'n'行を追加し、バイアルとサンプル名の下にバイアルの位置とサンプル名を入力します。ステップ 3 で生成されたメソッドを[メソッド名]ドロップダウンメニューから選択し、行ごとに Inj/Vial(Vial あたりのインジェクション)として 50 μL を入力します。
  3. [ 適用 ] をクリックし、[シーケンス テンプレート] を選択 してシーケンス テンプレート>保存します。[ シーケンス>読み込みシーケンス テンプレート] > [SequenceTemplateName] を選択して、シーケンス テンプレートが読み込まれるようにします。S.
  4. オンラインプロットで安定したベースラインを達成した後、パネル の「RIDモジュール」>「制御」を右クリックして「オフ・リサイクル・バルブ」を>、RID 検出器を通して溶媒の流れを無駄にします。データ取得を開始するには、メニュー バーの [シーケンス ] メニューの [実行] > [シーケンス] を選択します。

5. データの抽出と分析後の実行。

  1. [表示] メニューから[データ分析ビュー] を選択します。画面左側のファイルリストからシーケンスファイル名を見つけます。画面の中央パネルで、信号ビュー選択> RID シグナルに移動してサンプルクロマトグラムを表示します。
  2. 画面上の上部パネルから高濃度標準サンプルに対応する行を選択します。表示されたクロマトグラム上のターゲット検体ピークの保持時間をメモします。標的検地に対応するピークは、グルコース、コハク酸塩、乳酸塩、定型、酢酸塩、およびエタノールとして保持時間軸に沿って配置される(補足図1)。
    注:クロマトグラムの最初の大きなピークはトリクロロ酢酸に相当します。RI 単位は、すべての標準曲線サンプルで一貫している必要があります。各化合物を別々のサンプルとして実行して、各ターゲットの対象の検体の保持時間を検証します。
  3. 各標的検体のピーク領域を、標準のクロマトグラムと反応サンプルから抽出します。
    1. 対象となるピークがソフトウェアによって十分に統合されているかどうかを確認します。各ピークの底部として赤線を描き、曲線の下に正確に統合された領域を得る。自動統合が失敗した場合(つまり、赤い線が斜めである)、統合ツールセットから手動統合ボタンを選択し、ピークベースを手動で描画してピークエリアを統合します。
      注: 1 つのサンプルでターゲット分析対象に対して手動統合を実行する必要がある場合は、一貫性を保ち、すべてのサンプルに同じ分析対象を手動で統合してください。
    2. 共通ツールセットからカーソルツールを選択して、適切に統合されたピークをクリックします。選択したピークのピーク領域と対応する保持時間が、画面の下部パネルの表の行として強調表示されます。
    3. ピークエリアをエクスポートするには、[ ファイル>エクスポート>統合結果] を選択します。
  4. 標準曲線を使用してターゲットの検体濃度を定量化します。
    1. スプレッドシート内のサンプルの既知の濃度との間にピーク面積の値をプロットします。プロットされたデータを右クリックし、[ 近似曲線を追加>近似曲線の書式設定>数式をチャートに表示します
    2. 別のスプレッドシートで、標準曲線トレンドラインの方程式を使用して、各サンプルから各分析対象のピーク領域値を濃度に変換します。データビジュアライゼーションの三数にまたがる平均ピークエリアと標準誤差値を計算します。

LC-MS/MS 定量化のための CFME 反応をトレースする、開始、停止、および処理時間コースの同位体。

  1. 1.1-1.2 で説明されているように氷上のポイント(時間ゼロを除く)ごとに三重反応を設定します。しかし、グルコースの代わりに、反応に100mM13C6-グルコースの最終濃度を使用する。 37°Cで1時間、2時間、3時間の反応をインキュベートする。
  2. 終了するには、液体窒素中の反応をフラッシュ凍結し、-80°Cで保存します。 当日の分析では、このストレージステップをスキップします。
    注:LC-MS/MSを介して一部の中枢炭素代謝物を検出する際に、トリクロロ酢酸は酸からの干渉による反応を止めるために使用されませんでした。代わりに、ギ酸を含む抽出溶媒(ステップ6.3)は、報告されたMS/MS法の検出限界を下回るギ酸の質量であるため、代謝タンパク質を沈殿させるために使用された。
  3. 抽出溶媒の50mLを調製する。組み合わせてアセトニトリルの20 mL、メタノールの20 mL、および10 mLの水(全LC-MSグレード)を50 mL遠心管に入れ、0.199mLのギ酸と共に0.1M溶液を作ります。抽出時に溶剤を4°Cに冷やし、使用しない場合は-20°Cで保存します。
  4. LC-MS/MS 分析のサンプルの処理
    1. 分析の日に、抽出溶媒の等価な容積(すなわち、50 μL)を各サンプルにピペットします。サンプルを凍結した場合は、サンプルが完全に解凍する前に抽出溶媒を添加して、グルコース代謝の再活性化を防ぎます。氷上ですべてのサンプル処理手順を実行します。
    2. 時間ゼロを再現するには、抽出溶媒の最終体積(すなわち、50 μL)を、反応中の所望の最終濃度(すなわち、50 μLの反応量で4.5mg/mLの)に適した溶解液の量にピペットします。残りの反応成分をステップ1.2のように加えます。この酸性化工程は、糖を著しく代謝する前に、ライセート酵素を沈殿させる。
    3. 穏やかな揺れで30分間氷上の抽出溶媒にサンプルをインキュベートし、4°Cで15分間21,000 x g でサンプルを遠心分離し、沈殿したタンパク質から上澄み液を分離します。上清の50 μLをオートサンプラーバイアルに移し、4°Cオートサンプラー内のトレイにバイアルを積み込みます。上清の残りの部分は-20°Cで保存し、今後の分析を行います。

