Desenvolvemos um protocolo prático e abordagem analítica para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial e a capacidade de transferência de elétrons em homogeneizadores de tumores frescos. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para levantamento de várias funções mitocondriais que contribuem para a iniciação do câncer, progressão e resposta ao tratamento.
Mitocôndrias são essenciais para o início e progressão do câncer através da produção de energia, regulação reativa de espécies de oxigênio e síntese macromolécula. Adaptações genéticas e funcionais de mitocôndrias ao ambiente tumoral impulsionam o potencial proliferativo e metastático. O advento do sequenciamento de DNA e RNA removeu barreiras críticas à avaliação de mediadores genéticos da tumorigênese. No entanto, até o momento, as abordagens metodológicas para avaliar a função mitocondrial tumoral permanecem evasivas e requerem proficiência técnica limitando a viabilidade, diminuindo o valor diagnóstico e prognóstico tanto em ambientes experimentais quanto clínicos. Aqui, descrevemos um método simples e rápido para quantificar as taxas de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e capacidade de transferência de elétrons (ET) em homogeneiza tumores sólidos recém-extirpados usando respirometria de alta resolução. O protocolo pode ser aplicado de forma reprodutivelmente entre espécies e tipos de tumores, bem como adaptado para avaliar uma diversidade de vias et mitocondriais. Usando este protocolo, demonstramos que camundongos portadores de câncer mamário B luminal apresentam respiração ligada à dinucleotida de nicotinamida defeituosa e dependência de succinato para gerar triptofato de adenosina via OXPHOS.
Todas as células estão intimamente ligadas à sua necessidade de produzir e consumir triphosfato de adenosina (ATP), a moeda de energia molecular. Como as mutações celulares dão origem à formação de tumores, as mitocôndrias garantem a sobrevivência através da diversificação da produção de energia que muitas vezes é fenotipicamente distinguível do tecido não cancerígeno1,2,3. Como tal, há uma necessidade crítica de perfil rápido e profundo da função respiratória mitocondrial, a fim de facilitar a classificação do tipo de tumor, iniciação do câncer, progressão e resposta ao tratamento.
Funções respiratórias de amostras de tecido excisado não podem ser avaliadas intactas, pois os substratos primários para OXPHOS não são permeáveis por células. Para superar essa limitação, as mitocôndrias podem ser preparadas por isolamento, permeabilização química ou homogeneização mecânica. O isolamento mitocondrial é considerado um padrão-ouro para a avaliação da função respiratória. No entanto, requer grandes quantidades de tecido, é demorado, e é de baixo rendimento com possível viés de seleção para certas frações de mitocôndrias4. A permeabilização consiste na separação mecânica e exposição de seções teciduais ou feixes de fibras a um detergente suave que degrada seletivamente a membrana plasmática5. A permeabilização é frequentemente empregada em tecidos estriados, como músculo esquelético e cardíaco, pois os feixes individuais de fibras podem ser provocados à parte. Em comparação com o isolamento, a permeabilização produz mais mitocôndrias em seu ambiente celular nativo e forma física5. A permeabilização tem sido aplicada com sucesso em outros tecidos como tumor6,7 e placenta8; no entanto, a reprodutibilidade das preparações de fibras permeabilizadas pode ser difícil devido à consistência dos requisitos de dissecção e oxigênio para superar as limitações de difusão9. Além disso, as fibras permeabilizadas podem ser inadequadas em certos tipos de tumores que são densamente celulares e altamente fibrosos. Os homogeneizadores teciduais são gerados através da interrupção mecânica da membrana plasmática e são semelhantes às fibras permeabilizadas em termos de rendimento mitocondrial eintegridade 10. Os homogeneizadores teciduais também minimizam as limitações da difusão de oxigênio e podem ser facilmente empregados entre os tipos de tecidos através da otimização da força mecânica11,12.
Aqui, delineamos um método simples e rápido para quantificar as taxas de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e capacidade de transferência de elétrons (ET) em homogeneizadores de tumores sólidos recém-extirpados. O protocolo é projetado para avaliar o tecido fresco usando o respirômetro de alta resolução oxygraph-2k (O2k), que requer conhecimento prévio de configuração instrumental e calibração, mas pode ser adaptado da mesma forma usando qualquer eletrodo do tipo Clark, analisador de cavalo marinho ou leitor de placas. O protocolo pode ser aplicado de forma reprodutivelmente entre espécies e tipos de tumores, bem como adaptado para avaliar uma diversidade de vias et mitocondriais.
