Summary
Protokollene beskriver høyytelses væskekromatografimetoder kombinert for å brytningsindeks eller massespektrometrisk deteksjon for å studere metabolske reaksjoner i komplekse lysatebaserte cellefrie systemer.
Abstract
Teknisk cellulær metabolisme for målrettet biosyntese kan kreve omfattende design-build-test-learn (DBTL) sykluser som ingeniøren arbeider rundt cellens overlevelseskrav. Alternativt kan utføre DBTL-sykluser i cellefrie miljøer akselerere denne prosessen og lindre bekymringer med vertskompatibilitet. En lovende tilnærming til cellefri metabolsk engineering (CFME) utnytter metabolsk aktive råcelleekstrakter som plattformer for bioproduksjon og for raskt å oppdage og prototyping av modifiserte proteiner og veier. Å realisere disse funksjonene og optimalisere CFME-ytelsen krever metoder for å karakterisere metabolomen til lysatebaserte cellefrie plattformer. Det vil si at analytiske verktøy er nødvendige for å overvåke forbedringer i målrettede metabolittkonverteringer og i å belyse endringer i metabolittfluks ved manipulering av lysatmetabolisme. Her ble metabolittanalyser ved hjelp av høyytelses væskekromatografi (HPLC) kombinert med enten optisk eller massespektrometrisk deteksjon brukt til å karakterisere metabolittproduksjon og fluss i E. coli S30 lysater. Nærmere bestemt beskriver denne rapporten utarbeidelsen av prøver fra CFME-lysater for HPLC-analyser ved hjelp av brytningsindeksdeteksjon (RID) for å kvantifisere genereringen av sentrale metabolske mellomprodukter og biprodukter i konverteringen av lavkostnads substrater (dvs. glukose) til ulike produkter av høy verdi. Analysen av metabolittkonvertering i CFME-reaksjoner matet med 13C-merket glukose gjennom omvendt fase flytende kromatografi koblet til tandemmassespektrometri (MS / MS), et kraftig verktøy for å karakterisere spesifikke metabolittutbytter og lysat metabolsk flux fra startmaterialer, presenteres også. Til sammen gjør bruk av disse analytiske metodene på CFME lysatmetabolisme det mulig å fremme disse systemene som alternative plattformer for å utføre raskere eller nye metabolske ingeniøroppgaver.
Introduction
Begrensninger i tekniske mikrober for kjemisk produksjon kan løses ved å rekapitlere biokjemiske reaksjoner in vitro der konkurrerende cellulære overlevelsesfunksjoner er fraværende1. Videre er det åpne reaksjonsmiljøet (dvs. fravær av cellemembran) mer egnet til manipulering og er lettere å overvåke sammenlignet med levende celler. Dette grunnleggende konseptet med cellefri metabolsk engineering (CFME) har blitt elegant demonstrert ved rekonstituering av metabolske veier for å syntetisere verdifulle kjemikalier som hydrogen og monoterpener med produksjonsmålinger som er størrelsesorden høyere enn presentert i mikrobielle cellefabrikker så langt1,2,3 . Metoder for rensing av hele veier er imidlertid for tiden begrenset av tid og kostnad. Alternativt kan cellefrie metabolske systemer avledes fra råcelleekstrakter gjennom raske og rimelige metoder i forhold til rekonstituering av hele banen4. Den sentrale metabolismen som beholdes i celleekstrakter kan suppleres med energisubstrater (f.eks. glukose og enzymatiske kofaktorer) og salter i bufrede løsninger for å generere sentrale metabolske forløpere i over 24 timer5,6. Ved å tilsette eksogene enzymer til den lysatebaserte CFME-reaksjonen, kan mer komplekse biotransformasjoner av glukose til mer verdifulle kjemikalier ved høye titere4,6,7. Selv om utbyttet har en tendens til å bli kompromittert i disse systemene på grunn av deres cellelignende metabolske kompleksitet, har unike metoder for å kuratere lysate proteomer for konvertering med høyere avkastning vært og utvikles7,8.
Den enkle å utføre metabolske transformasjoner i lysate-baserte cellefrie systemer gjør disse utmerkede plattformene for enten å flytte kjemisk produksjon utenfor cellen helt eller for å prototyping nye veier med høy gjennomstrømning før du bygger og tester disse designene in vivo2,9. For begge bruksområdene er verktøy for overvåking av metabolske konverteringer eller observasjon av generelle endringer i metabolsk flux i lysater integrert i utviklingen av CFME. Høyytelses væskekromatografi (HPLC) kan brukes til å skille de kjemiske bestanddelene av CFME-reaksjoner med høy oppløsning og kan kobles til optiske eller massespektrometriske detektorer for metabolitt kvantifisering5,10. Det underliggende prinsippet for HPLC er at analytter oppløst i et løsningsmiddel (dvs. mobilfase) og pumpet gjennom en kolonne vil samhandle med det spesifikke kolonneemballasjematerialet (dvs. stasjonær fase)11. Avhengig av deres kjemiske egenskaper, viser disse analyttene varierende oppbevaringstider før de til slutt blir unndratt fra den stasjonære fasen og båret av den mobile fasen til en detektor. Denne rapporten beskriver utarbeidelse og analyse av E. coli lysate-baserte CFME-reaksjoner gjennom HPLC-baserte metoder som utnytter RID og MS / MS-deteksjon.
HPLC koblet til refraktiv indeksdeteksjon (HPLC-RID) er en generelt tilgjengelig metode for raskt å identifisere sentrale metabolske forløpere og sluttprodukter. Kort sagt måler RID hvordan analytter endrer avbøyningen av lys av den mobile fase12. RID-signaler som tilsvarer målanalytter i prøver, kan deretter kvantifiseres ved sammenligninger med RID-signaler om standardløsninger. I CFME-programmer har denne deteksjonsmodusen blitt mest brukt med HPLC-kolonner som skiller forbindelser basert på en kombinasjon av størrelsesekskludering og ligandutvekslingsmekanismer, eller ionmoderert partisjonskromatografi5,6,8,13. Denne spesielle teknikken brukes til raskt å kvantifisere forbruket av sukkersubstrater som glukose samt dannelse av gjæringsprodukter som succinat, laktat, format, acetat og etanol i lysatebaserte CFME-reaksjoner8. Registrering av konsentrasjonsendringene til disse forbindelsene via HPLC har vært nyttig for både å belyse potensialet til råcelleekstrakter for å samle sentrale metabolske forløpere og forstå hvordan banefluks omdirigeres gjennom gjæringsveier under komplekse metabolske konverteringer fra glukose i lysater6,8,14. Seminal CFME-studier i E. coli-celleekstrakter bekrefter at gjæringsforbindelser akkumuleres som sluttprodukter av glukosekabolisme og forekommer også som uønskede biprodukter i lysater som overekspresserer eksogene enzymer6,15. Det foreslås at fermentativ metabolisme spiller en nødvendig rolle i å regenerere redoksekvivalenter av kofaktorer (dvs. NAD (P)H og ATP) for å opprettholde glykolytiske reaksjoner8. Derfor er en HPLC-basert optisk deteksjonsmetode designet for å skille gjæringsprodukter et nyttig og vanlig brukt verktøy når du utfører forskjellige lysatebaserte CFME-oppgaver.
