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Summary

Abbiamo sviluppato un protocollo pratico e un approccio analitico per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la capacità di trasferimento di elettroni negli omogeneizzati tumorali freschi. Questo protocollo può essere facilmente adattato per esaminare varie funzioni mitocondriali che contribuiscono all’inizio, alla progressione e alla risposta al trattamento del cancro.

Abstract

I mitocondri sono essenziali per l’insorgenza e la progressione del cancro attraverso la produzione di energia, la regolazione delle specie reattive dell’ossigeno e la sintesi delle macromolecole. Gli adattamenti genetici e funzionali dei mitocondri all’ambiente tumorale guidano il potenziale proliferativo e metastatico. L’avvento del sequenziamento del DNA e dell’RNA ha rimosso le barriere critiche alla valutazione dei mediatori genetici della tumorigenesi. Tuttavia, ad oggi, gli approcci metodologici per valutare la funzione mitocondriale tumorale rimangono elusivi e richiedono competenze tecniche che limitano la fattibilità, diminuendo in definitiva il valore diagnostico e prognostico sia in ambito sperimentale che clinico. Qui, delineiamo un metodo semplice e rapido per quantificare i tassi di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e la capacità di trasferimento di elettroni (ET) negli omogeneizzati tumorali solidi appena asportati utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. Il protocollo può essere applicato in modo riproducibile tra specie e tipi di tumore, nonché adattato per valutare una diversità di percorsi ET mitocondriali. Usando questo protocollo, dimostriamo che i topi portatori di un cancro mammario B luminale presentano una respirazione difettosa legata alla nicotinamide adenina dinucleotide e si affidano al succinato per generare adenosina trifosfato tramite OXPHOS.

Introduction

Tutte le cellule sono intimamente legate dalla loro necessità di produrre e consumare adenosina trifosfato (ATP), la valuta dell’energia molecolare. Poiché le mutazioni cellulari danno origine alla formazione di tumori, i mitocondri assicurano la sopravvivenza attraverso la diversificazione della produzione di energia che è spesso fenotipicamente distinguibile dal tessuto non canceroso^1,2,3. Pertanto, vi è un bisogno critico di profilazione rapida e profonda della funzione respiratoria mitocondriale al fine di facilitare la classificazione del tipo di tumore, l’inizio del cancro, la progressione e la risposta al trattamento.

Le funzioni respiratorie dei campioni di tessuto asportato non possono essere valutate intatte in quanto i substrati primari per OXPHOS non sono permeabili alle cellule. Per superare questa limitazione, i mitocondri possono essere preparati mediante isolamento, permeabilizzazione chimica o omogeneizzazione meccanica. L’isolamento mitocondriale è a lungo considerato un gold standard per la valutazione della funzione respiratoria. Tuttavia, richiede grandi quantità di tessuto, richiede molto tempo ed è a basso rendimento con possibili bias di selezione per alcune frazioni di mitocondri⁴. La permeabilizzazione consiste nella separazione meccanica e nell’esposizione di sezioni di tessuto o fasci di fibre a un detergente delicato che degrada selettivamente la membrana^{plasmatica 5}. La permeabilizzazione è spesso impiegata nei tessuti striati come il muscolo scheletrico e cardiaco poiché i singoli fasci di fibre possono essere presi in giro. Rispetto all’isolamento, la permeabilizzazione produce più mitocondri nel loro ambiente cellulare nativo e forma fisica⁵. La permeabilizzazione è stata applicata con successo in altri tessuti come il tumore^6,7 e la placenta^8; tuttavia, la riproducibilità dei preparati di fibre permeabilizzate può essere difficile a causa della consistenza della dissezione e dei requisiti di ossigeno per superare i limiti di diffusione⁹. Inoltre, le fibre permeabilizzate possono essere inadatte in alcuni tipi di tumore che sono densamente cellulari e altamente fibrotici. Gli omogeneizzati tissutali sono generati attraverso la distruzione meccanica della membrana plasmatica e sono simili alle fibre permeabilizzate in termini di resa e integrità mitocondriale¹⁰. Gli omogeneizzati tissutali minimizzano anche i limiti della diffusione dell’ossigeno e possono essere facilmente impiegati tra i tipi di tessuto attraverso l’ottimizzazione della forza meccanica^11,12.

Qui, delineiamo un metodo semplice e rapido per quantificare i tassi di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e la capacità di trasferimento di elettroni (ET) negli omogeneizzati tumorali solidi appena asportati. Il protocollo è progettato in modo ottimale per valutare il tessuto fresco utilizzando il respirometro ad alta risoluzione Oxygraph-2k (O2k), che richiede una conoscenza preliminare della configurazione e della calibrazione strumentale, ma può essere adattato in modo simile utilizzando qualsiasi elettrodo di tipo Clark, analizzatore Seahorse o lettore di piastre. Il protocollo può essere applicato in modo riproducibile tra specie e tipi di tumore, nonché adattato per valutare una diversità di percorsi ET mitocondriali.

