Summary
シロイヌズナ(シロイヌズナ)種子の表面滅菌のためのハイスループットプロトコルが提供され、真空ポンプで構成された簡単な吸引装置で液体処理ステップを最適化する。何百もの種子サンプルを1日で表面滅菌することができます。
Abstract
シロイヌナズナは、機能研究に最も広く使用されている植物モデル種です。シロイヌナズナの種子の表面滅菌は、この目的に向かって必要とされる基本的なステップです。したがって、数十~数百個のサンプル(トランスジェニックライン、エコタイプ、または変異体)を一度に処理するハイスループットシロイヌナズナシス種子表面滅菌法を確立することが最も重要です。一般的な真空ポンプから構築された自家製の吸引装置を用いたチューブ内の液体の効率的な除去に基づく種子表面滅菌法を本研究で紹介する。この方法で、1日に数百個のサンプルを処理することで、労働集約的なハンズオン時間を劇的に短縮することで、少しの労力で可能になります。シリーズタイムコース分析は、高い発芽率を維持することにより、表面滅菌の非常に柔軟な時間範囲をさらに示しました。この方法は、種子サイズに応じて吸引装置の簡単なカスタマイズ、および液体を排除するために望まれる速度で、他の種類の小さな種子の表面滅菌に容易に適応することができる。
Introduction
シロイヌナズナは、ブラッシカ科に属する二分植物種です。その比較的短いライフサイクル(長い日の成長条件下で一世代あたり2ヶ月)、小さな植物のサイズ、および植物ごとに何百もの種子の生産と自己受粉は、それを最初の基本的な植物モデル種1、2にしました。さらに、そのゲノムは完全に配列3であり、広範な逆遺伝学ツール(飽和T-DNA、トランスポゾン、および化学的変異体化された集団)が利用可能である4、5、6、および効果的なアグロバクテリウム媒介変換は、さらに下流作業のための十分なトランスジェニックラインを得るために十分確立されている7 .したがって、過去20年間に、自然、遺伝的、表現型のバリエーション8、9を含む分子レベルで植物生物学の多様な側面を解剖するためのモデル種としてシロイヌナズナシスを使用して大きな進歩が達成されました。
シロイヌナズナの目的の遺伝子を機能的に特徴付けるためには、種子表面滅菌は、無菌培養を必要とする多くの下流プロトコルの前提条件となる真菌および細菌汚染物質を排除する。過剰発現10に対する遺伝的形質転換は、ノックダウン(RNA-I11)またはノックアウト(ゲノム編集12、13)の遺伝子機能、細胞内局在化14、プロモーター活性15、16、タンパク質タンパク質17およびタンパク質-DNA相互作用18の、最も一般的な用途のみを引用し、すべて種子表面滅菌工程を必要とする。したがって、その相対的な単純さにもかかわらず、種子表面滅菌は、多くの機能解析において基本的な役割を果たす。
これまで、2つの主要なカテゴリーの種子表面滅菌方法が、気相滅菌法または液相滅菌法19に基づいて開発されてきた。ガス相シード表面滅菌のスループットは中~高であるが、有害試薬塩素ガスを表面殺菌剤として用いることは、その広い用途を妨げている。逆に液相殺菌に基づく方法は、表面殺菌のためにエタノールや漂白剤溶液のような穏やかな化学物質に依存しており、塩素燻蒸よりも本質的に低い効率を有するにもかかわらず、より広く使用されています。一般に、液体試薬を用いる2つの異なる方法が一般的に使用されている。1つの主に使用される方法は、時間20、21の異なる期間の異なる濃度でエタノールと漂白剤で洗浄に基づいている。別の方法は、漂白剤のみの21、22の適用に基づいています。どちらの方法も主に小規模な種子表面滅菌に適用されます。しかしながら、多くの実験において、1つの変換15、23、または画面から得られる多くのシロイヌナズナのトランスジェニックラインを、異なる変換24,25から生成される多くのトランスジェニックラインを並行してスクリーニングする必要がある。我々の知る限りでは、高スループット種子表面滅菌のための液体ベースの方法は公開されておらず、これはほとんど認識されていないが、機能的ゲノミクスのアプローチのための重要なボトルネックである。したがって、種子表面滅菌のための安全で堅牢で高スループットな方法を開発することは、一度に多くの遺伝子の機能的特性評価の成功に向けて必要かつ重要なステップです。
