Котрансляционные взаимодействия играют решающую роль в модификациях зарождающейся цепи, нацеливании, складывании и сборке путей. Здесь мы описываем селективное профилирование рибосом, метод in vivo, прямого анализа этих взаимодействий в модели eukaryote Saccharomyces cerevisiae.
В последние годы стало очевидно, что рибосомы не только расшифровывают нашу мРНК, но и направляют появление полипептидной цепи в переполненную клеточную среду. Рибосомы обеспечивают платформу для пространственного и кинетически контролируемого связывания мембранно-целевых факторов, модифицирующих ферментов и складных шаперонов. Недавно было обнаружено, что даже сборка в олигомерные комплексы высокого порядка, а также этапы формирования белково-белковой сети координируются с синтезом.
Здесь мы описываем селективное профилирование рибосом, метод, разработанный для захвата котрансляционных взаимодействий in vivo. Мы подробно расскажем о различных этапах очистки аффинности, необходимых для захвата рибосомно-зарождающихся цепных комплексов вместе с котрансляционными интеракторами, а также об извлечении мРНК, исключении размера, обратной транскрипции, глубоком секвенировании и шагах анализа больших данных, необходимых для расшифровки котрансляционных взаимодействий в почти кодонном разрешении.
Selective Ribosome Profiling (SeRP) является единственным методом на сегодняшний день, который захватывает и характеризует котрансляционные взаимодействия in vivo прямым образом 1,2,3,4,5,6. SeRP позволяет глобально профилировать взаимодействия любого фактора с трансляцией рибосом в близкое к кодону разрешение 2,7.
Метод основан на мгновенном замораживании растущих клеток и сохранении активной трансляции. Клеточные лизаты затем обрабатывают РНКазой I для переваривания всех мРНК в клетке, за исключением защищенных рибосомами фрагментов мРНК, называемых «следами рибосом». Затем образец разбивается на две части; одна часть непосредственно используется для выделения всех клеточных рибосомных следов, представляющих всю текущую трансляцию в клетке. Вторая часть используется для аффинно-очистки специфического подмножества рибосом, связанных с интересующим фактором, например: модифицирующими ферментами, транслокационными факторами, складчатыми шаперонами и комплексосборочными взаимодействиями. Аффинно-очищенные рибосомные следы в совокупности называются интерактомом. Затем мРНК, защищенные рибосомами, извлекаются и используются для генерации библиотеки кДНК с последующим глубоким секвенированием.
Сравнительный анализ общих образцов транслейтома и интерактома позволяет идентифицировать все орфы, которые связаны с интересующим фактором, а также охарактеризовать каждый профиль взаимодействия орф. В этом профиле сообщается о точных последовательностях начала и окончания зацепления, из которых можно вывести декодированные кодоны и соответствующие остатки возникающей полипептидной цепи, а также об изменениях скорости рибосом во время взаимодействия 7,8. На рисунке 1 протокол показан в виде схемы.
Рисунок 1: Обзор протокола SeRP. Этот протокол может быть выполнен в полном объеме в течение 7-10 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Здесь протокол детализирует подход селективного профилирования рибосом для захвата котрансляционных взаимодействий в разрешении, близком к кодону. Поскольку рибосома поднимается как узел для координации появления зарождающейся цепи в переполненной цитоплазме, это является важным …
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории за плодотворные дискуссии и Мухаммада Махзуми за критическое прочтение рукописи. Эта работа финансировалась грантом ISF (Израильский научный фонд) 2106/20.
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide | IDT | custom order | RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3' |
Absolute ethanol | VWR | 20821 | |
Acid phenol–chloroform | Ambion | AM9722 | |
Antibody: mouse monclonal anti-HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
Aprotinin | Roth | A162.3 | |
ATP* | NEB | P0756S | 10 mM |
Bacto agar | BD | 214030 | |
Bacto peptone | BD | 211820 | |
Bacto tryptone | BD | 211699 | |
Bacto yeast extract | BD | 212720 | |
Bestatin hydrochloride | Roth | 2937.2 | |
Chloroform | Merck | 102445 | |
CircLigase II ssDNA Ligase* | Epicentre | CL9025K | 100 U/μL |
Colloidal Coomassie staining solution | Roth | 4829 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 29384100 | |
Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
DEPC treated and sterile filtered water* | Sigma | 95284 | |
D-Glucose anhydrous | Merck | G5767-500G | |
Diethylpyrocarbonate | Roth | K028 | |
Dimethylsulfoxide* | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* | Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
DNA loading dye* | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6× |
DNase I, recombinant | Roche | 4716728001 | RNAse free |
dNTP solution set* | NEB | N0446S | |
EDTA* | Roth | 8043 | |
Glycerol | VWR | 24388.260. | |
Glycine solution | Sigma-Aldrich | 67419-1ML-F | 1 M |
GlycoBlue | Ambion | AM9516 | 15 mg/mL |
HEPES | Roth | HN78.3 | |
HF Phusion polymerase* | NEB | M0530L | |
HK from S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
Hydrochloric acid | AppliChem | A1305 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 33539 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Roth | CN08 | |
Kanamycin | Roth | T832.4 | |
KCl | Roth | 6781.1 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
Linker L(rt) | IDT | custom order | |
Liquid nitrogen | |||
MgCl2 | Roth | KK36.3 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.2 | |
Na2HPO4·2H2O | Roth | T879.3 | |
NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
NaH2PO4·H2O | Roth | K300.2 | |
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads | GE Life Sciences | 17090601 | |
Nonidet P 40 substitute | Sigma | 74385 | |
Pepstatin A | Roth | 2936.2 | |
Phenylmethyl sulfonyl fluoride | Roth | 6367 | |
Precast gels | Bio-Rad | 5671034 | 10% and 12% |
RNase I | Ambion | AM2294 | |
SDS, 20% | Ambion | AM9820 | RNase free |
Sodium acetate* | Ambion | AM9740 | 3 M, pH 5.5 |
Sodium azide | Merck | S8032-100G | |
Sodium chloride | Roth | 9265 | |
Sodium hydroxide* | Sigma | S2770 | 1 N |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Superscript III Reverse Transciptase* | Invitrogen | 18080-044 | |
SYBR Gold* | Invitrogen | S11494 | |
T4 polynucleotide kinase* | NEB | M0201L | |
T4 RNA ligase 2* | NEB | M0242L | |
TBE polyacrylamide gel* | Novex | EC6215BOX | 8% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC68752BOX | 10% |
TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC6885BOX | 15% |
TBE–urea sample buffer* | Novex | LC6876 | 2× |
Tris | Roth | 4855 | |
Tris* | Ambion | AM9851 | 1 M, pH 7.0 |
Tris* | Ambion | AM9856 | 1 M, pH 8.0 |
UltraPure 10× TBE buffer* | Invitrogen | 15581-044 | |
* – for library preparation | |||
gasket and spring clamp , 90 mm, | Millipore | XX1009020 | |
ground joint flask 1 L , | Millipore | XX1504705 |