Automatically Generated

Summary

פיתחנו פרוטוקול מעשי וגישה אנליטית להערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי ויכולת העברת אלקטרונים בהומוגנטים של גידול טרי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לסקור פונקציות מיטוכונדריאליות שונות התורמות ייזום סרטן, התקדמות, תגובה לטיפול.

Abstract

המיטוכונדריה חיוניים להתפרצות ולהתקדמות הסרטן באמצעות ייצור אנרגיה, ויסות מיני חמצן תגובתי וסינתזה מקרומולקולית. התאמות גנטיות ותפקודיות של המיטוכונדריה לסביבת הגידול מניעות פוטנציאל רב ונדעי. הופעתם של DNA ורצף RNA הסיר חסמים קריטיים להערכה של מתווכים גנטיים של tumorigenesis. עם זאת, עד כה, גישות מתודולוגיות להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי הגידול נשארות חמקמקות ודורשות מיומנות טכנית המגבילה את ההיתכנות, ובסופו של דבר מפחיתה את הערך האבחוני והפרוצדורלי הן בהגדרות ניסיוניות והן בסביבה קלינית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה לכימות שיעורי זרחן חמצוני (OXPHOS) וקיבולת העברת אלקטרונים (ET) בהומוגנטים של גידול מוצק טרי באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול יכול להיות מיושם באופן רב על פני מינים וסוגי גידולים, כמו גם מותאם כדי להעריך מגוון של מסלולי ET מיטוכונדריאלי. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים כי עכברים הנושאים סרטן ממארי B זוהרים מציגים נשימה פגומה של ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד והסתמכות על תמציתי כדי ליצור אדנוסין טריפוספט באמצעות OXPHOS.

Introduction

כל התאים מקושרים קשר הדוק על ידי הצורך שלהם לייצר ולצרוך אדנוסין טריפוספט (ATP), מטבע האנרגיה המולקולרית. כמו מוטציות הסלולר להוליד היווצרות של גידולים, המיטוכונדריה להבטיח הישרדות באמצעות גיוון של ייצור אנרגיה כי הוא לעתים קרובות פנוטיפי להבחין בין רקמות לא סרטניות^1,2,3. ככזה, קיים צורך קריטי בפרופיל מהיר ועמוק של תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי על מנת להקל על סיווג סוג הגידול, חניכת הסרטן, התקדמות ותגובת הטיפול.

פונקציות נשימה של דגימות רקמה excised לא ניתן להעריך ללא פגע כמו המצעים העיקריים עבור OXPHOS אינם חדורים לתא. כדי להתגבר על מגבלה זו, המיטוכונדריה יכולה להיות מוכנה על ידי בידוד, פרמביליזציה כימית, או הומוגניזציה מכנית. בידוד מיטוכונדריאלי נחשב זה מכבר לסטנדרט זהב להערכת תפקוד הנשימה. עם זאת, זה דורש כמויות גדולות של רקמה, הוא זמן רב, והוא מניב נמוך עם הטיית בחירה אפשרית עבור שברים מסוימים של המיטוכונדריה⁴. Permeabilization מורכב הפרדה מכנית וחשיפה של קטעי רקמות או חבילות סיבים דטרגנט קל כי באופן סלקטיבי משפיל את קרום הפלזמה⁵. Permeabilization משמש לעתים קרובות ברקמות מפוספס כגון שריר השלד והלב כמו חבילות סיבים בודדים ניתן להקניט בנפרד. בהשוואה לבידוד, permeabilization מניב יותר מיטוכונדריה בסביבה התאית הטבעית שלהם ואת הצורה הפיזית⁵. פרמזביליזציה יושמה בהצלחה ברקמות אחרות כגון גידול^6,7 ושליה⁸; עם זאת, רבייה של תכשירי סיבים מחלחלים יכול להיות קשה בשל עקביות של דרישות ביתור וחמצן כדי להתגבר על מגבלות דיפוזיה⁹. בנוסף, סיבים מחלחלים עשויים להיות לא מתאימים בסוגי גידולים מסוימים שהם תאיים צפופים וסיברוטיים מאוד. הומוגנטים רקמות נוצרים באמצעות הפרעה מכנית של קרום הפלזמה והם דומים סיבים permeabilized במונחים של תשואה מיטוכונדריאלית ושלמות¹⁰. הומוגנטים רקמות גם למזער את המגבלות של דיפוזיה חמצן והוא יכול להיות מועסק בקלות על פני סוגי רקמות באמצעות אופטימיזציה של כוח מכני^11,12.

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה לכימות שיעורי זרחן חמצוני (OXPHOS) וקיבולת העברת אלקטרונים (ET) בהומוגנטים של גידול מוצק טרי. הפרוטוקול מתוכנן בצורה אופטימלית להערכת רקמה טרייה באמצעות נשימה ברזולוציה גבוהה של Oxygraph-2k (O2k), הדורש ידע מוקדם של התקנה וכיול אינסטרומנטליים אך ניתן להתאים אותו באופן דומה באמצעות כל אלקטרודה מסוג קלארק, מנתח סוסון ים או קורא לוחות. הפרוטוקול יכול להיות מיושם באופן רב על פני מינים וסוגי גידולים, כמו גם מותאם כדי להעריך מגוון של מסלולי ET מיטוכונדריאלי.