7. LC-MS/MS 分析用の LC システムの設定

  1. 950mLの水とイソプロパノール50 mLに酢酸アンモニウム 77.08 mgを完全に溶解して、溶媒Aの1 Lを調製します。アセトニトリル650mL、300mLの水、イソプロパノール50mL、酢酸アンモニウム77.08mgを用いて、1Lの溶媒Bを調製します。すべての溶媒が LC-MS グレードであることを確認します。
  2. ソルベントAとBを含む溶剤ボトルをポンプモジュールに接続します。高い流量でシステムをパージし、溶剤の機器中に発生した空気汚染をLCシステムに除去/制限します。
  3. C18逆相型カラム(カラム長30cm、内径75μm、粒子径5μm)をシステムに装備します。100%の溶媒Bを流し、ゆっくりと溶媒Aを100%まで流れ上げて、LC-MSシステムにカラムを条件にします。
    注:カラムの先端はマイクロピペットの引き手を使用して社内で準備され、圧力細胞およびヘリウムを詰めた。

8. フーリエ変換とイオントラップ質量分析計にリンクされたLCシステムのLC-MS/MSデータ取得および解釈ソフトウェアの方法を作成します。

  1. チューンプラスソフトウェアを開いて、MSメソッドのチューンファイルを編集します。
    1. メニューバーの ファイル から、プレインストールされたネガティブモードチューンファイルを開きます。
    2. メニュー バー の [スキャン モード ] を選択し、[ スキャン ウィンドウの定義] を選択します。MSn のマイクロスキャン時間設定を、イオン トラップと FT の両方で 1 に設定します。
    3. Nano-ESI ソースの設定に移動し、 スプレー電圧 を 4 kV に設定します。許容できるエレクトロスプレーが生成されるまで、これを調節します。通常、許容できるエレクトロスプレーは、2〜5kVの範囲内で達成することができる。
    4. チューン ファイルを保存します。
  2. 計測器のデータ収集および解釈ソフトウェアの セットアップウィザード を使用して、新しいLCメソッドを生成します。 ロードマップ>シーケンスセットアップ ウィザード>開きます。これらのメソッドは列ヒーターの使用を必要としないため、一時制御の手順は省略してください。
    1. [フロー勾配ポンプオプション]で、[マルチステップ] を選択します。次のウィンドウで、7 行を挿入し、各行の流量を 0.1 mL·min-1に設定します。各行に次のパラメータを入力します:0-3分から、100%の溶媒Aを送ります。3〜9分から、100%溶媒Aから20%の溶媒Bへの勾配を導入する。9〜19分から、20%の溶媒Bから100%の溶媒Bへの新しい勾配を導入する。19-27分から、100%溶媒Bで保持します。27-28分から、勾配を100%溶媒Aに戻します。28-44分から、100%の溶媒Aで保持して後続の走行のためにカラムのすすいで再調整を行い、LCが使用されていないときに溶媒を節約するために、ランの完了時に流量を0.03 mL·min-1に下げる最終ステップを含めます。
    2. 録オプションとしてポンプ圧力>サンプラーオプションのデフォルト設定を適用し、デフォルトの取得時間を使用し、デフォルトのポンプ圧力オプションを使用します。
  3. 「インストゥルメントのセットアップ」ウィンドウのサイドバーからオービトラップ・ベロス・プロMSアイコンを選択して、MS/MS方式を作成します。
    1. [ データ依存 MS/MS >新しい方法] をクリックします。 取得時間 を LC 実行の長さ (つまり 44 分)、 セグメント を 1 に、 スキャン イベント を 11 に設定します。[ファイルを調整]で、ステップ 8.1 から編集したファイルを選択します。
      注: 最初のイベントは、フーリエ変換 MS(FTMS)を使用した MS1 前駆体スキャンです。後続の 10 個のイベントは、MS2 フラグメンテーションの各前駆体スキャンで最も強烈で一意の 10 個のイオンを選択する MS2 スキャンです。
    2. イベント 1 の場合、[ スキャンの説明 ] で [アナライザー FTMS に設定し、 極性 負に設定します。[MSn 設定]では、 解像度 30,000、 正規化衝突エネルギー 35 V の設定 スキャン範囲 を最初の質量で 50 m/z、最後の質量で 1800 m/z に設定して小分子をキャプチャします。
    3. イベント 2 から 11 の場合は、[ スキャンの説明 ] の下の [アナライザー イオン トラップに設定します。 [依存スキャン ] を選択し、[ グローバル>動的除外>設定 ] をクリックして、[ 有効]を選択します。30 s の繰り返し継続時間と 120 s の除外期間を設定して、近接での反復スキャンを排除します。
    4. [スキャン イベント] 設定に移動し、すべての MS2 イベント (2 ~ 11) に対して[スキャン イベントから一括判定] を 1 に設定します。最も強いイオンのトップ10をスキャンするには、各MS2スキャンイベントを設定して、1stから10番目までのn番目の最も強いイオンを検出します。したがって、イベント 2を n番目の最も強いイオンとして検出する、イベント 3 が 2 を検出する、などで設定します。
    5. セットアップ ウィンドウを閉じ、[ ファイル] > [名前を付けて保存 ] [Method_Name] に移動します。
      メモ:LC機器および質量分析計の一般的な使用、メンテナンス、校正については、製造元が提供する取扱説明書とマニュアルを参照してください。

9. 実行シーケンスを設定し、LC-MS/MS 実行を開始します。

  1. LC-MS/MSシステムのデータ取得および解釈ソフトウェアを使用して実行シーケンスを設定します。Roadmap > シーケンス設定内で、テーブルを右クリックして、サンプルと同じ数の行を挿入します。各行に対して 、Inj Vol を5 μLに設定し 、位置 をオートサンプラートレイ上のバイアルのそれぞれの位置に設定します。サンプル名としてファイル名を入力し、実行結果に必要なファイル パスを設定します。
    注: ソルベント A を含むブランクバイアルは、シーケンスの先頭と、各三重サンプルセット(各時間ポイント)の間で列をすすぐように実行できます。
  2. 実行を開始するには、シーケンス内のすべてのファイル名をハイライト表示します。メニュー バーから [ アクション] を選択>[シーケンスの実行] > [OK] を選択します。

10. MZmine 2.53 でファイルを統合し、仮の注釈を検索します。

  1. MZmine を開き、ステップ 9.1 から '.raw' 出力ファイルをインポートします。メニュー バーから [ 生データ のインポート] を選択>データを読み込む。サンプルに対応するファイルを選択します。
  2. MS1 と MS2 のスキャンを区別するピークのリストを作成します。メニュー バーから、MS/MS ピークリスト ビルダー>機能検出>生データ メソッド 。関連する設定には、m/z ウィンドウが 0.01 に設定され、タイム ウィンドウが実行の長さに設定されるなどがあります。[設定されたフィルタ] で、[極性として負]を選択し、[スペクトル タイプ] として[中心心]を選択します。
  3. メニュー バーから機能 の一覧の方法>機能検出>ピーク エクステンダに移動します。 m/z 許容値 を 0.005 m/z または 10 ppm に設定し、 最小高さを 1E3 に設定します。このステップは完全に肉付きのピークを作成します。
  4. 重複したピークを削除します。 [重複ピーク フィルタのフィルタリング>機能リスト方法>戻る。関連する設定には、0.005 m/z または 10 ppm に設定された m/z 許容値、RT 許容値 が 5 分に設定されています。
  5. 類似したデータ ファイル (つまり、三重反応のファイル) 内のピークを整列させるには、機能リストの方法>正規化>保持時間の調整に戻ります。サンプルを一緒に三重化し、空白を除外するようにしてください。関連する設定には、0.005 m/z または 10 ppm に設定されたm/z 許容値、RT 許容値を 3 分絶対値(分)に設定、最小標準強度を 1E3 に設定します。
  6. 機能リストメソッドの位置合わせ> RANSAC Alignerから m/z と保持時間によって、すべてのファイルからピークを整列>します。 m/z 許容値 を 0.005 m/z または 10 ppm、補正後の RT 許容値RT 許容値 をそれぞれ 44 分と 39 分に設定し 、RANSAC 反復を 0、 最小ポイント数 を 10%、 しきい値を 1 に設定します。[ 同じ充電状態が必要]オプションにチェックマークを付けます。
  7. ピークファインダーの「機能一覧方法」の前の手順で失われた可能性のあるデータポイント>ギャップ埋め>修正します。関連する設定には、[強度許容値]が 50%、m/z許容値が 0.005 m/z または 10 ppm に設定され、RT 許容値が 3 分に設定されます。RT 補正を有効にします。