この目的のために、現在の研究では、シロイヌナズナの種子の表面滅菌のための改善された方法が提示される。この方法は安全で、低コストで、非常に堅牢で、高スループットで、種表面滅菌の初めからペトリ皿の種子播種の終わりまで1時間以内に96本の独立したラインを取り扱うことを可能にします。この方法は、真空ポンプ、消耗品、プラスチック製品などの広く利用可能な基本的な実験室機器に依存しています。この改良された方法は、シロイヌナプシスおよび他の非モデル植物種における近代的な機能的ゲノミクスアプローチに十分なスループットを備えた種子表面滅菌を合理化するための安全でシンプルで手頃な価格のアプローチを科学界に提供する。
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Protocol
1. 試薬および媒体調製
- 70%エタノール溶液を調製:蒸留水263mLに95%のテクニカルエタノールの737 mLを加えます。よく混ぜます。
注:無菌の作業台に70%エタノール溶液を準備してください。
注意:エタノールは非常に可燃性であり、目に深刻な刺激を引き起こす可能性があります。炎や熱源から遠ざけてください。目に触れた場合は、豊富な水ですすいでください。 - 5%漂白液を調製する:家庭用漂白剤5mL(次亜塩素酸ナトリウム、NaClOの約3.5%を含む)を95mLの滅菌蒸留水に加えます。非イオン性洗剤(例えば、Tween 20)を数滴加え、十分に混ぜます。
注:ラミナーフードの中に5%の漂白剤溶液を準備してください。
注意:漂白剤の活性成分である次亜塩素酸ナトリウムは、非常に刺激性が高い。それは非常に腐食性であり、胃腸管に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。接触した場合は、すぐに豊富な水ですすいでください。摂取の場合は、毒物管理センターまたは医師に相談して治療のアドバイスを受けてください。 - ハーフストレングスムラシゲとスクーグ(1/2 MS)培地26を準備します。
- 蒸留水800mLにMS培地パウダー2.2g(ビタミンを含む)と10gのスクロースを加えます。1 M KOH を使用して溶液の pH を調整し、蒸留水を使用して 1 L までの体積を持って下さい。アリコート500mLを1Lボトルに入れ、4gの寒天を加えて固体培地を調製する。ソリューションをオートクレーブします。
- オートクレーブした後、水浴で媒体を50〜53°Cに冷却し、層流フードの下のペトリ皿に注ぎます。選択培地を調製するには、50mg/mLカナマイシンストック溶液の1000μL/Lを加える(蒸留水10mLに500mgのカナマイシン硫酸一水和物を混ぜ、フィルター滅菌して-20°Cで保存する)培地(50-53°C)に入れる。渦巻いてよく混ぜ、前に述べたようにペトリ料理に注ぎます。
2. 吸引器のセットアップ
メモ: 計測器のセットアップは 図 1に要約されています。
- 真空ポンプの入口を適当なサイズのポリエチレン(PE)チューブの一端に接続します。チューブのもう一方の端を、デカンテーションボトルの双方向蓋の出口に接続します。チューブの接合部を密閉フィルム(材料表)でしっかりと包み込み、気密接続を確保します。
- 2番目のPEチューブをデカンテーションボトルのスクリューキャップの入口(ボトルの内側に突き出た穴)に接続します。チューブの反対側を水槽バルブの出口に合わせます。必要に応じて、接合部に沿ってシールフィルムで包み、空気漏れを除去します。
- 使用直前に、薄層流れフードの下の水槽フィルターの入口に滅菌200 μLピペットチップを取り付けます。
図1:滅菌液の高スループット除去用吸引装置の模式図。わかりやすくするために、単一の部品はスケールに描画されません。レター(A)は真空ポンプ、(B)リザーバーボトルが液体(エタノール、漂白剤、滅菌水)を集め、液体の還流を避けるバルブ、滅菌200μLピペットチップ、および(E)種子および滅菌液を含む1.5 mLマイクロ遠心チューブを示す。矢印は、気流の方向を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
種子の3スループットの高い液体表面滅菌
