Automatically Generated

Summary

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Abstract

Mitochondriën zijn essentieel voor het ontstaan en de progressie van kanker door middel van energieproductie, reactieve regulering van zuurstofsoorten en macromolecuulsynthese. Genetische en functionele aanpassingen van mitochondriën aan de tumoromgeving stimuleren proliferatief en gemetastaseerd potentieel. De komst van DNA- en RNA-sequencing verwijderde kritische barrières voor de evaluatie van genetische mediatoren van tumorigenese. Tot op heden blijven methodologische benaderingen om de mitochondriale functie van de tumor te evalueren echter ongrijpbaar en vereisen ze technische vaardigheid die de haalbaarheid beperkt, waardoor uiteindelijk de diagnostische en prognostische waarde in zowel experimentele als klinische omgevingen afneemt. Hier schetsen we een eenvoudige en snelle methode om de snelheid van oxidatieve fosforylering (OXPHOS) en elektronenoverdracht (ET) capaciteit in vers weggesneden vaste tumorhomogenaten te kwantificeren met behulp van respirometrie met hoge resolutie. Het protocol kan reproduceerbaar worden toegepast op soorten en tumortypen en worden aangepast om een diversiteit aan mitochondriale ET-routes te evalueren. Met behulp van dit protocol tonen we aan dat muizen met een luminale B-borstkanker defecte nicotinamide-adenine dinucleotide-gebonden ademhaling vertonen en afhankelijk zijn van succinaat om adenosinetrifosfaat te genereren via OXPHOS.

Introduction

Alle cellen zijn nauw verbonden door hun behoefte om adenosinetrifosfaat (ATP), de moleculaire energievaluta, te produceren en te consumeren. Aangezien cellulaire mutaties aanleiding geven tot de vorming van tumoren, zorgen mitochondriën voor overleving door diversificatie van de energieproductie die vaak fenotypisch te onderscheiden is van niet-kankerweefsel^1,2,3. Als zodanig is er een kritieke behoefte aan snelle en diepe profilering van de mitochondriale ademhalingsfunctie om de classificatie van tumortype, kankerinitiatie, progressie en behandelingsrespons te vergemakkelijken.

Respiratoire functies van weggesneden weefselmonsters kunnen niet intact worden geëvalueerd omdat de primaire substraten voor OXPHOS niet celdoorlatend zijn. Om deze beperking te overwinnen, kunnen mitochondriën worden bereid door isolatie, chemische permeabilisatie of mechanische homogenisatie. Mitochondriale isolatie wordt lang beschouwd als een gouden standaard voor de evaluatie van de ademhalingsfunctie. Het vereist echter grote hoeveelheden weefsel, is tijdrovend en heeft een lage opbrengst met mogelijke selectiebias voor bepaalde fracties van mitochondriën⁴. Permeabilisatie bestaat uit mechanische scheiding en blootstelling van weefselsecties of vezelbundels aan een mild reinigingsmiddel dat selectief het plasmamembraan afbreekt⁵. Permeabilisatie wordt vaak gebruikt in dwarsgestreepte weefsels zoals skelet- en hartspier, omdat individuele vezelbundels uit elkaar kunnen worden geplaagd. In vergelijking met isolatie levert permeabilisatie meer mitochondriën op in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving en fysieke vorm⁵. Permeabilisatie is met succes toegepast in andere weefsels zoals tumor^6,7 en placenta^8; de reproduceerbaarheid van gepermeabiliseerde vezelpreparaten kan echter moeilijk zijn vanwege de consistentie van dissectie en zuurstofbehoeften om diffusiebeperkingen te overwinnen⁹. Bovendien kunnen gepermeabiliseerde vezels ongeschikt zijn in bepaalde tumortypen die dichtcellig cellulair en zeer fibrotisch zijn. Weefselhomogenaten worden gegenereerd door mechanische verstoring van het plasmamembraan en zijn vergelijkbaar met gepermeabiliseerde vezels in termen van mitochondriale opbrengst en integriteit¹⁰. Weefselhomogenaten minimaliseren ook de beperkingen van zuurstofdiffusie en kunnen gemakkelijk worden gebruikt in weefseltypen door optimalisatie van mechanische kracht^11,12.

Hier schetsen we een eenvoudige en snelle methode om de snelheid van oxidatieve fosforylering (OXPHOS) en elektronenoverdracht (ET) capaciteit in vers weggesneden vaste tumorhomogenaten te kwantificeren. Het protocol is optimaal ontworpen om vers weefsel te evalueren met behulp van de Oxygraph-2k (O2k) respirometer met hoge resolutie, die voorkennis vereist van instrumentele installatie en kalibratie, maar op dezelfde manier kan worden aangepast met behulp van elke Clark-type elektrode, Seahorse-analyzer of plaatlezer. Het protocol kan reproduceerbaar worden toegepast op soorten en tumortypen en worden aangepast om een diversiteit aan mitochondriale ET-routes te evalueren.