11. 13C標識グルコース由来代謝産物の負のモード質量を計算し、フィルタリングされたデータでこれらの分析物のm/z特徴を検索する。

  1. 標的検索のためのグルコース代謝から 13C標識代謝産物の質量を計算する。
    1. 各分子式の原子数と各元素20のモノアイソトピック質量から各標的化合物のモノアイソトピック質量を算出する。
    2. 化合物の負のモード質量 [M-H]- モノアイソトピック質量から 1 プロトン(1.007276 Da)の質量を減算して計算します。イオン化中に分子が水素イオンを取り除いた後の負モードMS検出で検出される質量です。
    3. 負のモード質量から 、13C組み込み代謝産物の質量を計算する。ここでは、グルコース由来の 13Cラベルを最大に組み込んだアイソトポーグの質量を計算した。
  2. MZmine 結果から m/z フィーチャーを検索してアサインするには、計算された 13個の C ラベル化された代謝物の質量を使用します。各ヒットに対して、次の式を使用して質量誤差(ppm)を計算します。
    Equation 1
    注: <15 ppm の質量誤差を持つ実験的な m/z 値は、現在の解析では推定アノテーションと見なされました。
  3. 品質ブラウザで推定注釈のスペクトルを手動で確認し、注釈を確認します。
    1. クアルブラウザ>ロードマップを開く。ツール バーからRAW ファイルを開き、各サンプルの生の MS データをインポートします。
    2. 全イオンクロマトグラム(上パネル)に所望の保持時間の範囲(すなわち、推定アノテーションに対応する)の下に線を引き、マススペクトル(下部パネル)を表示する。スペクトルを右クリックし、ターゲットの m/z を囲む質量の範囲を入力します。推定アノテーションに、ノイズの上に顕著に高いピーク信号があるかどうかを確認してください(補足図2)。
  4. 各時点の生物学的複製全体の平均ピーク領域と正の注釈の標準誤差を計算します。データを可視化(すなわち、棒グラフ上)、グルコース代謝の傾向を観察する。

Representative Results

グルコースからの一般的な発酵産物のライセートベースの無細胞合成を定量化するために、2xYPTG培地で増殖した株に由来するライセートを、一次炭素源8として100μMグルコースを供給した。反応は、タンパク質酸性化により24時間経過で停止した。ピルビン酸、コハク酸、乳酸塩、糖、酢酸、およびグルコース異化から生成されたエタノールを含む濾過された上清を、RIDモジュールを搭載したHPLCシステムのオートサンプラーモジュールに積載した。1.17 μM、2.34 μM、4.69 μM、9.38 μM、18.75 μM、37.50 μM、75 μM、および150 μM濃度の発酵製品とグルコースの濾過混合物を含むバイアルを、標準として機器にロードしました。検体は、HPLCカラムからRIDにイソクラシーに溶出した。1~150μMの範囲内のグルコース、コハク酸、乳酸塩、シマ質、酢酸、エタノールのピークは、RIDによって解決できます。グルコースのピーク領域は、時間経過および標準曲線サンプルのRIDデータから手動積分することによって導出された。コハク酸塩、乳酸塩、formate、酢酸、エタノールの抽出ピーク領域を、自動的に集積したシグナルから採取した。すべての標準曲線(ピーク面積対既知の濃度)はR2 値>0.99を持ち、ここで使用される濃度の範囲全体にわたって線形であった。

すべての標的検体に対するモル濃度は、それぞれの標準曲線から計算した。グルコースは、反応の最初の3時間以内に消費され、主に乳酸に発酵させた(図2A、B)。エタノールの蓄積もまた、反応の最初の3時間以内に顕著に起こり、その後停止した(図2C)。3時間後に有意なグルコース消費を伴う有意な乳酸塩およびエタノール生産の観察は、乳酸塩およびエタノール生産経路が、糖分解による継続的なグルコース消費に必要な1ネットモルNAD+の分解を可能にするので前例がない(図1)。乳酸およびエタノールは、このように、ライセート系無細胞性グルコース代謝における主要な発酵の終末生成物と考えることができる。酢酸塩は、当初、S30バッファーの成分として反応中に存在し、予想外にグルコース消費量が減速した6時間後の代謝のために蓄積された(図2D)。この結果から、酢酸発酵は、早期の時点で迅速な解糖流を必ずしも可能にするわけではないことが示唆された。一方、コハク酸との間に、小さな発酵製品として合成した(図2E、F)。全体として、この方法は、大腸菌S30糖における糖基質枯渇および発酵生成物の絶対定量化を可能にした。