注:全体的な手順と 96 独立したサンプルを持つヒリン野生型(Col-0)(シロイヌナズナシス)種子の表面滅菌に必要な最小の時間を 図2にまとめます。
- 永久的なマーカーの48 x 1.5 mLのマイクロ遠心分離管の2つのバッチが進歩的な数とラベル。
- 96個の無菌1.5 mLマイクロ遠心分離チューブ(チューブの円錐端の底面から約1〜2mm)のそれぞれに100-200シビジ種子を加えます。
- アリコート 70% エタノールの約 1000 μL を各チューブに 10 mL の滅菌血清学的ピペットを使用して、ラミナーフローフード (シード バッチ 1,48 チューブ) を使用し、慎重に蓋を閉じます。
注:分配された容積が種子の量の数倍高い限り、ソリューションを分配することは非常に正確である必要はありません。あるいは、このステップを層状フードの外側(非滅菌状態)で行う。 - シェーカーで少なくとも3分間、8.0 Hzの振動周波数でチューブを振ります。
- シェーカーからアダプターを取り外し、ベンチトップマイクロ遠心分離機のバスケットに移します。
- パルス関数(ほとんどのベンチトップ遠心分離機に存在する)を使用して種子を素早くスピンダウンし、1880 x g(〜15 s)に達します。
注: 長い時間またはそれ以上の遠心力は、種子の発芽に悪影響を与えます。 - アダプターから 48 個のチューブを 1 つのラックに移し、すべてのチューブを層流フードの下に開きます。チューブに取り付けられる蓋の部分に触れないでください。蓋が互いに近すぎる場合は、チューブを2つのラックに分割して取り扱いが容易にします。
- 滅菌200 μL黄色の先端を、ラミナーフローフードの下の自家製アスピレーターのアクアリウムバルブ入口に取り付け、ポンプのスイッチを入れます。
- 黄色の先端を種子のレベルのすぐ上に挿入して、液体を吸うときに種子に触れないようにします。または、先端をチューブの下部に素早く配置します。種子が液体の吸引をブロックする場合は、黄色の先端を排除し、新しいものを挿入します。
- アリコートは、層流フード内の10 mL滅菌血清学的ピペットを使用して、5%漂白剤の約1000 μLの各チューブに入る。
- すべての蓋をしっかりと閉じ、すべてのチューブをシェーカーアダプターに戻します。シェーカーで少なくとも3分間、8.0 Hzの振動周波数でチューブを振ります。
- 1880 x g (~15 s) に達するために必要な時間のベンチトップ遠心分離機のパルス関数を使用して、種子を素早くスピンダウンします。
- 新しい滅菌200 μL黄色の先端を、層流フードの下の真空ポンプに接続された水槽バルブに取り付け、ポンプをスイッチします。
- 漂白剤溶液を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルの上に黄色の先端を挿入します。
- アリコートは、層流フード内の10 mLの無菌血清ピペットを使用して、1000 μLの殺菌されたH2Oの周りに各チューブに入る。
注: 2 つのシード バッチを組み合わせて、操作時間を最小限に抑えます。 - 新しい滅菌200 μL黄色の先端を、層流フードの下の真空ポンプに接続された水槽バルブに取り付け、ポンプのスイッチを入れます。
- H2 Oを吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上に黄色の先端を挿入します。
- アリコートは、10 mLの滅菌血清学的ピペットを使用して、滅菌されたH2Oの約500 μLの各チューブに入り、層流フード内のすべての蓋を閉じる。種をまく準備ができています。必要に応じて、チューブを室温で数時間、または一晩4 °Cに保ちます。
- 十分な量の水で液体を収集するために使用される貯水池のボトルを充填し、それをオートクレーブ。その後、液体を通常のシンクに捨てます。
注:リザーバ内のすべての種子を殺すために液体をオートクレーブ。
図2:96個の独立サンプルを用いたシロイヌナズナ種子の表面滅菌に必要な手順と最小時間の概要。 提示された実験では、96個の独立したサンプルが2つの等しいサイズのバッチで処理されます。手順全体は両方のバッチで同じで、並列処理されますが、バッチ 2 はバッチ 1 と比較して 1 ステップの遅延で処理されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