Protocol

כל הניסויים וההליכים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי מרכז המחקר הביו-רפואי פנינגטון הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים. 1. הכנה ריאגנט. הכן את מדיית צמיחת התאים EO771 עם 10 mM HEPES, סרום בקר עוברי 10% (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL) ו-0.2% אמפטריצין B. הכן 1 ליטר של פתרון שימור ביופסיה (BIOPS) בכוס זכוכית 1000 מ”ל. הוסף 3.180 גרם של Na2ATP (ריכוז סופי של 5.77 מ”מ). הוסיפו 1.334 גרם ל-MgCL2·6H2O (ריכוז סופי של 6.56 מ’). יש להוסיף 2.502 גרם טאורין (20 מ”מ בריכוז סופי). הוסיפו 3.827 גרם שלנוס 2זרחן (ריכוז סופי של 15 מ”מ). הוסיפו 1.362 גרם של Imidazole (ריכוז סופי של 20 מ”מ). הוסף 0.077 גרם של Dithiothreitol (ריכוז סופי של 0.5 מ”מ). יש להוסיף 9.76 גרם לחות MES (ריכוז סופי של 50 מ’. מוסיפים 800 מ”ל של H2O ומערבבים את המרכיבים באמצעות מערבל מגנטי ב 30 °C (50 °F). הוסף 72.3 מ”ל של 100 מ”מ K2EGTA (7.23 מ”מ ריכוז סופי). להמיס 7.608 גרם של EGTA ו 2.3 גרם של KOH ב 100 מ”ל של H2O. כוונן את ה- pH ל- 7.0 עם 5 M KOH והעלה את עוצמת הקול עד 200 מ”ל עם H2O. הוסף 27.7 מ”ל של 100 מ”מ CaK2EGTA (2.77 מ”מ ריכוז סופי). להמיס 7.608 גרם של EGTA ב 200 מ”ל של H2O וחום ל 80 °C (100mM ריכוז סופי). יש להמיס 2.002 גרם של CaCO3 ב-200 מ”ל של תמיסת EGTA חמה של 100 מ”מ. תוך כדי ערבוב רציף, הוסיפו 2.3 גרם KOH והתאימו את רמת ה-pH ל-7.0. כוונן את ה- pH ל- 6.75 ב- 23 °C (pH 7.1 ב- 0 °C )C) עם 5 M KOH. העלה את עוצמת הקול עד 980 מ”ל עם H2O, וערבב את הפתרון. בדוק את ה- pH פעם נוספת, התאם במידת הצורך, והביא את הנפח הסופי עד 1000 מ”ל עם מים. Aliquot BIOPS לתוך צינורות חרוט (15 מ”ל או 50 מ”ל) ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד לשימוש. מפשירים רק פעם אחת, ממש לפני השימוש. הכן 1 ליטר של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי (MiR05) בכוס זכוכית 1000 מ”ל. הוסיפו 0.190 גרם של EGTA (ריכוז סופי של 0.5 מ”מ). הוסיפו 0.610 גרם ל-MgCL2·6H2O (ריכוז סופי של 3 מ”מ). יש להוסיף 2.502 גרם טאורין (20 מ”מ בריכוז סופי). הוסיפו 1.361 גרם של KH2PO4 (ריכוז סופי של 10 מ”מ). יש להוסיף 4.77 גרם של HEPES (ריכוז סופי של 20 מ”מ). הוסיפו 37.65 גרם ל-D-סוכרוז (ריכוז סופי של 110 מ”ר). מוסיפים 800 מ”ל של H2O ומערבבים את המרכיבים באמצעות מערבל מגנטי ב 30 °C (50 °F). יש להוסיף 120 מ”ל של חומצה לקטוביונית 0.5 מ’ (ריכוז סופי של 60 מ”מ). להמיס 35.83 גרם של חומצה לקטוביונית ב 100 מ”ל של H2O. כוונן את ה- pH ל- 7.0 עם 5 M KOH והעלה את עוצמת הקול עד 200 מ”ל עם H2O. מערבבים את הפתרון ומתאימה את ה-pH ל-7.1 עם 5 M KOH. שקול 1 גרם של BSA, בעצם ללא חומצות שומן (1 גרם / ליטר ריכוז סופי), בצינור חרוט 50 מ”ל. הוסיפו 40 מ”ל לתמיסת ה-pH 7.1 משלב 9 לצינור, היפו בעדינות כדי לערבב, והימנעו מקציף. מעבירים את ה-BSA המומס לתמיסת ה-pH 7.1 הנותרת בשלב 9 ומערבבים בעדינות ובהתמדה. בדוק את ה- pH פעם נוספת, התאם במידת הצורך והבא את עוצמת הקול הסופית עד 1000 מ”ל עם H2O. Aliquot miR05 בינוני לתוך צינורות חרוט 50 מ”ל ולאחסן ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש. מפשירים רק פעם אחת, ממש לפני השימוש. הכן מצעים, תותמים ומעכבים. הכן 0.8 M Malate: להמיס 536.4 מ”ג של חומצה L-Malic ב 4 מ”ל של H2O. לנטרל עם 5 M KOH ל pH 7 ולהביא את הנפח עד 5 מ”ל עם H2O. לחלק לתוך aliquots ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (7).” הכן 1 M Pyruvate: להמיס 550 מ”ג של מלח נתרן חומצה פירובית ב 4 מ”ל של H2O. לנטרל עם 5 M KOH ל pH 7 ולהביא את הנפח עד 5 מ”ל עם H2O. לחלק לתוך aliquots ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (7).” הכן 0.5 M ADP (אדנוסין 5′-דיפוספט): יש להמיס 1.068 גרם של מלח נתרן ADP ב-4 מ”ל של H2O. לנטרל עם 5 M KOH ל- pH 7 ולהביא את הנפח עד 5 מ”ל עם H2O. לחלק ל aliquots ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (5 °F). הכן 2 M גלוטמט: להמיס 3.7426 גרם של חומצה L-גלוטמית מונוהידראט ב 8 מ”ל של H2O. לנטרל עם 5 M KOH ל- pH 7 ולהביא את הנפח עד 10 מ”ל עם H2O. לחלק אליקואט ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (5 °F). הכן 4 mM Cytochrome c: להמיס 50 מ”ג של Cytochrome c ב 1 מ”ל של H2O. לחלק לתוך aliquots ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (70 °F). הכן 1 M Succinate: להמיס 2.701 גרם של מלח דיסודיום תמציתי hexahydrate ב 8 מ”ל של H2O. לנטרל עם 1 N HCl ל pH 7 ולהביא את הנפח עד 10 מ”ל עם H2O. לחלק אליקאוטים ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (50 °F). הכן 1 mM FCCP (קרבוניל ציאניד-4-(טריפלואורומטוקסי)פניל הידרוזון): להמיס 2.54 מ”ג של FCCP ב 10 מ”ל של אתנול טהור. מחלקים ל-aliquots ואז מאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס. הכן 150 מיקרומטר רוטנון: להמיס 3.94 מ”ג של רוטנון ב 10 מ”ל של אתנול טהור כדי להכין מלאי 1 mM, מערבולת עד מומס לחלוטין. לדלל 225 μL של 1 mM רוטנון מניית ריכוז עם 1.275 מ”ל של אתנול טהור לעשות 1.5 מ”ל של 150 μM רוטנון. להגן מפני אור, לחלק לתוך aliquots, ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (50 °F). הכן 125 מיקרומטר אנטימיצין A: להמיס 11 מ”ג של אנטימצין A ב 4 מ”ל של אתנול טהור כדי להכין 5 mM ריכוז מלאי של אנטימיצין A. לדלל 25 μL של 5 mM אנטימצין ריכוז מניות עם 975 μL של אתנול טהור לעשות 1 מ”ל של 0.125 mM עתיקות A. לחלק אליקוטס ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C. הכן 0.8 M אסקורבאט: להמיס 1.584 גרם של מלח נתרן אסקורבאט ב 8 מ”ל של H2O. להתאים pH עם חומצה אסקורבית ל- pH 6 ולהביא את הנפח עד 10 מ”ל עם H2O. להגן מפני אור, לחלק aliquots, ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (50 °F). הכן 0.2 M TMPD (tetramethyl-p-פנילנדיאמין): להמיס 32.85 מ”ג של TMPD ב 987.5 μL של DMSO. הוסף 12.5 μL של 0.8 M אסקורבאט (10 mM ריכוז סופי של אסקורבאט). להגן מפני אור, לחלק לתוך aliquots, ולאחר מכן לאחסן ב -20 °C (50 °F). הכן 4 M נתרן אזיד: להמיס 2.6 גרם של נתרן אזיד ב 10 מ”ל של H2O. לחלק אליקוטים ולאחסן ב -20 °C (70 °F). 2. גידול לגדל EO771 תאים ב RPMI 1640 צמיחה מדיה ולשמור על התאים באינקובטור לח 37 °C עם 5% CO2. עכברי C57BL/6J נקבה בת ארבעה שבועות, לשמור אותם ב 21-22 °C (52 °F) על אור 12 שעות: מחזור כהה. ספק לעכברים גישה לליביטום למזון ומים. ברגע שהעכברים מגיעים לגיל 10 שבועות, הכינו את התאים והעכברים להשתלת תאים סרטניים. Trypsinize התאים, לנטרל טריפסין עם מדיה צמיחה, ותאי צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נט ואת resuspend ולשלב את כדורי התא (לפי הצורך) במדיה. לספור תאים קיימא באמצעות כחול טריפן ולהכין דילול תא של 1 x 106 תאים בנפח כולל של 60 μL עם 1:1:1 מדיה / מטריצת קרום מרתף / PBS פתרון. לאחר מטריצת קרום המרתף מתווסף, לערבב היטב ולשמור את השעיית התא על קרח. מלא מזרקים עם 60 μL של השעיית תא ומניח אותם על קרח. לעבוד ביעילות ולהזריק תאים לעכברים בתוך 1.5 שעות של הכנה. עכברים מרדים על ידי שאיפת איזופלוראן (3%-5% עבור אינדוקציה ו 1%-3% לתחזוקה). גילוח בין בלוטות החלב המשתנות הימניות4 ו-5. הזריקו באופן אורתופי לעכברים המרדים את ההשעיה של תא EO771. השתמש calipers אלקטרוני כדי לפקח ולמדוד את הגידול פעמיים בשבוע במשך 4 שבועות. ב נמק, excise, לשקול, ולאחר מכן למקם את הגידול (או מינימום של 60 מ”ג סעיף הגידול) מיד לתוך 10 מ”ל של BIOPS קר כקרח. שמור את הצינור על קרח רטוב. 3. התקנת מכשיר וכיול מחממים את המדיום MiR05 באמבט מים 37 °C (37 °F). הפעל את מערכת Oroboros O2k, פתח תוכנת DATLAB, הזן או בחר משתמש. לחץ על התחבר ל- O2k. בדוק את תצורת O2k וודא שהמכשיר הנכון מסומן עבור Power-O2k וכל תא מתאים לחיישן החמצן הנכון; לחץ על אישור. לאחר פתיחת חלון הבקרה O2k, תחת הכרטיסיה מערכות, הגדר את טמפרטורת הבלוק ל- 37 °C (77 °F), מהירות הסטרר ל- 750 סל”ד עבור שני התאים, ND מרווח הזמן להקלטת נתונים ל- 2.0 שניות. בדוק הן את כוח סטירר והן את התאורה בתיבות הקאמריות. בכרטיסיה חמצן, O2, הגדר את השג עבור חיישן ל- 1 V / μA (ייתכן שיהיה צורך להתאים את הרווח לדגמי מכשירים ישנים יותר), מתח הקיטוב ל- 800 mV ולאחר מכן לחץ על התחבר ל- O2k. לאחר פתיחת קובץ ניסוי חדש, תן שם לקובץ ולחץ על שמור. לאחר שהניסוי פעיל, ייפתח חלון בחירת פרוטוקול; לחץ על ביטול כדי להפעיל חליפה מותאמת אישית (מצע ביטול החלפה של טיטור מעכבי מצע). לאחר בחירת הפרוטוקול, ייפתח חלון לדוגמה כדי למלא את הקוד הניסיוני, סוג המדגם, הקוהורטה, הקוד לדוגמה, מספר המדגם ומספר דגימת המשנה לפי העניין. הקצה את היחידה ל- mg והזן את ריכוז הומוגנט הגידול לכל mL (כמות לכל תא יהיה לאכלס באופן אוטומטי). ודא כי המדיום המצוין הוא MiR05 ונפח התא הוא 2.00 מ”ל. הוסף הערות לפי הצורך בתיבה התחתונה ולחץ על אישור. הסר את פקקים ושאף את 70% אתנול מן התאים. לעולם אל ישאף קרוב לממברנה החשופה בחלק הפנימי של התא. יש לשטוף ארבע פעמים במים טהורים ולמלא את התא ב-2.25 מ”ל של MiR05. בדיקת חיישן: לחץ על F9 כדי לכבות את המערבבים במשך 30 s. לאחר סרגל stirrer מופעל שוב, ודא כי מדרון O2 גדל במהירות חד-אקספוננציאלי בכל תא. אם התא נכשל במבחן החיישן, בדוק את החיבורים החשמליים ונקה אם מלחים הצטברו; חזור על הבדיקה. אם החיישן ממשיך להיכשל בבדיקה, הסר את מחבר חיישן החמצן הפולרוגרפי (POS) כדי לבדוק את הממברנה. אם נצפתה פגיעה גלויה בממברנה, חמצון כבד או הצטברות בועה משמעותית, עצרו את ההליכים הניסיוניים והמשיכו לשירות מכשירים. כיול חמצן: בצע כיול חמצן כדי לקבל מדידות נשימה מדויקות. בתנועת פיתול, הכנס את המעצורים באיטיות למיקומם המכויל בנפח. לשאוב את המדיום העודף שנפלט דרך נימי ההזרקה שאוסף בבאר של פקק. עם תנועה מפותלת, הרם את הפקק מספיק כדי להתאים בחוזקה את כלי הפקק-spacer משאיר נפח גז מעל השלב הנוזלי עבור שיווי משקל האוויר הסופי (30-45 דקות.). השתמש במצב היציב שהושג בתקופה זו כדי לכייל את חיישן החמצן כדי להשיג מדידות מדויקות של נשימה. O2 מדרון שלילי שלילי (שיפוע שלילי של חמצן) הוא 0 ± 2 pmol / s·mL. אם הערך גבוה מ-2 pmol/s·mL, נקו את התא וחידשו אותו ב-MiR05 שהופשר זה עתה. אם השיפוע אינו יציב, המשך לשירות מכשירים. לאחר השגת מצב יציב, בחר את עקומת הריכוז O2 וסמן את האזור היציב של העקומה על-ידי החזקת מקש Shift ולחצן העכבר לחיצה שמאלה. לאחר בחירת האזור, לחץ על F5, בחר את הסימן לכיול האוויר עם החץ הנפתח ולחץ על כיול והעתק ללוח. כיול רקע אינסטרומנטלי (אופציונלי) לאחר כיול האוויר, ודא כי אין נפח גז מעל השלב הנוזלי עבור שיווי משקל רקע שטף (~ 15 דקות) ולסגור את התאים במלואם.הערה: קצב המצב היציב שהושג בתקופה זו מייצג רקע אינסטרומנטלי וניתן להפחית אותו מהנתונים המתקבלים לדיוק אנליטי משופר. מדרון O2 שלילי. בתחילה יעלה מעט ואת הרמה בין ± 2 עד 4 pmol / s·mL. אם הערך גבוה (>6 pmol/s·mL), יש זיהום ביולוגי פוטנציאלי. במקרה זה, לנקות את החדר ולחדש אותו עם MiR05 מופשר טרי. לאחר השגת מצב יציב, בחר בעקומה O2 slopeg. וסמן את האזור היציב של העקומה על-ידי החזקת מקש Shift לחוץ ולחצן העכבר לחיצה שמאלה. לאחר בחירת האזור, לחץ על F5, בחר בתיבת התיקון הבסיסי ובסימן עבור תוכנית בסיסית עם החץ הנפתח ולחץ על אישור. 4. הכנת גידול הומוגנית מניחים הומוגניזר זכוכית המכיל 1 מ”ל של MiR05 ועלי זכוכית מתאים היטב על קרח רטוב. בזמן המחקר, מניחים את הרקמה ב-1 מ”ל של ביופס בצלחת פטרי קרה כקרח. לנקות ולנתח את הרקמה כדי למקסם חומר מסיס, להימנע מאזורים נמקיים, ולהסיר רקמת גידול שולית. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, אזמל ופינצטה כירורגית, להסיר כל שיער, רקמה נמקית, חיבור היקפי ורקמת כלי דם, ושומן סמוך, לפי העניין. יש להקפיד לשמור על הגידול ב- BIOPS קר כקרח במהלך הניתוח. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות (~ 5-10 מ”ג כל אחד) ומניחים את חתיכות הגידול הנותרות בחזרה ל 10 מ”ל של BIOPS נשמר על קרח. השתמש ברקמה זו מאוחר יותר עבור תכשירים נוספים במידת הצורך.הערה: בצע את השלבים הבאים במהירות כדי למזער את משך הזמן שבו המדגם אינו שקוע באופן מלא ב- BIOPS. ברגע המדגם ממוקם MiR05, הזמן הוא המהות. העבירו בזהירות את ההומוגנית המוכנה לחדר המכויל בהקדם האפשרי. כתם קטעי הרקמה בזהירות על נייר מסנן, מניח אותם על סירת שקילה קטנה מזופת פלסטיק, ולתעד את המשקל הרטוב הראשוני. מניחים את החלקים שאינם בשימוש בחזרה לתוך הצינור החרוט 10 מ”ל של BIOPS להמשך שימור. שקועים בקטעי הרקמה בהומוגניזר קר כקרח המכיל MiR05 ומתעדים את המשקל הנותר על סירת השקילה, אם ישים. באמצעות עלה זכוכית (טווח פינוי 0.09-0.16 מ”מ), לשבש בעדינות את רקמת הגידול על ידי השלמת 5-7 משיכות כלפי מטה ולמעלה. עבור כל משיכה, סובב את העלי בתנועה חכמה-שעון נגד כיוון השעון 3 פעמים תוך דחיפת העלי כלפי מטה ו-3 פעמים נוספות תוך משיכת העלי בחזרה למעלה. הקפד לאפשר לרקמה להתיישב לתחתית של homogenizer בין שבץ אבל להימנע להביא את העלי באופן מלא מעל נפח הנוזל כדי למנוע קצף.הערה: הומוגנט וכתוצאה מכך צריך להיראות מעונן עם שרידי רקמה מוצקה מינימלית. יוצקים את ההומוגנאט לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל ומניחים אותו על קרח. פיפטה 1-3 מ”ל של MiR05 טרי מעל המהח עלה לתוך homogenizer לשטוף כל רקמה הומוגנית שנותרה. יוצקים את שטיפת MiR05 לתוך הצינור החרוט המכיל הומוגנטי. חזור על שטוף עלה והומוגניזר 2-3 פעמים כדי להבטיח העברה מלאה של הומוגניאט. זכור את ריכוז היעד ואת נפח נדרש לא לדלל את המדגם במהלך שלבי הכביסה. כדי לחשב במדויק את ריכוז הרקמה הומוגנית, בדוק בקפידה את homogenizer ואת הומוגני עבור חומר לא הומוגני הנותרים (כלומר, רקמת חיבור). כדי להסיר את החומר הלא הומוגני מן homogenizer כי לא ניתן להגיע עם פינצטה, להוסיף MiR05 הומוגניזר, לשאוף את הנפח (כולל הרקמה) עם pipette ולהעביר את התוכן לצלחת פטרי. כדי להסיר את החומר הלא הומוגני מן הומוגנט (התיישב בחתיכות גדולות בתחתית הצינור חרוטי), לשאוף את החלקים הגדולים עם pipette ומניחים אותם על מכסה הרקמה של הצינור חרוטי. הסר את הרקמה מצלחת הפטרי או כובע צינור חרוטי עם פינצטה ולהכתים אותו על נייר מסנן. מוסיפים את ההומוגנית הנותרת מכסת הצינור החרוט בחזרה לצינור החרוט, מכסים אותו ואז הופכים לערבב. בדוק מחדש את homogenizers הומוגניאט עבור כל חומר נוסף לא הומוגני, ולחזור על שלבים 4.10.1-4.10.3 כדי להסיר את החומר לפי הצורך. שקול ומתעד את המסה של החומר הלא הומוגני התאושש מן homogenizer. בדוק את ההכנה הומוגנית עבור כל רקמה שלמה ברוטו הועבר. הסר את החלקים הלא הומוגניים ולשקול לפי הצורך. הפחת את משקל הרקמה התאושש מסירת השקילה, homogenizer, הומוגנית (במידת הצורך) מן המשקל הרטוב הראשוני כדי לחשב את משקל המדגם הסופי. באמצעות משקל המדגם הסופי, הוסף MiR05 נוסף כדי להביא הומוגנט לריכוז הרצוי (ראה שלב 5 לקבלת פרטים לגבי ניסויי אופטימיזציה). ברגע שההומוגנטים נשקלים ומוכנים, המשיכו לבצע את ההסתה בהקדם האפשרי. שמור את המדגם מאוחסן על קרח רטוב עד שהוא מועבר למכשיר. 