CFME kan implementeres for å akkumulere metabolske sluttprodukter som ikke er karbohydrater, organiske syrer eller alkoholer4. Måling av mellomprodukter som forbrukes så raskt som de syntetiseres, kan også være ønskelig10. Mens HPLC-RID er tilgjengelig når det gjelder kostnader og vanskeligheter, er denne metoden begrenset av dens evne til bare å skille metabolitter basert på oppbevaringstid. Et bredere spekter av metabolitter kan analyseres når flytende kromatografi er koblet til MS/MS-deteksjon (LC-MS/MS)16. Ved denne metoden blir analytter i mobilfasen ionisert og differensialt oppdaget basert på hvert molekyls masse- og ladeegenskaper. Kunnskap om både metabolittens masse-til-kostnad (m / z) forhold og oppbevaringstid på kolonnen letter dermed separasjonen av de fleste metabolske mellomprodukter og sluttprodukter med høy oppløsning16. Denne deteksjonsteknikken kan også kobles til nano-væskekromatografi, som gir mye lavere strømningshastigheter og prøveinjeksjonsvolumer, noe som gir mer sensitiv deteksjon av små molekyler i den komplekse lysatbakgrunnen17. LC-MS/MS kan i tillegg brukes med isotopmerking siden innebygde etiketter gir endringer i analyttenes m/z-verdier18. Timepoint-målinger ekstrahert fra en CFME-reaksjon supplert med et 13C6-glukosesubstrat kan dermed bestemme ende- eller biproduktene som er avledet spesielt fra supplert glukose. Selv om denne isotopsporingsmetoden ennå ikke brukes ofte i CFME-studier, er det et kraftig verktøy for å forstå metabolske konverteringer i lysatebaserte CFME-systemer, spesielt siden salttellerioner (dvs. acetat og glutamat) i disse reaksjonene også er katabolisert som sekundære substrater19. Utnytte denne teknikken kan dermed tegne et omfattende bilde av glukosemetabolismen i lysater, som til denne dagen ikke er helt forstått. Her beskriver protokollen en metode for nano-flytende kromatografi koblet til nanoelektrosprayionisering (nano ESI) MS/MS som kan brukes til å forhøre en mulig modell for glukosemetabolisme, spesielt i E. coli lysates (Figur 1). Modellen er basert på rapporter om fermentative veier og pentosefosfatveien som er aktiv i E. coli lysater avledet fra stammer vokst i rike medier5,6,8,14. Teknikken brukes i tillegg til å undersøke aminosyreproduksjon siden dagens kunnskap om aminosyre anabolisme fra glukose i lysater er begrenset til noen få eksempler som syntese av aromatiske aminosyrer7. Gitt den mest polare naturen til sluttprodukter og mellomprodukter i disse veiene (dvs. organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer), ble omvendt faset væskekromatografi brukt her. Denne teknikken skiller polarforbindelser ved elution fra en ikke-polar stasjonær fase. Disse forbindelsene ble deretter ionisert av nano ESI i negativ ionmodus som tillater påvisning av analytter med minst en negativ elementær ladning og er dermed nyttig for å oppdage sure forbindelser. Denne teknikken brukes her for å analysere glukose-avledet 13C-inkorporerende metabolitter og demonstrerer nytten av LC-MS / MS for å forstå glukosemetabolisme i lysater.
Protocol
1. Starte, stoppe og behandle tidskurs CFME-reaksjoner for HPLC-RID-kvantifisering.
- Tin tidligere tilberedt E. coli lyser og forberede resten av reaksjonskomponentene på is.
MERK: Lysatene som rapporteres her ble avledet fra E. coli BL21DE3-Star dyrket i 2xYPTG (1,8 % glukose) medier til midtloggfase.- Klargjør et passende volum filtersterilisert (0,20 μm porefilter) S30-buffer (1 M Tris-OAc justert til pH 8,2 med iseddiksyre, 1,4 M Mg(OAc)2og 6 M KOAc).
- Forbered en energimiks som inneholder glukose, glutamatsalter, ATP, Koenzym A, NAD+, Bis-Tris buffer og dipotassiumfosfat i S30-bufferen. Endelige konsentrasjoner i ønsket reaksjonsvolum som ble brukt til å forberede CFME-reaksjoner her var 100 mM glukose, 18 mM magnesiumglutamat, 15 mM ammoniumglutamat, 195 mM kaliumglutamat, 1 mM ATP, 0,2 mM Koenzym A, 1 mM NAD+, 150 mM Bis-Tris og 10 mM dipotassiumfosfat.
- Kombiner komponentene i 1,5 ml mikrosenterrør for å forberede endelige reaksjoner med 4,5 mg/ml totalt lysatprotein. Her ble CFME-reaksjoner utarbeidet med endelige volumer på 50 μL i triplikat per tidspunkt. Inkuber reaksjonene ved 37 °C for deres respektive tidsrammer.
MERK: Arbeid raskt og tilsett lysat som den endelige komponenten i reaksjonsblandingen for å forhindre for tidlige metabolske reaksjoner med glukose og glutamatsalter. Minimalt glukoseforbruk kan oppstå avhengig av hvor lenge reaksjonsblandinger inkuberes på is. - Avslutt reaksjonene og behandle prøvene for HPLC-RID-analyse.
- For å avslutte triplikatreaksjonene på passende tidspunkter, tilsett umiddelbart et likt volum på 5% trikloreddiksyre til hver prøves endelige reaksjonsvolum (dvs. 50 μL 5% trikloreddiksyre til en 50 μL reaksjon). Fortynn hver prøve med sterilt vann ved 2x reaksjonsvolumet (dvs. 100 μL).
- For å rekapitulere tid null, bland samme volum på 5% trichloroacetic acid som det totale endelige reaksjonsvolumet (dvs. 50 μL) med lysatet før du legger til resten av reaksjonskomponentene. Dette forsuringstrinnet utfeller lysate enzymer før de betydelig metaboliserer glukose.
- Virvel prøvene og sentrifugen på en stasjonær mikrosenter ved 11 600 x g i 5 minutter og overfør supernatanter som inneholder organiske analytter til rene rør. Oppbevar prøvene ved -20 °C hvis HPLC-analyser skal utføres på en annen dag. Sørg for å tine de lagrede prøvene på is før du går videre til neste trinn.
- Filtrer hvert supernatant med et 0,22 μm porefilter. Som et alternativ til sprøyter, bruk sentrifugerørfiltre og sentrifuger supernatantene ved 16.300 x g i 1 min.
- Overfør hvert filtrat til et rent HPLC-hetteglass. Legg hetteglassene på HPLC autosampler-skuffen.
- Klargjør prøver for standard kurvegenerering.
- Forbered en lagerløsning av alle målanalytter oppløst i S30-buffer ved likevektsmengder over startkonsentrasjonen av glukose i CFME-reaksjonene. Her ble det utarbeidet en lagerløsning bestående av 150 μM glukose, succinat, laktat, format, acetat og etanol. Utfør 1:1 (v/v) serielle fortynninger fra lagerløsningen for å oppnå triplikat 50 μL løsninger med endelige konsentrasjoner fra 0 μM til lagerkonsentrasjonen (dvs. 150 μM).
- Fortynn hver løsning med 50 μL 5% trichloroacetic acid og 100 μL sterilt vann. Gjenta trinn 1.3.4-1.3.5.
MERK: Kjør løsninger for standard kurvegenerering med hver prøvegruppe for å sikre nøyaktig kvantifisering av metabolittkonsentrasjoner.