4. 1/2 MSプレート上のシロイヌナズナのめっきとスコアリング
- 種子と300-400 μLの滅菌H2Oをペトリ皿に移し、1000 μLピペットで優しくピペットを入れます。
- 10本のチューブを移管した後、抗生物質なしで溶かした1/2 MS培地の1.5〜2.0 mLの周りに各プレートに注ぎます。
注:固まりを避けるために、予め溶融し、その後、50〜53°Cに設定されたサーモスタットバスに1/2 MS溶融培地を保ちます。種子の発芽性を低下させないために、温度が58°Cを超えないようにしてください。 - すぐにプレートを旋回して、その中に種子を分配します。反対側のプレートをテープで貼ります。
- プレートをプラスチックまたはアルミホイルで包み、暗闇の中で3日間冷蔵庫(4°C)に入れて均一な発芽を得ます。
- 100-120 μmol·m-2·s-1 と60%相対湿度の光強度で長い日の条件(16時間光/8時間暗)の下で23°Cに設定された成長チャンバーにプレートを移します。
- 2日後、ラジクルの存在によって植物をスコア付けします。ラジクルの出現と緑色のコチルドン形成(2つのコチルドンの完全な開口部)を検出して、種子の発芽を評価します。
5. 統計分析
注:ここでは、Tukeyの対次検定を統計的分析に使用しました。
- 0.01 未満の P 値は統計的に有意であると考えてください。少なくとも5つの生物学的複製ですべての実験を行う。
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Representative Results
種子滅菌手順全体に要する時間を評価するために、現在のプロトコルにおける液体処理96サンプルの時間差を計算し、従来のピペット法と比較した。この結果は、現在のプロトコルが時間を節約し、従来のプロトコルで液体処理時間をその 4 分の 1 に短縮することを示しています (表 1)。この表はさらに、現在のプロトコルの液体除去時間は、従来の方法よりも多くの時間を節約し、全体的に8倍の削減を行うことを強調しています。
種子滅菌の時間範囲の選択
長い殺菌ステップは汚染率を最小にするが、種子の発芽に悪影響を及ぼす可能性がある。汚染のない発芽率が最も高い種子滅菌の最良の時間範囲を決定するために、各滅菌ステップの異なる持続時間を試験し、種子発芽率と緑色コチルドン出現率の両方を評価した。2日目から4日目、7日目に行われた発芽分析では、70%エタノール滅菌の10分から40分までの時間範囲に有意な差は示さなかった。しかし、70%エタノールによる処理の40分から、発芽率は低下した(図3)。これに対応して、緑色のコチルドン出現率が低下した(図4)。短い滅菌時間は、スループットを増加させることができますが、汚染率を増加させる,48サンプルの2つのバッチで96の異なる種子サンプルを殺菌するために必要な最小時間を評価した。さらに、シェーカーで行われる振盪で好ましいセットアップを与え、我々は48サンプルの2つのバッチで96サンプルを取り扱うことによって、種子滅菌に必要な最小時間をテストした。一度に48サンプルを処理するために必要な最小時間は3分であり、したがって、48サンプルの第2のセットは、待ち時間なしで最初のセットの直後に処理することができます。したがって、70%エタノールに対して3分間、5%漂白剤に対して3分を、種子((a)を図3に殺菌する最小時間として適用した。これらの分析は、汚染や種子の活力の損失のない最高のものと同様の発芽率をもたらしました(図3)。
要約すると、微生物の十分な除去に由来する汚染のない種子発芽の最も高い割合を維持するための適切な時間範囲は、70%のエタノールに対して3〜30分、5%漂白剤の3〜22.5分の間である。
私たちが最初に使用した種子が微生物で汚染されていることを実証するために、非無菌種子をMSプレートに直接播種しました。2日間の播種後プレートに菌類が現れ、7日間の発芽後にプレート全体に広がった(補足図1)。
異なる種別遺伝子型間の交差汚染の評価