5. מצע, ביטול פיקוח, פרוטוקול טיקור מעכב (SUIT) לאחר המכשיר מכויל, ואת המדגם מוכן, להסיר את פקקים עם תנועה מפותלת ולשאף את MiR05 מן התאים (הימנעות הממברנה חשופה בתוך התא). מערבבים היטב את ההומוגנית ומוסיפים 2.25 מ”ל של הומוגנטים לתא. אם מוסיפים הומוגנט אחד לתאים מרובים, pipette 1 מ”ל בכל פעם לתוך כל תא תוך ערבוב הומוגני כדי להבטיח התפלגות רקמות שווה. לחץ על F4 כדי להחתים את חותמת הזמן של האירוע ולאחר מכן לחץ על אישור. מלא מזרק 50 מ”ל בחמצן ממיכל חמצן עם וסת וצינורות גז באמצעות מחט קהה 18 G. היפראוקסיגנט התאים ~ 500 מיקרומטר חמצן. בשביל זה, להזריק חמצן ישירות לתוך התאים. הכנס באופן רופף את פקקים ולחכות לסגור עד החמצן מגיע ~ 480 מיקרומטר. בתנועה מפותלת, סגור לאט לאט את התא ואפשר לנשימה להתפרק (~ 15-20 דקות). מלאו את נימי הבלם המרכזי ב-MiR05 במידת הצורך. קביעה אנליטית של קיבולת OXPHOS ו- ET (מצב העברת אלקטרונים) של פעילות N מקושרת ו- NS מקושרת ו- CIV (מורכב IV): השתמש במיקרו-מזרקים ייעודיים כדי להזריק מצעים, uncouplers ומעכבים לתאים סגורים לחלוטין. לחץ על F4 עם כל זריקה כדי שם וזמן חותמת האירועים עבור כל תא בזמן אמת. לאורך המחקר, בחר F6 כדילהתאים את ריכוז O 2 ו O2 מדרון קשקשים. לפי הצורך. לאחר כל זריקה, לשטוף את המזרקים 3 פעמים במים (עבור תרכובות מסיסות במים) או 70% אתנול (עבור תרכובות מומס אתנול או DMSO).הערה: N-linked: O 2 שטף נתמך על ידי שילובימצע מוגדרים ליצירת NADH, NS מקושר: O2 שטף נתמך על ידי התכנסות של שילובי מצע מוגדרים NADH ליצור תמציתי. הוסף 5 μL של 0.8 M Malate (2 mM ריכוז סופי) ולהמשיך מיד לזריקה הבאה. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים במים. מיד להוסיף 5 μL של 1 M Pyruvate (2.5 מ”מ ריכוז סופי) ולחכות הנשימה להתייצב. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים במים. הוסף 10 μL של 0.5 M ADP (ריכוז סופי של 2.5 מ”מ) והמתן לתגובת ADP כדי להתייצב. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים במים.הערה: ADP נוסף (2.5-10 מ”מ) עשוי להידרש כדי להבטיח שריכוזים אדנילט אינם מגבילים לשטף בדרכי הנשימה. מוסיפים 5 μL של 2 M גלוטמט (ריכוז סופי של 5 מ”מ) ומחכים להתייצבות הנשימה. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים במים. הוסף 5 μL של 4 mM Cytochrome c (ריכוז סופי 10 מיקרומטר) ולחכות הנשימה להתייצב. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים במים. הוסף 20 μL של 1 M Succinate (10 mM ריכוז סופי) ולחכות הנשימה להתייצב. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים במים. טיrate 0.5-1 μL תוספות של 1 mM FCCP (ריכוז סופי 2-20 מיקרומטר) ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין עלייה נוספת בנשימה. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים ב 70% אתנול. הוסף 2 μL של 150 μM רוטנון (ריכוז סופי 150 nM-2 μM) ולחכות הנשימה להתייצב. הוסף עוד 1 μL של רוטנון כדי להבטיח שאין עיכוב נוסף. אם יש ירידה בנשימה, להמשיך עם זריקות נוספות עד שאין ירידה בנשימה. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים ב 70% אתנול. הוסף 2 μL של 125 מיקרומטר אנטימיצין A (125 nM-5 μM ריכוז סופי) ולחכות הנשימה להתייצב. הוסף עוד 1 μL של אנטימיצין A כדי להבטיח שאין עיכוב נוסף. אם יש ירידה בנשימה, להמשיך עם זריקות נוספות עד שאין ירידה בנשימה. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים ב 70% אתנול. בדוק את ריכוז החמצן של התא; אם הריכוז הוא מתחת 125 מיקרומטר, reoxygenate לאוויר החדר או hyperoxygenate קלות כדי להבטיח כי חמצן אינו מגביל את שטף הנשימה. הוסף 5 μL של 0.8 M אסקורבאט (2 mM ריכוז סופי). לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים ב 70% אתנול. מיד להוסיף 10 μL של 0.2 M TMPD (1 mM ריכוז סופי) לחכות לעלייה נשימה איטית. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים ב 70% אתנול. הוסף 25 μL של 4 M נתרן אזיד (50 mM ריכוז סופי) מיד כאשר שטף הנשימה של הרמות Ascorbate / TMPD. לשטוף את מזרק הזרקה 3 פעמים ב 70% אתנול. סיים את המחקר – לחץ על קובץ, שמור והתנתק. ממשיכים לשטוף את התא והמזרק בעקבות שלבים 9.2-9.3. 6. פרוטוקול רגישות ADP לאחר המכשיר מכויל המדגם מוכן, להסיר את פקקים עם תנועה מפותלת ולשאף את MiR05 מן התאים (הימנעות הממברנה חשופה בחלק הפנימי של התא). מערבבים היטב את ההומוגנית ומוסיפים 2.25 מ”ל של הומוגנטים לתא. נניח הוספת הומוגניט אחד לתאים מרובים, pipette 1 מ”ל בכל פעם לתוך כל תא תוך ערבוב הומוגני כדי להבטיח התפלגות רקמות שווה. לחץ על F4 כדי להחתים את האירוע ובזמן ובזמן ולחץ על אישור. הכנס את פקקים, ועם תנועה מפותלת, לאט לסגור את התא ולאפשר את הנשימה כדי שיווי משקל (~ 15-20 דקות). מלאו את נימי הבלם המרכזי ב-MiR05 במידת הצורך. קביעה אנליטית של רגישות ADP מיטוכונדריאלית הקשורה לתמציתיות: לחץ על F4 עם כל זריקה כדי להחתים את האירועים עבור כל תא בזמן אמת. לאורך המחקר, בחר F6 כדילהתאים את ריכוז O 2 ו O2 מדרון קשקשים. לפי הצורך. הוסף 2 μL של 150 μM רוטנון (ריכוז סופי 150 ננומטר). מיד להוסיף 20 μL של 1 M Succinate (10 mM ריכוז סופי) ולחכות הנשימה להתייצב. Titrate ADP על ידי תוספת צעדית של ריכוזים תת-רוויים עד להגעה לקצב התגובה המקסימלי (VMAX; ריכוז סופי של 2.5-10 מ”מ).