MS検出は、具体的に糖代謝を促進する糖代謝をプロファイルするために、ここで適用した。2xYPTG培地で増殖した株に由来するリセートは、炭素源として13C6-グルコースを供給した。 CFME反応は、0時間、1時間、2時間、および3時間の三重で実行した。各タイムポイントからのサンプルは、逆相カラムを装備したLCシステムにロードされ、フーリエ変換およびイオントラップ質量分析計に結合されました。負イオンモードスペクトルを取得し、有機酸、リン酸糖、アミノ酸を分析するために処理しました。計算された、中央炭素代謝に属する13種のC標識種の計算された理論塊を探索し、具体的にグルコース由来化合物を同定した。大腸菌CFMEにおける活性経路の利用されたソース株培養条件および以前の報告に基づいて、このライセートプロテオームは、グルコースを解糖発酵に供給する代謝ネットワーク、ペントースリン酸経路、およびおそらくアミノ酸解離性5、6、7、8、14(図1)を含むと仮定するしたがって、これらの経路のメンバーに絞り込んだ検索は、グルコース由来の13Cラベルを組み込んだ16個の代謝産物が明確にアポイントニングされた(補足表1)。

13C6-グルコースは、解糖性中量の変動によって証明されるように、解糖分解を通じて観察的に消費された(図3A-E)。HPLC-RIDデータと一致して、グルコースは13C3-乳酸に蓄積し、また、反応の最初の3時間以内に13C3-コハク酸塩に発酵させた(図4A、B)。13C3-コハク酸イソトポログの形成は、2-炭素アセチルCoA分子のTCAサイクルへの侵入ではなく、3-炭素ホスホエノールピルビン酸(PEP)分子のカルボキシル化によってコハク酸が生成される可能性が高い、糖代謝の提案されたモデルを支持する(図 1) 。TCAサイクルの活性化は以前のCFME研究では想定されていたが、TCAの他の13C標識中間体はここでは検出されなかった8,19,21。13しかし、C3-アスパラギン酸合成は、最初のh内で起こり、消費され、PEPが直接オキサセテートに変換されるという考えを補強した(図1、図6C)。データは、グルコースリッチ培地(2xYPTG)上で発酵成長中に収穫されたソース株からのリゼートプロテオームを反映しています。これは、コハク酸産生に関与していないTCA酵素の残りの部分が酸化的TCA分岐を形成することをさらに示唆するであろう(図1)。しかし、この経路中の代謝産物はいずれも検出されなかったが、おそらく高濃度のグルタミン酸が塩対イオンとしてCFME反応に添加されたため、この枝の進行を妨げる。

HPLC-RIDデータは、3h反応期間内の13C2-アセテート検出の欠如によってさらに補完され、グルコースから3hまでの酢酸の蓄積がないことを示唆している(図2B)。しかし、酢酸の直接前駆体は、アセチルリン酸(アセチル-P)が蓄積し、アセチルCoAから酢酸合成のためのPta-AckA経路のPtaアームが活性であることを示唆している(図4C、D)。AckA触媒13C2-アセチル-P〜13C-2-アセテートの触媒は、アセテートが反応に使用されるS30バッファーの主要成分であるため、この期間内に発生しない可能性が高い(図1、図2B)。

13C6-グルコース由来炭素を糖リン酸塩6-ホスホグルコノラクトン(6PGL)、6-ホスホグルコナトナート(6PG)、リプロス-5リン酸(Ru5P)、セドエプツロース-7-リン酸(S7P)に取り込むことも観察された(図5)。これらの結果は、タンパク質研究によって以前に示唆された13C9-チロシン合成を供給する可能性のある13C9-チロシン合成におけるペントースリン酸経路の関与を確認し、同時に13C5-ヒスチジン産生の前駆体を提供する(図6A、B)7。ここではフェニルアラニンとトリプトファンの標識は認められず、必須アミノ酸のほとんども認められなかった。しかし、アミノ酸の同化作用は、栄養不足の条件下で、または定常期7、22で増殖した細胞に由来するリセートに富む可能性が高いため、これは全く驚くべきことではない。さらに、これまでのデータは、グリコ分解と発酵の中間体が、グリセアルデヒド-3リン酸、ピルビン酸、アセチルCoA(すなわち、グリシン、システイン、セリン、アラニン、バリン、レイン、レイン)に由来する多くのアミノ酸の合成を妨げなければならない補因子再生反応に向けて漏斗されていることを示唆している。前述のように、13C3-アスパラギン酸は最初の1時間以内に産生されたが、アスパラギン酸由来の13C組み込みアミノ酸(すなわち、スレオニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン)は、グルコース由来アスパラギンが発酵に関与するため、おそらく観察されなかった(図1、図6C)。最後に、標識されたグルタミン酸およびグルタミン酸由来のアミノ酸に向かうフラックスは、反応環境において高レベルのグルタミン酸によって妨げられている可能性がある(図1)。