2. Klargjøring av HPLC-systemet for metabolittdeteksjon.
- Under en avtrekkshette, lag en sterilisert 5 mM svovelsyreoppløsning fra deionisert og filtersterilisert vann. Tilsett ~550 μL av en 98% HPLC-type svovelsyreoppløsning til 2 L vann for å tilberede 5 mM svovelsyre.
FORSIKTIG: Svovelsyre er et farlig kjemikalie, og arbeid under en avtrekkshette med riktig lab-PVU forhindrer innånding, hudkontakt og øyekontakt. Konsentrert svovelsyre reagerer kraftig med vann og bør tilsetts direkte til vann, ikke omvendt. Oppbevars i et kjølig, tørt område borte fra direkte sollys og følg riktige avfallshåndteringstiltak som er satt av laboratoriet. - Oppbevar 2 L-flasken med 5 mM svovelsyre inkubert i et vannbad ved siden av HPLC-instrumentet. Sett vannbadet til 35 °C. Plasser slangen med et løsemiddelfilter i løsemiddelflasken og fest den andre enden til en avgassermodul i tråd med pumpemodulen.
MERK: Rensing av systemet med et nylaget løsningsmiddel før du installerer kolonnen er god instrumenthåndteringspraksis. - Utstyr HPLC-instrumentet med HPLC-kolonnen på linje med RID-modulen. Plasser søylen i vannbadet på 35 °C hvis en kolonnetermostat ikke er tilgjengelig.
- Klargjør RID-modulen for analyse ved 35 °C i Chromatography Data System (CDS)-programvare som er installert på systemdatamaskinen.
- Velg Metode på Vis -menyen, og kjør Kontrollvisning. Høyreklikk pumpemodulen > metode. Sett strømningshastigheten til 0,55 ml·min-1 og velg På-knappen for å starte pumpen.
MERK: Hvis kolonnen var på lager før den ble utstyrt på HPLC, må du øke strømningshastigheten til 0,55 ml·min-1 etter å ha likevektet kolonnen i henhold til produsentens anvisninger. - Høyreklikk på panelet som tilsvarer RID-modulen > metode. Sett temperaturen på RI-detektormodulen til 35 °C og velg På for å starte oppvarmingen av RI-detektormodulen.
- Høyreklikk på panelet RID Module > Control. Velg På for rensereferansecellen i minst 15 minutter ved bruk av et nytt løsningsmiddel eller 1 time hvis forskjellige løsningsmidler strømmet gjennom RI-detektoren før dette oppsettet. Klikk på På-knappen.
MERK: Hold pumpen og RI-detektoren på for å oppnå en stabil basislinje på nettplottet. Dette påvirkes av temperatursvingninger i laboratoriet og kan ta opptil 4 timer eller lenger. Hold systemet på over natten før prøvelasting.
- Velg Metode på Vis -menyen, og kjør Kontrollvisning. Høyreklikk pumpemodulen > metode. Sett strømningshastigheten til 0,55 ml·min-1 og velg På-knappen for å starte pumpen.
3. Opprette en metode for isokratisk HPLC-separasjon av organiske gjæringsprodukter i CDS.
- Velg Metode > Ny metodepå menylinjen. Velg metode > Lagre metode som [MethodName].M. Velg metode > Rediger hele metoden > Instrument/anskaffelse
- I kategorien Binær pumpe setter du strømmen til 0,55 ml·min-1. Under Løsemidlervelger du bokstaven som tilsvarer løsningsmiddelinngangen på pumpemodulen og setter den til 100% for isokratisk elution. Sett Trykkgrenser til 0 og 400 bar og skriv inn 30 min som Stoptime.
- I kategorien Sampler setter du injeksjonsvolumet til 50 μL. Velg alternativet Som pumpe/ingen grense under Stopptid. Sett avanserte tilleggsinnstillinger for Trekkhastighet, Løs ut hastighetog Trekkposisjon til 200 μL·min-1, 200 μL·min-1og -0,5 mm.
- I KATEGORIEN RID setter du Optisk enhetstemperatur til 35 °C. Under Signalvelger du Hent for signal og >0,2 min for Peakwidth. Velg alternativet Som pumpe/injektor for Stopptid.
- Under Avansert i kategorien RID setter du Analoge utdata til 5 % nullforskyvning og 500 000 nRIU for demping. Velg alternativet Positiv for Signalpolaritet og Alternativet På for Automatisk null før analyse.
- Lagre metoden ved å velge Metode > Lagre metode. Last inn metoden ved å velge Metode > Load Method > [MethodName]. M.
4. Opprette en sekvenstabell for automatisk oppdatering og starte HPLC-RID-systemet for datainnsamling.
- Velg Sekvens > Ny sekvensmalpå menylinjen. Velg Sekvens > Lagre sekvensmal som [SequenceTemplateName]. S.
- Velg Sekvens > sekvenstabell. Legg til 'n' rader som tilsvarer 'n' hetteglass, og skriv deretter inn hetteglassposisjoner og prøvenavn under henholdsvis Hetteglass og Prøvenavn, i henhold til deres arrangement på autosampler-skuffen. Velg metoden som genereres i trinn 3, fra rullegardinmenyen Metodenavn og skriv inn 50 μL som Inj/Hetteglass (injeksjon per hetteglass) for hver rad.
- Klikk Bruk , og lagre sekvensmalen ved å velge Sekvensmal > Lagre sekvensmal. Kontroller at sekvensmalen er lastet inn ved å velge Sekvens > Last sekvensmal > [SequenceTemplateName]. S.
- Etter å ha oppnådd en stabil basislinje på den elektroniske tomten, høyreklikker du på panelet RID-modul > kontroll > av resirkuleringsventilen for å lede løsningsmiddelstrømmen gjennom RID-detektoren til avfall. Hvis du vil starte datainnsamlingen, velger du Sekvens på menylinjen, Sekvens > Kjør.
5. Trekke ut og analysere data etter kjøring.
- Velg Dataanalysevisning på Vis-menyen. Finn sekvensfilnavnet fra fillisten til venstre på skjermen. Gå til Valg av signalvisning på det midterste panelet på skjermen > RID-signal for å vise prøvekromatogrammene.
- Velg en rad som tilsvarer en standardprøve med høy konsentrasjon fra det øverste panelet på skjermen. Legg merke til oppbevaringstidene for målanalytttoppene på det viste kromatogrammet. Topper som tilsvarer målanalyttene vil bli arrangert langs oppbevaringstidsaksen som glukose, succinat, laktat, format, acetat og etanol (Supplerende figur 1).
MERK: Den første store toppen på kromatogrammet tilsvarer trichloroacetic acid. RI-enhetene skal være konsekvente på tvers av alle standard kurveprøver. Valider oppbevaringstiden for hvert målanalytt ved å kjøre hver forbindelse som en egen prøve. - Trekk ut toppområder for hvert målanalytt fra kromatogrammer av standardene og reaksjonsprøvene.
- Se om toppene av interesse er godt integrert av programvaren. Tegn den røde linjen som base for hver topp for å få et nøyaktig integrert område under kurven. Hvis automatisk integrering mislykkes (dvs. rød linje er skjev), velger du Manuell integrasjon-knappen fra integreringsverktøysettet og tegner manuelt en toppbase for å integrere toppområdet.