Protocol

Tutti gli esperimenti e le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Preparazione del reagente. Preparare mezzi di crescita cellulare EO771 con 10 mM HEPES, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina-streptomicina (100 U / mL) e 0,2% amfotericina B. Preparare 1 L di soluzione di conservazione della biopsia (BIOPS) in un becher di vetro da 1000 ml. Aggiungere 3.180 g di Na2ATP (5.77 mM concentrazione finale). Aggiungere 1,334 g di MgCL2·6H2O (concentrazione finale di 6,56 mM). Aggiungere 2.502 g di Taurina (20 mM di concentrazione finale). Aggiungere 3,827 g di Na2Fosfocreatina (15 mM di concentrazione finale). Aggiungere 1.362 g di Imidazolo (20 mM di concentrazione finale). Aggiungere 0,077 g di ditiotreitolo (concentrazione finale di 0,5 mM). Aggiungere 9,76 g di idrato MES (50 mM di concentrazione finale). Aggiungere 800 mL di H2O e mescolare i costituenti utilizzando un agitatore magnetico a 30 °C. Aggiungere 72,3 mL di 100 mM K2EGTA (7,23 mM di concentrazione finale). Sciogliere 7,608 g di EGTA e 2,3 g di KOH in 100 mL di H2O. Regolare il pH a 7,0 con 5 M KOH e portare il volume fino a 200 mL con H2O. Aggiungere 27,7 mL di 100 mM CaK2EGTA (2,77 mM di concentrazione finale). Sciogliere 7,608 g di EGTA in 200 mL di H2O e riscaldare a 80 °C (concentrazione finale di 100 mM). Sciogliere 2.002 g di CaCO3 in 200 mL di soluzione EGTA calda da 100 mM. Mescolando continuamente, aggiungere 2,3 g di KOH e regolare il pH a 7,0. Regolare il pH a 6,75 a 23 °C (pH 7,1 a 0 °C) con 5 M KOH. Portare il volume fino a 980 mL con H2O e mescolare la soluzione. Controllare nuovamente il pH, regolare se necessario e portare il volume finale a 1000 ml con acqua. Aliquota BIOPS in tubi conici (15 mL o 50 mL) e conservare a -20 °C fino all’uso. Scongelare solo una volta, appena prima dell’uso. Preparare 1 L di mezzo respiratorio mitocondriale (MiR05) in un becher di vetro da 1000 ml. Aggiungere 0,190 g di EGTA (0,5 mM di concentrazione finale). Aggiungere 0,610 g di MgCL2·6H2O (concentrazione finale di 3 mM). Aggiungere 2.502 g di Taurina (20 mM di concentrazione finale). Aggiungere 1.361 g di KH2PO4 (concentrazione finale di 10 mM). Aggiungere 4,77 g di HEPES (20 mM di concentrazione finale). Aggiungere 37,65 g di D-Saccarosio (110 mM di concentrazione finale). Aggiungere 800 mL di H2O e mescolare i costituenti utilizzando un agitatore magnetico a 30 °C. Aggiungere 120 mL di acido lattobionico 0,5 M (concentrazione finale di 60 mM). Sciogliere 35,83 g di acido lattobionico in 100 ml di H2O. Regolare il pH a 7,0 con 5 M KOH e portare il volume fino a 200 mL con H2O. Mescolare la soluzione e regolare il pH a 7,1 con 5 M KOH. Pesare 1 g di BSA, essenzialmente privo di acidi grassi (concentrazione finale di 1 g/L), in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 40 mL della soluzione di pH 7,1 dal passaggio 9 al tubo, invertire delicatamente per mescolare ed evitare la formazione di schiuma. Trasferire il BSA disciolto nella soluzione di pH 7.1 rimanente dal passaggio 9 e mescolare delicatamente e continuamente. Controllare nuovamente il pH, regolare se necessario e portare il volume finale fino a 1000 ml con H2O. Aliquotare il mezzo MiR05 in tubi conici da 50 mL e conservare a -20 °C fino all’uso. Scongelare solo una volta, appena prima dell’uso. Preparare substrati, disaccoppiatori e inibitori. Preparare 0,8 M di malato: sciogliere 536,4 mg di acido L-malico in 4 mL di H2O. Neutralizzare con 5 M KOH a pH 7 e portare il volume fino a 5 mL con H2O. Dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 1 M di piruvato: Sciogliere 550 mg di sale sodico dell’acido piruvico in 4 mL di H2O. Neutralizzare con 5 M KOH a pH 7 e portare il volume fino a 5 mL con H2O. Dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 0,5 M ADP (adenosina 5′-difosfato): Sciogliere 1,068 g di sale sodico ADP in 4 mL di H2O. Neutralizzare con 5 M KOH a pH 7 e portare il volume fino a 5 mL con H2O. Dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 2 M di glutammato: Sciogliere 3,7426 g di acido L-glutammico monoidrato in 8 mL di H2O. Neutralizzare con 5 M KOH a pH 7 e portare il volume fino a 10 mL con H2O. Dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 4 mM Citocromo c: Sciogliere 50 mg di Citocromo c in 1 mL di H2O. Dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 1 M di succinato: sciogliere 2,701 g di sale succinato disodico esaidrato in 8 ml di H2O. Neutralizzare con 1 N HCl a pH 7 e portare il volume fino a 10 ml con H2O. Dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 1 mM FCCP (carbonile cianuro-4-(trifluorometossidi)fenilidrazone): sciogliere 2,54 mg di FCCP in 10 ml di etanolo puro. Dividere in aliquote e poi conservare a -20 °C. Preparare Rotenone da 150 μM: Sciogliere 3,94 mg di Rotenone in 10 ml di etanolo puro per preparare 1 mM di brodo, vortice fino a completa dissoluzione. Diluire 225 μL di 1 mM di concentrazione di rotenone con 1,275 mL di etanolo puro per produrre 1,5 ml di Rotenone da 150 μM. Proteggere dalla luce, dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 125 μM di Antimicina A: Sciogliere 11 mg di Antimicina A in 4 mL di etanolo puro per preparare 5 mM di concentrazione di riserva di Antimicina A. Diluire 25 μL di 5 mM di Concentrazione di antimicina A con 975 μL di etanolo puro per ottenere 1 mL di 0,125 mM Antimicina A. Dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 0,8 M di ascorbato: sciogliere 1,584 g di sale sodico di ascorbato in 8 mL di H2O. Regolare il pH con acido ascorbico a pH 6 e portare il volume fino a 10 ml con H2O. Proteggere dalla luce, dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 0,2 M TMPD (tetrametil-p-fenilendiammina): Sciogliere 32,85 mg di TMPD in 987,5 μL di DMSO. Aggiungere 12,5 μL di 0,8 M di ascorbato (10 mM di concentrazione finale di ascorbato). Proteggere dalla luce, dividere in aliquote e quindi conservare a -20 °C. Preparare 4 M Sodio azide: Sciogliere 2,6 g di Sodio Azide in 10 ml di H2O. Dividere in aliquote e conservare a -20 °C. 2. Crescita del tumore Coltivare celle EO771 in mezzi di crescita RPMI 1640 e mantenere le celle in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. Topi C57BL/6J femmina di quattro settimane a casa singola, li mantengono a 21-22 °C su un ciclo di luce: buio di 12 ore. Fornire ai topi ad libitum l’accesso al cibo e all’acqua. Una volta che i topi raggiungono le 10 settimane di età, preparare le cellule e i topi per l’impianto di cellule tumorali. Tripsinizzare le cellule, disattivare la tripsina con mezzi di crescita e centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere e combinare i pellet di cella (se necessario) nel mezzo. Contare le cellule vitali usando il tripano blu e preparare una diluizione cellulare di 1 x10 6 celle in un volume totale di 60 μL con una soluzione 1:1:1 Media/Basement Membrane Matrix/PBS. Una volta aggiunta la matrice della membrana basale, mescolare bene e mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio. Riempire le siringhe con 60 μL di sospensione cellulare e metterle sul ghiaccio. Lavorare in modo efficiente e iniettare cellule nei topi entro 1,5 ore dalla preparazione. Anestetizzare i topi per inalazione di isoflurano (3%-5% per induzione e 1%-3% per mantenimento). Rasarsi tra la4a e la5a ghiandola mammaria inguinale destra. Iniettare ortotopicamente i topi anestetizzati con la sospensione cellulare EO771. Utilizzare pinze elettroniche per monitorare e misurare la crescita del tumore due volte a settimana per 4 settimane. All’autopsia, asportare, pesare e quindi posizionare immediatamente il tumore (o un minimo di 60 mg di sezione tumorale) in 10 ml di BIOPS ghiacciato. Tenere il tubo sul ghiaccio bagnato. 3. Configurazione e calibrazione dello strumento Riscaldare il mezzo MiR05 a bagnomaria a 37 °C. Accendi il sistema Oroboros O2k, apri il software DATLAB, inserisci o seleziona Utente. Fare clic su Connetti a O2k. Controllare la configurazione O2k e assicurarsi che lo strumento corretto sia etichettato per Power-O2k e che ogni camera corrisponda al sensore di ossigeno corretto; fare clic su OK. Una volta aperta la finestra di controllo O2k, nella scheda Sistemi, impostare la temperatura di blocco a 37 °C, la velocità dell’agitatore a 750 rpm per entrambe le camere, ND l’intervallo di registrazione dei dati a 2,0 s. Controllare sia l’alimentazione dell’agitatore che l’illuminazione nelle scatole della camera. Nella scheda Ossigeno, O2, impostare il guadagno per sensore su 1 V/μA (potrebbe essere necessario regolare il guadagno per i modelli di strumenti precedenti), la tensione di polarizzazione su 800 mV, quindi fare clic su Connetti a O2k. Una volta aperto un nuovo file dell’esperimento, assegna un nome al file e fai clic su Salva. Una volta che l’esperimento è attivo, si aprirà una finestra di selezione del protocollo; fare clic su Annulla per eseguire una titolazione personalizzata SUIT (Substrate uncoupler inhibitor). Dopo la selezione del protocollo, si aprirà una finestra di esempio per compilare il codice sperimentale, il tipo di campione, la coorte, il codice di esempio, il numero di campione e il numero di sottocampione, a seconda dei casi. Assegnare l’unità a mg e inserire la concentrazione di omogeneizzato tumorale per ml (la quantità per camera si auto-popola). Assicurarsi che il mezzo indicato sia MiR05 e che il volume della camera sia di 2,00 ml. Aggiungi i commenti necessari nella casella in basso e fai clic su OK. Rimuovere i tappi e aspirare l’etanolo al 70% dalle camere. Non aspirare mai vicino alla membrana esposta all’interno della camera. Risciacquare quattro volte con acqua pura e riempire la camera con 2,25 ml di MiR05. Test del sensore: Fare clic su F9 per spegnere gli agitatori per 30 s. Una volta riaccesa la barra dell’agitatore, assicurarsi che la pendenza O2 aumenti rapidamente in modo monoesponenziale in ogni camera. Se la camera non supera il test del sensore, controllare i collegamenti elettrici e pulire se i sali si sono accumulati; ripetere il test. Se il sensore continua a non superare il test, rimuovere il connettore del sensore di ossigeno polarografico (POS) per ispezionare la membrana. Se si osservano danni visibili alla membrana, ossidazione pesante o accumulo significativo di bolle, interrompere le procedure sperimentali e procedere alla manutenzione dello strumento. Calibrazione dell’ossigeno: eseguire la calibrazione dell’ossigeno per ottenere misurazioni accurate della respirazione. Con un movimento di torsione, inserire lentamente i tappi nella loro posizione calibrata sul volume. Sifonare il mezzo in eccesso espulso attraverso il capillare di iniezione che si raccoglie nel pozzetto del tappo. Con un movimento di torsione, sollevare i tappi quel tanto che basta per adattare saldamente l’utensile del distanziatore del tappo lasciando un volume di gas al di sopra della fase liquida per l’equilibrio finale dell’aria (30-45 min.). Utilizzare lo stato stazionario raggiunto in questo periodo per calibrare il sensore di ossigeno per ottenere misurazioni accurate della respirazione. La pendenza O2 neg. (pendenza negativa dell’ossigeno) è 0 ± 2 pmol/s·mL. Se il valore è superiore a 2 pmol/s·mL, pulire la camera e reintegrarla con MiR05 appena scongelato. Se la pendenza è instabile, procedere alla manutenzione dello strumento. Dopo aver raggiunto uno stato stazionario, selezionare la curva di concentrazione O2 ed evidenziare la regione costante della curva tenendo premuto il tasto Maiusc e facendo clic con il pulsante sinistro del mouse. Una volta selezionata la regione, fare clic su F5, selezionare il segno per la calibrazione dell’aria con la freccia a discesa e fare clic su Calibra e copia negli appunti. Calibrazione strumentale dello sfondo (opzionale) Dopo la calibrazione dell’aria, assicurarsi che non vi sia alcun volume di gas al di sopra della fase liquida per l’equilibrio di fondo del flusso (~ 15 min) e chiudere completamente le camere.NOTA: Il tasso di stato stazionario raggiunto in questo periodo rappresenta lo sfondo strumentale e può essere sottratto dai dati risultanti per una maggiore precisione analitica. La pendenza O2 neg. inizialmente aumenterà leggermente e si stabilizzerà tra ± 2 e 4 pmol/s·mL. Se il valore è elevato (>6 pmol/s·mL), esiste una potenziale contaminazione biologica. In questo caso, pulire la camera e reintegrarla con MiR05 appena scongelato. Una volta raggiunto uno stato stazionario, selezionate la curva neg. pendenza O2 ed evidenziate la regione costante della curva tenendo premuto il tasto Maiusc e facendo clic con il pulsante sinistro del mouse. Dopo aver selezionato la regione, fare clic su F5, selezionare la casella correzione baseline e il segno per Baseline con la freccia a discesa e fare clic su OK. 4. Preparazione dell’omogeneizzato tumorale Posizionare un omogeneizzatore di vetro contenente 1 mL di MiR05 e un pestello di vetro aderente sul ghiaccio bagnato. Al momento dello studio, posizionare il tessuto in 1 ml di BIOPS in una capsula di Petri ghiacciata. Pulire e sezionare il tessuto per massimizzare il materiale solubile, evitare le regioni necrotiche e rimuovere il tessuto tumorale marginale. Utilizzando un microscopio di dissezione, bisturi e pinzette chirurgiche, rimuovere eventuali capelli, tessuto necrotico, tessuto connettivo e vascolare periferico e grasso adiacente, a seconda dei casi. Fare attenzione a mantenere il tumore in BIOPS ghiacciato durante la dissezione. Tagliare il tumore in piccoli pezzi (~ 5-10 mg ciascuno) e rimettere i restanti pezzi tumorali in 10 ml di BIOPS tenuti sul ghiaccio. Utilizzare questo tessuto in seguito per ulteriori preparazioni, se necessario.NOTA: eseguire rapidamente i seguenti passaggi per ridurre al minimo la quantità di tempo in cui il campione non è completamente immerso in BIOPS. Una volta che il campione è stato inserito in MiR05, il tempo è essenziale. Spostare con attenzione l’omogeneizzato preparato nella camera calibrata il prima possibile. Asciugare accuratamente le sezioni di tessuto su una carta da filtro, posizionarle su una piccola barca di pesatura catramata di plastica e registrare il peso umido iniziale. Riposizionare i pezzi inutilizzati nel tubo conico da 10 ml di BIOPS per una conservazione continua. Immergere le sezioni di tessuto in un omogeneizzatore ghiacciato contenente MiR05 e registrare il peso rimanente sulla barca di pesatura, se applicabile. Utilizzando un pestello di vetro (intervallo di gioco 0,09-0,16 mm), interrompere delicatamente il tessuto tumorale completando 5-7 colpi verso il basso e verso l’alto. Per ogni colpo, ruota il pestello in senso orario 3 volte mentre spingi il pestello verso il basso e altre 3 volte mentre tiri indietro il pestello. Assicurati di lasciare che il tessuto si depositi sul fondo dell’omogeneizzatore tra una corsa e l’altra, ma evita di portare il pestello completamente al di sopra del volume del fluido per evitare la formazione di schiuma.NOTA: l’omogeneizzato risultante dovrebbe apparire torbido con residui minimi di tessuto solido. Versare l’omogeneizzato in un tubo conico da 15 ml e metterlo sul ghiaccio. Pipettare 1-3 ml di MiR05 fresco sopra il pestello e nell’omogeneizzatore per lavare l’omogeneizzatore tissutale rimanente. Versare il lavaggio MiR05 nel tubo conico contenente l’omogeneizzato. Ripetere il pestello e il lavaggio dell’omogeneizzatore 2-3 volte per garantire il trasferimento completo dell’omogeneizzato. Tenere presente la concentrazione target e il volume richiesto per non diluire eccessivamente il campione durante le fasi di lavaggio. Per calcolare con precisione la concentrazione di omogeneizzato tissutale, ispezionare attentamente l’omogeneizzatore e l’omogeneizzatore per il materiale non omogeneizzato rimanente (cioè il tessuto connettivo). Per rimuovere dall’omogeneizzatore il materiale non omogeneizzato che non può essere raggiunto con una pinzetta, aggiungere MiR05 all’omogeneizzatore, aspirare il volume (compreso il tessuto) con una pipetta e spostare il contenuto in una capsula di Petri. Per rimuovere il materiale non omogeneizzato dall’omogeneizzato (sistemato in pezzi di grandi dimensioni nella parte inferiore del tubo conico), aspirare i pezzi grandi con una pipetta e posizionarli sul cappuccio di tessuto del tubo conico. Rimuovere il tessuto dalla capsula di Petri o dal cappuccio del tubo conico con una pinzetta e tamponarlo su carta da filtro. Aggiungere l’omogeneizzato rimanente dal cappuccio del tubo conico nel tubo conico, tapparlo e quindi invertire per mescolare. Ispezionare nuovamente gli omogeneizzatori e l’omogeneizzatore per qualsiasi materiale aggiuntivo non omogeneizzato e ripetere i passaggi 4.10.1-4.10.3 per rimuovere il materiale secondo necessità. Pesare e registrare la massa del materiale non omogeneizzato recuperato dall’omogeneizzatore. Ispezionare la preparazione omogenea per qualsiasi tessuto grossolanamente intatto trasferito. Rimuovere i pezzi non omogeneizzati e pesare se necessario. Sottrarre il peso del tessuto recuperato dalla barca di pesatura, dall’omogeneizzatore e dall’omogeneizzatore (se necessario) dal peso umido iniziale per calcolare il peso finale del campione. Utilizzando il peso del campione finale, aggiungere ulteriore MiR05 per portare l’omogeneizzato alla concentrazione desiderata (vedere il passaggio 5 per i dettagli relativi agli esperimenti di ottimizzazione). Una volta che l’omogeneizzato è stato pesato e preparato, procedere al test il prima possibile. Conservare il campione conservato su ghiaccio bagnato fino a quando non viene trasferito allo strumento. 5. Protocollo di titolazione del substrato, disaccoppiatore, inibitore (SUIT) Una volta calibrato lo strumento e preparato il campione, rimuovere i tappi con un movimento di torsione e aspirare il MiR05 dalle camere (evitando la membrana esposta all’interno della camera). Mescolare bene l’omogeneizzato e aggiungere 2,25 ml di omogeneizzato alla camera. Se si aggiunge un omogeneizzato a più camere, pipettare 1 mL alla volta in ciascuna camera mentre si mescola l’omogeneizzato per garantire un’equa distribuzione tissutale. Fare clic su F4 per nominare e contrassegnare l’evento e quindi fare clic su OK. Riempire una siringa da 50 ml con ossigeno da un serbatoio di ossigeno con un regolatore e un tubo del gas usando un ago smussato da 18 G. Iperossigenare le camere a ~500 μM di ossigeno. Per questo, iniettare ossigeno direttamente nelle camere. Inserire liberamente i tappi e attendere la chiusura fino a quando l’ossigeno raggiunge ~ 480 μM. Con un movimento di torsione, chiudere lentamente la camera e lasciare che la respirazione si equilibri (~ 15-20 min). Riempire il capillare centrale del tappo con MiR05 se necessario. Determinazione analitica della capacità OXPHOS ed ET (stato di trasferimento elettronico) dell’attività N-linked e NS-linked e CIV (Complex IV): utilizzare microsiringhe dedicate per iniettare substrati, disaccoppiatori e inibitori in camere completamente chiuse. Clicca su F4 con ogni iniezione per nominare e timbrare il timestamp degli eventi per ogni camera in tempo reale. Durante lo studio, selezionare F6 per regolare la concentrazione di O2 e le scale di pendenza O2 neg. secondo necessità. Dopo ogni iniezione, lavare le siringhe 3 volte in acqua (per composti solubili in acqua) o al 70% di etanolo (per composti disciolti in etanolo o DMSO).NOTA: N-linked: flusso O2 supportato da combinazioni di substrato che generano NADH definite, NS-linked: flusso O2 supportato dalla convergenza di combinazioni di substrato generate da NADH e succinato. Aggiungere 5 μL di 0,8 M di Malato (2 mM di concentrazione finale) e procedere immediatamente all’iniezione successiva. Lavare la siringa per iniezione 3 volte in acqua. Aggiungere immediatamente 5 μL di 1 M di piruvato (2,5 mM di concentrazione finale) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Lavare la siringa per iniezione 3 volte in acqua. Aggiungere 10 μL di 0,5 M ADP (2,5 mM di concentrazione finale) e attendere che la risposta ADP si stabilizzi. Lavare la siringa per iniezione 3 volte in acqua.NOTA: Può essere necessario un ADP aggiuntivo (2,5-10 mM) per garantire che le concentrazioni di adenilato non siano limitanti ai flussi respiratori. Aggiungere 5 μL di glutammato 2 M (5 mM di concentrazione finale) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Lavare la siringa per iniezione 3 volte in acqua. Aggiungere 5 μL di 4 mM di citocromo c (concentrazione finale di 10 μM) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Lavare la siringa per iniezione 3 volte in acqua. Aggiungere 20 μL di 1 M Succinato (10 mM di concentrazione finale) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Lavare la siringa per iniezione 3 volte in acqua. Titolare incrementi di 0,5-1 μL di 1 mM FCCP (concentrazione finale di 2-20 μM) e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione. Lavare la siringa per iniezione 3 volte con etanolo al 70%. Aggiungere 2 μL di Rotenone da 150 μM (concentrazione finale di 150 nM-2 μM) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Aggiungere altri 1 μL di Rotenone per assicurarsi che non vi sia ulteriore inibizione. Se c’è una diminuzione della respirazione, continuare con ulteriori iniezioni fino a quando non vi è alcuna diminuzione della respirazione. Lavare la siringa per iniezione 3 volte con etanolo al 70%. Aggiungere 2 μL di 125 μM di Antimicina A (125 nM-5 μM di concentrazione finale) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Aggiungere altri 1 μL di Antimicina A per assicurarsi che non vi sia ulteriore inibizione. Se c’è una diminuzione della respirazione, continuare con ulteriori iniezioni fino a quando non vi è alcuna diminuzione della respirazione. Lavare la siringa per iniezione 3 volte con etanolo al 70%. Controllare la concentrazione di ossigeno della camera; se la concentrazione è inferiore a 125 μM, riossigenare all’aria ambiente o leggermente iperossigenato per garantire che l’ossigeno non limiti il flusso respiratorio. Aggiungere 5 μL di 0,8 M di ascorbato (concentrazione finale di 2 mM). Lavare la siringa per iniezione 3 volte con etanolo al 70%. Aggiungere immediatamente 10 μL di 0,2 M TMPD (1 mM di concentrazione finale) attendere un aumento della respirazione lenta. Lavare la siringa per iniezione 3 volte con etanolo al 70%. Aggiungere 25 μL di 4 M Azide di Sodio (50 mM di concentrazione finale) immediatamente quando il flusso respiratorio di Ascorbato/TMPD si stabilizza. Lavare la siringa per iniezione 3 volte con etanolo al 70%. Termina lo studio: fai clic su File, Salva e Disconnetti. Continuare a lavare la camera e la siringa seguendo i passaggi 9.2-9.3. 6. Protocollo di sensibilità ADP Una volta calibrato lo strumento e preparato il campione, rimuovere i tappi con un movimento di torsione e aspirare il MiR05 dalle camere (evitando la membrana esposta all’interno della camera). Mescolare bene l’omogeneizzato e aggiungere 2,25 ml di omogeneizzato alla camera. Supponiamo di aggiungere un omogeneizzato a più camere, pipettare 1 mL alla volta in ogni camera mentre si mescola l’omogeneizzato per garantire un’equa distribuzione tissutale. Fare clic su F4 per assegnare un nome e un timestamp all’evento e fare clic su OK. Inserire i tappi e, con un movimento di torsione, chiudere lentamente la camera e consentire alla respirazione di equilibrarsi (~ 15-20 min). Riempire il capillare centrale del tappo con MiR05 se necessario. Determinazione analitica della sensibilità ADP mitocondriale legata al succinato: fare clic su F4 con ogni iniezione per nominare e contrassegnare gli eventi per ciascuna camera in tempo reale. Durante lo studio, selezionare F6 per regolare la concentrazione di O2 e le scale di pendenza O2 neg. secondo necessità. Aggiungere 2 μL di Rotenone da 150 μM (concentrazione finale di 150 nM). Aggiungere immediatamente 20 μL di 1 M di succinato (10 mM di concentrazione finale) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Titolare aDP mediante aggiunta graduale di concentrazioni sub-saturanti fino a raggiungere il tasso massimo di risposta (VMAX; 2,5-10 mM concentrazione finale).NOTA: La velocità può stabilizzarsi dopo l’iniezione a causa di un piccolo cambiamento nella concentrazione di ADP, quindi aumentare la concentrazione di iniezione dopo ogni plateau e continuare con la titolazione fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione anche con un aumento della concentrazione di iniezione di ADP. 7. Esperimenti di ottimizzazione consigliati Determinare l’omogeneità ottimale e la concentrazione di ossigeno per il protocollo. Eseguire il protocollo SUIT (fasi 5.1-5.3) a concentrazioni tissutali multiple (ad esempio, 30 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1 mg/mL e/o 0,5 mg/mL). Selezionare una concentrazione che massimizzi il flusso respiratorio limitando la frequenza delle reossigenazioni (non più di 1-2). Se sono necessarie riossigenazioni più frequenti, diminuire la concentrazione dell’omogeneizzato. Determinare il numero ottimale di colpi con l’omogeneizzatore. Eseguire il protocollo SUIT (passaggi 5.1-5.3) a più livelli di omogeneizzazione (ad esempio, 5 colpi, 10 colpi, 15 colpi, 20 colpi). Poiché non ci sono dati sufficienti in letteratura per determinare una soglia dell’aumento percentuale del citocromo c con preparazione di omogeneizzati tumorali, scegliere il preparato con risposta limitata al citocromo c ma respirazione adeguata energizzata dal substrato o dai substrati di interesse. Determinare le concentrazioni ottimali di substrato, ADP, disaccoppiatore e inibitore necessarie per i flussi respiratori quantitativi e riproducibili. Eseguire il protocollo SUIT (passaggi 5.1-5.3.9) alla concentrazione tissutale scelta (fase 7.1). Titolare ogni substrato, disaccoppiatore, inibitore e ADP fino a quando non si osserva un’ulteriore risposta. Titolare l’inibizione con azide di sodio in esperimenti separati. Aggiungere 5 μL di 0,8 M di Malato (2 mM di concentrazione finale) e procedere immediatamente all’iniezione successiva. Titolare incrementi di 1 μL di 1 M di piruvato e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione. Titolare incrementi di 2 μL di 0,5 M ADP e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione. Titolare incrementi di 1 μL di glutammato 2 M e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione. Aggiungere 5 μL di 4 mM di citocromo c (concentrazione finale di 10 μM) e attendere che la respirazione si stabilizzi. Titolare incrementi di 5 μL di 1 M Succinato e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione. Titolare incrementi di 5 μL di 0,5 M ADP e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione. Titolare incrementi di 0,5 μL di 1 mM FCCP e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione. Titolare incrementi di 1 μL di 150 μM Rotenone e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcun aumento della respirazione. Titolare incrementi di 1 μL di 125 μM Antimicina A e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione, continuare fino a quando non vi è alcuna ulteriore diminuzione della respirazione. Aggiungere 5 μL di 0,8 M di ascorbato (concentrazione finale di 2 mM). Aggiungere immediatamente 5 μL di 0,2 M TMPD (concentrazione finale di 0,5 mM) attendere un aumento della respirazione lenta. In un esperimento separato, aggiungere 10 μL di 0,2 M TMPD (1 mM di concentrazione finale). In esperimenti separati aggiungere, 10 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL di 4 M Azide di Sodio (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM concentrazione finale, rispettivamente) immediatamente quando il flusso respiratorio di Ascorbato / TMPD si stabilizza. Scegli il substrato e le concentrazioni di inibitori che si saturano all’interno della prima iniezione per migliorare i tempi dell’esperimento. Utilizzare ADP a concentrazioni di saturazione o sottosaturazione per combinare le valutazioni di sensibilità ADP con i protocolli SUIT tradizionali. Utilizzare concentrazioni di disaccoppiatori sub-massime per dimostrare la dose-reattività senza inibizione del flusso respiratorio. 8. Analisi dei dati Analisi SUIT Selezionare i tassi di stato stazionario o di picco da ciascuna titolazione ed esportazione per la riduzione analitica. Esprimere i dati come pmol O2 al secondo per mg di tessuto (pmol/s/mg). Ottenere la riduzione analitica di PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P e PMGS-E sottraendo il tasso insensibile all’antimicina A dal rispettivo tasso (cioè il tasso di stato stazionario ottenuto dopo l’aggiunta di ADP).NOTA: PM: Piruvato + Malato; PMG: Piruvato + Malato + Glutammato; PMGS: Piruvato + Malato + Glutammato + Succinato; -L: Stato di perdita; -P: Stato di fosforilazione ossidativa, -E: Stato di trasferimento di elettroni. Ottenere la riduzione analitica di CIV-E sottraendo il tasso insensibile all’azide di sodio dal tasso di picco ascorbato/TMPD. Ottenere la riduzione analitica di PMG-E sottraendo il tasso di insensibilità al rotenone dal tasso PMGS-E. Ottenere la riduzione analitica di S-E sottraendo il tasso insensibile all’antimicina A dal tasso insensibile al rotenone. Ottenere la riduzione analitica dell’efficienza di controllo del citocromo c, un marcatore di integrità della membrana esterna, con la seguente equazione:jc = ((JCHNOc – JCHNO)/JCHNO) x 100Nell’equazione, jc è l’aumento % all’aggiunta del citocromo c, JCHNOc è il flusso di ossigeno dopo l’aggiunta del citocromo ce JCHNO è il flusso di ossigeno prima dell’aggiunta del citocromo c. Analisi di sensibilità ADP Determinare analiticamente la cinetica per la sensibilità ADP rispetto al tasso di perdita di succinato + rotenone (non il tasso di omogeneizzato tissutale). Tracciare il flusso O2 (asse Y) rispetto alla concentrazione ADP relativa (asse X). Determinare la velocità respiratoria massima (Vmax)come la velocità di picco raggiunta durante la titolazione ADP. Determinare la cinetica di Michaelis-Menten utilizzando un software di raccordo di curva (PRISM, versione 10.1) per rivelare la concentrazione di ADP alla quale si ottiene 1/2 VMAX (Apparente KM). 9. Controllo qualità strumentale Eseguire lo sfondo strumentale O2 nell’intervallo di concentrazione di ossigeno desiderato (0-600 μM) e la calibrazione zero. Completare i passaggi 3.1 e 3.2 Rimuovere i tappi e aspirare l’etanolo al 70% dalle camere (evitando la membrana esposta all’interno della camera). Risciacquare 4 volte con H2O a doppio distillato e riempire la camera con 2,25 mL di MiR05 Iperossigenare le camere a ~ 600 μM di ossigeno. Inserire lentamente i tappi nella loro posizione completamente chiusa. Sifonare il mezzo in eccesso espulso attraverso il capillare di iniezione e raccolto nel pozzetto del tappo e consentire al segnale di ossigeno di stabilizzarsi (30-45 min). Per eseguire la calibrazione dell’ossigeno, selezionare la regione in cui sia la concentrazione di ossigeno che la pendenza sono stabili, aprire la finestra di calibrazione per la rispettiva camera e selezionare il segno R1. Preparare la soluzione di ditionite sciogliendo 20 mg di idrosolfito di sodio in 0,5 ml di acqua. Limitare l’esposizione all’aria in quanto la ditionite viene ossidata nel tempo con l’esposizione all’ossigeno. Una volta stabilizzato il segnale di ossigeno, iniettare 1 μL e osservare il calo della concentrazione di ossigeno. Regolare la potenza della soluzione di ditionite secondo necessità. Iniettare una soluzione di ditionite sufficiente per abbassare la concentrazione di ossigeno a 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM e 0 μM, rispettivamente. Ad ogni iniezione, lasciare che l’ossigeno si stabilizzi e selezionare un segno per la pendenza allo stato stazionario. Una volta che la concentrazione di ossigeno è ~ 0 μM, contrassegnare la concentrazione di ossigeno. Per eseguire la correzione strumentale dello sfondo di O2, selezionare la finestra di flusso/pendenza per la rispettiva camera, selezionare O2 Calibrazione di sfondoe fare clic su Calibra per i segni di interesse. Per eseguire la calibrazione zero, aprire la finestra di calibrazione per la rispettiva camera e selezionare il marchio R0 ottenuto dopo la titolazione della ditionite. Pulizia degli strumenti Risciacquare rapidamente ogni camera con acqua pura tre volte. Per il primo lavaggio, aspirare l’omogeneizzato, riempire completamente la camera con acqua e quindi aspirare l’acqua. Per il secondo lavaggio, riempire la camera 3/4 piena d’acqua, inserire i tappi per forzare l’acqua attraverso il capillare di iniezione, aspirare parte dell’acqua attraverso il capillare di iniezione e quindi rimuovere i tappi per aspirare completamente il lavaggio. Lavare le camere con etanolo al 70% per 5 minuti. Sopra un lavandino o un becher, pulire i tappi con acqua pura, etanolo al 70% etanolo al 100%, forzando il fluido attraverso i capillari di iniezione usando una bottiglia di lavaggio. Risciacquare rapidamente ogni camera con acqua pura due volte. Incubare le camere con 2 ml di PBS contenenti ~ 2 mg di mitocondri congelati, lisato cellulare o fibroblasti viventi per 15 minuti. Lavare le camere con acqua pura per 5 minuti due volte. Lavare le camere con etanolo al 70% per 5 minuti due volte. Lavare le camere con etanolo al 100% per 10 minuti. Riempire le camere con il 70% di etanolo. Se si esegue un esperimento consecutivo, lasciare le camere in etanolo al 70% per 5 minuti e quindi continuare con il passaggio 3.3. Se gli esperimenti sono completi, mettere i coperchi sui tappi e spegnere lo strumento. Dopo ogni utilizzo, pulire correttamente le siringhe per iniezione e tenere le siringhe dedicate all’uso specifico del composto per evitare il riporto. Inserire la siringa nel liquido di lavaggio e immergere completamente l’ago per iniezione. Aspirare il liquido di lavaggio nella siringa al massimo volume. Rimuovere la siringa dal contenitore di lavaggio, espellere il liquido di lavaggio in un becher e quindi tamponare la siringa su un tovagliolo di carta. Ripetere i passaggi 9.3.1-9.3.3 tre volte il prima possibile dopo ogni utilizzo.

Representative Results

Gli studi iniziali hanno rivelato che i tumori EO771 erano scarsamente ossidativi e quindi richiedevano alte concentrazioni di omogeneizzati per un’adeguata valutazione del flusso di O2. Sono stati condotti esperimenti di ottimizzazione per determinare l’intervallo di concentrazione ottimale di omogeneizzati tissutali per lo studio. Gli omogeneizzati tumorali sono stati inizialmente preparati a 40 mg/ml e poi diluiti linearmente. Il flusso di O2 normalizzato alla massa tissutale era coerente tra le concentrazioni (Figure 1A-D). È stato osservato che 40 mg/mL hanno provocato un rapido esaurimento di ossigeno e non erano adatti alla sperimentazione (Figura 1A). Il consumo di ossigeno è rallentato sostanzialmente con 30 mg/mL e 20 mg/mL ma è comunque diminuito rapidamente in breve tempo in assenza di substrati o ADP (Figura 1B,C). La concentrazione di 10 mg/ml ha portato al tasso di consumo ottimale di ossigeno (Figura 1D) che supporterebbe un protocollo SUIT più lungo di 90 minuti. Un protocollo SUIT è stato utilizzato per valutare OXPHOS ed ET legati a NADH e succinato, nonché l’attività CIV (Figura 2A). Piruvato e malato sono stati aggiunti all’omogeneizzato tissutale in assenza di ADP per guidare la perdita (L) attraverso il NADH. L’ADP saturante è stato quindi aggiunto per guidare l’OXPHOS (P) legato al NADH massimo, seguito dall’aggiunta di glutammato. Il citocromo c è stato quindi aggiunto per garantire l’integrità della membrana esterna; l’aumento del tasso respiratorio è stato inferiore al 20% in tutti i campioni (Figura 2B). Data la risposta molto bassa ai substrati legati al NADH, il rilascio di citocromo c è stato valutato anche in presenza di succinato e rotenone e ha osservato una stimolazione minima del citocromo c (Figura 2B). È interessante notare che l’OXPHOS legato al NADH era trascurabile nei tumori EO771 (Figura 2C). Il succinato è stato quindi aggiunto in presenza di piruvato, malato e glutammato per stimolare il flusso di elettroni attraverso la succinato deidrogenasi. FCCP è stato quindi titolato per guidare il flusso massimo di elettroni (E), il che ha rivelato che nei tumori EO771, la fosforilazione piuttosto che l’ossidazione era limitante alla respirazione (Figura 2C). Rotenone e antimicina A sono stati successivamente titolati per inibire rispettivamente il complesso I e il complesso III. Ascorbato e TMPD sono stati quindi aggiunti per guidare il flusso massimo di elettroni attraverso CIV, che viene poi inibito dall’azide di sodio. La Tabella 1 illustra le equazioni analitiche di riduzione dei dati grezzi (Tabella 2) per quantificare i parametri respiratori tracciati nella Figura 2C. Nel complesso, i profili respiratori omogeneizzati tumorali (Figura 2C) sono simili a quelli delle cellule EO771 non impiantate permeabilizzate alla digitonina (Figura 2D) ad eccezione del diminuito trasferimento massimo di elettroni supportato da substrati legati a N e S nel tumore. Poiché la respirazione legata al NADH era trascurabile, la cinetica respiratoria del succinato è stata ulteriormente valutata mediante titolazioni graduali di ADP sub-saturazione fino a raggiungere la velocità massima (VMAX)(Figura 3A,3B). La concentrazione semi-massimale (KM) di ADP in presenza di succinato + rotenone era di 37,5 μM, mentre il VMAX era di ~10,5 pmol/s/mg (Figura 3C). Pertanto, nonostante i tassi di ossidazione relativamente scarsi, i tumori EO771 erano altamente sensibili all’ADP e sostenevano la sintesi di ATP a concentrazioni di ADP relativamente basse. La selezione di regioni appropriate dei dati grezzi per l’estrazione è fondamentale per la riproducibilità degli esperimenti e la quantificazione accurata. Per il citocromo c, è necessario selezionare un segno allo stato stazionario immediatamente prima dell’iniezione (Figura 4A, segno 1). C’è spesso un artefatto di iniezione iniziale che può essere seguito da un periodo di tempo (circa 5-10 minuti) in cui il flusso di O2 non è costante. La valutazione dell’efficienza del citocromo c viene effettuata effettuando una selezione aggiuntiva una volta che il flusso di O2 si è stabilizzato (Figura 4A, segno 2). Le selezioni dopo l’aggiunta di substrati, ADP o la maggior parte degli inibitori vengono effettuate anche dopo l’artefatto di iniezione e una volta che il flusso di O2 si è stabilizzato (Figura 4B). La selezione utilizzata per determinare la respirazione massima disaccoppiata viene effettuata al picco di aumento ottenuto durante la titolazione di FCCP, che spesso non è l’ultima iniezione effettuata (Figura 4C). La selezione per TMPD viene effettuata dopo l’aggiunta di ascorbato e TMPD e al picco di aumento della respirazione (Figura 4D, segno 1). Subito dopo questo picco, viene aggiunto l’inibitore, l’azide di sodio, che diminuisce rapidamente la respirazione ma spesso ha anche un artefatto di iniezione inferiore alla frequenza respiratoria inibita (Figura 4D). Il segno inibitore viene effettuato immediatamente dopo l’artefatto di iniezione (Figura 4D, segno 2). Il flusso di O2 in genere non si stabilizza e continua a diminuire. Tabella 1: Notazione respiratoria e derivazione analitica. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Campione e caratteristiche respiratorie degli omogeneizzati del tumore mammario luminale B. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Figura 1: Ottimizzazione della concentrazione di omogeneizzati tumorali. Concentrazione di O2 Flux (rosso) e O2 (blu) negli omogeneizzati tumorali mammari preparati a (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL e (D) 10 mg/mL. Thom: Respirazione omogeneizzata tissutale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Valutazione della capacità di OXPHOS ed ET mediante respirometria ad alta risoluzione in omogeneizzati tumorali appena asportati. (A) Grafico rappresentativo del consumo di ossigeno (rosso) e delle concentrazioni (blu) nel corso di un substrato, inibitore, protocollo di disaccoppiamento. PM: Piruvato + Malato, D: ADP, G: Glutammato, c: Citocromo c, S: Succinato, F: FCCP, Marciume: Rotenone, Ama: Antimicina A, Asc / TMPD: Ascorbato / Tetrametil-p-fenilendiammina. (B) Aumento percentuale del flusso di O2 con l’aggiunta del citocromo c. (C-D) Respirazione supportata da malato, piruvato, glutammato e succinato in presenza di ADP, FCCP e ascorbato/TMPD in (C) Omogenati tumorali derivati da EO771 e (D) cellule non impiantate EO771 permeabilizzate alla digitonina. Thom: Respirazione omogeneizzata tissutale; PM: Piruvato + Malato; PMG: Piruvato + Malato + Glutammato; PMGS: Piruvato + Malato + Glutammato + Succinato; CIV: Complesso IV; -L: Stato di perdita; -P: Stato di fosforilazione ossidativa, -E: Stato di trasferimento di elettroni; N-linked: flusso O2 supportato da combinazioni di substrato che generano NADH definite; NS-linked: flusso di O2 supportato dalla convergenza di combinazioni di substrato generate da NADH e succinato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: I tumori mammari EO771 hanno mostrato un’elevata sensibilità all’ADP (adenosina 5′-difosfato). (A) Rappresentazione rappresentativa del consumo di ossigeno (rosso) e delle concentrazioni (blu) in un protocollo di titolazione ADP legato all’S. Thom: Respirazione omogeneizzata tissutale; S/Rot: Succinato/Rotenone; D: ADP. (B) Respirazione supportata da succinato in presenza di rotenone e concentrazioni crescenti di ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Tasso massimale (VMAX) e concentrazione semi-massimale (KM) di ADP in presenza di succinato + rotenone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Traccia rappresentativa che illustra laselezione del segno dei flussi grezzi di O2 per l’estrazione dei dati. (A) Selezione del citocromo c: selezione numero 1 prima dell’iniezione del citocromo c e selezione numero 2 dopo l’iniezione quando il flusso di O2 si è stabilizzato. c Citocromo c. (B) Selezione del substrato, dell’ADP e degli inibitori: selezione numero 1 dopo l’iniezione (succinato in questo grafico rappresentativo) in cui il flusso di O2 si è stabilizzato. S: Succinate. (C) Selezione del disaccoppiatore: selezione numero 1 al picco di aumento della respirazione durante la titolazione del disaccoppiatore. In questo grafico di titolazione FCCP rappresentativo, la terza iniezione diminuisce leggermente la respirazione e quindi non viene utilizzata per la selezione. F: ACCP. (D) Selezione TMPD: selezione numero 1 al picco di aumento della respirazione dopo le iniezioni di ascorbato e TMPD. Selezione dell’azide di sodio: selezione numero 2 dopo l’artefatto di iniezione acuta quando la respirazione inizialmente diminuisce. As/Tm: Ascorbato/TMPD; Azd: Azide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Gli approcci per valutare la respirazione mitocondriale nel cancro sono stati in gran parte limitati ai modelli in vitro ^13,14,15,16. Un certo successo è stato raggiunto nella misurazione della respirazione mitocondriale nei tumori utilizzando la permeabilizzazione chimica^6,7,17,ma non esiste un approccio uniforme e gold standard che possa essere universalmente applicato e confrontato tra i tipi di tumore. Inoltre, la mancanza di analisi e report dei dati coerenti ha limitato la generalizzabilità e la riproducibilità dei dati. Il metodo qui delineato fornisce un approccio semplice e relativamente rapido per misurare la respirazione mitocondriale¹⁸ in preparati mitocondriali da campioni di tumore solido appena asportati. I tumori sono stati coltivati da cellule tumorali mammarie murine Luminal B impiantate ortotopicamente, ERα-negative EO771¹⁹.

La diligenza e la cura con la manipolazione dei tessuti miglioreranno notevolmente l’accuratezza e la normalizzazione dei tassi di consumo di ossigeno. Il tessuto e i mitocondri possono essere facilmente danneggiati se il campione non viene mantenuto freddo, non è costantemente immerso nei mezzi di conservazione o viene eccessivamente maneggiato, con conseguente routine non ottimale e tassi di OXPHOS. Inoltre, il peso umido accurato del tessuto omogeneizzato è di fondamentale importanza in quanto questo è il metodo di normalizzazione primario. Possono essere presi in considerazione altri metodi di normalizzazione, come la proteina totale o i marcatori specifici mitocondriali, come l’attività della citrato sintasi²⁰. Inoltre, l’eterogeneità dei tessuti dovrà essere affrontata, con decisioni sulle regioni tumorali da includere negli esperimenti fatti a priori. Necrotico, fibrotico e tessuto connettivo potrebbero non omogeneizzare e / o respirare bene e dovrebbero essere evitati a meno che non si analizzi intenzionalmente queste regioni tumorali. In particolare, il tumore può essere molto appiccicoso a seconda del tipo e della regione di escissione, rendendo più difficile la pesatura e il trasferimento accurati. Il numero di colpi utilizzati per le omogeneizzazioni deve essere ottimizzato per garantire la completa preparazione dei mitocondri mitigando i danni alle membrane mitocondriali esterne.

Per migliorare l’accuratezza e la riproducibilità, si consiglia di eseguire esperimenti di ottimizzazione per il numero di colpi per la preparazione omogenea, la concentrazione dei tessuti e le concentrazioni di substrato, disaccoppiatore, inibitore. Gli studi possono confrontare il diverso numero di ictus e come corrispondono alla risposta all’aggiunta di citocromo c all’interno dello studio, nonché la capacità respiratoria mitocondriale massima ²¹. Sebbene vi sia un’accettazione generale che una minore risposta al citocromo c sia migliore, poiché un aumento del consumo di ossigeno dopo l’aggiunta del citocromo c può indicare danni alla membrana mitocondriale esterna, non esiste un gold standard su quale sia questa soglia per ogni tessuto e dovrebbe essere studiato sperimentalmente per garantire che il tessuto non sia sovraccarico o poco preparato. In questo tessuto tumorale, è stato riscontrato che una risposta al citocromo c inferiore a ~ 30% non compromette la funzione respiratoria. L’uso del citocromo c diventa fondamentale per una quantificazione accurata della capacità respiratoria se il test è positivo. In questo caso, l’aggiunta reintegra il citocromo c endogeno, che, se esaurito, causerà una sottostima delle frequenze respiratorie.

Gli esperimenti di titolazione della concentrazione tissutale possono essere eseguiti su una gamma di concentrazioni fattibili e, idealmente, sarebbero fatti con SUIT che saranno studiati durante lo studio. La capacità respiratoria varia in base al tipo di tumore e alla composizione. Pertanto, i tumori densi di mitocondri o alta capacità respiratoria richiederanno concentrazioni più basse (0,5-5 mg / ml). I tumori con pochi mitocondri o bassa capacità respiratoria richiedono concentrazioni più elevate (7-12 mg / ml). Inoltre, i SUIT lunghi o con substrati altamente consumati potrebbero aver bisogno di meno tessuto per prevenire la riossigenazione della camera o la limitazione dell’ADP. Alcuni tessuti avranno una relazione lineare nel consumo di ossigeno, mentre altri mostreranno una migliore sensibilità e la massima ossidazione a determinati intervalli di concentrazione. La concentrazione tissutale scelta deve essere ottimizzata per massimizzare il flusso di ossigeno limitando il numero di eventi di riossigenazione. Inoltre, è spesso meglio sopravvalutare la necessità o mirare alla fascia più alta dell’intervallo di concentrazione. Gli inibitori, che sono essenziali per la quantificazione dei flussi respiratori, sono più precisi se utilizzati in pool più grandi di mitocondri.

Un’altra considerazione essenziale è la concentrazione dei farmaci che vengono utilizzati durante i protocolli. I cambiamenti nella concentrazione di omogeneizzati possono alterare le concentrazioni di substrati, disaccoppiatori e inibitori necessari per la risposta massima. Pertanto, una volta scelto l’intervallo di concentrazione ottimale, deve essere eseguito un esperimento che testa le dosi richieste per il protocollo SUIT. È possibile aggiungere ulteriore ADP per garantire che le concentrazioni di adenilato non siano limitanti ai flussi respiratori. Gli sganciatori chimici come FCCP o CCCP inibiscono la respirazione a concentrazioni più elevate²². Pertanto, è essenziale titolare in piccole quantità per rivelare il tasso massimo raggiunto. Gli inibitori, come il rotenone e l’antimicina A, sono meglio utilizzati quando saturi entro la prima iniezione. Mentre le concentrazioni ottimali sono state determinate in esperimenti preliminari, abbiamo anche osservato differenze correlate al trattamento nella risposta agli inibitori e quindi spesso aggiungiamo un’ulteriore iniezione di inibitori per dimostrare la massima inibizione poiché i tassi risultanti servono come base per la quantificazione. L’inibizione chimica dell’ascorbato/TPMD è essenziale per un’accurata riduzione analitica in quanto il TMPD subisce l’autoossidazione^23. Abbiamo controllato l’auto-ossidazione di ascorbato / TMPD / citocromo c attraverso l’aggiunta di azide di sodio, un inibitore CIV stabilito. Per gli studi Km, l’aggiunta di rotenone in presenza di succinato da solo previene l’accumulo di ossalacetato che può inibire l’attività della succinato deidrogenasi a basse concentrazioni^24. Il volume e la concentrazione di ADP dipendono fortemente dalla sensibilità dei mitocondri alla combinazione prevalente di substrato. I preparati mitocondriali altamente sensibili all’ADP richiederanno concentrazioni iniziali più basse. Inoltre, le sostanze chimiche convalidate e la corretta preparazione del farmaco con attenzione al pH, alla sensibilità alla luce, se applicabile, e alla temperatura di conservazione sono essenziali per esperimenti di successo.