Figure 1
図1:高グルコース濃度で指数関数的に成長する 大腸菌 BL21DE3-スターに由来するリゼートの推定代謝モデル。 解糖(緑色)の中間体および末端産物、ペントースリン酸経路(ダークオレンジ)、およびアセチルCoAからの発酵経路(青)が、リセートベースCFMEで報告されている。コハク酸発酵の存在は、酸化TCA枝(灰色)の活性化を意味する。リセート中のアミノ酸のアボシズム(金)は明確に定義されておらず、ここで調査されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:大腸菌粗抽出物を用いて調製したCFME反応におけるグルコース消費量及び発酵終製品合成に関するHPLC-RIDデータ(A)グルコース消費量及び(B)乳酸塩、(C)エタノール、(D)酢酸、(E)formate、および(F)CFME反応におけるコハク酸産生を24時間にわたってモニタリングした。標準曲線で定量化された平均mM濃度と誤差範囲(SE)が提示されます(n = 3)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:大腸菌のCFMEにおける13C6-グルコースおよび13C標識糖分解中間体の経時推移(A) 13C6-グルコース、 (B) 13C6-グルコース-6-リン酸/フルクトース-6-リン酸、 (C ) 13C6-フルクトース-1,6-ビスリン酸塩、 (D) 13C3-グリセアルデヒド-3-リン酸/ジヒドロキシアセトリン酸、および(E)13C63 63 -ピルビン酸は3時間を超えるCFME反応で行う。mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
4:大腸菌のCFMEにおける13C6-グルコース発酵における中間体および末端生成物の経時推移(A) 13C3-乳酸の相対存在量, (B) 13C3-コハク酸塩,(C) 13C2-アセチルリン酸塩, および(D) 13C2-アセチルCoAのCFME反応で 3時間を超える.mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
5:大腸菌のリン酸経路中間体である13C6-グルコース由来のリン酸経路の経時傾向CFME.相対存在量(A) 13C6-6-ホスホグルコノラクトン,(B) 13C6-6-ホスホグルコン酸塩,(C) 13C5-リブロース-5-リン酸塩, および (D) 13C7-セドエプトゥロース-7-リン酸塩 3 h.mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:大腸菌の糖由来アミノ酸を検出した13C6-グルコースCFMEの経時傾向(A) 13C9-チロシンの相対存在量, (B) 13C5-ヒスチジン, 及び (C) 13C3-アスパラギンテ 3 h.mzMINEソフトウェアによって抽出された生のピーク領域は、正の注釈(n =3)の平均および誤差範囲(SE)を計算するために使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:代表的なHPLC-RIDクロマトグラムは、37°Cで24時間インキュベートしたCFME反応における主要発酵生成物のピークを示す。グルコース、コハク酸塩、乳酸塩、formate、酢酸、およびエタノールピークは、5 mM硫酸溶媒によるアイソクラティック溶出時のHPLCカラム上での保持時間によって十分に区別可能である。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:13C標識代謝産物、具体的には(A)乳酸、(B)グルコース、および(C)37°CでインキュベートされたCFME反応中の(6PG)の代表的な質量スペクトルを1時間ダウンロード してください。

補足表1: 検出された 13個のC標識代謝産物のリスト、保持時間(MZmineを使用したサンプル間で整列)、理論上 の完全13Cラベルの負モードm/Z値、検出された特徴のm/Z値、および計算された質量誤差。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

概説されたHPLC-RIDアプローチは、糖基質の消費を定量化し、その後の主要な有機酸およびリセート中枢代謝のアルコール製品への変換を経時的に正常に定量するために使用することができます。さらに、このプロトコルは単一の移動相を用いた単純なアイソクラティック法を採用し、サンプル調製を最小限に抑え、簡単なターゲットダウンストリーム解析を可能にする。HPLC-RID法で測定された検体は、その保持時間と、よって選択されたカラム樹脂との相互作用によってのみ区別されます。ここで利用されるHPLCカラムは、特にサイズ排除とリガンド交換(すなわち、イオンモデレートされた分配クロマトグラフィー)を組み合わせることによって、炭水化物、有機酸、およびアルコールを分離するように設計された。したがって、記載された方法は、糖質基質のより標的分析に有用であり、主にライセートベースのバイオトランスフォーメーション8、15、21を促進し通電することが期待されるグルコース発酵経路の末端産物を選択する。しかし、このプロトコルは、細胞抽出物中の他の代謝経路の活性化を考慮していない。他のクロマトグラフィー分離技術(すなわち、親水性相互作用クロマトグラフィー)、勾配溶出法、より複雑なサンプル調製(すなわち、誘導体化)、および異なる光学検出器(例えば、紫外線または蒸発光散乱検出器)を用いるパイプラインは、アミノ酸およびリン酸塩などの他の代謝物を検出するために使用することができる23,24, 24, .また、LC-MS/MSを用いて、ライセート代謝を研究するグローバルなアプローチを取ることができます。

