Summary

Глобальная идентификация сетей котрансляционного взаимодействия путем селективного профилирования рибосом

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

Котрансляционные взаимодействия играют решающую роль в модификациях зарождающейся цепи, нацеливании, складывании и сборке путей. Здесь мы описываем селективное профилирование рибосом, метод in vivo, прямого анализа этих взаимодействий в модели eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

В последние годы стало очевидно, что рибосомы не только расшифровывают нашу мРНК, но и направляют появление полипептидной цепи в переполненную клеточную среду. Рибосомы обеспечивают платформу для пространственного и кинетически контролируемого связывания мембранно-целевых факторов, модифицирующих ферментов и складных шаперонов. Недавно было обнаружено, что даже сборка в олигомерные комплексы высокого порядка, а также этапы формирования белково-белковой сети координируются с синтезом.

Здесь мы описываем селективное профилирование рибосом, метод, разработанный для захвата котрансляционных взаимодействий in vivo. Мы подробно расскажем о различных этапах очистки аффинности, необходимых для захвата рибосомно-зарождающихся цепных комплексов вместе с котрансляционными интеракторами, а также об извлечении мРНК, исключении размера, обратной транскрипции, глубоком секвенировании и шагах анализа больших данных, необходимых для расшифровки котрансляционных взаимодействий в почти кодонном разрешении.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) является единственным методом на сегодняшний день, который захватывает и характеризует котрансляционные взаимодействия in vivo прямым образом 1,2,3,4,5,6. SeRP позволяет глобально профилировать взаимодействия любого фактора с трансляцией рибосом в близкое к кодону разрешение 2,7.

Метод основан на мгновенном замораживании растущих клеток и сохранении активной трансляции. Клеточные лизаты затем обрабатывают РНКазой I для переваривания всех мРНК в клетке, за исключением защищенных рибосомами фрагментов мРНК, называемых «следами рибосом». Затем образец разбивается на две части; одна часть непосредственно используется для выделения всех клеточных рибосомных следов, представляющих всю текущую трансляцию в клетке. Вторая часть используется для аффинно-очистки специфического подмножества рибосом, связанных с интересующим фактором, например: модифицирующими ферментами, транслокационными факторами, складчатыми шаперонами и комплексосборочными взаимодействиями. Аффинно-очищенные рибосомные следы в совокупности называются интерактомом. Затем мРНК, защищенные рибосомами, извлекаются и используются для генерации библиотеки кДНК с последующим глубоким секвенированием.

Сравнительный анализ общих образцов транслейтома и интерактома позволяет идентифицировать все орфы, которые связаны с интересующим фактором, а также охарактеризовать каждый профиль взаимодействия орф. В этом профиле сообщается о точных последовательностях начала и окончания зацепления, из которых можно вывести декодированные кодоны и соответствующие остатки возникающей полипептидной цепи, а также об изменениях скорости рибосом во время взаимодействия 7,8. На рисунке 1 протокол показан в виде схемы.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор протокола SeRP. Этот протокол может быть выполнен в полном объеме в течение 7-10 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

1. Генерация штаммов для селективного профилирования рибосом ПРИМЕЧАНИЕ: Selective Ribosome Profiling (SeRP) – метод, который опирается на аффинную очистку интересующих факторов для оценки их способа взаимодействия с рибосомами-зарождающимися цепными комплексами. Гомологичн…

Representative Results

Как показано на блок-схеме этого протокола (рисунок 1), клетки выращивали до логарифмической фазы, а затем быстро собирали путем фильтрации и лизировали криогенным измельчением. Затем лизат был разделен на два: один для общих следов мРНК, защищенных рибосомами, а другой д…

Discussion

Здесь протокол детализирует подход селективного профилирования рибосом для захвата котрансляционных взаимодействий в разрешении, близком к кодону. Поскольку рибосома поднимается как узел для координации появления зарождающейся цепи в переполненной цитоплазме, это является важным …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории за плодотворные дискуссии и Мухаммада Махзуми за критическое прочтение рукописи. Эта работа финансировалась грантом ISF (Израильский научный фонд) 2106/20.

Materials

3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* – for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. . Illumina Index Adapters – Pooling Guide Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019)
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

Play Video

Cite This Article
Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

View Video