La configurazione degli strumenti e la cura di routine sono di fondamentale importanza per il successo di questi esperimenti. Un’adeguata e corretta pulizia delle camere è essenziale per la riproducibilità e la prevenzione della contaminazione biologica, proteica, inibitore o disaccoppiatore. Gli elettrodi di tipo Clark e i sistemi O2k utilizzano camere di reazione in vetro, il che rappresenta un vantaggio significativo in termini di costi per i sistemi basati su piastre che si basano su materiali di consumo. Tuttavia, le camere di vetro devono essere pulite vigorosamente e possono essere una fonte di contaminazione inibitore in studi successivi. L’incubazione con campioni ricchi di mitocondri durante il processo di lavaggio (mitocondri isolati a cuore o fegato, ad esempio) può ridurre il rischio di contaminazione sperimentale ed è raccomandata in aggiunta alle procedure di diluizione e lavaggio a base alcolica. Se vengono eseguiti studi consecutivi, la pulizia con etanolo e mitocondri riduce al minimo la possibilità di contaminazione da inibitori. Si raccomanda la calibrazione del sensore di ossigeno prima di ogni esperimento per ottenere misurazioni accurate della respirazione rispetto alla pressione parziale prevalente dell’ossigeno. Se non sono possibili calibrazioni multiple, una calibrazione al giorno può essere sufficiente se la concentrazione di ossigeno rimane stabile e costante dopo la procedura di lavaggio.

Le procedure sopra descritte sfruttano lo strumento Oroboros O2k per misurare il consumo di ossigeno nel tessuto tumorale entro 4 ore dall’escissione del tumore utilizzando una soluzione di conservazione e mezzi respiratori precedentemente progettati e ottimizzati^25,26,27. Più parametri in questo protocollo possono essere modificati per le applicazioni successive. La configurazione e la calibrazione dello strumento, gli omogeneizzatori utilizzati per la preparazione dei tessuti e la concentrazione ottimale di ossigeno omogeneizzato e camera possono essere adattati per l’uso su altri strumenti con potenziale di monitoraggio dell’ossigeno. Ad esempio, le camere erano leggermente sovrariempite quando si aggiungeva l’omogeneizzato, e quindi quando la camera è completamente chiusa, il capillare della camera rimane pieno. Questo consumerà un po ‘di ossigeno nella camera, ma con l’ottimizzazione della concentrazione del campione, possiamo spiegare questo consumo nel determinare con quale livello di ossigeno iniziare. In alternativa, il campione può essere lasciato equilibrare all’ossigeno ambiente prima che la camera sia chiusa, ma questo spesso aumenta la quantità di tempo prima dell’inizio dell’esperimento e ritarda l’aggiunta di substrati. Mentre gli omogeneizzatori utilizzati in questo protocollo sono ampiamente accessibili, potrebbero essere impiegate altre tecniche di omogeneizzazione commerciale, come un trituratore di tessuti o un omogeneizzatore automatizzato²⁸.

Inoltre, la preparazione dei tessuti e le procedure strumentali possono essere utilizzate con una serie di diversi SUIT per studiare il controllo respiratorio attraverso una varietà di stati di accoppiamento e controllo del percorso²⁹. Questi protocolli SUIT sono stati sviluppati per misurare la capacità funzionale e, quindi, il contributo di potenziali substrati endogeni non ha alcun impatto sulla misurazione della capacità. Teniamo conto analiticamente del consumo di ossigeno non mitocondriale e / o del consumo residuo dell’omogeneizzato attraverso la sottrazione dell’antimicina A-rotenone, o tassi insensibili all’azide di sodio, a seconda dei casi. I mitocondri possono rimanere vitali in BIOPS o soluzioni di conservazione costruite in modo simile per lunghi periodi di tempo (>24 h) a seconda del tipo di tessuto e dell’integrità^30,31. Gli studi possono essere effettuati in anticipo per determinare i limiti di conservazione temporale in quanto OXPHOS di alcuni substrati può avere limitazioni diverse. Questo è essenziale se l’esperimento non può essere eseguito entro diverse ore dall’escissione tissutale / biopsia. 37°C è una temperatura ottimale e fisiologica per la valutazione della funzione respiratoria nella maggior parte dei sistemi di mammiferi. Tuttavia, se la temperatura del saggio sembra interferire con la valutazione³², possono essere condotti studi comparativi in un ampio intervallo di temperatura (25-40 °C) per garantire un’adeguata reattività. I vincoli strumentali possono limitare la capacità di condurre tali studi.

I principali limiti del metodo sopra descritto sono 1) il potenziale danno ai mitocondri attraverso l’omogeneizzazione meccanica, 2) la presenza di ATPasi o di altri biochimici subcellulari in preparati omogeneizzati che possono interferire con la determinazione simultanea di ATP o altre variabili di interesse e possono richiedere ulteriori metodi di correzione o l’uso di inibitori³³ , e 3) la valutazione di molti campioni e/o di più SUIT per campione richiede molto tempo in quanto uno strumento può ospitare due esperimenti alla volta e richiede la pulizia e l’impostazione tra esperimenti successivi. Esperimenti di ottimizzazione e preparazione coerente dei campioni possono ridurre al minimo i danni mitocondriali sostanziali che contribuirebbero a dati incoerenti.

L’importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti / alternativi è una migliore fattibilità rispetto alla quantità di materiale di partenza, alla sfida di isolare i mitocondri o alla sfida tecnica nella permeabilizzazione del tessuto. La preparazione degli omogeneizzati è più veloce, l’ossigeno non è così limitante ed è meno suscettibile alla variabilità tra il personale rispetto al tessuto permeabilizzato. È importante sottolineare che quasi tutti i tipi di campione sono adatti per la preparazione di omogeneizzati che consente l’analisi comparativa tra i tessuti. La respirometria ad alta risoluzione è la misura gold standard di OXPHOS e ET mitocondriale. L’applicazione di questo metodo nella ricerca pre-clinica e clinica sul cancro ha la capacità di espandere le attuali indagini in vitro agli studi ex vivo. Inoltre, offre potenziali applicazioni in contesti clinici e diagnostici.

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383
Amphotericin B	Gibco	15290018
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free	Sigma-Aldrich	3117057001	Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe	Fisher Scientific	13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles	Fisher Scientific	23-021-020
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C2506
Datlab 7.4 software	Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide	Amresco	N182
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
D-Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30	Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in	World Precision Instruments	501601
EO771 cells	CH3 BioSystems	SKU: 94APV1-vial-prem	Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E4378
Female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock #000664
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750
Kimwipes	Fisher Scientific	34120
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	G1626
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	L2398
Malate	Sigma-Aldrich	M6413
Matrigel Matrix	Corning	354248
MgCl·6H2O	Sigma-Aldrich	M2670
Microsyringes	Hamilton	87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma-Aldrich	T7394
Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer	Oroboros Instruments	10003-01
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	P7936
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
RPMI 1640	Gibco	21875034
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Succinate (disodium)	Sigma-Aldrich	W327700
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Whatman Filter Paper, grade 5	Sigma-Aldrich	1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL	Duran Wheaton Kimble	357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11	McKesson	1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2	Becton, Dickinson and Company	305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1	Becton, Dickinson and Company	305195
BD 1mL Slip Tip Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm	Thermo Fisher Scientific	316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate	Research Diet	D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm	Thermo Fisher Scientific	S34819