記述されたLC-MS/MS法は、より広範な範囲の代謝産物を測定および同定するための単一のワークフローである。LC-MS/MS は、メタボロームプロファイリングの最新式の分析ツールであり、その感度と保持時間による代謝物と高解像度16の m/z 比を区別する能力を備えています。中枢炭素代謝経路とアミノ酸のアボレーションに焦点を当て、極性有機酸、リン酸糖、アミノ酸を特異的に検出するために、ネガティブモードMS/MSが実装されました。ナノ液体クロマトグラフィー技術と相まって、この方法は、複雑な溶解物の背景17における小分子を検出するための高感度を提供する。しかし、プロファイルリセートベースのCFME代謝の面では、記述されたLC-MS/MSプロトコルの制限は、エタノール、糖代謝の主要産物であるエタノールの測定を妨げる50m/zの低検出限界であり、また、詳細なHPLC-RID法によって容易に定量化される。LC-MS/MSと比較して、HPLC-RIDにはコストと難易度の点で相対的なアクセシビリティの付加的な利点があります。後者の点では、ここで説明する LC-MS/MS 法のトラブルシューティングには、質量分析に関するある程度の専門知識が必要になる場合があります。それにもかかわらず、MS検出は、メタボロムにおける標識同位体をさらに区別することができるので、RID上で独特に魅力的な用途を有し、複雑なリセート代謝ネットワーク18を介して補足された基質からの炭素移動を理解するための優れた技術である。このようなアプローチは 、13C6-グルコースで反応を補い、下流 の13C組み込み代謝産物の相対的な存在量値を分析することによって、ここで適用された。この分析により、活性経路と非アクティブな経路の定義が可能になり、以前に報告された仮定をサポートし、ライセート中の代謝フラックスに関する新しい洞察を提供しました。特定の解析の方法内で変更を行うこともできます。例えば 、13個のC標識対象化合物の標準的な溶液をサンプルと一緒に分析して、グルコース由来分子の時間の経過とともに絶対的な定量的測定を達成し、フラックス分布に関する結論を出すことができます。正のモード検出用に調整された .meth ファイルを使用してシーケンスを実行することで、正に帯電した化合物の検出を現在のワークフロー内で有効にすることもできます。

両方の方法での分析サンプリングは、容易に自動化され、高い再現性を保証します。また、適切な機器処理の実施やメンテナンスが守られ、スムーズな分析が期待できます。これらのツールを使用して CFME の反応を分析する場合は、サンプリングのアップストリームとダウンストリームに関するより重要な考慮事項を作成する必要があります。サンプルの準備中に、タイム コース コントロールがタイム ゼロを表す必要があります。ここで、タンパク質は、代謝反応を停止させる酸性化によってライセート中に沈殿した。タイムゼロサンプルの場合、グルコースを含む反応ミックスを添加する前に、酸溶媒を溶解物と組み合わせた。トリクロロ酢酸による酸性化は、HPLC-RIDデータに示すように、グルコースが時間ゼロで代謝されないことを効果的に保証した(図2)。報告されたLC-MS/MS分析ではグルコース代謝をクエンチする同様の手順が行われたが 、13のC標識代謝物は、後の時点で抽出されたサンプルに対して有意に低い存在量値ではあるが、タイムゼロサンプルで検出された。また、これらの観察は解糖の中間体に限られていた。このデータは、この高感度法で検出された抽出溶媒による酸性化後、反応がある程度の解糖活性を保持することを示唆している。ただし、このアクティビティの範囲は定量化する必要があります。以前の研究では、酸性抽出溶媒は中間解糖反応を十分にクエンチしないかもしれないが、有意なグルコース消費を止めることができると報告した10。これはここで使用されるシステムではさらに調査される予定ですが、タイムゼロ以降のタイムポイントサンプル間の相対的な豊富な値の急激な変化は、グルコース代謝の傾向として解釈することができます。しかし、同様の用途では、特に代謝中間体10の絶対量を得るために、代替的なクエンチング法を探索することが推奨される。さらに、下流のソフトウェア分析中の良い慣行も観察する必要があります。RID信号からピーク領域を手動で統合して人為的ミスを減らすには、一貫性が不可欠です。手動統合は、サンプル中の代謝産物の濃度を定量化するために手動で統合されたピーク領域が使用されている場合に、標準のピーク領域にも適用する必要があります。対象となる LC-MS/MS 分析では、MZmine 分析の仮注釈を MS 品質ブラウザを使用した手動ピーク チェックで検証し、計算された質量エラーが許容される場合にのみ m/z フィーチャに注釈を付ける必要があります。ここでは、同位体探索のための包括的かつ堅牢なソフトウェアがまだ確立されていないので、これらの分析は限られたターゲットのセットに対して手動で実行されました。しかし 、13C標識代謝産物を探索するためのこのような自動化された方法は、現在出現しており、中央炭素代謝25を超えてライセートをプロファイリングするような、より複雑な分析も合理化するだろう。