MERK: Hvis manuell integrering må utføres for en målanalytt i én prøve, må du holde konsekvent og manuelt integrere den samme analytten på tvers av alle prøver. - Velg markørverktøyet fra common tool set for å klikke på riktig integrerte topper. Toppområdet og den tilsvarende oppbevaringstiden for den valgte toppen utheves som en tabellrad på det nederste panelet på skjermen.
- Hvis du vil eksportere toppområder, velger du Fil > Eksporter > integreringsresultater.
- Se om toppene av interesse er godt integrert av programvaren. Tegn den røde linjen som base for hver topp for å få et nøyaktig integrert område under kurven. Hvis automatisk integrering mislykkes (dvs. rød linje er skjev), velger du Manuell integrasjon-knappen fra integreringsverktøysettet og tegner manuelt en toppbase for å integrere toppområdet.
- Kvantifisere målanalyttkonsentrasjonene ved hjelp av standardkurver.
- Tegne inn toppområdeverdier i forhold til kjente konsentrasjoner av prøver i et regneark. Høyreklikk de tegnede dataene, Legg til trendlinje > Formater trendlinje > Vis formel i diagram.
- I et eget regneark bruker du ligningene for standardkurvetrendlinjer til å konvertere toppområdeverdier til konsentrasjoner for hver analytt fra hvert utvalg. Beregn gjennomsnittlige toppområder og standard feilverdier på tvers av triplikater for datavisualisering.
6. Starte, stoppe og behandle tidskurs isotopsporing CFME-reaksjoner for LC-MS / MS-kvantifisering.
- Sett opp triplikatreaksjoner per tidspunkt (unntatt tid null) på is som beskrevet i 1.1-1.2. Men i stedet for glukose, bruk en endelig konsentrasjon på 100 mM 13C6-glukose i reaksjonene. Inkuber reaksjonene ved 37 °C i 1 time, 2 timer og 3 timer.
- For å avslutte, blits fryse reaksjonene i flytende nitrogen og lagre dem ved -80 °C. Hopp over dette lagringstrinnet for analyse samme dag.
MERK: Trichloroacetic acid ble ikke brukt til å stoppe reaksjoner på grunn av forstyrrelser fra syren når man oppdaget noen sentrale karbonmetabolitter via LC-MS/MS. I stedet ble ekstraksjonsløsningsmiddel som inneholder maursyre (trinn 6.3) brukt til å utfelle metabolske proteiner siden maursyrens masse er under deteksjonsgrensen for den rapporterte MS / MS-metoden. - Forbered 50 ml av ekstraksjonsløsningsmidlet. Kombiner og virvel 20 ml acetonitril, 20 ml metanol og 10 ml vann (alle LC-MS-grader) i et 50 ml sentrifugerør sammen med 0,199 ml maursyre for å lage en 0,1 M løsning. Avkjøl oppløsningsvæsken til 4 °C under ekstraksjon og oppbevar oppløsningsvæsken ved -20 °C når det ikke er i bruk.
- Behandlingseksempler for LC-MS/MS-analyse
- På analysedagen pipetteres et tilsvarende volum av ekstraksjonsløsningsmidlet (dvs. 50 μL) til hver prøve. Hvis prøvene var frosset, legg til ekstraksjonsløsningsmidlet før prøvene helt tiner ut for å forhindre reaktivering av glukosemetabolismen. Utfør alle prøvebehandlingstrinn på is.
- For å rekapitulere tid null, pipette det endelige volumet av ekstraksjonsløsningsmiddel (dvs. 50 μL) til et passende volum lysat for ønsket sluttkonsentrasjon i reaksjonen (dvs. av 4,5 mg / ml i 50 μL reaksjonsvolum). Tilsett resten av reaksjonskomponentene som i trinn 1.2. Dette forsuringstrinnet utfeller lysate enzymer før de betydelig metaboliserer glukose.
- Inkuber prøvene i ekstraksjonsløsningsmiddel på is i 30 minutter med forsiktig risting, og sentrifuger deretter prøvene på 21 000 x g i 15 minutter ved 4 °C for å skille supernatanten fra det utfelte proteinet. Overfør 50 μL av supernatanten til autosampler hetteglass og legg hetteglassene på brettet innen 4 °C autosampler. Oppbevar resten av supernatanten ved -20 °C for fremtidige analyser.
7. Sette opp LC-systemet for LC-MS/MS-analyse.
- Forbered 1 L av løsningsmiddel A ved å fullstendig oppløse 77,08 mg ammoniumacetat i 950 ml vann og 50 ml isopropanol. Forbered 1 L løsemiddel B med 650 ml acetonitril, 300 ml vann og 50 ml isopropanol sammen med 77,08 mg ammoniumacetat. Kontroller at alle løsemidler er LC-MS-grad.
- Koble løsemiddelflaskene som inneholder løsningsmidler A og B, til pumpemodulen. Tøm systemet med høy strømningshastighet for å fjerne/begrense eventuell luftforurensning som kan ha oppstått under utstyret til løsningsmidlene til LC-systemet.
- Utstyr systemet med en C18 omvendt faset kolonne (30 cm kolonnelengde, 75 μm indre diameter og 5 μm partikkeldiameter). Kondisjoner kolonnen til LC-MS-systemet ved å strømme 100% løsningsmiddel B og sakte strømme opp Løsningsmiddel A til 100%.
MERK: Kolonnespisser ble tilberedt internt ved hjelp av en mikropipettetrekker og fullpakket med trykkceller og helium.
8. Opprette en metode på LC-MS/MS-datainnsamlings- og tolkningsprogramvare for LC-systemet knyttet til Fourier Transform og Ion Trap Mass Spectrometers.
- Åpne Tune Plus-programvaren for å redigere en tunefil for MS-metoden.
- Åpne en forhåndsinstallert innstillingsfil for negativ modus på menylinjen.
- Velg ScanMode på menylinjen, og velg deretter Definer skannevindu. Sett den mikroskanske tidsinnstillingen for MSn til 1 for både Ion Trap og FT.
- Gå til innstillinger for Nano-ESI Source og sett Spray Voltage til 4 kV. Moduler dette til en akseptabel elektrospray genereres; vanligvis kan akseptabel elektrospray oppnås innenfor området 2-5 kV.
- Lagre mottakerfilen.
- Generer en ny LC-metode ved hjelp av installasjonsveiviseren for instrumentets programvare for datainnsamling og tolkning. Åpne Veikart > > veiviser for sekvensoppsett. Siden disse metodene ikke krever bruk av en kolonnevarmer, hopper du over Temp Control-trinnet.
- Velg Multistepunder Alternativer for pumpe for strømningsgradient. I det neste vinduet setter du inn 7 linjer og setter strømningshastigheten for hver rad til 0,1 ml·min-1. Angi følgende parametere for hver rad: fra 0-3 min, lever 100% løsningsmiddel A; fra 3-9 min, introdusere en gradient fra 100% løsningsmiddel A til 20% løsningsmiddel B; fra 9-19 min, introdusere en ny gradient fra 20% løsningsmiddel B til 100% løsningsmiddel B; fra 19-27 min, hold på 100% løsningsmiddel B; fra 27-28 min, sett gradienten tilbake til 100% løsningsmiddel A; fra 28-44 min, skyll og rekondisjonering av kolonnen for påfølgende løp ved å holde på 100% løsningsmiddel A. Inkluder et siste trinn for å senke strømningshastigheten til 0,03 ml·min-1 når løpeturen er fullført for å bevare løsningsmidlet når LC ikke er i bruk.