異なる種子サンプルを処理するための単一の無菌ピペットチップの使用がクロスコンタミネーションをもたらし得るかどうかを確認し、そのような交差汚染の量を評価するために、2つの異なる遺伝子型種子(Col-0野生型、カナマイシンに敏感、およびアラビナプシストランスジェニックラインAdoIspS-79、カンマイシン24に耐性)が交互に行われた。標準的な種子滅菌後、50mg/Lカナマイシンを加えずに半強度のMS固体プレートに播種した。実験は5回複製された。これらの分析は、カナマイシンを含むMSプレートで発芽した種子の約96%が、Col-0遺伝子型で播種されたプレートの発芽7日目 には緑色のコチルドンが観察されなかったことを示した(図5)。並行して、MSプレートに播種されたCol-0種子は約94%の発芽を示し、すべてのコチルドンは7日間の発芽後に緑色であった。これらの結果は、単一のピペットチップを使用して滅菌溶液を除去したにもかかわらず、サンプル間の汚染の持ち越しを示さない。
図3:異なる文字で示された異なる滅菌時間で播種2-、3-、4-および7日間のシロイヌナズナズの種子後の種子の発芽率。 a:70%エタノールの3分と5%漂白剤の3分、 b:70%エタノールの10分、5%漂白剤7.5分、c:70%エタノール20分、5%漂白剤の15分、d:70%エタノールの30分、5%漂白剤の22.5分、e:70%エタノールの40分、5%漂白剤の30分、 f:70%エタノール50分、5%漂白剤の37.5分、g:70分70%エタノール、5%漂白剤52.5分。2つの星は、Tukeyの対方向検定(p <0.01)に従って有意な差を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:7日間のシロイヌナズナ種子播種後の緑色のコチルドン率は、異なる文字で示された異なる滅菌時間で播種した。 a:70%エタノールの3分と5%漂白剤の3分、 b:70%エタノールの10分、5%漂白剤7.5分、c:70%エタノール20分、5%漂白剤の15分、d:70%エタノールの30分、5%漂白剤の22.5分、e:70%エタノールの40分、5%漂白剤の30分、 f:70%エタノール50分、5%漂白剤の37.5分、g:70分70%エタノール、5%漂白剤52.5分。2つの星は、Tukeyの対方向検定(p <0.01)に従って有意な差を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:コル-0野生型とAdoIspS-79種子の間の交差汚染アッセイ。 半強度MSプレート(左)でのCol-0発芽、50mg/Lカナマイシン(中央)を補った半強度MSプレートのコル-0、半強度MSプレートのAdoIspS-79に50mg/ Lカナマイシン(右)、スケールバー=1cm。5 つの複製のうちの 1 つの代表的なイメージを図に示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| プロシージャ | 現在のプロトコル (分) | 伝統的なピペッティング(分) |
| 液体1を追加する | 12 | 24 |
| 除去液 1 | 6 | 48 |
| トータル | 18 | 72 |
表1:96種サンプルの滅菌中の液体処理に要する最小時間の概要。 表は、現在のプロトコルと従来のピペットを使用するプロトコルを使用して、シード表面滅菌の主要なステップ全体で液体を追加および除去するために必要な合計時間(分)をリストしています。
補足図1:7日間のシロイヌナズナ種子播種後の汚染検出。 画像は、非無菌種子(水ですすがされた;左)と無菌種子(メインテキストに記載されているように表面滅菌を受ける;右)の汚染の程度を示しています。スケールバー= 1 cm. このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
種子の滅菌は、シロイヌナズナの機能研究の基本的なステップです。多くの異なる目的のために頻繁に行われますが、シロイヌズナでのハイスループット種子表面滅菌に関する限定的な研究が可能です。
これまで、最も高いスループットを有する方法の1つは、漂白剤と濃縮HClを混合して発生した塩素ガスを用いることで行なわれた。この方法は、限られた実務時間を必要としますが、それは人間に非常に有毒なガスを使用します27.また、表面滅菌する種子の数と表面種子滅菌の持続時間を慎重に制御する必要があります。種子が多すぎると、塩素ガスの投与量が種子コートに存在する微生物を完全に殺すには十分ではなく、種子バッチの広範な汚染をもたらす。一方、表面滅菌の持続時間が長すぎると、種子が殺されます。したがって、いくつかの利点にもかかわらず、燻蒸はシロイヌズナでの種子表面滅菌のための好みの方法ではない。