As abordagens para avaliar a respiração mitocondrial no câncer têm sido em grande parte limitadas aos modelos in vitro 13,14,15,16. Algum sucesso foi alcançado na medição da respiração mitocondrial em tumores usando permeabilização química6,7,17, mas não há uma abordagem uniforme e padrão-ouro que possa ser universalmente aplicada e comparada entre os tipos de tumores. Além disso, a falta de análise e relatório de dados consistentes tem generalizabilidade e reprodutibilidade de dados limitados. O método aqui descrito fornece uma abordagem simples e relativamente rápida para medir a respiração mitocondrial18 em preparações mitocondriais de amostras de tumores sólidos recém-extirpados. Os tumores foram cultivados a partir de murina luminal b, ERα-negativo EO771 células cancerígenas mamárias19.
A diligência e o cuidado com o manuseio de tecidos melhorarão muito a precisão e a normalização das taxas de consumo de oxigênio. O tecido e as mitocôndrias podem ser facilmente danificados se a amostra não for mantida fria, não estiver consistentemente submersa em meios de preservação, ou for excessivamente manuseada, resultando em rotina subótima e taxas de OXPHOS. Além disso, o peso úmido preciso do tecido homogeneizado é de importância crítica, pois este é o método primário de normalização. Outros métodos de normalização podem ser considerados, como proteína total ou marcadores específicos mitocondriais, como a atividade de sinthase citrato20. Além disso, a heterogeneidade tecidual precisará ser abordada, com decisões sobre regiões tumorais para incluir em experimentos feitos a priori. O tecido necrosado, fibroso e conjuntivo não pode homogeneizar e/ou respirar bem e deve ser evitado a menos que intencionalmente testenize essas regiões tumorais. Notavelmente, o tumor pode ser muito pegajoso dependendo do tipo e região de excisão, tornando a pesagem precisa e a transferência mais desafiadora. O número de derrames utilizados para homogeneizações deve ser otimizado para garantir a preparação completa das mitocôndrias, ao mesmo tempo em que mitiga danos às membranas mitocondriais externas.
Para maior precisão e reprodutibilidade, recomendamos que sejam realizados experimentos de otimização para o número de derrames para preparação homo homogene, concentração de tecido e substrato, desacoplador, inibidor. Estudos podem comparar o número diferente de derrames e como correspondem à resposta à adição de citocromo c dentro do estudo, bem como a capacidade respiratória mitocondrial máxima 21. Embora exista uma aceitação geral de que a resposta c menos citocromocômo é melhor, pois um aumento no consumo de oxigênio após a adição de citocromo c pode indicar danos à membrana mitocondrial externa, não há padrão-ouro quanto ao que é esse limiar para cada tecido e deve ser investigado experimentalmente para garantir que o tecido não esteja sendo sobrecarregado ou despreparado. Neste tecido tumoral, verificou-se que uma resposta citocromática c em ~30% não prejudicou a função respiratória. O uso do citocromo c torna-se fundamental para uma quantificação precisa da capacidade respiratória se o teste for positivo. Neste caso, a adição repõe citocromo endógeno c, o que, se esgotado, causará uma subestimação das taxas respiratórias.
Experimentos de titulação de concentração de tecidos podem ser realizados em uma série de concentrações viáveis e, idealmente, seriam feitos com SUITs que serão investigados durante o estudo. A capacidade respiratória vai variar de acordo com o tipo de tumor e composição. Assim, tumores densos com mitocôndrias ou alta capacidade respiratória exigirão concentrações mais baixas (0,5-5 mg/mL). Tumores com poucas mitocôndrias ou baixa capacidade respiratória exigirão concentrações mais elevadas (7-12 mg/mL). Além disso, os SUITs que são longos ou têm substratos altamente consumidos podem precisar de menos tecido para evitar a reoxigenação da câmara ou limitação de ADP. Alguns tecidos terão uma relação linear no consumo de oxigênio, enquanto outros mostrarão melhor sensibilidade e oxidação máxima em determinadas faixas de concentração. A concentração de tecido escolhida deve ser otimizada para maximizar o fluxo de oxigênio, limitando o número de eventos de reoxigenação. Além disso, muitas vezes é melhor superestimar a necessidade ou mirar para a extremidade superior da faixa de concentração. Os inibidores, essenciais para a quantitação de fluxos respiratórios, são mais precisos quando usados em piscinas maiores de mitocôndrias.