高度液体クロマトグラフィーは、複雑な代謝混合物11中で小分子を分離するための堅牢で広く適用される方法である。この分離手法と屈折率または質量分析検出を組み合わせて、リセートベースのCFME反応における代謝産物の変換を正常に分析します。HPLC-RIDおよびLC-MS/MSは、アクティブなライゼート代謝をプロファイリングするための個別に強力なツールであり、その相補性は、各技術の固有の限界に対処するためにさらに活用することができます。報告された方法は、それがリゼート代謝を理解し、ターゲット代謝物の変換の改善を監視し、そして、リセート代謝を操作するときの代謝産物の変化を解明するために利用することができるようにCFMEの適用および開発を可能にする。

Disclosures

著者らは、競合する金銭的利益やその他の利益相反は知られていないと宣言している。

Acknowledgments

この研究は、植物微生物インタフェース科学フォーカスエリア(http://pmi.ornl.gov)の一環として、米国エネルギー省科学生物環境研究局ゲノム科学プログラムが主催しました。オークリッジ国立研究所は、契約DE-AC05-00OR22725の下で米国エネルギー省のUT-Battelle、LLCによって管理されています。この原稿は、米国エネルギー省との契約DE-AC05-00OR22725の下でUT-Battelle, LLCによって作成されています。米国政府は、出版のための記事を受け入れることによって、出版社は、米国政府が米国政府の目的のために、この原稿の出版された形態を公開または複製したり、他の人に許可したりする非独占的、有料、取り消し不可能な、世界的なライセンスを保持していることを認めます。エネルギー省は、DOE公共アクセス計画(http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan に従って連邦政府主催の研究のこれらの結果への一般アクセスを提供します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) Corning Costar 8160
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 87003-294
1260 Infinity Binary LC Pump Agilent G1312B HPLC-RID system
1260 Infinity High Performance Degasser Agilent G4225A HPLC-RID system
1260 Infinity Refractive Index Detector Agilent G7162A HPLC-RID system
1260 Infinity Standard Autosampler Agilent G1329B HPLC-RID system
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374 CFME reaction mix component (LC-MS/MS)
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter VWR 10040-436
Acetonitrile (LC/MS grade) Fisher Scientific A955 Solvent preparation for LC-MS/MS
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A7699 CFME reaction mix component
Aminex HPX 87-H column Bio-rad 1250140 Chromatography column for HPLC-RID
Ammonium acetate (LC/MS grade) Fisher Scientific A11450 Solvent preparation for LC-MS/MS
Ammonium glutamate Sigma-Aldrich G1376 CFME reaction mix component
Autosampler vial caps (yellow, snap) Thermo Scientific C4011-50Y Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) Wheaton W225181 Sample storage/delivery for LC-MS/MS
Benchtop microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Bis-Tris Sigma-Aldrich B9754 CFME reaction mix component
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282 CFME reaction mix component
D-dextrose (Glucose) VWR BDH9230 CFME reaction mix component
Dipotassium phosphate Sigma-Aldrich P8281 CFME reaction mix component
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Formic acid (LC/MS grade) Thermo Scientific 85178 Solvent preparation for LC-MS/MS
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) Polymicro Technologies WM22005-ND Chromatography column for LC-MS/MS
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A6283 S30 buffer ingredient
Isopropanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A461 Solvent preparation for LC-MS/MS
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) Phenomenex N/A; special order Chromatography column for LC-MS/MS
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific N/A; special order Mass spectrometer for LC-MS/MS
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M5661 S30 buffer ingredient
Magnesium glutamate Sigma-Aldrich 49605 CFME reaction mix component
Methanol (LC/MS grade) Fisher Scientific A456 Solvent preparation for LC-MS/MS
NAD+ Sigma-Aldrich N0632 CFME reaction mix component
Nanospray Ionization Source ThermoFisher Scientific/Proxeon ES071 (newest model) Mass spectrometer for LC-MS/MS
OpenLab CDS (Online) Software Agilent Version 2.15.26 Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software Thermo Version 2.7 Software for tuning the LC-MS/MS system
Potassium acetate Sigma-Aldrich P1190 S30 buffer ingredient
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1501 CFME reaction mix component
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5415 C
Screw caps (with septa, 9 mm) Supelco 29315-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Screwthread glass vials (2 mL) Supelco 29376-U Sample storage/delivery for HPLC-RID
Sodium acetate Sigma-Aldrich 241245 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium formate Sigma-Aldrich 247596 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sodium lactate Sigma-Aldrich 71716 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Succinic acid Sigma-Aldrich 398055 Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID)
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105 Solvent preparation for HPLC-RID
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T6399
Tris-acetate GoldBio T-090-100 S30 buffer ingredient
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Solvent Rack: SRD-3600 Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Ultimate 3000 LC with autosampler Dionex Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis
Water (LC/MS grade) Fisher Scientific W6500 Solvent preparation for LC-MS/MS
Xcalibur Software Thermo Version 3.0.63 Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS

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References

  1. Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
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バイオエンジニアリング、問題175、
リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出
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Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T.,More

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems. J. Vis. Exp. (175), e62852, doi:10.3791/62852 (2021).

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