対照的に、28、29、30の利用可能なシロイヌズナの種子の表面滅菌のための液体ベースの方法の数があります。ただし、これらの方法の主な制限は、サンプル数が少ない場合にのみ使用でき、スループットに最適化されないことです。我々の知る限りでは、シロイヌナズナの種子のハイスループット表面滅菌に関する唯一の研究は、リンジー、B.E.ら31によって記述された。本研究では、著者たちは2つの異なる方法を提案した。著者らは、上記の塩素ガスを用いた1つのアプローチに加えて、5〜10分間の滅菌に適用される濃縮漂白剤溶液を用いた液体ベースの表面滅菌法を提案した。この方法は、異なる時間に異なる濃度の漂白剤を用いた表面種子滅菌のための最初の体系的な研究を提供し、対応する出力を分析したが、プロトコルはまだ改善することができた。まず、この方法は、オペレータや環境に有害であり得る高濃度の漂白剤を使用しました。第二に、高濃度漂白剤の利用により、最良の種子表面滅菌タイミングは5〜10分の間だけであり、プロトコルの完了のための狭い時間枠を提供する。さらに、漂白剤を除去するために、多くの洗浄工程が必要であったが、プロトコルを時間と仕事の両方にする必要があり、表面滅菌工程の短い時間範囲でスループットを制限した。
これらの制限をすべて克服し、これまでの作品の最良の側面を組み合わせるために、ここで説明した方法は、70%のテクニカルエタノールを用いて、さらに低い割合の漂白剤(5%)を用いて実施し、毒性および労働集約的な洗浄工程を減少させた。さらに、種子発芽の系統的分析は、発芽率に影響を与えることなく、種子表面滅菌のための3〜30分の間のより広い時間範囲を提供した。これにより、ワークフローを整理する柔軟性が高くなり、同時作業に従って表面滅菌時間を調整できます。さらに重要なことに、労働集約的なピペット化手順は、液体を添加するための血清学的ピペットを複数の分配によって置き換え、最も重要なのは、サンプル間の先端交換を必要としない単純な自家製吸引装置によって支援される非常に速い吸引方法によって置き換えられた。貯水池のボトルの存在を考えると、ピペットチップで不注意に熱望される可能性のある種子がボトルにデカン化されるため、ライン間の交差汚染は実験的に観察されなかった。滅菌先端とチューブの間のアダプターとして使用される弁は、種子を含むチューブに戻って流れることなく、液体が回収ボトルに吸引されることを保証するために特別に選択した。このように、この方法は、容易な取り扱いと時間節約と種子表面滅菌手順を劇的に改善した。
結論として、このプロトコルは、安価で簡単にどのラボで設定できる、シロイヌナプシス種子の表面滅菌のための安全で、非常に時間の柔軟性、低労働、時間節約のアプローチを科学界に提供します。さらに、この方法は、種子サイズに応じて最終的に滅菌チップ、アダプター、チューブを変更することによって、他のタイプの小さな種子の表面滅菌にも適用することができます。特に、この方法は、いくつかのブラッシカ科種(例えば、カルダミンインパチエンスL.、ベルテロアインカナ(L.)DC.、カペラブルサ-パスティス(L.)メディカス、アリア・ペティオラタ(M.ビーバースタイン)カヴァラ・エ・グランデなど、変更なしで使用されました。 L.シード。この方法は、遠心分離の速度/時間および表面滅菌処理の長さの正確な決定が確立できる限り、蘭のようなさらに小さな種子に適用することもできる32。
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Disclosures
すべての著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、フォンダツィオーネ・E・マッハのエコゲノミクス・グループのコア・ファンドを通じてトレント自治州から資金提供を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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