Protocol

Alle experimenten en procedures met dieren werden goedgekeurd door het Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Reagensvoorbereiding. Bereid EO771 celgroeimedia voor met 10 mM HEPES, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine (100 U / ml) en 0,2% amfotericine B. Bereid 1 L biopsieconserveringsoplossing (BIOPS) in een glazen bekerglas van 1000 ml. Voeg 3,180 g Na2ATP (eindconcentratie van 5,77 mM) toe. Voeg 1,334 g MgCL2·6H2O (6,56 mM eindconcentratie) toe. Voeg 2,502 g taurine (eindconcentratie van 20 mM) toe. Voeg 3,827 g Na2fosfocreatine (eindconcentratie van 15 mM) toe. Voeg 1,362 g imidazool (eindconcentratie van 20 mM) toe. Voeg 0,077 g Dithiothreitol (5 mM eindconcentratie) toe. Voeg 9,76 g MES-hydraat (eindconcentratie van 50 mM) toe. Voeg 800 ml H2O toe en meng de bestanddelen met een magneetroerder bij 30 °C. Voeg 72,3 ml van 100 mM K2EGTA (7,23 mM eindconcentratie) toe. Los 7,608 g EGTA en 2,3 g KOH op in 100 ml H2O. Stel de pH in op 7,0 met 5 M KOH en breng het volume op 200 ml met H2O. Voeg 27,7 ml van 100 mM CaK2EGTA (2,77 mM eindconcentratie) toe. Los 7,608 g EGTA op in 200 ml H2O en verwarm tot 80 °C (eindconcentratie van 100 mM). Los 2,002 g CaCO3 op in 200 ml hete EGTA-oplossing van 100 mM. Voeg onder voortdurend roeren 2,3 g KOH toe en stel de pH in op 7,0. Stel de pH in op 6,75 bij 23 °C (pH 7,1 bij 0 °C) met 5 M KOH. Breng het volume tot 980 ml met H2O en meng de oplossing. Controleer de pH nogmaals, pas indien nodig aan en breng het uiteindelijke volume met water op 1000 ml. Aliquot BIOPS in conische buizen (15 ml of 50 ml) en bewaar bij -20 °C tot gebruik. Ontdooi slechts één keer, vlak voor gebruik. Bereid 1 L mitochondriaal ademhalingsmedium (MiR05) in een glazen bekerglas van 1000 ml. Voeg 0,190 g EGTA (eindconcentratie van 0,5 mM) toe. Voeg 0,610 g MgCL2·6H2O (eindconcentratie van 3 mM) toe. Voeg 2,502 g taurine (eindconcentratie van 20 mM) toe. Voeg 1,361 g KH2PO4 (eindconcentratie van 10 mM) toe. Voeg 4,77 g HEPES (eindconcentratie van 20 mM) toe. Voeg 37,65 g D-sucrose (eindconcentratie van 110 mM) toe. Voeg 800 ml H2O toe en meng de bestanddelen met een magneetroerder bij 30 °C. Voeg 120 ml 0,5 m lactobionic acid (eindconcentratie van 60 mM) toe. Los 35,83 g lactobionic zuur op in 100 ml H2O. Stel de pH in op 7,0 met 5 M KOH en breng het volume tot 200 ml met H2O. Meng de oplossing en stel de pH in op 7,1 met 5 M KOH. Weeg 1 g BSA, in wezen vetzuurvrij (1 g/l eindconcentratie), af in een conische buis van 50 ml. Voeg 40 ml van de pH 7.1-oplossing van stap 9 naar buis toe, keer voorzichtig om om te mengen en vermijd schuimvorming. Breng het opgeloste BSA over in de resterende pH 7.1-oplossing uit stap 9 en roer voorzichtig en continu. Controleer de pH nogmaals, pas indien nodig aan en breng het uiteindelijke volume op 1000 ml met H2O. Vul het MiR05-medium in conische buizen van 50 ml en bewaar het bij -20 °C tot gebruik. Ontdooi slechts één keer, vlak voor gebruik. Bereid substraten, ontkoppelaars en remmers voor. Bereid 0,8 M Malaat: Los 536,4 mg L-Appelzuur op in 4 ml H2O. Neutraliseer met 5 M KOH tot pH 7 en breng het volume op tot 5 ml met H2O. Verdeel in aliquots en bewaar vervolgens bij -20 °C. Bereid 1 M Pyruvaat: Los 550 mg Pyruvinezuur natriumzout op in 4 ml H2O. Neutraliseer met 5 M KOH tot pH 7 en breng het volume op 5 ml met H2O. Verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Bereid 0,5 M ADP (adenosine 5′-difosfaat): Los 1,068 g ADP-natriumzout op in 4 ml H2O. Neutraliseer met 5 M KOH tot pH 7 en breng het volume op 5 ml met H2O. Verdeel in aliquoten en bewaar vervolgens bij -20 °C. Bereid 2 M glutamaat voor: Los 3,7426 g L-glutaminezuurmonohydraat op in 8 ml H2O. Neutraliseer met 5 M KOH tot pH 7 en breng het volume op 10 ml met H2O. Verdeel in aliquots en bewaar vervolgens bij -20 °C. Bereid 4 mM Cytochroom c: Los 50 mg Cytochroom c op in 1 ml H2O. Verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Bereid 1 M Succinaat: Los 2,701 g Succinaat dinatriumzout hexahydraat op in 8 ml H2O. Neutraliseer met 1 N HCl tot pH 7 en breng het volume op 10 ml met H2O. Verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Bereid 1 mM FCCP (carbonylcyanide-4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon): Los 2,54 mg FCCP op in 10 ml zuivere ethanol. Verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Bereid 150 μM rotenon: Los 3,94 mg rotenon op in 10 ml zuivere ethanol om 1 mM bouillon te bereiden, vortex totdat deze volledig is opgelost. Verdun 225 μL van 1 mM Rotenone-voorraadconcentratie met 1,275 ml pure ethanol tot 1,5 ml 150 μM Rotenone. Bescherm tegen licht, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Bereid 125 μM Antimycine A: Los 11 mg Antimycine A op in 4 ml pure ethanol om 5 mM voorraadconcentratie van Antimycine A te bereiden. Verdun 25 μL van 5 mM Antimycine A-voorraadconcentratie met 975 μL pure ethanol om 1 ml van 0,125 mM Antimycine A te maken. Bereid 0,8 M ascorbaat: Los 1,584 g ascorbaatnatriumzout op in 8 ml H2O. Stel de pH met ascorbinezuur in op pH 6 en breng het volume op 10 ml met H2O. Bescherm tegen licht, verdeel in aliquots en bewaar het vervolgens bij -20 °C. Bereid 0,2 M TMPD (tetramethyl-p-fenyleendiamine): Los 32,85 mg TMPD op in 987,5 μL DMSO. Voeg 12,5 μl 0,8 M ascorbaat (10 mM eindconcentratie ascorbaat) toe. Bescherm tegen licht, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Bereid 4 M natriumazide: Los 2,6 g natriumazide op in 10 ml H2O. Verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. 2. Tumorgroei Kweek EO771-cellen in RPMI 1640-groeimedia en onderhoud de cellen in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2. Vier weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muizen met één huis, houd ze op 21-22 °C op een lichtcyclus van 12 uur: donker. Geef de muizen ad libitum toegang tot voedsel en water. Zodra de muizen 10 weken oud zijn, bereidt u de cellen en de muizen voor op de implantatie van kankercellen. Trypsiniseren van de cellen, deactiveren trypsine met groeimedia en centrifugeer cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant en resuspend en combineer de celkorrels (indien nodig) in media. Tel levensvatbare cellen met trypan blue en bereid een celverdunning van 1 x 106 cellen in een totaal volume van 60 μL met een 1:1:1 Media/ Basement Membrane Matrix/PBS-oplossing. Zodra de keldermembraanmatrix is toegevoegd, mengt u goed en houdt u de celsuspensie op ijs. Vul spuiten met 60 μL celsuspensie en plaats ze op ijs. Werk efficiënt en injecteer cellen in muizen binnen 1,5 uur na bereiding. Verdoving muizen door isofluraaninhalatie (3% -5% voor inductie en 1% -3% voor onderhoud). Scheer tussen de rechter 4e en 5e liesklieren. Injecteer de verdoofde muizen orthotopisch met de EO771-celsuspensie. Gebruik elektronische remklauwen om de tumorgroei twee keer per week gedurende 4 weken te controleren en te meten. Bij obductie, accijns, weeg en plaats vervolgens de tumor (of een tumorsectie van minimaal 60 mg) onmiddellijk in 10 ml ijskoude BIOPS. Houd de buis op nat ijs. 3. Instrument instellen en kalibreren Verwarm het MiR05 medium in een waterbad van 37 °C. Schakel het Oroboros O2k-systeem in, open DATLAB-software, voer gebruiker in of selecteer . Klik op Verbinden met O2k. Controleer de O2k-configuratie en zorg ervoor dat het juiste instrument is gelabeld voor Power-O2k en dat elke kamer overeenkomt met de juiste zuurstofsensor; klik op OK. Zodra het O2k-bedieningsvenster wordt geopend, stelt u onder het tabblad Systemen de bloktemperatuur in op 37 °C, de roersnelheid op 750 tpm voor beide kamers, ND het gegevensregistratie-interval op 2,0 s. Vink zowel Roerkracht als Verlichting in kamervakken aan. Stel op het tabblad Zuurstof, O2 de versterking voor sensor in op 1 V / μA (de versterking moet mogelijk worden aangepast voor oudere instrumentmodellen), de polarisatiespanning op 800 mV en klik vervolgens op Verbinden met O2k. Zodra een nieuw experimentbestand