הערה: הקצב עשוי לרמה לאחר הזרקה עקב שינוי קטן בריכוז ADP, ובכך להגדיל את ריכוז ההזרקה לאחר כל רמה ולהמשיך עם titration עד שאין עלייה נוספת בנשימה גם עם עלייה קיפול בריכוז הזרקת ADP. 7. ניסויי אופטימיזציה מומלצים לקבוע ריכוז הומוגנטי וחמצן אופטימלי לפרוטוקול. לבצע פרוטוקול SUIT (שלבים 5.1-5.3) בריכוזים מרובים של רקמות (למשל, 30 מ”ג/מ”ל, 20 מ”ג/מ”ל, 10 מ”ג/מ”ל, 5 מ”ג/מ”ל, 2.5 מ”ג/מ”ל, 1 מ”ג/מ”ל, ו/או 0.5 מ”ג/מ”ל). בחר ריכוז שממקסם את שטף הנשימה תוך הגבלת תדירות ה- reoxygenations (לא יותר מ 1-2). אם נדרשים reoxygenations תכופים יותר, להקטין את הריכוז של הומוגנייט. לקבוע את המספר האופטימלי של משיכות עם homogenizer. בצע פרוטוקול SUIT (שלבים 5.1-5.3) ברמות מרובות של הומוגניזציה (למשל, 5 משיכות, 10 משיכות, 15 משיכות, 20 משיכות). מכיוון שאין מספיק נתונים בספרות כדי לקבוע סף של עליית האחוזים של ציטוכרום c עם הכנת הומוגנט גידול, בחר את ההכנה עם תגובת ציטוכרום c מוגבלת אך נשימה נאותה המוגברת על ידי המצע(ים) של עניין. קבעו את המצע האופטימלי, ADP, uncoupler וריכוז המעכב הנדרשים לשטף נשימה כמותי ושחזורי. בצע פרוטוקול SUIT (שלבים 5.1-5.3.9) בריכוז הרקמה שנבחר (שלב 7.1). יש לתבל כל מצע, לבטל את התפירה, המעכב ואת ADP עד שלא נצפתה תגובה נוספת. לתגר את העיכוב עם נתרן אזיד בניסויים נפרדים. הוסף 5 μL של 0.8 M Malate (2 mM ריכוז סופי) ולהמשיך מיד לזריקה הבאה. Titrate 1 μL תוספות של 1 M Pyruvate ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין עלייה נוספת בנשימה. Titrate 2 μL תוספות של 0.5 M ADP ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין עלייה נוספת בנשימה. Titrate 1 μL תוספות של 2 M גלוטמט ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין עלייה נוספת בנשימה. הוסף 5 μL של 4 mM Cytochrome c (ריכוז סופי 10 מיקרומטר) ולחכות הנשימה להתייצב. Titrate 5 μL תוספות של 1 M Succinate ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין עלייה נוספת בנשימה. Titrate 5 μL תוספות של 0.5 M ADP ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין עלייה נוספת בנשימה. Titrate 0.5 μL תוספות של 1 mM FCCP ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין עלייה נוספת בנשימה. טירט 1 μL תוספות של 150 μM רוטנון ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין ירידה בנשימה. Titrate 1 μL תוספות של 125 מיקרומטר אנטימיצין A ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה, להמשיך עד שאין ירידה נוספת בנשימה. הוסף 5 μL של 0.8 M אסקורבאט (2 mM ריכוז סופי). מיד להוסיף 5 μL של 0.2 M TMPD (ריכוז סופי 0.5 מ”מ) לחכות לעלייה בנשימה איטית. בניסוי נפרד, להוסיף 10 μL של 0.2 M TMPD (1 mM ריכוז סופי). בניסויים נפרדים להוסיף, 10 μL, 25 μL, 50 μL, ו 100 μL של 4 M נתרן אזיד (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM ריכוז סופי, בהתאמה) מיד כאשר שטף הנשימה של הרמות Ascorbate / TMPD. בחר את ריכוזי המצע והמעכבים הרוויים בתוך הזריקה הראשונה כדי לשפר את תזמון הניסוי. השתמש ב- ADP בריכוזים רוויים או רוויים כדי לשלב הערכות רגישות ADP עם פרוטוקולי SUIT מסורתיים. השתמש בריכוזים תת-מקסימליים כדי להדגים את תגובת המינון ללא עיכוב של שטף נשימה. 8. ניתוח נתונים ניתוח חליפה בחר את שיעורי המצב היציב או השיא מכל טיטריון וייצוא להפחתה אנליטית. לבטא את הנתונים כמו pmol O2 לשנייה לכל מ”ג של רקמה (pmol / s / מ”ג). להשיג את ההפחתה האנליטית של PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P ו- PMGS-E על ידי הפחתה של אנטימצין שיעור חסר רגישות מהשיעור המתאים (כלומר, שיעור מצב יציב המתקבל לאחר הוספת ADP).הערה: PM: פירובט + מלאט; PMG: פירובט + מלאט + גלוטמט; PMGS: פירובט + מלאט + גלוטמט + תמציתי; -L:מצב דליפה; -P: מצב זרחן חמצוני, -E: מצב העברת אלקטרונים. להשיג את ההפחתה האנליטית של CIV-E על ידי הפחתה של נתרן azide חסר רגישות משיעור אסקורבאט / TMPD שיא. להשיג את ההפחתה האנליטית של PMG-E על ידי הפחתה של שיעור חוסר רגישות רוטנון משיעור PMGS-E. להשיג את ההפחתה האנליטית של S-E על ידי חיסור שיעור חוסר רגישות אנטימיצין A משיעור חוסר רגישות רוטנון. להשיג את ההפחתה האנליטית של יעילות השליטה של ציטוכרום c, סמן של שלמות הממברנה החיצונית, על ידי המשוואה הבאה:jc = ((JCHNOc – JCHNO)/JCHNO) x 100במשוואה, jc הוא העלייה % בתוספת של ציטוכרום c, JCHNOc הוא שטף החמצן לאחר התוספת של ציטוכרום c, ו JCHNO הוא שטף החמצן לפני התוספת של ציטוכרום c. ניתוח רגישות ADP באופן אנליטי לקבוע את הקינטיקה עבור רגישות ADP ביחס לשיעור הדליפה של תמציתי + רוטנון (לא את קצב הומוגניאט הרקמה). התווה את שטף O2 (ציר Y) כנגד ריכוז ADP היחסי (ציר X). קבע את מהירות הנשימה המרבית (Vmax) כקצב השיא שהושג מעל טיטציה ADP. קבע את הקינטיקה מיכאליס-מנטן באמצעות תוכנת התאמת עקומה (PRISM, גרסה 10.1) כדי לחשוף את ריכוז ADP שבו 1/2 VMAX מושגת (לכאורה KM). 9. בקרת איכות אינסטרומנטלית בצע רקע O2 אינסטרומנטלי על טווח ריכוז החמצן הרצוי (0-600 מיקרומטר) וכיול אפס. שלימו את שלבים 3.1 ו-3.2 הסר את פקקים ושאף את 70% אתנול מן התאים (הימנעות הממברנה חשופה בחלק הפנימי של התא). יש לשטוף 4 פעמים עם H2O מזוקק כפול, ולמלא את התא ב-2.25 מ”ל של MiR05 היפראוקסיגנט התאים ~ 600 מיקרומטר חמצן. הכנס את פקקים לאט למקומם הסגור לחלוטין. לשאוב את המדיום העודף נפלט דרך נימי ההזרקה ונאסף בבאר של פקק ולאפשר לאות החמצן להתייצב (30-45 דקות). כדי לבצע כיול חמצן, בחר את האזור שבו ריכוז החמצן והשיפוע יציבים, פתח את חלון הכיול עבור התא המתאים ובחר את סימן R1. הכן את הפתרון dithionite על ידי המסת 20 מ”ג של נתרן הידרוסולפיט ב 0.5 מ”ל של מים. להגביל את החשיפה לאוויר כמו dithionite הוא חמצון לאורך זמן עם חשיפה לחמצן. לאחר אות החמצן מיוצב, להזריק 1 μL ולבחון את הירידה בריכוז חמצן. התאימו את העוצמה של הפתרון הדיוני לפי הצורך. הזרקת פתרון מספיק dithionite כדי להוריד את ריכוז החמצן ל 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM, ו 0 μM, בהתאמה. בכל זריקה, אפשרו לחמצן להתייצב ובחרו סימן למדרון היציב. ברגע שריכוז החמצן הוא ~ 0 מיקרומטר, לסמן את ריכוז החמצן. כדי לבצע תיקון רקע אינסטרומנטלי O2, בחר את חלון השטף/שיפוע עבור התא המתאים, בחר O2 כיול רקעולחץ על כיול לסימני עניין. כדי לבצע כיול אפס, פתח את חלון הכיול עבור התא המתאים ובחר את סימן R0 שהושג לאחר טיטרציה dithionite. ניקוי מכשירים יש לשטוף במהירות כל תא במים טהורים שלוש פעמים. עבור לשטוף הראשון, לשאוף הומוגני, למלא את החדר במלואו במים, ולאחר מכן לשאוף את המים. עבור לשטוף השני, למלא את התא 3/4 מלא מים, להכניס את פקקים לכפות מים דרך נימי ההזרקה, לשאוף חלק מהמים דרך נימי ההזרקה ולאחר מכן להסיר את פקקים לשאוף לשטוף באופן מלא. לשטוף את התאים עם 70% אתנול במשך 5 דקות. מעל כיור או, לנקות את פקקים עם מים טהורים, 70% אתנול, ו 100% אתנול, מכריח נוזל דרך נימי הזרקה באמצעות בקבוק לשטוף. יש לשטוף במהירות כל תא במים טהורים פעמיים. לדגור על התאים עם 2 מ”ל של PBS המכיל ~ 2 מ”ג של מיטוכונדריה קפואה, ליסאט תא, או פיברובלסטים חיים במשך 15 דקות. לשטוף את החדרים עם מים טהורים במשך 5 דקות פעמיים. לשטוף את התאים עם 70% אתנול במשך 5 דקות פעמיים. לשטוף את התאים עם 100% אתנול במשך 10 דקות. מלא את התאים עם 70% אתנול. אם ריצה ניסוי רצופה, להשאיר את התאים ב 70% אתנול במשך 5 דקות ולאחר מכן להמשיך שלב 3.3. אם הניסויים הושלמו, לשים מכסים על פקקים ולכבה את המכשיר. לאחר כל שימוש, לנקות כראוי את מזרקי הזרקה ולשמור את המזרקים ייעודי לשימוש מורכב ספציפי כדי למנוע נשיאה. הכנס את המזרק לתוך נוזל הכביסה ולהטביע באופן מלא את מחט ההזרקה. צייר את נוזל הכביסה לתוך המזרק לנפח המרבי. מוציאים את המזרק ממיכל הכביסה, מוציאים את נוזל הכביסה לתוך כף ואז מכתים את המזרק על מגבת נייר. חזור על שלבים 9.3.1-9.3.3 פעמים שלוש פעמים לאחר כל שימוש.