Outra consideração essencial é a concentração das drogas que são utilizadas durante os protocolos. Alterações na concentração homogeneizado podem alterar as concentrações de substratos, desacopladores e inibidores necessários para a resposta máxima. Assim, uma vez escolhida a faixa de concentração ideal, deve ser realizado um teste de experimentos das doses necessárias para o protocolo SUIT. ADP adicional pode ser adicionado para garantir que as concentrações de adenilato não sejam limitantes a fluxos respiratórios. Desacopladores químicos como FCCP ou CCCP inibirão a respiração em concentrações mais elevadas22. Como tal, é essencial titular em pequenas quantidades para revelar a taxa máxima alcançada. Inibidores, como rotenona e antimicina A, são melhor utilizados quando saturados dentro da primeira injeção. Embora as concentrações ideais tenham sido determinadas em experimentos preliminares, também observamos diferenças relacionadas ao tratamento em resposta aos inibidores e, portanto, muitas vezes adicionamos uma injeção adicional de inibidores para demonstrar inibição máxima, pois as taxas resultantes servem como base para quantificação. A inibição química do Ascorbate/TPMD é essencial para uma redução analítica precisa, pois o TMPD sofre autooxidação23. Controlamos a auto-oxidação de ascorbate/TMPD/citocromo c através da adição de azida de sódio, um inibidor de CIV estabelecido. Para os estudos do Km, a adição de rotenona na presença de succinato por si só previne o acúmulo de oxaloacetato que pode inibir a atividade desidrogenase de succinato em baixas concentrações24. O volume e a concentração de ADP são altamente dependentes da sensibilidade das mitocôndrias à combinação de substrato predominante. Preparações mitocondriais altamente sensíveis ao ADP exigirão concentrações iniciais mais baixas. Além disso, produtos químicos validados e preparação adequada de medicamentos com atenção ao pH, sensibilidade à luz, se aplicável, e temperatura de armazenamento são essenciais para experimentos bem sucedidos.
A configuração dos instrumentos e os cuidados rotineiros são de fundamental importância para o sucesso desses experimentos. A limpeza adequada e adequada das câmaras é essencial para a reprodutibilidade e prevenção da contaminação biológica, proteica, inibidora ou desacopladora. Eletrodos do tipo Clark e sistemas O2k utilizam câmaras de reação de vidro, o que é uma vantagem significativa de custo para sistemas baseados em placas que dependem de consumíveis. No entanto, as câmaras de vidro devem ser vigorosamente limpas e podem ser uma fonte de contaminação inibidora em estudos subsequentes. A incubação com espécimes ricos em mitocôndrias durante o processo de lavagem (mitocôndrias isoladas do coração ou fígado, por exemplo) pode reduzir o risco de contaminação experimental e é recomendada, além de procedimentos de diluição e lavagem à base de álcool. Se são realizados estudos consecutivos, a limpeza com etanol e mitocôndrias minimiza a possibilidade de contaminação inibidora. A calibração do sensor de oxigênio é recomendada antes de cada experimento para obter medições precisas da respiração em relação à pressão parcial predominante do oxigênio. Se várias calibrações não forem viáveis, uma calibração por dia pode ser suficiente se a concentração de oxigênio permanecer estável e consistente após o procedimento de lavagem.