wordt geopend, geeft u het bestand een naam en klikt u op Opslaan. Zodra het experiment actief is, wordt een protocolselectievenster geopend; klik op Annuleren om een aangepaste SUIT (Substraat ontkoppelaarremmertitratie) uit te voeren. Na protocolselectie wordt een voorbeeldvenster geopend om de experimentele code, het monstertype, het cohort, de voorbeeldcode, het steekproefnummer en het substeekproefnummer in te vullen, indien van toepassing. Wijs de eenheid toe aan mg en voer de tumorhomogenaatconcentratie per ml in (hoeveelheid per kamer wordt automatisch ingevuld). Zorg ervoor dat het aangegeven medium MiR05 is en het kamervolume 2,00 ml. Voeg indien nodig opmerkingen toe in het onderste vak en klik op OK. Verwijder de stoppers en zuig de 70% ethanol uit de kamers. Adem nooit dicht bij het membraan dat aan de binnenkant van de kamer is blootgesteld. Spoel vier keer af met zuiver water en vul de kamer met 2,25 ml MiR05. Sensortest: Klik op F9 om de roerders gedurende 30 s uit te schakelen. Zodra de roerstaaf weer wordt ingeschakeld, moet u ervoor zorgen dat de O2-helling snel monoexponentiaal in elke kamer toeneemt. Als de kamer de sensortest niet doorstaat, controleer dan de elektrische aansluitingen en reinig als er zouten zijn opgehoopt; herhaal de test. Als de sensor de test blijft doorstaan, verwijdert u de polarografische zuurstofsensor (POS)-connector om het membraan te inspecteren. Als zichtbare schade aan het membraan, zware oxidatie of significante bubbelaccumulatie wordt waargenomen, stop dan de experimentele procedures en ga verder met instrumentonderhoud. Zuurstofkalibratie: Voer zuurstofkalibratie uit om nauwkeurige ademhalingsmetingen te verkrijgen. Met een draaiende beweging plaatst u de stoppers langzaam in hun volumegekalibreerde positie. Sifon het overtollige medium af dat wordt uitgestoten door het injectiecapillair dat zich verzamelt in de put van de stop. Til met een draaiende beweging de stoppers net genoeg op om goed op het stopper-afstandsgereedschap te passen en een gasvolume boven de vloeistoffase achter te laten voor de laatste luchtevenwichtigheid (30-45 min.). Gebruik de steady-state die in deze periode is bereikt om de zuurstofsensor te kalibreren om nauwkeurige metingen van de ademhaling te verkrijgen. De O2 helling neg. (negatieve helling van zuurstof) is 0 ± 2 pmol/s·ml. Als de waarde hoger is dan 2 pmol/ml, reinigt u de kamer en vult u deze aan met vers ontdooide MiR05. Als de helling onstabiel is, gaat u verder met instrumentonderhoud. Nadat u een steady state hebt bereikt, selecteert u de O2-concentratiecurve en markeert u het stabiele gebied van de curve door de Shift-toets ingedrukt te houden en met de rechtermuisknop met de linkermuisknop te klikken. Zodra het gebied is geselecteerd, klikt u op F5,selecteert u het merk voor luchtkalibratie met de vervolgkeuzepijl en klikt u op Kalibreren en kopiëren naar klembord. Instrumentele achtergrondkalibratie (optioneel) Zorg er na de luchtkalibratie voor dat er geen gasvolume boven de vloeibare fase is voor fluxachtergrondevenwicht (~ 15 min) en sluit de kamers volledig.OPMERKING: De steady-state rate die in deze periode is bereikt, vertegenwoordigt een instrumentele achtergrond en kan worden afgetrokken van de resulterende gegevens voor verbeterde analytische precisie. De O2 helling neg. zal in eerste instantie iets toenemen en plateau tussen ± 2 tot 4 pmol/s·ml. Als de waarde hoog is (>6 pmol/ml), is er sprake van mogelijke biologische besmetting. Maak in dit geval de kamer schoon en vul deze aan met vers ontdooide MiR05. Zodra een steady-state is bereikt, selecteert u de O2 slope neg. curve en markeert u het stabiele gebied van de curve door de Shift-toets ingedrukt te houden en met de linkermuisknop te klikken. Nadat u het gebied hebt geselecteerd, klikt u op F5,selecteert u het vak Basislijncorrectie en het teken voor Basislijn met de vervolgkeuzepijl en klikt u op OK. 4. Tumorhomogenaatpreparaat Plaats een glazen homogenisator met 1 ml MiR05 en een nauwsluitende glazen stamper op nat ijs. Plaats het weefsel op het moment van het onderzoek in 1 ml BIOPS in een ijskoude petrischaal. Reinig en ontleed het weefsel om oplosbaar materiaal te maximaliseren, necrotische gebieden te vermijden en marginaal tumorweefsel te verwijderen. Verwijder met behulp van een dissectiemicroscoop, scalpel en chirurgisch pincet al het haar, necrotisch weefsel, perifeer bind- en vaatweefsel en aangrenzend vet, indien van toepassing. Zorg ervoor dat de tumor tijdens de dissectie in ijskoude BIOPS blijft. Snijd de tumor in kleine stukjes (~ 5-10 mg elk) en plaats de resterende tumorstukken terug in 10 ml BIOPS die op ijs worden gehouden. Gebruik dit weefsel later voor extra preparaten indien nodig.OPMERKING: Voer de volgende stappen snel uit om de hoeveelheid tijd te minimaliseren dat het monster niet volledig in BIOPS wordt ondergedompeld. Zodra het monster in MiR05 is geplaatst, is tijd van essentieel belang. Verplaats het bereide homogenaat zo snel mogelijk voorzichtig in de gekalibreerde kamer. Dep de tissuesecties zorgvuldig op een filterpapier, plaats ze op een kleine plastic geteerde weegboot en noteer het initiële natte gewicht. Plaats de ongebruikte stukken terug in de conische buis van 10 ml BIOPS voor verdere conservering. Dompel de weefselsecties onder in een ijskoude homogenisator met MiR05 en noteer het resterende gewicht op de weegboot, indien van toepassing. Verstoor met behulp van een glazen stamper (klaringsbereik 0,09-0,16 mm) het tumorweefsel voorzichtig door 5-7 neerwaartse en omhoog-en-omhoog-slagen te voltooien. Draai voor elke slag de stamper 3 keer in een kloksgewijze beweging tegen de klok in terwijl je de stamper naar beneden duwt en 3 extra keer terwijl je de stamper weer omhoog trekt. Zorg ervoor dat het weefsel tussen de slagen door naar de bodem van de homogenisator zakt, maar vermijd dat de stamper volledig boven het vloeistofvolume komt om schuimvorming te voorkomen.OPMERKING: Het resulterende homogenaat moet troebel lijken met minimale vaste weefselresten. Giet het homogenaat in een conische buis van 15 ml en plaats het op ijs. Pipetteer 1-3 ml verse MiR05 over de stamper en in de homogenisator om eventueel achtergebleven weefselhomogenaat te wassen. Giet de MiR05-was in de conische buis met het homogenaat. Herhaal de stamper en homogenisator 2-3 keer om een volledige overdracht van het homogenaat te garanderen. Houd rekening met de doelconcentratie en het vereiste volume om het monster niet te veel te verdunnen tijdens de wasstappen. Om de weefselhomogenaatconcentratie nauwkeurig te berekenen, inspecteert u de homogenisator en het homogenaat zorgvuldig op achtergebleven niet-gehomogeniseerd materiaal (d.w.z. bindweefsel). Om het niet-gehomogeniseerde materiaal uit de homogenisator te verwijderen dat niet met een pincet kan worden bereikt, voegt u MiR05 toe aan de homogenisator, zuigt u het volume (inclusief het weefsel) op met een pipet en verplaatst u de inhoud naar een petrischaal. Om het niet-gehomogeniseerde materiaal uit het homogenaat te verwijderen (in grote stukken op de bodem van de conische buis), zuigt u de grote stukken op met een pipet en plaatst u ze op de weefseldop van de conische buis. Verwijder het zakdoekje met een pincet uit de petrischaal of conische buisdop en dep het op filterpapier. Voeg het resterende homogenaat van de conische buisdop terug in de conische buis, dop het af en keer vervolgens om om te mengen. Inspecteer de homogenisatoren en het homogenaat opnieuw op extra niet-gehomogeniseerd materiaal en herhaal stap 4.10.1-4.10.3 om het materiaal indien nodig te verwijderen. Weeg en noteer de massa van het niet-gehomogeniseerde materiaal dat uit de homogenisator wordt teruggewonnen. Inspecteer het homogenaatpreparaat op eventueel grof intact weefsel dat wordt overgedragen. Verwijder de niet-gehomogeniseerde stukken en weeg indien nodig. Trek het weefselgewicht dat is teruggewonnen van de weegboot, homogenisator en homogenaat (indien nodig) af van het oorspronkelijke natte gewicht om het uiteindelijke monstergewicht te berekenen. Voeg met behulp van het uiteindelijke monstergewicht extra MiR05 toe om homogenaat in de gewenste concentratie te brengen (zie stap 5 voor details over optimalisatie-experimenten). Zodra het homogenaat is gewogen en bereid, gaat u zo snel mogelijk over tot de test. Bewaar het monster op nat ijs totdat het op het instrument wordt overgebracht. 5. Substraat, uncoupler, inhibitor titratie protocol (SUIT) Zodra het instrument is gekalibreerd en het monster is voorbereid, verwijdert u de stoppen met een draaiende beweging en zuigt u de MiR05 uit de kamers (vermijd het membraan dat in de kamer wordt blootgesteld). Meng het homogenaat goed en voeg 2,25 ml homogenaat toe aan de kamer. Als u één homogenaat aan meerdere kamers toevoegt, pipetteer dan 1 ml per keer in elke kamer terwijl u het homogenaat mengt om een gelijke weefselverdeling te garanderen. Klik op F4 om het evenement een naam te geven en de tijd te stempelen en klik vervolgens op OK. Vul een spuit van 50 ml met zuurstof uit een zuurstoftank met een regelaar en een gasslang met een stompe naald van 18 G. Hyperoxygeneer de kamers tot ~500 μM zuurstof. Injecteer hiervoor zuurstof rechtstreeks in de kamers. Plaats de stoppers losjes en wacht met sluiten totdat de zuurstof ~ 480 μM bereikt. Sluit met een draaiende beweging langzaam de kamer en laat de ademhaling in evenwicht brengen (~ 15-20 min). Vul indien nodig het centrale capillair van de stop met MiR05. Analytische bepaling van de OXPHOS- en ET-capaciteit (elektronenoverdrachtstoestand) van N-gebonden en NS-gebonden en CIV-activiteit (Complex IV): gebruik speciale microsyringes om substraten, ontkoppelaars en remmers in volledig gesloten kamers te injecteren. Klik bij elke injectie op F4 om de gebeurtenissen voor elke kamer in realtime te benoemen en te stempelen. Selecteer gedurende het onderzoek F6 om de O 2-concentratie en O2-helling neg.schalen indien nodig aan te passen. Was de spuiten na elke injectie 3 keer in water (voor in water oplosbare verbindingen) of 70% ethanol (voor verbindingen opgelost in ethanol of DMSO).OPMERKING: N-gebonden: O2 flux ondersteund door gedefinieerde NADH-genererende substraatcombinaties, NS-gebonden: O2 flux ondersteund door de convergentie van gedefinieerde NADH-gegenereerde substraatcombinaties en succinaat. Voeg 5 μL van 0,8 M Malaat (2 mM eindconcentratie) toe en ga onmiddellijk over tot de volgende injectie. Was de injectiespuit 3 keer in water. Voeg onmiddellijk 5 μL 1 M Pyruvaat (2,5 mM eindconcentratie) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Was de injectiespuit 3 keer in water. Voeg 10 μL van 0,5 M ADP (2,5 mM eindconcentratie) toe en wacht tot de ADP-respons is gestabiliseerd. Was de injectiespuit 3 keer in water.OPMERKING: Extra ADP (2,5-10 mM) kan nodig zijn om ervoor te zorgen dat de adenylaatconcentraties niet beperkt zijn tot ademhalingsfluxen. Voeg 5 μL glutamaat (eindconcentratie van 5 mM) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Was de injectiespuit 3 keer in water. Voeg 5 μL van 4 mM Cytochroom c (10 μM eindconcentratie) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Was de injectiespuit 3 keer in water. Voeg 20 μL 1 M Succinaat (10 mM eindconcentratie) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Was de injectiespuit 3 keer in water. Titreer stappen van 0,5-1 μL van 1 mM FCCP (2-20 μM eindconcentratie) en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is. Was de injectiespuit 3 keer in 70% ethanol. Voeg 2 μL van 150 μM Rotenone (150 nM-2 μM eindconcentratie) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Voeg nog eens 1 μL Rotenone toe om ervoor te zorgen dat er geen verdere remming is. Als er een afname van de ademhaling is, ga dan door met extra injecties totdat er geen afname van de ademhaling is. Was de injectiespuit 3 keer in 70% ethanol. Voeg 2 μL van 125 μM Antimycine A (125 nM-5 μM eindconcentratie) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Voeg nog eens 1 μL Antimycin A toe om ervoor te zorgen dat er geen verdere remming is. Als er een afname van de ademhaling is, ga dan door met extra injecties totdat er geen afname van de ademhaling is. Was de injectiespuit 3 keer in 70% ethanol. Controleer de zuurstofconcentratie van de kamer; als de concentratie lager is dan 125 μM, reoxygeneren tot kamerlucht of mild hyperoxygeneren om ervoor te zorgen dat zuurstof de ademhalingsflux niet beperkt. Voeg 5 μL 0,8 M ascorbaat (eindconcentratie van 2 mM) toe. Was de injectiespuit 3 keer in 70% ethanol. Voeg onmiddellijk 10 μL van 0,2 M TMPD (1 mM eindconcentratie) toe en wacht op een langzame toename van de ademhaling. Was de injectiespuit 3 keer in 70% ethanol. Voeg onmiddellijk 25 μL 4 M natriumazide (eindconcentratie van 50 mM) toe wanneer de ademhalingsflux van ascorbaat/TMPD-plateaus bereikt. Was de injectiespuit 3 keer in 70% ethanol. Beëindig het onderzoek- klik op Bestand, Opslaan en Loskoppelen. Blijf de kamer en spuit wassen volgens de stappen 9.2-9.3. 6. ADP-gevoeligheidsprotocol Zodra het instrument is gekalibreerd en het monster is voorbereid, verwijdert u de stoppen met een draaiende beweging en zuigt u de MiR05 uit de kamers (vermijd het membraan dat aan de binnenkant van de kamer wordt blootgesteld). Meng het homogenaat goed en voeg 2,25 ml homogenaat toe aan de kamer. Stel dat u één homogenaat aan meerdere kamers toevoegt, pipetteer dan 1 ml per keer in elke kamer terwijl u het homogenaat mengt om een gelijke weefselverdeling te garanderen. Klik op F4 om het evenement een naam te geven en de tijd te stempelen en klik op OK. Plaats de stoppers en sluit met een draaiende beweging langzaam de kamer en laat de ademhaling in evenwicht brengen (~ 15-20 min). Vul indien nodig het centrale capillair van de stop met MiR05. Analytische bepaling van succinaat-gekoppelde mitochondriale ADP-gevoeligheid: Klik bij elke injectie op F4 om de gebeurtenissen voor elke kamer in realtime te benoemen en te timetempelen. Selecteer gedurende het onderzoek F6 om de O 2-concentratie en O2-helling neg.schalen indien nodig aan te passen. Voeg 2 μL van 150 μM Rotenone (150 nM eindconcentratie) toe. Voeg onmiddellijk 20 μL 1 M Succinaat (10 mM eindconcentratie) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Titreer ADP door stapsgewijze toevoeging van subverzadigingsconcentraties totdat de maximale responssnelheid (VMAX; 2,5-10 mM eindconcentratie) is bereikt.OPMERKING: De snelheid kan na injectie afvlakken als gevolg van een kleine verandering in de ADP-concentratie, waardoor de injectieconcentratie na elk plateau toeneemt en doorgaat met de titratie totdat er geen verdere toename van de ademhaling is, zelfs niet met een plooiverhoging van de ADP-injectieconcentratie. 7. Aanbevolen optimalisatie-experimenten Bepaal optimale homogenaat- en zuurstofconcentratie voor protocol. Voer het SUIT-protocol (stappen 5,1-5,3) uit bij meerdere weefselconcentraties (bijv. 30 mg / ml, 20 mg / ml, 10 mg / ml, 5 mg / ml, 2, 5 mg / ml, 1 mg / ml en / of 0, 5 mg / ml). Selecteer een concentratie die de ademhalingsflux maximaliseert en tegelijkertijd de frequentie van reoxygenaties beperkt (niet meer dan 1-2). Als frequentere reoxygenaties nodig zijn, verlaag dan de concentratie van het homogenaat. Bepaal het optimale aantal slagen met de homogenisator. Voer het SUIT-protocol uit (stappen 5.1-5.3) op meerdere niveaus van homogenisatie (bijv. 5 slagen, 10 slagen, 15 slagen, 20 slagen). Aangezien er onvoldoende gegevens in de literatuur zijn om een drempel te bepalen van de procentuele toename van cytochroom c met tumorhomogenaatpreparaat, kiest u het preparaat met beperkte cytochroom c-respons maar adequate ademhaling onder impuls van het (de) substraat (en) van belang. Bepaal de optimale substraat-, ADP-, ontkoppelings- en inhibitorconcentraties die nodig zijn voor kwantitatieve en reproduceerbare ademhalingsfluxen. Voer het SUIT-protocol uit (stappen 5.1-5.3.9) bij de gekozen weefselconcentratie (stap 7.1). Titreer elk substraat, uncoupler, inhibitor en ADP totdat er geen verdere respons wordt waargenomen. Titreer de remming met natriumazide in afzonderlijke experimenten. Voeg 5 μL van 0,8 M Malaat (2 mM eindconcentratie) toe en ga onmiddellijk over tot de volgende injectie. Titreer stappen van 1 μL van 1 M Pyruvaat en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is. Titreer stappen van 2 μL van 0,5 M ADP en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is. Titreer stappen van 1 μL van 2 M glutamaat en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is. Voeg 5 μL van 4 mM Cytochroom c (10 μM eindconcentratie) toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Titreer stappen van 5 μL van 1 M Succinaat en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is. Titreer stappen van 5 μL van 0,5 M ADP en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is. Titreer stappen van 0,5 μL van 1 mM FCCP en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is. Titreer stappen van 1 μL van 150 μM Rotenone en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen afname van de ademhaling is. Titreer stappen van 1 μL van 125 μM Antimycine A en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert, ga door totdat er geen extra afname van de ademhaling is. Voeg 5 μL 0,8 M ascorbaat (eindconcentratie van 2 mM) toe. Voeg onmiddellijk 5 μL van 0,2 M TMPD (.5 mM eindconcentratie) toe in afwachting van een langzame toename van de ademhaling. Voeg in een afzonderlijk experiment 10 μL van 0,2 M TMPD (1 mM eindconcentratie) toe. Voeg in afzonderlijke experimenten 10 μL, 25 μL, 50 μL en 100 μL 4 M natriumazide (respectievelijk 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM eindconcentratie) toe wanneer de ademhalingsflux van ascorbaat/ TMPD-plateaus. Kies de substraat- en inhibitorconcentraties die verzadigen binnen de eerste injectie om de timing van het experiment te verbeteren. Gebruik ADP bij verzadigings- of subverzadigingsconcentraties om ADP-gevoeligheidsevaluaties te combineren met traditionele SUIT-protocollen. Gebruik submaximale ontkoppelingsconcentraties om de dosisresponsiviteit aan te tonen zonder remming van de ademhalingsflux. 8. Data-analyse SUIT analyse Selecteer de steady-state of pieksnelheden van elke titratie en export voor analytische reductie. Druk de gegevens uit als pmol O2 per seconde per mg weefsel (pmol/s/mg). Bereik de analytische reductie van PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P en PMGS-E door antimycine A ongevoelige snelheid af te trekken van de respectieve snelheid (d.w.z. steady-state rate verkregen na toevoeging van ADP).OPMERKING: PM: Pyruvaat + Malaat; PMG: Pyruvaat + Malaat + Glutamaat; PMGS: Pyruvaat + Malaat + Glutamaat + Succinaat; -L: Lek toestand; -P: Oxidatieve fosforyleringstoestand, -E: Elektronenoverdrachtstoestand. Bereik de analytische reductie van CIV-E door de natriumazide ongevoelige snelheid af te trekken van de piek ascorbaat/TMPD snelheid. Bereik de analytische reductie van PMG-E door de rotenonongevoelige snelheid af te trekken van de PMGS-E-snelheid. Bereik de analytische reductie van S-E door de antimycine A ongevoelige snelheid af te trekken van de rotenon ongevoelige snelheid. Bereik de analytische reductie van cytochroom c controle-efficiëntie, een marker van intactheid van het buitenmembraan, door de volgende vergelijking:jc = ((JCHNOc – JCHNO)/JCHNO) x 100In de vergelijking is jc de % toename bij toevoeging van cytochroom c, JCHNOc is de zuurstofflux na de toevoeging van cytochroom c, en JCHNO is de zuurstofflux voorafgaand aan de toevoeging van cytochroom c. ADP gevoeligheidsanalyse Bepaal analytisch de kinetiek voor de ADP-gevoeligheid ten opzichte van de leksnelheid van succinaat + rotenon (niet de snelheid van het weefselhomogenaat). Zet de O2-flux (Y-as) uit tegen de relatieve ADP-concentratie (X-as). Bepaal de maximale ademhalingssnelheid (Vmax) als de pieksnelheid die wordt bereikt over de ADP-titratie. Bepaal de Michaelis-Menten kinetiek met behulp van een curve fitting software (PRISM, versie 10.1) om de ADP concentratie te onthullen waarbij 1/2 VMAX wordt bereikt (Apparent KM). 9. Instrumentele kwaliteitscontrole Voer instrumentele O2-achtergrond uit over het gewenste zuurstofconcentratiebereik (0-600 μM) en nulkalibratie. Voltooi stap 3.1 en 3.2 Verwijder de stoppers en zuig de 70% ethanol uit de kamers (vermijd het membraan dat aan de binnenkant van de kamer wordt blootgesteld). Spoel 4 keer met dubbel gedestilleerd H2O en vul de kamer met 2,25 ml MiR05 Hyperoxygeneer de kamers tot ~600 μM zuurstof. Plaats de stoppers langzaam in hun volledig gesloten positie. Sifon het overtollige medium dat door het injectiecapillair wordt uitgestoten en in de put van de stop wordt verzameld en laat het zuurstofsignaal stabiliseren (30-45 min). Om zuurstofkalibratie uit te voeren, selecteert u het gebied waar zowel de zuurstofconcentratie als de helling stabiel zijn, opent u het kalibratievenster voor de betreffende kamer en selecteert u het R1-merkteken. Bereid de dithionietoplossing door 20 mg natriumhydrosulfiet op te lossen in 0,5 ml water. Beperk de blootstelling aan lucht omdat dithioniet in de loop van de tijd wordt geoxideerd met blootstelling aan zuurstof. Zodra het zuurstofsignaal is gestabiliseerd, injecteert u 1 μL en observeert u de afname van de zuurstofconcentratie. Pas de potentie van de dithionietoplossing indien nodig aan. Injecteer voldoende dithionietoplossing om de zuurstofconcentratie te verlagen tot respectievelijk 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM en 0 μM. Laat bij elke injectie de zuurstof stabiliseren en selecteer een markering voor de steady-state helling. Zodra de zuurstofconcentratie ~ 0 μM is, markeert u de zuurstofconcentratie. Om instrumentele O2-achtergrondcorrectie uit te voeren, selecteert u het flux-/hellingvenster voor de betreffende kamer, selecteert u O2 Achtergrondkalibratieen klikt u op Kalibreren voor de gewenste tekens. Om nulkalibratie uit te voeren, opent u het kalibratievenster voor de betreffende kamer en selecteert u de R0-markering die is bereikt na dithioniettitratie. Instrument reiniging Spoel elke kamer snel drie keer af met zuiver water. Zuig voor de eerste wasbeurt het homogenaat op, vul de kamer volledig met water en zuig vervolgens het water aan. Vul voor de tweede wasbeurt de kamer 3/4 vol met water, plaats de stoppers om water door het injectiecapillair te persen, zuig een deel van het water op via het injectiecapillair en verwijder vervolgens de stoppen om de was volledig op te zuigen. Was de kamers gedurende 5 minuten met 70% ethanol. Reinig de stoppen boven een gootsteen of bekerglas met zuiver water, 70% ethanol en 100% ethanol, waarbij vloeistof door de injectiecapillairen wordt geforceerd met behulp van een wasfles. Spoel elke kamer snel twee keer af met zuiver water. Incubeer de kamers met 2 ml PBS met ~ 2 mg bevroren mitochondriën, cellysaat of levende fibroblasten gedurende 15 minuten. Was de kamers twee keer 5 minuten met zuiver water. Was de kamers twee keer twee keer met 70% ethanol gedurende 5 minuten. Was de kamers gedurende 10 minuten met 100% ethanol. Vul de kamers met 70% ethanol. Als u een opeenvolgend experiment uitvoert, laat u de kamers gedurende 5 minuten in 70% ethanol en gaat u verder met stap 3.3. Als de experimenten zijn voltooid, plaatst u deksels op de stoppen en schakelt u het instrument uit. Reinig na elk gebruik de injectiespuiten op de juiste manier en houd de spuiten speciaal voor specifiek samengesteld gebruik om overdracht te voorkomen. Steek de spuit in het wasvocht en dompel de injectienaald volledig onder. Zuig het wasvocht op in de spuit tot het maximale volume. Haal de spuit uit het wasmedium, werp het wasvocht uit in een bekerglas en dep de spuit vervolgens op een keukenpapier. Herhaal stap 9.3.1-9.3.3 driemaal zo snel mogelijk na elk gebruik.

Representative Results

Uit de eerste studies bleek dat EO771-tumoren laag oxidatief waren en dus hoge homogenaatconcentraties nodig hadden voor een adequate beoordeling van de O2-flux. Optimalisatie-experimenten werden uitgevoerd om het optimale weefselhomogenaatconcentratiebereik voor de studie te bepalen. Tumorhomogenaten werden aanvankelijk bereid bij 40 mg / ml en vervolgens lineair verdund. De O2-flux genormaliseerd tot weefselmassa was consistent in alle concentraties (figuren 1A-D). Er werd waargenomen dat 40 mg /ml resulteerde in snelle zuurstofdepletie en niet geschikt was voor experimenten(figuur 1A). Het zuurstofverbruik vertraagde aanzienlijk met 30 mg/ml en 20 mg/ml, maar nam nog steeds snel af in korte tijd bij afwezigheid van substraten of ADP (figuur 1B, C). De concentratie van 10 mg/ml resulteerde in het optimale zuurstofverbruik(figuur 1D)dat een langer SUIT-protocol van 90 minuten zou ondersteunen. Een SUIT-protocol werd gebruikt om NADH- en succinaat-gekoppelde OXPHOS en ET te evalueren, evenals CIV-activiteit(figuur 2A). Pyruvaat en malaat werden toegevoegd aan het weefselhomogenaat in afwezigheid van ADP om lek (L) door NADH te drijven. Saturating ADP werd vervolgens toegevoegd om maximale NADH-gekoppelde OXPHOS (P) aan te drijven, gevolgd door de toevoeging van glutamaat. Cytochroom c werd vervolgens toegevoegd om de integriteit van het buitenmembraan te waarborgen; de toename van de ademhalingsfrequentie was minder dan 20% in alle monsters(figuur 2B). Gezien de zeer lage respons op NADH-gebonden substraten, werd cytochroom c afgifte ook beoordeeld in de aanwezigheid van succinaat en rotenon en waargenomen minimale cytochroom c stimulatie (Figuur 2B). Interessant is dat NADH-gebonden OXPHOS verwaarloosbaar was in EO771-tumoren(figuur 2C). Succinaat werd vervolgens toegevoegd in aanwezigheid van pyruvaat, malaat en glutamaat om de elektronenstroom door succinaatdehydrogenase te stimuleren. FCCP werd vervolgens getitreerd om de maximale elektronenstroom (E) te stimuleren, waaruit bleek dat in EO771-tumoren fosforylering in plaats van oxidatie beperkt was tot ademhaling(figuur 2C). Rotenon en antimycine A werden vervolgens getitreerd om respectievelijk complex I en complex III te remmen. Ascorbaat en TMPD werden vervolgens toegevoegd om de maximale elektronenstroom door CIV te sturen, die vervolgens wordt geremd door natriumazide. Tabel 1 illustreert analytische reductievergelijkingen van de ruwe gegevens ( tabel 2 ) om de in figuur 2Cuitgezette ademhalingsparameters te kwantificeren. Over het algemeen zijn de tumorhomogenaat respiratoire profielen (figuur 2C) vergelijkbaar met die van niet-geïmplanteerde digitonine-gepermeabiliseerde EO771-cellen (figuur 2D) met uitzondering van verminderde maximale elektronenoverdracht ondersteund door N- en S-gebonden substraten in de tumor. Aangezien nadh-gebonden ademhaling verwaarloosbaar was, werd de respiratoire kinetiek van succinaat verder geëvalueerd door stapsgewijze titraties van subverzadigende ADP totdat de maximale snelheid (VMAX)was bereikt (figuur 3A, 3B). De half-maximale concentratie (KM)van ADP in aanwezigheid van succinaat + rotenon was 37,5 μM, terwijl de VMAX ~10,5 pmol/s/mg was(figuur 3C). Dus, ondanks relatief slechte oxidatiesnelheden, waren EO771-tumoren zeer gevoelig voor ADP en hielden atp-synthese aan bij relatief lage ADP-concentraties. Het selecteren van geschikte regio’s van de ruwe gegevens voor extractie is van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid van experimenten en nauwkeurige kwantificering. Voor cytochroom cmoet onmiddellijk voorafgaand aan de injectie een markering worden geselecteerd bij de steady-state(figuur 4A,merk 1). Er is vaak een initieel injectieartefact dat kan worden gevolgd door een periode (ongeveer 5-10 minuten) waarin de O2-flux niet stabiel is. Evaluatie van cytochroom c efficiëntie wordt gemaakt door een extra selectie te maken zodra de O2 flux is gestabiliseerd(Figuur 4A,merk 2). Selecties na de toevoeging van substraten, ADP of de meeste remmers worden ook gemaakt na het injectieartefact en zodra de O2-flux is gestabiliseerd(figuur 4B). De selectie die wordt gebruikt om de maximale ontkoppelde ademhaling te bepalen, wordt gemaakt bij de piektoename die wordt bereikt tijdens titratie van FCCP, wat vaak niet de laatste injectie is die wordt gemaakt(figuur 4C). De selectie voor TMPD wordt gemaakt nadat zowel ascorbaat als TMPD zijn toegevoegd en op de piek toename van de ademhaling (Figuur 4D, merk 1). Net na deze piek wordt de remmer, natriumazide, toegevoegd, die de ademhaling snel vermindert, maar ook vaak een injectieartefact heeft dat lager is dan de geremde ademhalingssnelheid(figuur 4D). Het inhibitormerk wordt onmiddellijk na het injectieartefact gemaakt(figuur 4D,merkteken 2). De O2-flux zal meestal niet stabiliseren en blijven afnemen. Tabel 1: Respiratoire notatie en analytische afleiding. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Monster- en respiratoire kenmerken van luminale B-borsttumorhomogenaten. Klik hier om deze tabel te downloaden. Figuur 1: Optimalisatie van de tumorhomogenaatconcentratie. O2 Flux (rood) en O2 Concentratie (blauw) in borsttumorhomogenaten bereid bij (A) 40 mg / ml, (B) 30 mg / ml, (C) 20 mg / ml en (D) 10 mg / ml. Thom: Weefselhomogenaat ademhaling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Evaluatie van OXPHOS- en ET-capaciteit door hoge-resolutie respirometrie in vers weggesneden tumorhomogenaten. (A) Representatieve plot van zuurstofverbruik (rood) en concentraties (blauw) in de loop van een substraat, remmer, ontkoppelingsprotocol. PM: Pyruvaat + Malaat, D: ADP, G: Glutamaat, c: Cytochroom c, S: Succinaat, F: FCCP, Rot: Rotenone, Ama: Antimycine A, Asc / TMPD: Ascorbaat / Tetramethyl-p-fenyleendiamine. (B) Procentuele toename van de O2-flux na toevoeging van cytochroom c. (C-D) Ademhaling ondersteund door malaat, pyruvaat, glutamaat en succinaat in aanwezigheid van ADP, FCCP en ascorbaat / TMPD in (C) EO771-afgeleide tumorhomogenaten en (D) niet-geïmplanteerde EO771 digitonine-permeabiliseerde cellen. Thom: Weefselhomogenaat ademhaling; PM: Pyruvaat + Malaat; PMG: Pyruvaat + Malaat + Glutamaat; PMGS: Pyruvaat + Malaat + Glutamaat + Succinaat; CIV: Complex IV; -L: Lektoestand; -P: Oxidatieve fosforyleringstoestand, -E: Elektronenoverdrachtstoestand; N-gebonden: O2-flux ondersteund door gedefinieerde NADH-genererende substraatcombinaties; NS-gebonden: O2 flux ondersteund door de convergentie van gedefinieerde NADH-gegenereerde substraatcombinaties en succinaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: EO771 borsttumoren vertoonden een hoge ADP (adenosine 5′-difosfaat) gevoeligheid. (A) Representatief plot van zuurstofverbruik (rood) en concentraties (blauw) in een S-gebonden ADP-titratieprotocol. Thom: Weefselhomogenaat ademhaling; S / Rot: Succinaat / Rotenone; D: ADP. (B) Ademhaling ondersteund door succinaat in aanwezigheid van rotenon en toenemende concentraties van ADP (0 μM ADP = S / Rot-L). (C) Maximale snelheid (VMAX) en half-maximale concentratie (KM) van ADP in aanwezigheid van succinaat + rotenon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Representatieve tracering ter illustratie van de merkselectie van ruwe O2-fluxen voor gegevensextractie. (A) Cytochroom c-selectie: selectienummer 1 vóór de Cytochroom c-injectie en selectienummer 2 na de injectie wanneer de O2-flux is gestabiliseerd. c Cytochroom c. (B) Substraat, ADP en inhibitorselectie: selectie nummer 1 na de injectie (succinaat in deze representatieve grafiek) waar de O2-flux is gestabiliseerd. S: Succinaat. (C) Ontkoppelingsselectie: selectie nummer 1 bij de piektoename van de ademhaling tijdens de ontkoppelingstitratie. In deze representatieve FCCP-titratieplot vermindert de derde injectie de ademhaling enigszins en wordt dus niet gebruikt voor selectie. F: ACCP. (D) TMPD-selectie: selectie nummer 1 bij de piektoename van de ademhaling na de ascorbaat- en TMPD-injecties. Natriumazideselectie: selectie nummer 2 na het acute injectieartefact wanneer de ademhaling aanvankelijk afneemt. As/ Tm: Ascorbaat /TMPD; Azd: Azide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Benaderingen voor het evalueren van mitochondriale ademhaling bij kanker zijn grotendeels beperkt tot in vitro modellen^13,14,15,16. Er is enig succes geboekt bij het meten van mitochondriale ademhaling in tumoren met behulp van chemische permeabilisatie^6,7,17,maar er is geen uniforme, gouden standaardbenadering die universeel kan worden toegepast en vergeleken tussen tumortypen. Bovendien heeft een gebrek aan consistente gegevensanalyse en -rapportage de generaliseerbaarheid en reproduceerbaarheid van gegevens beperkt. De hierin beschreven methode biedt een eenvoudige, relatief snelle aanpak om mitochondriale ademhaling¹⁸ te meten in mitochondriale preparaten uit vers weggesneden vaste tumormonsters. Tumoren werden gekweekt uit orthotopisch geïmplanteerde muriene luminale B, ERα-negatieve EO771 borstkankercellen¹⁹.

Zorgvuldigheid en zorg met weefselbehandeling zullen de nauwkeurigheid en normalisatie van de zuurstofverbruiksnelheden aanzienlijk verbeteren. Het weefsel en de mitochondriën kunnen gemakkelijk worden beschadigd als het monster niet koud wordt gehouden, niet consequent wordt ondergedompeld in conserveringsmedia of te veel wordt behandeld, wat resulteert in suboptimale routine en OXPHOS-snelheden. Bovendien is een nauwkeurig nat gewicht van het gehomogeniseerde weefsel van cruciaal belang, omdat dit de primaire normalisatiemethode is. Andere normalisatiemethoden kunnen worden overwogen, zoals totaal eiwit of mitochondriale specifieke markers, zoals citraatsynthase-activiteit²⁰. Bovendien zal weefselheterogeniteit moeten worden aangepakt, waarbij beslissingen over tumorregio’s a priori in experimenten moeten worden opgenomen. Necrotisch, fibrotisch en bindweefsel homogeniseren en/of ademen mogelijk niet goed en moeten worden vermeden, tenzij deze tumorgebieden opzettelijk worden getest. Met name kan de tumor erg kleverig zijn, afhankelijk van het type en het excisiegebied, waardoor nauwkeurig wegen en overbrengen uitdagender wordt. Het aantal slagen dat wordt gebruikt voor homogenisaties moet worden geoptimaliseerd om een volledige voorbereiding van de mitochondriën te garanderen en tegelijkertijd de schade aan de buitenste mitochondriale membranen te beperken.

Voor verbeterde nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid raden we aan optimalisatie-experimenten uit te voeren voor het aantal slagen voor homogenaatpreparaat, weefselconcentratie en substraat-, ontkoppelings- en remmerconcentraties. Studies kunnen het verschillende aantal beroertes vergelijken en hoe ze overeenkomen met de respons op de toevoeging van cytochroom c binnen de studie, evenals de maximale mitochondriale ademhalingscapaciteit ²¹. Hoewel er een algemene acceptatie is dat minder cytochroom c-respons beter is, omdat een toename van het zuurstofverbruik na de toevoeging van cytochroom c kan wijzen op schade aan het buitenste mitochondriale membraan, is er geen gouden standaard over wat deze drempel is voor elk weefsel en moet experimenteel worden onderzocht om ervoor te zorgen dat het weefsel niet overwerkt of onvoldoende voorbereid is. In dit tumorweefsel werd gevonden dat een cytochroom c-respons onder ~ 30% de ademhalingsfunctie niet verminderde. Cytochroom c gebruik wordt van cruciaal belang voor nauwkeurige kwantificering van de ademhalingscapaciteit als de test positief is. In dit geval vult de toevoeging endogene cytochroom c aan, wat, indien uitgeput, een onderschatting van de ademhalingsfrequenties zal veroorzaken.

Weefselconcentratietitratie-experimenten kunnen worden uitgevoerd over een reeks haalbare concentraties en zouden idealiter worden uitgevoerd met SUITs die tijdens het onderzoek zullen worden onderzocht. De ademhalingscapaciteit varieert per tumortype en samenstelling. Tumoren dicht bij mitochondriën of hoge ademhalingscapaciteit vereisen dus lagere concentraties (0,5-5 mg / ml). Tumoren met weinig mitochondriën of een lage ademhalingscapaciteit vereisen hogere concentraties (7-12 mg / ml). Bovendien hebben SUITs die lang zijn of veel substraten hebben, mogelijk minder weefsel nodig om reoxygenatie van de kamer of ADP-beperking te voorkomen. Sommige weefsels zullen een lineaire relatie hebben in zuurstofverbruik, terwijl andere een verbeterde gevoeligheid en maximale oxidatie vertonen bij bepaalde concentratiebereiken. De gekozen weefselconcentratie moet worden geoptimaliseerd om de zuurstofflux te maximaliseren en tegelijkertijd het aantal reoxygenatiegebeurtenissen te beperken. Daarnaast is het vaak beter om de behoefte te overschatten of te streven naar de bovenkant van het concentratiebereik. De remmers, die essentieel zijn voor de kwantificering van ademhalingsfluxen, zijn nauwkeuriger wanneer ze worden gebruikt in grotere pools van mitochondriën.

Een andere essentiële overweging is de concentratie van de geneesmiddelen die tijdens de protocollen worden gebruikt. Veranderingen in de homogenaatconcentratie kunnen de concentraties van substraten, ontkoppelaars en remmers die nodig zijn voor een maximale respons veranderen. Zodra het optimale concentratiebereik is gekozen, moet dus een experiment worden uitgevoerd waarbij de doses worden getest die nodig zijn voor het SUIT-protocol. Extra ADP kan worden toegevoegd om ervoor te zorgen dat de adenylaatconcentraties niet beperkt blijven tot ademhalingsfluxen. Chemische ontkoppelaars zoals FCCP of CCCP remmen de ademhaling bij hogere concentraties²². Als zodanig is het essentieel om in kleine hoeveelheden te titreren om de maximaal bereikte snelheid te onthullen. Remmers, zoals rotenon en antimycine A, kunnen het beste worden gebruikt wanneer ze verzadigd zijn binnen de eerste injectie. Hoewel optimale concentraties werden bepaald in voorlopige experimenten, hebben we ook behandelingsgerelateerde verschillen in respons op remmers waargenomen en dus vaak één extra injectie van remmers toegevoegd om maximale remming aan te tonen, omdat de resulterende snelheden dienen als basis voor kwantificering. Chemische remming van ascorbaat/TPMD is essentieel voor een nauwkeurige analytische reductie aangezien TMPD autooxidatie ondergaat²³. We controleerden op auto-oxidatie van ascorbaat/TMPD/cytochroom c door de toevoeging van natriumazide, een gevestigde CIV-remmer. Voor de Km-studies voorkomt de toevoeging van rotenon in aanwezigheid van succinaat alleen oxaalacetaataccumulatie die de succinaatdehydrogenaseactiviteit bij lage concentraties kan remmen²⁴. Het volume en de concentratie van ADP zijn sterk afhankelijk van de gevoeligheid van de mitochondriën voor de heersende substraatcombinatie. Mitochondriale preparaten die zeer gevoelig zijn voor ADP vereisen lagere startconcentraties. Bovendien zijn gevalideerde chemicaliën en een goede medicijnbereiding met aandacht voor pH, gevoeligheid voor licht indien van toepassing en opslagtemperatuur essentieel voor succesvolle experimenten.

Instrumentopstelling en routinezorg zijn van cruciaal belang voor het succes van deze experimenten. Adequate en goede reiniging van de kamers is essentieel voor de reproduceerbaarheid en preventie van biologische, eiwit-, remmer- of ontkoppelingsbesmetting. Clark-type elektroden en O2k-systemen maken gebruik van glazen reactiekamers, wat een aanzienlijk kostenvoordeel is voor op platen gebaseerde systemen die afhankelijk zijn van verbruiksartikelen. De glazen kamers moeten echter krachtig worden gereinigd en kunnen in latere onderzoeken een bron van inhibitorbesmetting zijn. Incubatie met mitochondria-rijke monsters tijdens het wasproces (geïsoleerde hart- of levermitochondriën, bijvoorbeeld) kan het risico op experimentele besmetting verminderen en wordt aanbevolen naast verdunnings- en op alcohol gebaseerde wasprocedures. Als opeenvolgende studies worden uitgevoerd, minimaliseert reiniging met ethanol en mitochondriën de kans op inhibitorbesmetting. Kalibratie van de zuurstofsensor wordt aanbevolen voorafgaand aan elk experiment om nauwkeurige metingen van de ademhaling te verkrijgen ten opzichte van de heersende partiële druk van zuurstof. Als meerdere kalibraties niet haalbaar zijn, kan één kalibratie per dag voldoende zijn als de zuurstofconcentratie stabiel en consistent blijft na de wasprocedure.

De hierboven beschreven procedures maken gebruik van het Oroboros O2k-instrument voor het meten van zuurstofverbruik in tumorweefsel binnen 4 uur na tumorexcisie met behulp van eerder ontworpen en geoptimaliseerde conserveringsoplossing en ademhalingsmedia^25,26,27. Meerdere parameters in dit protocol kunnen worden gewijzigd voor volgende toepassingen. De instrumentopstelling en kalibratie, de homogenisatoren die worden gebruikt voor weefselvoorbereiding en optimale homogenaat- en kamerzuurstofconcentratie kunnen allemaal worden aangepast voor gebruik op andere instrumenten met zuurstofbewakingspotentieel. De kamers waren bijvoorbeeld iets overvol bij het toevoegen van homogenaat, en dus wanneer de kamer volledig gesloten is, blijft het capillair van de kamer vol. Dit zal wat zuurstof in de kamer verbruiken, maar met optimalisatie van de monsterconcentratie kunnen we rekening houden met dit verbruik bij het bepalen van het zuurstofniveau waarmee we moeten beginnen. Als alternatief kan het monster worden toegestaan om te balanceren met omgevingszuurstof voordat de kamer wordt gesloten, maar dit zal vaak de hoeveelheid tijd voordat het experiment begint verlengen en de toevoeging van substraten vertragen. Hoewel de homogenisatoren die in dit protocol worden gebruikt, breed toegankelijk zijn, kunnen andere commerciële homogenisatietechnieken worden gebruikt, zoals een weefselversnipperaar of geautomatiseerde homogenisator²⁸.

Bovendien kunnen de weefselpreparaat- en instrumentprocedures worden gebruikt met een aantal verschillende SUITs om ademhalingscontrole te bestuderen door een verscheidenheid aan koppelings- en routecontroletoestanden²⁹. Deze SUIT-protocollen zijn ontwikkeld om de functionele capaciteit te meten en dus heeft de bijdrage van potentiële endogene substraten geen invloed op de capaciteitsmeting. We houden analytisch rekening met niet-mitochondriaal zuurstofverbruik en /of restverbruik van het homogenaat door aftrek van de antimycine A-rotenon, of natriumazide ongevoeligheden, naargelang het geval. Mitochondriën kunnen levensvatbaar blijven in BIOPS of vergelijkbaar geconstrueerde conserveringsoplossingen gedurende langere tijd (>24 uur), afhankelijk van het weefseltype en de intactheid^30,31. Er kunnen vooraf studies worden uitgevoerd om de tijdelijke opslaglimieten te bepalen, aangezien OXPHOS van bepaalde substraten verschillende beperkingen kan hebben. Dit is essentieel als het experiment niet binnen enkele uren na weefselexcisie/biopsie kan worden uitgevoerd. 37°C is een optimale en fysiologische temperatuur voor de evaluatie van de ademhalingsfunctie in de meeste zoogdiersystemen. Als de testtemperatuur echter de evaluatie lijkt te verstoren^32,kunnen vergelijkende studies worden uitgevoerd over een breed temperatuurbereik (25-40 °C) om een adequate responsiviteit te garanderen. Instrumentele beperkingen kunnen het vermogen om dergelijke studies uit te voeren beperken.

Belangrijke beperkingen van de hierboven beschreven methode zijn 1) het potentieel voor schade aan mitochondriën door mechanische homogenisatie, 2) aanwezigheid van ATPasen of andere subcellulaire biochemische stoffen in homogenaatpreparaten die kunnen interfereren met gelijktijdige bepaling van ATP of andere variabelen van belang en mogelijk aanvullende correctiemethoden of remmergebruik vereisen³³ , en 3) evaluatie van veel monsters en/of meerdere SUITs per monster is tijdrovend omdat één instrument twee experimenten tegelijk kan huisvesten en tussen opeenvolgende experimenten moet worden gereinigd en opgezet. Optimalisatie-experimenten en consistente voorbereiding van monsters kunnen aanzienlijke mitochondriale schade minimaliseren die zou bijdragen aan inconsistente gegevens.

De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden is verbeterde haalbaarheid in vergelijking met de hoeveelheid uitgangsmateriaal, uitdaging van het isoleren van mitochondriën of technische uitdaging bij het permeabiliseren van weefsel. De bereiding van homogenaten is sneller, zuurstof is lang niet zo beperkend en is minder gevoelig voor variabiliteit tussen personeel in vergelijking met gepermeabiliseerd weefsel. Belangrijk is dat bijna alle monstertypen geschikt zijn voor homogenaatpreparaat, waardoor vergelijkende analyse tussen weefsels mogelijk is. Hoge resolutie respirometrie is de gouden standaard meting van mitochondriaal OXPHOS en ET. De toepassing van deze methode in preklinisch en klinisch kankeronderzoek heeft de capaciteit om het huidige in vitro onderzoek uit te breiden naar ex vivo studies. Bovendien biedt het potentiële toepassingen in klinische en diagnostische omgevingen.

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383
Amphotericin B	Gibco	15290018
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free	Sigma-Aldrich	3117057001	Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe	Fisher Scientific	13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles	Fisher Scientific	23-021-020
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C2506
Datlab 7.4 software	Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide	Amresco	N182
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
D-Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30	Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in	World Precision Instruments	501601
EO771 cells	CH3 BioSystems	SKU: 94APV1-vial-prem	Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock #000664
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750
Kimwipes	Fisher Scientific	34120
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	G1626
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	L2398
Malate	Sigma-Aldrich	M6413
Matrigel Matrix	Corning	354248
MgCl·6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
Microsyringes	Hamilton	87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma-Aldrich	T7394
Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer	Oroboros Instruments	10003-01
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
RPMI 1640	Gibco	21875034
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Succinate (disodium)	Sigma-Aldrich	W327700
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Whatman Filter Paper, grade 5	Sigma-Aldrich	1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL	Duran Wheaton Kimble	357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11	McKesson	1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2	Becton, Dickinson and Company	305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1	Becton, Dickinson and Company	305195
BD 1mL Slip Tip Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm	Thermo Fisher Scientific	316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate	Research Diet	D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm	Thermo Fisher Scientific	S34819