Representative Results

מחקרים ראשוניים גילו כי גידולי EO771 היו חמצוניים נמוכים ולכן נדרש ריכוזים הומוגניים גבוהים להערכת שטף O2 נאותה. ניסויי אופטימיזציה נערכו כדי לקבוע את טווח הריכוז הומוגני רקמות אופטימלי עבור המחקר. גידול הומוגנטים הוכנו בתחילה ב 40 מ”ג / מ”ל ולאחר מכן מדולל ליניארית. השטף O2 מנורמל מסת רקמה היה עקבי על פני ריכוזים (איורים 1A-D). נצפתה כי 40 מ”ג/מ”ל גרמו לדלדול חמצן מהיר ולא היו מתאימים לניסויים(איור 1A). צריכת החמצן הואטה באופן משמעותי עם 30 מ”ג/מ”ל ו-20 מ”ג/מ”ל, אך עדיין ירדה במהירות תוך זמן קצר בהיעדר מצעים או ADP (איור 1B,C). ריכוז 10 מ”ג/מ”ל הביא לקצב צריכת החמצן האופטימלי(איור 1D)שיתמוך בפרוטוקול SUIT ארוך יותר של 90 דקות. פרוטוקול SUIT שימש להערכת OXPHOS ו- ET הקשורים ל- NADH, כמו גם לפעילות CIV (איור 2A). Pyruvate ו malate נוספו לרקמה הומוגנית בהיעדר ADP לנהוג דליפה (L) באמצעות NADH. לאחר מכן נוספה ADP רוויה כדי להניע OXPHOS (P) מרבי הקשור ל-NADH, ואחריו תוספת של גלוטמט. ציטוכרום c נוסף אז כדי להבטיח שלמות הממברנה החיצונית; העלייה בשיעור הנשימה הייתה פחות מ-20% בכל הדגימות(איור 2B). בהתחשב בתגובה הנמוכה מאוד למצעים הקשורים ל-NADH, שחרור ציטוכרום c הוערך גם בנוכחות תמציתי ורוטנון ונצפה גירוי מינימלי של ציטכרום c (איור 2B). מעניין, OXPHOS הקשור NADH היה זניח בגידולים EO771(איור 2C). לאחר מכן נוספה תמציתי בנוכחות פירובט, מלאט וגלוטמט כדי לעורר את זרימת האלקטרונים דרך דהידרוגנאז תמציתי. לאחר מכן, FCCP זכה לתמיכת זרימת אלקטרונים מקסימלית (E), שגילתה כי בגידולי EO771, זרחן ולא חמצון מגביל לנשימה (איור 2C). רוטנון ואנטימיצין A היו לאחר מכן titrated לעכב מורכב I מורכב III, בהתאמה. אסקורבאט ו- TMPD נוספו אז כדי להניע זרימת אלקטרונים מקסימלית דרך CIV, אשר מעוכבת לאחר מכן על ידי נתרן אזיד. טבלה 1 מדגימה משוואות הפחתה אנליטיות של הנתונים הגולמיים (טבלה 2) כדי לכמות את הפרמטרים הנשימתיים המותווים באיור 2C. בסך הכל, פרופילי הנשימה ההומוגניים של הגידול (איור 2C) דומים לאלה של תאי EO771 שאינם מושתלים – מחלחלים לדיג’נין (איור 2D) למעט העברת אלקטרונים מקסימלית מופחתת הנתמכת על ידי מצעים המקושרים ל- N ו- S בגידול. מאז הנשימה הקשורה NADH היה זניח, הקינטיקה הנשימתית של תמציתי הוערכו עוד יותר על ידי titrations צעדים של ADP תת רווי עד השיעור המקסימלי (VMAX)הושג (איור 3A,3B). הריכוז החצי מקסימלי (KM)של ADP בנוכחות תמציתי + רוטנון היה 37.5 מיקרומטר, ואילו VMAX היה ~ 10.5 pmol / s / mg (איור 3C). לכן, למרות שיעורי חמצון ירודים יחסית, גידולי EO771 היו רגישים מאוד ADP וסינתזת ATP מתמשכת בריכוזים ADP נמוכים יחסית. בחירת אזורים מתאימים של הנתונים הגולמיים לחילוץ היא קריטית לשחזור ניסויים וכימות מדויק. עבור ציטוכרום c,יש לבחור סימן במצב היציב מיד לפני ההזרקה(איור 4A, סימן 1). לעתים קרובות יש חפץ הזרקה ראשונית שניתן לעקוב אחר פרק זמן (כ 5-10 דקות) שבו השטף O2 אינו יציב. הערכה של יעילות cytochrome c נעשית על ידי ביצוע בחירה נוספת לאחר שטף O2 התייצב (איור 4A, סימן 2). בחירות לאחר הוספת מצעים, ADP, או רוב המעכבים נעשות גם לאחר חפץ ההזרקה וברגע שטף O2 התייצב (איור 4B). הבחירה המשמשת לקביעת נשימה מקסימלית לא מרוסנת נעשית בשיא העלייה שהושגה במהלך טיטורציה של FCCP, שהיא לעתים קרובות לא הזריקה האחרונה שנעשתה (איור 4C). הבחירה עבור TMPD נעשית לאחר הוספת אסקורבאט ו- TMPD ובשיא העלייה בנשימה (איור 4D, סימן 1). רק לאחר שיא זה, המעכב, נתרן אזיד, מתווסף, אשר מקטין במהירות את הנשימה אבל גם לעתים קרובות יש חפץ הזרקה נמוך יותר מאשר שיעור הנשימה המעכבת (איור 4D). סימן המדכא נעשה מיד לאחר חפץ ההזרקה(איור 4D, סימן 2). שטף O2 בדרך כלל לא יתייצב וימשיך לרדת. טבלה 1: תיוון נשימתי וגזרה אנליטית. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 2: מאפיינים מדגמיים ונשימה של גידול ממארי B זוהר הומוגנטים. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. איור 1: אופטימיזציה של ריכוז הומוגניאט גידול. O2 שטף (אדום) ו O2 ריכוז (כחול) הומוגנטים גידול mammary מוכן ב (A) 40 מ”ג / מ”ל, (B) 30 מ”ג / מ”ל, (C) 20 מ”ג / מ”ל, ו (D) 10 מ”ג / מ”ל. תום: נשימה הומוגנית של רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: הערכת OXPHOS וקיבולת ET על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה בהומוגנטים של גידולים שנקטעו זה עתה. (A)חלקה מייצגת של צריכת חמצן (אדום) וריכוזים (כחול) במהלך פרוטוקול מצע, מעכב, לא משתף פעולה. PM: Pyruvate + Malate, D: ADP, G: גלוטמט, c: ציטכרום c, S: תמציתי, F: FCCP, רוט: רוטנון, אמא: אנטימיצין A, Asc / TMPD: אסקורבט / טטראמתיל-p-פנילנדיאמין. (B)עלייה באחוזים בשטף O2 עם תוספת של ציטוכרום c. (C-D) נשימה הנתמכת על ידי מלאט, פירובט, גלוטמט ותמצית בנוכחות ADP, FCCP, ו ascorbate / TMPD ב (C) הומוגנטים גידול שמקורם EO771 ו -( D)תאים שאינם מושתלים EO771 דיגיטונין permeabilized. טום: נשימה הומוגנית של רקמות; PM: פירובט + מלאט; PMG: פירובט + מלאט + גלוטמט; PMGS: פירובט + מלאט + גלוטמט + תמציתי; אזרחי: מורכב 4; -L: מצב דליפה; -P: מצב זרחן חמצוני, -E: מצב העברת אלקטרונים; N מקושר: O2 שטף נתמך על ידי שילובי מצע מוגדרים NADH יצירת; NS מקושר: O2 שטף נתמך על ידי התכנסות של שילובי מצע מוגדרים NADH ליצור תמציתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: גידולי EO771 ממכר הציגו רגישות גבוהה ל-ADP (אדנוסין 5′-דיפוספט). (A)חלקה מייצגת של צריכת חמצן (אדום) וריכוזים (כחולים) לאורך פרוטוקול טיטריון ADP מקושר S. טום: נשימה הומוגנית של רקמות; ש/רוט: תמציתי/רוטנון; ד: א.ד. (B)נשימה הנתמכת על ידי תמציתי בנוכחות רוטנון וריכוזים גוברים של ADP (0 μM ADP = S / Rot-L). (C)שיעור מקסימלי (VMAX)וריכוז חצי מקסימלי (KM)של ADP בנוכחות תמציתי + רוטנון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: מעקב ייצוגי הממחיש את בחירת הסימנים של שטפי O2 גולמיים להפקת נתונים. (A)בחירת Cytochrome c: בחירה מספר 1 לפני הזרקת Cytochrome c ובחירה מספר 2 לאחר ההזרקה כאשר שטף O2 התייצב. c ציטכרום ג. (B)מצע, ADP, ובחירת מעכב: בחירה מספר 1 לאחר הזריקה (תמציתי בעלילה מייצגת זו) שבו שטף O2 התייצב. ס:תמציתי. (C)בחירת ביטול קירור: בחירה מספר 1 בשיא העלייה בנשימה במהלך titration uncoupler. בעלילת טיטריון FCCP מייצגת זו, הזריקה השלישית מקטינה מעט את הנשימה ולכן אינה משמשת לבחירה. פ: ACCP. (D)בחירת TMPD: בחירה מספר 1 בשיא העלייה של הנשימה לאחר זריקות אסקורבאט ו- TMPD. בחירת נתרן אזיד: בחירה מספר 2 לאחר חפץ הזרקה חריפה כאשר הנשימה בתחילה פוחתת. As/Tm: אסקורבאט/TMPD; אזיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

גישות להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בסרטן הוגבלו במידה רבה למודלים במבחנה ^13,14,15,16. הצלחה מסוימת הושגה במדידת נשימה מיטוכונדריאלית בגידולים באמצעות פרמביליזציה כימית^6,7,17, אבל אין גישה אחידה, תקן זהב שניתן ליישם באופן אוניברסלי ולהשוות בין סוגי גידולים. בנוסף, היעדר ניתוח נתונים עקביים ודיווח מוגבלים על יכולת ההכללה והשחזור של הנתונים. השיטה המתוארת כאן מספקת גישה פשוטה ומהירה יחסית למדידת נשימה מיטוכונדריאלית¹⁸ בתכשירים מיטוכונדריאליים מדגימות גידול מוצקות טריות. גידולים גדלו ממורין לומינאל B מושתל אורתוטופית, ERα שלילי EO771 תאי סרטן המאמרי¹⁹.

חריצות וטיפול ברקמות ישפרו מאוד את הדיוק והנורמליזציה של שיעורי צריכת החמצן. הרקמה והמיטוכונדריה עלולות להיפגע בקלות אם המדגם אינו נשמר קר, אינו שקוע בעקביות באמצעי השימור, או מטופל יתר על המידה, וכתוצאה מכך שגרה תת-אופטימלית ושיעורי OXPHOS. בנוסף, משקל רטוב מדויק של הרקמה הומוגנית הוא בעל חשיבות קריטית שכן זוהי שיטת הנורמליזציה העיקרית. שיטות נורמליזציה אחרות עשויות להיחשב, כגון סך חלבון או סמנים ספציפיים מיטוכונדריאליים, כגון פעילות סינתאז^{ציטוט 20}. בנוסף, הטרוגניות רקמות יהיה צורך לטפל, עם החלטות על אזורי הגידול לכלול בניסויים שנעשו מראש. רקמת נמק, פיברוטית וחיבור לא יכולה להומוגני ו/או להנשים היטב ויש להימנע ממנה אלא אם כן היא מנסחת בכוונה את אזורי הגידול האלה. ראוי לציין, הגידול עשוי להיות דביק מאוד בהתאם לסוג ואת אזור כריתה, מה שהופך את השקילה המדויקת ולהעביר מאתגר יותר. מספר השבץ המשמש הומוגניזציה צריך להיות מותאם כדי להבטיח הכנה מלאה של המיטוכונדריה תוך צמצום נזק לממברנות המיטוכונדריאלי החיצוני.

לשיפור הדיוק וההתרבות, אנו ממליצים לבצע ניסויי אופטימיזציה עבור מספר השבץ להכנת הומוגניות, ריכוז רקמות, ומצע, uncoupler, ריכוז מעכב. מחקרים יכולים להשוות את המספר השונה של שבץ וכיצד הם תואמים את התגובה לתוספת של ציטוכרום c בתוך המחקר, כמו גם את יכולת הנשימה המיטוכונדריאלית המקסימלית ²¹. למרות שיש קבלה כללית כי פחות תגובה cytochrome c הוא טוב יותר, כמו עלייה בצריכת חמצן לאחר תוספת של cytochrome c יכול להצביע על נזק לממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית, אין תקן זהב לגבי מה סף זה הוא עבור כל רקמה ויש לחקור באופן ניסיוני כדי להבטיח את הרקמה לא להיות overworked או לא מוכן. ברקמת הגידול הזו, נמצא כי תגובת ציטוכרום c מתחת ל- ~ 30% לא פגעה בתפקוד הנשימה. השימוש בציטוכרום c הופך לקריטי לכימות מדויק של יכולת הנשימה אם הבדיקה חיובית. במקרה זה, התוספת מחדשת את הציטוכרום האנדיגני c, אשר, אם מרוקן, יגרום לזלזל בשיעורי הנשימה.

ניסויי טיטריון ריכוז רקמות יכולים להתבצע על פני מגוון של ריכוזים אפשריים, באופן אידיאלי, ייעשה עם SUITs כי ייחקר במהלך המחקר. קיבולת הנשימה תשתנה בהתאם לסוג הגידול והרכבו. לכן, גידולים צפופים עם מיטוכונדריה או יכולת נשימה גבוהה ידרשו ריכוזים נמוכים יותר (0.5-5 מ”ג /מ”ל). גידולים עם מעט מיטוכונדריה או קיבולת נמוכה של הנשימה ידרשו ריכוזים גבוהים יותר (7-12 מ”ג/מ”ל). בנוסף, SUITs ארוכים או שיש להם מצעים נצרכים מאוד עשויים להזדקק לפחות רקמה כדי למנוע reoxygenation של התא או מגבלת ADP. לרקמות מסוימות יהיה קשר ליניארי בצריכת חמצן, בעוד שאחרות יראו רגישות משופרת וחמצון מקסימלי בטווחי ריכוז מסוימים. ריכוז הרקמה שנבחר צריך להיות מותאם כדי למקסם את שטף החמצן תוך הגבלת מספר אירועי reoxygenation. בנוסף, לעתים קרובות עדיף למעלה להיפטר מהצורך או לשאוף לקצה הגבוה יותר של טווח הריכוז. המעכבים, החיוניים לכמות של שטפי נשימה, מדויקים יותר כאשר משתמשים בהם בבריכות גדולות יותר של המיטוכונדריה.

שיקול חיוני נוסף הוא ריכוז התרופות המשמשות במהלך הפרוטוקולים. שינויים בריכוז הומוגני עשויים לשנות את הריכוזים של מצעים, uncouplers, ומעכבים הנדרשים לתגובה מקסימלית. לכן, לאחר בחירת טווח הריכוז האופטימלי, ניסוי הבודק את המינונים הנדרשים לפרוטוקול SUIT צריך להתבצע. ניתן להוסיף ADP נוסף כדי להבטיח שריכוזים אדנילט אינם מגבילים שטפי נשימה. כימיקלים unouplers כגון FCCP או CCCP יעכב נשימה בריכוזים גבוהים יותר²². ככזה, זה חיוני כדי titrate בכמויות קטנות כדי לחשוף את השיעור המרבי שהושג. מעכבים, כגון רוטנון ואנטימיצין A, משמשים בצורה הטובה ביותר כאשר הם רוויים בתוך הזריקה הראשונה. בעוד ריכוזים אופטימליים נקבעו בניסויים ראשוניים, ראינו גם הבדלים הקשורים לטיפול בתגובה מעכבים ולכן לעתים קרובות להוסיף זריקה אחת נוספת של מעכבים כדי להפגין עיכוב מקסימלי כמו שיעורי התוצאה לשמש כבסיס לכימות. עיכוב כימי של אסקורבאט/TPMD חיוני להפחתה אנליטית מדויקת מכיוון ש- TMPD עובר אוטוקסידציה²³. שלטנו על חמצון אוטומטי של אסקורבט / TMPD / cytochrome c באמצעות תוספת של נתרן אזיד, מעכב אזרחי מבוסס. עבור מחקרי ק”מ, תוספת של רוטנון בנוכחות תמציתי לבד מונע הצטברות oxaloacetate אשר יכול לעכב פעילות דהידרוגנאז תמציתי בריכוזים נמוכים²⁴. הנפח והריכוז של ADP תלויים מאוד ברגישות המיטוכונדריה לשילוב המצע השורר. תכשירים מיטוכונדריאליים רגישים מאוד ADP ידרשו ריכוזי התחלה נמוכים יותר. בנוסף, כימיקלים מאומתים והכנת תרופות נכונה עם תשומת לב ל- pH, רגישות לאור אם ישים, וטמפרטורת האחסון חיוניים לניסויים מוצלחים.

הגדרת מכשירים וטיפול שגרתי הם בעלי חשיבות קריטית להצלחת ניסויים אלה. ניקוי נאות ונכון של התאים חיוני להתרבות ומניעה של זיהום ביולוגי, חלבון, מעכב או לא משתף. אלקטרודות מסוג קלארק ומערכות O2k משתמשות בתאי תגובה מזכוכית המהווה יתרון עלות משמעותי למערכות מבוססות צלחת הנתמכות על חומרים מתכלים. עם זאת, תאי הזכוכית חייבים להיות מנוקים במרץ והוא יכול להיות מקור של זיהום מעכבות במחקרים הבאים. דגירה עם דגימות עשירות במיטוכונדריה במהלך תהליך הכביסה (מיטוכונדריה מבודדת של לב או כבד, למשל) יכולה להפחית את הסיכון לזיהום ניסיוני ומומלץ בנוסף להליכי דילול ושטיפה על בסיס אלכוהול. אם מחקרים רצופים מנוהלים, ניקוי עם אתנול ומיטוכונדריה ממזער את האפשרות של זיהום מעכבות. כיול חיישן החמצן מומלץ לפני כל ניסוי כדי לקבל מדידות מדויקות של נשימה ביחס ללחץ החלקי השורר של חמצן. אם כיולים מרובים אינם אפשריים, כיול אחד ביום עשוי להספיק אם ריכוז החמצן נשאר יציב ועקבי לאחר הליך הכביסה.

ההליכים המתוארים לעיל ממנפים את מכשיר Oroboros O2k למדידת צריכת חמצן ברקמת הגידול תוך 4 שעות של כריתת גידול באמצעות פתרון שימור תוכנן בעבר ואופטימיזציה ומדיית^{נשימה 25,26,27}. ניתן לשנות פרמטרים מרובים בפרוטוקול זה עבור יישומים הבאים. ההתקנה וכיול המכשיר, homogenizers המשמש להכנת רקמות, וריכוז הומוגני אופטימלי חמצן התא ניתן להתאים את כולם לשימוש על מכשירים אחרים עם פוטנציאל ניטור חמצן. לדוגמה, התאים היו מעט מלאים יתר על המידה בעת הוספת הומוגני, ולכן כאשר התא סגור לחלוטין, נימי החדר נשאר מלא. זה יצרך קצת חמצן בחדר, אבל עם אופטימיזציה של ריכוז מדגם, אנחנו יכולים להסביר את הצריכה הזאת בקביעת מה רמת החמצן להתחיל עם. לחלופין, ניתן לאפשר לדגימה להתוות בחמצן סביבתי לפני סגירת התא, אך לעתים קרובות זה יגדיל את משך הזמן לפני תחילת הניסוי ויעכב את הוספת המצעים. בעוד homogenizers בשימוש בפרוטוקול זה נגישים באופן נרחב, טכניקות הומוגניזציה מסחרית אחרות ניתן להשתמש, כגון מגרסת רקמות או homogenizer אוטומטי²⁸.

בנוסף, הכנת הרקמות ואת הליכי המכשיר ניתן להשתמש עם מספר SUITs שונים כדי ללמוד שליטה נשימתית על ידי מגוון של צימוד ובקרת מסלולים קובע²⁹. פרוטוקולי SUIT אלה פותחו כדי למדוד יכולת תפקודית, ולכן, לתרומה של מצעים אנדוגניים פוטנציאליים אין השפעה על מדידת הקיבולת. אנו מבחינה אנליטית להסביר צריכת חמצן שאינם מיטוכונדריאליים ו /או צריכה שיורית של הומוגנט באמצעות חיסור של אנטיצין A-רוטנון, או נתרן אזיד שיעורי רגישות, לפי הצורך. המיטוכונדריה יכולה להישאר בת קיימא ב- BIOPS או פתרונות שימור שנבנו באופן דומה לתקופות זמן ממושכות (>24 שעות) בהתאם לסוג הרקמה ושלמות^30,31. מחקרים יכולים להתבצע מראש כדי לקבוע את מגבלות האחסון הזמני כמו OXPHOS של מצעים מסוימים עשויים להיות מגבלות שונות. זה חיוני אם הניסוי לא יכול להתבצע בתוך כמה שעות של כריתת רקמות / ביופסיה. 37°C היא טמפרטורה אופטימלית ופיזיולוגית להערכת תפקוד הנשימה ברוב מערכות היונקים. עם זאת, אם נראה שטמפרטורת ההסתה מפריעה להערכה³², מחקרים השוואתיים עשויים להתבצע על פני טווח טמפרטורות רחב (25-40 מעלות צלזיוס) כדי להבטיח היענות נאותה. אילוצים אינסטרומנטליים עשויים להגביל את היכולת לנהל מחקרים כאלה.

המגבלות העיקריות של השיטה המתוארת לעיל הן 1) הפוטנציאל לפגיעה במיטוכונדריה באמצעות הומוגניזציה מכנית, 2) נוכחות של ATPases או ביוכימיקלים תת-תאיים אחרים בתכשירים הומוגניים שיכולים להפריע לקביעה סימולטנית של ATP או משתנים אחרים של עניין ועשויים לדרוש שיטות תיקון נוספות או שימוש במעכב³³ ו-3) הערכה של דגימות רבות ו/או SUITs מרובים לכל מדגם גוזלת זמן רב מכיוון שמכשיר אחד יכול להכיל שני ניסויים בכל פעם ודורש ניקוי והגדרת ניסויים רצופים., ניסויי אופטימיזציה והכנה עקבית של דגימות יכולים למזער נזק מיטוכונדריאלי משמעותי שיתרום לנתונים לא עקביים.

המשמעות של השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות היא היתכנות משופרת בהשוואה לכמות החומר ההתחלתי, אתגר בידוד המיטוכונדריה, או אתגר טכני ברקמות מחלחלות. הכנת הומוגנטים מהירה יותר, חמצן אינו מגביל כמעט, והוא פחות רגיש לשונות בין כוח אדם לעומת רקמה מחלחלת. חשוב לציין, כמעט כל סוגי המדגם מתאימים להכנה הומוגנית המאפשרת ניתוח השוואתי על פני רקמות. ספירומטריה ברזולוציה גבוהה היא המדידה בתקן הזהב של OXPHOS מיטוכונדריאלי ו- ET. היישום של שיטה זו במחקר סרטן פרה קליני וקליני יש את היכולת להרחיב את חקירות במבחנה הנוכחית מחקרים ex vivo. יתר על כן, הוא מציע יישומים פוטנציאליים בהגדרות קליניות ואבחון.

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383
Amphotericin B	Gibco	15290018
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free	Sigma-Aldrich	3117057001	Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe	Fisher Scientific	13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles	Fisher Scientific	23-021-020
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C2506
Datlab 7.4 software	Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide	Amresco	N182
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
D-Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30	Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in	World Precision Instruments	501601
EO771 cells	CH3 BioSystems	SKU: 94APV1-vial-prem	Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock #000664
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750
Kimwipes	Fisher Scientific	34120
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	G1626
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	L2398
Malate	Sigma-Aldrich	M6413
Matrigel Matrix	Corning	354248
MgCl·6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
Microsyringes	Hamilton	87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma-Aldrich	T7394
Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer	Oroboros Instruments	10003-01
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
RPMI 1640	Gibco	21875034
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Succinate (disodium)	Sigma-Aldrich	W327700
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Whatman Filter Paper, grade 5	Sigma-Aldrich	1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL	Duran Wheaton Kimble	357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11	McKesson	1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2	Becton, Dickinson and Company	305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1	Becton, Dickinson and Company	305195
BD 1mL Slip Tip Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm	Thermo Fisher Scientific	316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate	Research Diet	D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm	Thermo Fisher Scientific	S34819