- Bruk standardinnstillinger for prøvealternativer > pumpetrykk som anskaffelsesalternativ, og bruk standard anskaffelsestid og bruk standard pumpetrykkalternativer.
- Opprett en MS/MS-metode ved å velge Orbitrap Velos Pro MS-ikonet fra sidefeltet i instrumentoppsettvinduet.
- Klikk Ny metode > Dataavhengig MS/MS. Sett Hent tid til lengden på LC-kjøringen (dvs. 44 min), Segment til 1 og Skann hendelser til 11. Velg den redigerte filen fra trinn 8.1 for Tune File.
MERK: Den første hendelsen er en MS1 forløperskanning ved hjelp av Fourier Transform MS (FTMS). De etterfølgende 10 hendelsene vil være MS2-skanninger som velger de 10 mest intense og unike ionene i hver forløperskanning etter MS2-fragmentering. - For hendelse 1 setter du Analysator for skanningsbeskrivelse til FTMS og Polaritet til Negativ under Skanningsbeskrivelse satt til FTMS og Polaritet til Negativ. Under MSn-innstillinger bruker du en oppløsning på 30 000 og en normalisert kollisjonsenergi på 35 V. Sett skanneområder til 50 m/z for første masse og 1800 m/z for siste masse for å fange små molekyler.
- For hendelse 2 til og med 11 setter du Analysator til Ion-felle under Skanningsbeskrivelse satt til Ion-felle. Velg Avhengig skanning, og klikk innstillinger > global > dynamisk ekskludering, og velg Aktiver; angi en gjentakelsesvarighet på 30 s og 120 s ekskluderingsvarighet for å eliminere gjentatte skanninger i nærheten.
- Gå til Innstillinger for skannehendelse og sett Massebestemt fra skanningshendelse til 1 for alle MS2-hendelser (2 til og med 11). Hvis du vil søke etter de ti mest intense ionene på topp 10, angir du at hver MS2-skanningshendelse skal oppdage en nth Mest intense ion fra 1m til 10. Sett derfor hendelse 2 til å oppdage 1 som den nth Most Intense Ion, hendelse 3 for å oppdage 2, og så videre.
- Lukk oppsettsvinduet, og gå til Lagre som > Fil [Method_Name].meth.
MERK: For generell bruk, vedlikehold og kalibrering av LC-instrumentet og massespektrometeret, se bruksanvisningen og håndbøkene som følger med produsenten.
- Klikk Ny metode > Dataavhengig MS/MS. Sett Hent tid til lengden på LC-kjøringen (dvs. 44 min), Segment til 1 og Skann hendelser til 11. Velg den redigerte filen fra trinn 8.1 for Tune File.
9. Sette opp en kjøresekvens og starte LC-MS/MS-kjøringen.
- Konfigurer en kjør sekvens ved hjelp av LC-MS/MS-systemets programvare for datainnsamling og tolkning. I Roadmap > Sequence Setuphøyreklikker du tabellen for å sette inn så mange rader som eksempler. For hver rad setter du Inj Vol til 5 μL og posisjonen til hetteglassets respektive posisjon på autosamplerskuffen. Skriv inn filnavn som eksempelnavn, og angi ønsket filbane for kjøreresultater.
MERK: Blanke hetteglass som inneholder løsningsmiddel A kan kjøres i begynnelsen av sekvensen og mellom hvert sett med triplikatprøver (hvert sett med tidspunkter) for å skylle kolonnen. - Hvis du vil starte kjøringen, merker du alle filnavnene i sekvensen. Velg Handlinger på menylinjen > Kjør sekvens > OK.
10. Konsolidere filer og søke etter foreløpige merknader på MZmine 2.53.
- Åpne MZmine og importer utdatafilene for .raw fra trinn 9.1. Velg Rådatametoder > Rådataimportpå menylinjen. Velg filer som tilsvarer eksemplene.
- Lag en liste over topper som skiller mellom MS1- og MS2-skanninger. Fra menylinjen > Raw Data Methods Feature Detection > MS/MS Peaklist Builder. Relevante innstillinger inkluderer m/z Vindu satt til 0,01 og Tidsvindu satt til lengden på kjøringen. Under Angi filtre velger du Negativ som polaritet og Sentroided som Spektrumtype.
- Gå til Metoder for funksjonsliste > Funksjonsgjenkjenning > Peak Extender -enhetenpå menylinjen. Sett m/z-toleransen til 0,005 m/z eller 22:00 og Minimumshøyde til 1E3. Dette trinnet vil skape fullt utfylte topper.
- Fjern dupliserte topper. Gå tilbake til Metoder for funksjonsliste > filtrering > duplisert toppfilter. Relevante innstillinger inkluderer m/z-toleranse satt til 0,005 m/z eller 22:00 og RT-toleransen satt til 5 min.
- Hvis du vil justere topper i lignende datafiler (det vil si triplikatreaksjoner), går du tilbake til Metoder for funksjonsliste > normalisering > Kalibreringav oppbevaringstid . Pass på å behandle triplikatprøver sammen og utelate emner. Relevante innstillinger inkluderer m/z-toleranse satt til 0,005 m/z eller 22:00, RT-toleranse satt til 3 min absolutt (min) og Minimum standardintensitet satt til 1E3.
- Juster topper fra alle filer etter m/z og oppbevaringstid fra metoder for funksjonsliste > justering > RANSAC-justering. Sett m/z-toleranse til henholdsvis 0,005 m/z eller 10 ppm, RT-toleranse og RT-toleranse etter korrigering til henholdsvis 44 og 39 minutter, RANSAC-gjentakelser til 0, Minimum antall poeng til 10 % og Terskelverdi til 1. Merk av for Alternativet Krev samme ladetilstand.
- Korriger for alle datapunkter som kan ha gått tapt i tidligere trinn i Metoder for funksjonsliste > Gap-fylling > Peak Finder. Relevante innstillinger inkluderer Intensitetstoleranse satt til 50 %, m/z-toleranse satt til 0,005 m/z eller 10 ppm, og RT-toleranse satt til 3 min. Aktiver RT-rettelse.
11. Beregning av negative modusmasser av 13C-merkede glukoseavledede metabolitter og søk etter m / z-funksjonene til disse analyttene i filtrerte data.
- Beregn massene av 13C-merkede metabolitter fra glukosemetabolisme for det målrettede søket.
- Beregn den monoisopiske massen av hver målforbindelse fra antall atomer i forbindelsens molekylære formel og de monoisotopiske massene av hvert element20.
- Beregn forbindelsens negative modusmasse [M-H]- ved å trekke massen av 1 proton (1.007276 Da) fra den monoisotopiske massen. Dette er massen oppdaget av negativ modus MS-deteksjon etter at molekyler er strippet for en hydrogenion under ionisering.
- Fra den negative modusmassen beregner du massen av den 13C-inkorporerende metabolitten. Her ble massene av isotopologer som maksimalt inkorporerer glukoseavledede 13C-etiketter beregnet.
- Bruk beregnede masser av 13C-merkede metabolitter til å søke etter og kommentere m/z-funksjoner fra MZmine-resultater. For hvert mulige treff beregner du massefeilen (ppm) ved hjelp av følgende formel:
MERK: Eksperimentelle m/z-verdier med <15 ppm massefeil ble ansett som putative merknader i den aktuelle analysen. - Kontroller spektra av putative merknader manuelt i en kvalitetsleser for å bekrefte merknader.
- Åpne Veikart > Qual Browser. Åpne Raw-fil på verktøylinjen for å importere rå MS-data for hvert eksempel.
- Tegn en linje under ønsket område av oppbevaringstider (dvs. tilsvarende den putative merknaden) på det totale ionkromatogrammet (topppanelet) for å se et massespekter (bunnpanel). Høyreklikk på spekteret og skriv inn en rekke masser som omfatter målet analytes m / z. Kontroller om de putative merknadene har tydelige toppsignaler som er merkbart over støyen (Supplerende figur 2).
- Beregn de gjennomsnittlige toppområdene og standardfeilene for positive merknader på tvers av biologiske replikeringer for hvert tidspunkt. Visualiser dataene (dvs. på en stolpegraf) for å observere trender i glukosemetabolismen.
Representative Results
For å kvantifisere den lysatebaserte cellefrie syntesen av vanlige gjæringsprodukter fra glukose, ble lysater avledet fra stammer dyrket i 2xYPTG-medier matet 100 μM glukose som en primær karbonkilde8. Reaksjonene ble stoppet over et 24 timers tidsforløp ved proteinforsuring. Filtrerte supernatanter som inneholder pyruvat, succinat, laktat, format, acetat og etanol produsert av glukosekabosabolisme ble lastet inn i autosamplermodulen til et HPLC-system utstyrt med en RID-modul. Hetteglass med filtrerte blandinger av fermentative sluttprodukter og glukose ved 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM og 150 μM konsentrasjoner i S30 buffer ble lastet på instrumentet som standarder. Analytter ble unndratt isocratically fra en HPLC-kolonne til RID. Topper for glukose, succinat, laktat, format, acetat og etanol innenfor området 1 til 150 μM kan løses av RID. Toppområder for glukose ble avledet ved manuell integrasjon fra RID-dataene for tidskurs og standard kurveprøver. Utpakkede toppområder for succinat, laktat, format, acetat og etanol ble tatt fra automatisk integrerte signaler. Alle standardkurver (toppområde vs. kjent konsentrasjon) hadde R2-verdier >0,99 og var lineære i hele konsentrasjonsområdet som ble brukt her.
Molarkonsentrasjoner for alle målanalytter ble beregnet ut fra deres respektive standardkurver. Glukose ble konsumert i løpet av de første 3 t av reaksjonen og hovedsakelig gjæret til laktat (Figur 2A, B). Etanolakkumulering skjedde også betydelig i løpet av de første 3 t av reaksjonen og stoppet deretter (Figur 2C). Observasjonen av betydelig laktat- og etanolproduksjon med betydelig glukoseforbruk etter 3 timer var ikke enestående siden laktat- og etanolproduksjonsveier tillater regenerering av 1 netto mol NAD + fra glykolytisk NADH som kreves for fortsatt glukoseforbruk gjennom glykolyse (figur 1). Laktat og etanol kan dermed betraktes som de viktigste gjæringssluttproduktene i lysatbasert cellefri glukosemetabolisme. Acetat var i utgangspunktet til stede i reaksjonene som en komponent i S30-bufferen og uventet bare akkumulert på grunn av metabolisme etter 6 timer da glukoseforbruket hadde avtatt (Figur 2D). Dette resultatet antyder at acetatgjæring ikke nødvendigvis muliggjør rask glykolytisk flux i tidligere tidspunkter. I mellomtiden ble format og succinat syntetisert som mindre gjæringsprodukter (Figur 2E, F). Til sammen muliggjorde metoden absolutt kvantifisering av sukkersubstratnedbrytning og fermentativ produktdannelse i E. coli S30 lysater.
MS-deteksjon for å profilere lysat glukosemetabolisme ble spesielt brukt her. Lysater avledet fra stammer dyrket i 2xYPTG media ble matet 13C6-glukose som karbonkilde. CFME-reaksjoner ble kjørt i triplikat i 0 timer, 1 t, 2 t og 3 timer. Prøver fra hvert tidspunkt ble lastet på et LC-system utstyrt med en omvendt fasekolonne og koblet til Fouriertransformasjon og ionfellemassespektrometre. Negativ ionmodusspektra ble oppnådd og behandlet for å analysere organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer. Beregnede teoretiske masser av 13C-merkede arter som tilhører sentral karbonmetabolisme ble søkt for å identifisere spesielt glukoseavledede forbindelser. Basert på de utnyttede kildestammedyrkingsforholdene og tidligere rapporter om aktive veier i E. coli CFME, antas det her at lysate proteom består av et metabolsk nettverk som mater glukose i glykolytisk gjæring, pentosefosfatbanen og muligens aminosyre anabolisme5,6,7,8,14 ( figur1). Derfor ble søket innsnevret til medlemmer av disse veiene, hvorav 16 metabolitter som inkorporerte glukoseavledede 13C-etiketter, ble entydig kommentert (Supplerende tabell 1).
13 C6-glukose ble observabelt konsumert gjennom glykolyse, som det fremgår av svingningene i glykolytiske mellomliggende overflod (Figur 3A-E). I samsvar med HPLC-RID-dataene akkumulerte glukose til 13C3-laktat og ble også gjæret til 13C3-succinat i løpet av de første 3 t av reaksjonen (Figur 4A,B). Dannelsen av 13C3-succinat isotopologue støtter den foreslåtte modellen for lysat glukosemetabolisme (figur 1), hvor succinat sannsynligvis vil bli generert av karboksylering av 3-karbon fosfoenolpyruvat (PEP) molekyl og ikke fra innføringen av et 2-karbon acetyl-CoA molekyl til TCA-syklusen. Aktivering av TCA-syklusen er antatt i tidligere CFME-studier, men andre 13C-merkede mellomprodukter av TCA ble ikke oppdaget her8,19,21. 13 C3-aspartatsyntesen forekom imidlertid i løpet av den første h og ble konsumert, noe som forsterket ideen om at PEP konverteres direkte til oksaacetat (Figur 1, Figur 6C). Dataene reflekterer en lysate proteom fra kildestammer høstet under gjærende vekst på glukoserike medier (2xYPTG). Dette vil videre innebære at resten av TCA-enzymene som ikke deltar i succinate produksjon danner en oksidativ TCA-gren (figur 1). Ingen av metabolittene i denne banen ble imidlertid oppdaget, muligens fordi høye konsentrasjoner av glutamat tilsatt CFME-reaksjonen som en saltteller forhindrer progresjonen av denne grenen.
HPLC-RID-dataene suppleres i tillegg av mangelen på 13C2-acetatdeteksjon innen 3 h reaksjonstidsrammen som antyder ingen opphopning av acetat fra glukose opp til 3 timer (Figur 2B). Imidlertid akkumuleres den direkte forløperen til acetat, acetyl-fosfat (acetyl-P), akkumulert, noe som tyder på at Pta-armen til Pta-AckA-banen for acetatsyntese fra acetyl-CoA er aktiv (Figur 4C, D). AckA katalysert defosforylering av 13C2-acetyl-P til 13C2-acetat forekommer sannsynligvis ikke innen denne tidsrammen på grunn av at acetat er en hovedkomponent i S30-bufferen som brukes i reaksjonene (Figur 1, Figur 2B).
Inkorporering av 13C6-glukose-avledede karboner til sukkerfosfater 6-fosfoglukonolakton (6PGL), 6-fosfoglukonat (6PG), ribulose-5-fosfat (Ru5P) og sedoheptulose-7-fosfat (S7P) ble også observert (Figur 5). Disse resultatene bekrefter deltakelsen av pentosefosfatbanen i lysat glukosemetabolisme og gir sannsynligvis 13C 9-tyrosinsyntese, som tidligere har blitt foreslått av en proteomisk studie, samtidig som den gir en forløper for 13C5-histidinproduksjon (Figur 6A,B)7. Merket fenylalanin og tryptofan ble ikke observert her, og heller ikke de fleste essensielle aminosyrer. Dette er imidlertid ikke helt overraskende siden aminosyre anabolisme er sannsynlig å bli beriket i lysater avledet fra celler som vokser i næringssultne forhold eller i den stasjonære fase7,22. Videre antyder dataene så langt at mellomprodukter av glykolyse og gjæring er traktert mot kofaktorregenerering av sluttreaksjoner, som må utelukke syntesen av mange aminosyrer avledet fra glyseraldehyd-3-fosfat, pyruvat og acetylsyre (dvs. glycin, cystein, serin, alanin, valin, leucin og lysin) (Figur 1). Som nevnt ble 13C3-aspartat produsert i løpet av den første timen, mens aspartat avledet 13C-inkorporerende aminosyrer (dvs. treonin, isoleucin, metionin og aspargin) ikke ble observert muligens fordi glukose-avledet aspartat deltar i gjæring (Figur 1, Figur 6C). Til slutt kan fluks mot merket glutamat og aminosyrer avledet fra glutamat ha blitt hindret av høye nivåer av glutamat i reaksjonsmiljøet (Figur 1).
Figur 1: En putativ metabolsk modell av lysater avledet fra E. coli BL21DE3-Star vokser eksponentielt i høye glukosekonsentrasjoner. Mellomprodukter og sluttprodukter av glykolyse (grønn), pentosefosfatbanen (mørk oransje) og fermentative veier (blå) fra acetyl-CoA er rapportert i lysatbasert CFME. Tilstedeværelsen av kortfattet gjæring innebærer aktivering av den oksidative TCA-grenen (grå). Aminosyre anabolisme (gull) i lysater er ikke godt definert og undersøkes her. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: HPLC-RID-data for glukoseforbruk og fermentativ sluttproduktsyntese i CFME-reaksjoner tilberedt med E. coli-råoljeekstrakter. (A) Glukoseforbruk og (B) laktat, (C) etanol, (D) acetat, (E) formate, og (F) succinate produksjon i CFME-reaksjoner ble overvåket over 24 timer. Gjennomsnittlig mM-konsentrasjon og feilfelt (SE) kvantifisert med standardkurver presenteres (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tidskurstrender på 13C6-glukose og 13C-merkede glykolytiske mellomprodukter i E. coli lysate CFME. Relative overflod av (A) 13C6-glukose, (B) 13C6-glukose-6-fosfat/fruktose-6-fosfat, (C) 13C6-fruktose-1,6-bisfosfat, (D) 13C3-glyseraldehyd-3-fosfat/dihydroksyacetonfosfat, og (E) 13C -pyruvat i CFME-reaksjoner over 3 timer. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidskurstrender for mellomprodukter og sluttprodukter i 13C6-glukosegjæring i E. coli lysate CFME. Relative overfloder av (A) 13C3-laktat, (B) 13C3-succinate, (C) 13C2-acetyl-fosfat, og (D) 13C2-acetyl-CoA i CFME-reaksjoner over 3 timer. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tidskurstrender på 13C6-glukoseavledede pentosefosfatbane mellomprodukter i E. coli lysate CFME. Relative overfloder av (A) 13C6-6-fosfogluconolakton, (B) 13C6-6-fosfoglukonat, (C) 13C5-ribulose-5-fosfat, og (D) 13C7-sedoheptulose-7-fosfat over 3 t. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Tidsforløptrender for påviste 13C6-glukoseavledede aminosyrer i E. coli lysate CFME. Relative overfloder av (A) 13C9-tyrosin, (B) 13C5-histidin, og (C) 13C3-aspartat over 3 timer. Raw peak områder hentet av mzMINE programvare ble brukt til å beregne gjennomsnitt og feilfelt (SE) for positive merknader (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Representativt HPLC-RID-kromatogram som viser topper for store gjæringsprodukter i en CFME-reaksjon inkubert ved 37 °C i 24 timer. Glukose-, succinat-, laktat-, format-, acetat- og etanoltopper er tilstrekkelig preget av oppbevaringstidene på en HPLC-kolonne under isokratisk elution med 5 mM svovelsyreløsningsmiddel. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Representativ massespektra for 13C-merkede metabolitter, spesielt (A) laktat,(B) glukose, og (C) 6-fosfoglukonat (6PG) i en CFME-reaksjon inkubert ved 37 °C i 1 t. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Liste over påviste 13C-merkede metabolitter, oppbevaringstider (justert på tvers av prøver ved hjelp av MZmine), teoretiske fullstendig 13C-merkede negative modus m/z-verdier, m/z-verdier for oppdagede funksjoner og beregnede massefeil. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Den skisserte HPLC-RID-tilnærmingen kan brukes til å kvantifisere sukkersubstratforbruk og etterfølgende konverteringer til store organiske syre- og alkoholprodukter av lysat sentral metabolisme over tid. Videre bruker denne protokollen en enkel isokratisk metode ved hjelp av en enkelt mobil fase, krever minimal prøvepreparering, og tillater en enkel målrettet nedstrømsanalyse. Analytter målt ved HPLC-RID-metoden utmerker seg utelukkende av oppbevaringstidene, og derfor deres interaksjoner med den valgte kolonneharpiksen. HPLC-kolonnen som brukes her, ble spesielt designet for å skille karbohydrater, organiske syrer og alkoholer ved å kombinere størrelsesekskludering og ligandutveksling (dvs. ion-moderert partisjonskromatografi). Den beskrevne metoden er derfor nyttig for mer målrettet analyse av karbohydratsubstrater og utvalgte sluttprodukter av glukosegjæringsveier som forventes å primært lette og energisere lysatebaserte biotransformasjoner8,15,21. Denne protokollen tar imidlertid ikke hensyn til aktivering av andre metabolske veier i celleekstrakter. Rørledninger som benytter andre kromatografiske separasjonsteknikker (dvs. hydrofil interaksjonskromatografi), gradient elutionmetoder, mer komplisert prøvepreparering (dvs. avledning) og forskjellige optiske detektorer (f.eks. ultrafiolett lys eller fordampende lysspredningsdetektorer) kan brukes til å oppdage andre metabolitter som aminosyrer og sukkerfosfater23,24 . Alternativt kan en global tilnærming til å studere lysatmetabolisme tas ved hjelp av LC-MS / MS.
Den beskrevne LC-MS/MS-metoden er en enkelt arbeidsflyt for måling og identifisering av et bredere spekter av metabolitter. LC-MS/MS er et toppmoderne analyseverktøy for metabolomprofilering på grunn av følsomheten og evnen til å skille mellom metabolitter ved oppbevaringstid og m/z-forhold med høy oppløsning16. Med fokus på sentrale karbonmetabolske veier og aminosyre anabolisme, negativ modus MS / MS ble implementert for å spesifikt oppdage polare organiske syrer, sukkerfosfater og aminosyrer. Kombinert med en nano-væske kromatografi teknikk, gir metoden høy følsomhet for å oppdage små molekyler i den komplekse lysatbakgrunnen17. Når det gjelder profilering av lysatbasert CFME-metabolisme, er imidlertid en begrensning av den beskrevne LC-MS / MS-protokollen dens nedre deteksjonsgrense på 50 m / z, som utelukker måling av etanol, et hovedprodukt i lysat glukosemetabolisme, samt format, som begge ellers lett kvantifiseres av den detaljerte HPLC-RID-metoden. Sammenlignet med LC-MS/MS har HPLC-RID den ekstra fordelen med relativ tilgjengelighet når det gjelder kostnader og vanskeligheter. Til sistnevnte punkt kan feilsøking av LC-MS/MS-metoden som er beskrevet her, kreve en viss grad av ekspertise innen massespektrometri. Likevel har MS-deteksjon unikt tiltalende applikasjoner over RID, da det i tillegg kan skille merkede isotoper i metabolomer, en utmerket teknikk for å forstå karbonbevegelse fra supplerte substrater gjennom det komplekse lysate metabolske nettverket18. En slik tilnærming ble brukt her ved å supplere reaksjoner med 13C6-glukose og analysere de relative overflodsverdiene til nedstrøms 13C-inkorporerende metabolitter. Analysen tillot definisjonen av aktive og inaktive veier, støttet tidligere rapporterte forutsetninger og ga ny innsikt om metabolsk flux i lysater. Endringer kan også gjøres innenfor metoden for spesifikke analyser. For eksempel kan standardløsninger av 13C-merkede målforbindelser analyseres sammen med prøver for å oppnå absolutte kvantitative målinger av glukoseavledede molekyler over tid og konkludere om fluksfordelinger. Bedre deteksjon av positivt ladede forbindelser kan også aktiveres i gjeldende arbeidsflyt ved å kjøre sekvenser med METH-filer justert for registrering av positiv modus.
Analytisk prøvetaking i begge beskrevne metoder er praktisk automatisert, noe som sikrer høy reproduserbarhet. Videre kan det forventes jevne analytiske løp så lenge riktig instrumenthåndteringspraksis og vedlikehold overholdes. Ved bruk av disse verktøyene for å analysere CFME-reaksjoner, bør det tas mer kritiske hensyn oppstrøms og nedstrøms prøvetaking. Under prøveforberedelsene er det viktig at tidskurskontrollene er representative for tids-null. Her ble proteiner utfelt i lysater ved forsuring for å stoppe metabolske reaksjoner. For tids-null-prøver ble syreløsningsmidlet kombinert med lysat før tilsetning av reaksjonsblandingen som inneholder glukose. Forsuring med trichloroacetic acid sørget effektivt for at glukose ikke metaboliseres ved tids-null, som vist i HPLC-RID-dataene (Figur 2). Mens en lignende prosedyre for å slukke glukosemetabolismen ble utført i den rapporterte LC-MS /MS-analysen, ble 13C-merkede metabolitter påvist i tids-null-prøver, om enn ved betydelig lave overflodsverdier i forhold til prøver ekstrahert på senere tidspunkter. Videre var disse observasjonene begrenset til mellomprodukter av glykolyse. Dataene tyder på at reaksjonene beholder en viss grad av glykolytisk aktivitet etter forsuring med ekstraksjonsløsningsmidlet som oppdages ved denne svært følsomme metoden. Omfanget av denne aktiviteten bør imidlertid kvantifiseres. En tidligere studie rapporterte at sure ekstraksjonsløsningsmidler kanskje ikke tilstrekkelig slukker mellomliggende glykolytiske reaksjoner, men kan stoppe betydelig glukoseforbruk10. Selv om dette gjenstår å undersøke nærmere i systemet som brukes her, kan drastiske endringer i relative overflodsverdier mellom tids-null og senere tidspunktprøver tolkes som trender i glukosemetabolismen. Utforske alternative slukkingsmetoder, men anbefales i lignende applikasjoner, spesielt for å oppnå absolutte mengder metabolske mellomprodukter10. Videre bør god praksis under nedstrøms programvareanalyser også observeres. Konsistens er viktig når du manuelt integrerer toppområder fra RID-signaler for å redusere menneskelig feil. Manuell integrasjon bør også brukes på toppområder av standarder når manuelt integrerte toppområder brukes til å kvantifisere metabolittkonsentrasjoner i prøver. Gjennom den målrettede LC-MS/MS-analysen bør foreløpige merknader fra MZmine-analysen valideres ved manuell toppkontroll ved hjelp av en MS-kvalitetsleser, og m/z-funksjoner bør bare kommenteres når beregnede massefeil er akseptable. Her ble disse analysene utført manuelt for et begrenset sett med mål siden omfattende og robust programvare for isotopsøk ennå ikke er etablert. Imidlertid er slike automatiserte metoder for å søke 13C-merkede metabolitter for tiden fremvoksende og vil effektivisere mer kompliserte analyser også, som profilering av lysater utover sentralkarbonmetabolisme25.
Avansert væskekromatografi er en robust og mye anvendt metode for å skille små molekyler i komplekse metabolske blandinger11. De beskrevne metodene kombinerer denne separasjonsteknikken med brytningsindeksen eller massespektrometrisk deteksjon for å analysere metabolittkonverteringer i lysatebaserte CFME-reaksjoner. HPLC-RID og LC-MS/MS er individuelt kraftige verktøy for profilering av aktiv lysatmetabolisme, og deres komplementaritet kan videre utnyttes for å adressere hver teknikks iboende begrensninger. De rapporterte metodene muliggjør anvendelse og utvikling av CFME som de kan brukes til å forstå lysate metabolisme, overvåke forbedringer i målrettede metabolitt konverteringer, og belyse endringer til metabolitt flux når manipulere lysat metabolisme.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble sponset av Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, som en del av Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory administreres av UT-Battelle, LLC, for det amerikanske energidepartementet under kontrakt DE-AC05-00OR22725. Dette manuskriptet er skrevet av UT-Battelle, LLC under Contract DE-AC05- 00OR22725 med det amerikanske energidepartementet. Den amerikanske regjeringen beholder og utgiveren, ved å godta artikkelen for publisering, erkjenner at den amerikanske regjeringen beholder en ikke-eksklusiv, betalt, ugjenkallelig, verdensomspennende lisens til å publisere eller reprodusere den publiserte formen for dette manuskriptet, eller la andre gjøre det, for amerikanske regjeringsformål. Institutt for energi vil gi offentlig tilgang til disse resultatene av føderalt sponset forskning i samsvar med DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
| 1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
| 13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
| 500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
| Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
| Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
| Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
| Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
| Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
| Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
| D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
| Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
| Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
| LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
| Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
| Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
| Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
| Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
| OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
| Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
| Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
| Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
| Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
| Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
| Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |
References
- Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
- Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
- Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
- Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003 (2019).
- Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
- Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
- Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
- Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162 (2021).
- Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
- Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72 (2020).
- Coskun, O. Separation Tecniques: Chromatography. 3, Kare Publishing. Istanbul. (2016).
- Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
- Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
- Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
- Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
- Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
- Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
- Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
- Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
- Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000 (2017).
- Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
- Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
- Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54 (2020).