Os procedimentos descritos acima alavancam o instrumento Oroboros O2k para medir o consumo de oxigênio no tecido tumoral dentro de 4 horas após a excisão tumoral utilizando solução de preservação previamente projetada e otimizada e mídia de respiração25,26,27. Vários parâmetros neste protocolo podem ser modificados para aplicações subsequentes. A configuração e calibração do instrumento, os homogeneizadores utilizados para a preparação do tecido e a ótima concentração de oxigênio homogêneo e de câmara podem ser adaptados para uso em outros instrumentos com potencial de monitoramento de oxigênio. Por exemplo, as câmaras foram ligeiramente preenchidas ao adicionar homogeneização, e assim, quando a câmara está totalmente fechada, a câmara capilar permanece cheia. Isso vai consumir um pouco de oxigênio na câmara, mas com a otimização da concentração amostral, podemos explicar esse consumo na determinação do nível de oxigênio para começar. Alternativamente, a amostra pode ser permitida a equilibrar-se com oxigênio ambiente antes que a câmara seja fechada, mas isso muitas vezes aumentará a quantidade de tempo antes do experimento começar e atrasará a adição de substratos. Embora os homogeneizadores utilizados neste protocolo sejam amplamente acessíveis, outras técnicas de homogeneização comercial poderiam ser empregadas, como um triturador de tecido ou homogeneizador automatizado28.
Além disso, os procedimentos de preparação e instrumento tecidual podem ser utilizados com uma série de SUITs diferentes para estudar o controle respiratório por uma diversidade de estados de acoplamento e controle de vias29. Estes protocolos SUIT foram desenvolvidos para medir a capacidade funcional e, portanto, a contribuição de substratos endógenos potenciais não tem impacto na medição da capacidade. Explicamos analiticamente o consumo não mitocondrial de oxigênio e/ou o consumo residual do homogeneizar através da subtração da antimicina A-rotenona, ou taxas insensíveis de azida de sódio, conforme apropriado. Mitocôndrias podem permanecer viáveis em BIOPS ou soluções de preservação construídas da mesma forma por longos períodos de tempo (>24 h) dependendo do tipo de tecido e da intactidade30,31. Estudos podem ser realizados com antecedência para determinar os limites de armazenamento temporal, pois o OXPHOS de certos substratos pode ter limitações diferentes. Isso é essencial se o experimento não puder ser realizado dentro de várias horas de excisão/biópsia tecidual. 37°C é uma temperatura ótima e fisiológica para a avaliação da função respiratória na maioria dos sistemas de mamíferos. No entanto, se a temperatura do ensaio parecer interferir na avaliação32,estudos comparativos podem ser realizados em uma ampla faixa de temperatura (25-40 °C) para garantir a resposta adequada. Restrições instrumentais podem limitar a capacidade de realizar tais estudos.
As principais limitações do método acima descritas são 1) o potencial de dano às mitocôndrias através da homogeneização mecânica, 2) presença de ATPases ou outros bioquímicos subcelulares em preparações homogeneizadas que podem interferir na determinação simultânea de ATP ou outras variáveis de interesse e podem exigir métodos adicionais de correção ou uso inibidor33 , e 3) a avaliação de muitas amostras e/ou SUITs múltiplos por amostra é demorada, pois um instrumento pode acomodar dois experimentos por vez e requer limpeza e configuração entre experimentos sucessivos. Experimentos de otimização e preparação consistente de amostras podem minimizar danos mitocondriais substanciais que contribuiriam para dados inconsistentes.
A significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos é a melhor viabilidade em comparação com a quantidade de material inicial, desafio de isolar mitocôndrias ou desafio técnico no tecido permeabilizante. A preparação dos homogeneizadores é mais rápida, o oxigênio não é tão limitador, e é menos suscetível à variabilidade entre o pessoal em comparação com o tecido permeabilizado. É importante ressaltar que quase todos os tipos de amostra são adequados para a preparação homogênea que permite a análise comparativa entre tecidos. Respirometria de alta resolução é a medida padrão-ouro de OXPHOS mitocondrial e ET. A aplicação desse método em pesquisas pré-clínicas e clínicas de câncer tem a capacidade de expandir as investigações in vitro atuais para estudos ex vivo. Além disso, oferece aplicações potenciais em configurações clínicas e diagnósticas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao centro de pesquisa biomédica pennington equipe núcleo de biologia comparativa para o cuidado com os animais. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Instituto Nacional de Saúde do Instituto Nacional de Saúde do U54GM104940 (JPK) e do KL2TR003097 (LAG). Todos os experimentos e procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |