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Biochemistry

मानव कोशिकाओं में अंतर्जात फॉस्फोराइलेटेड स्टेट प्रोटीन के मापन के लिए समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण Assays

Published: September 9, 2021 doi: 10.3791/62915
Automatic Translation
1, 1, 1
1BioAuxilium Research

Summary

समय हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण सेल आधारित परख प्रोटोकॉल सरल, विशिष्ट, संवेदनशील, और अंतर्जात फॉस्फोराइलेटेड सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन (STAT) के उत्प्रेरक के मजबूत परिमाणीकरण के लिए वर्णित कर रहे हैं 1/3/4/5/6 एक 384 अच्छी तरह से प्रारूप में सेल lysates में प्रोटीन.

Abstract

जेनस किनेज (जेएके)/सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन (एसटीएटी) सिग्नलिंग पाथवे के उत्प्रेरक साइटोकिन्स और विकास कारकों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। स्टेट प्रोटीन मुख्य रूप से जेएके द्वारा मध्यस्थता टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन द्वारा सक्रिय होते हैं। स्टेट सिग्नलिंग मार्गों की असामान्य सक्रियता कई मानव रोगों, विशेष रूप से कैंसर और प्रतिरक्षा से संबंधित स्थितियों में फंस गई है। इसलिए, देशी सेल सिग्नलिंग वातावरण के भीतर स्टेट प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन की निगरानी करने की क्षमता अकादमिक और दवा खोज अनुसंधान दोनों के लिए महत्वपूर्ण है। पारंपरिक परख फॉस्फोराइलेटेड STAT प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपलब्ध प्रारूपों पश्चिमी blotting और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) शामिल हैं. ये विषम तरीके श्रम-गहन, कम-थ्रूपुट हैं, और अक्सर पश्चिमी ब्लोटिंग के मामले में विश्वसनीय (विशिष्ट) नहीं होते हैं। सजातीय (नो-वॉश) विधियां उपलब्ध हैं लेकिन महंगी रहती हैं।

यहां, विस्तृत प्रोटोकॉल संवेदनशील, मजबूत, और लागत प्रभावी माप के लिए फॉस्फोराइलेटेड STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699), और STAT6 (Y641) के अंतर्जात स्तरों के अंतर्जात स्तरों के 384-अच्छी तरह से प्रारूप में प्रदान किए जाते हैं, जो उपन्यास थंडर टाइम-हल किए गए Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (TR-FRET) प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके अनुयायी या निलंबन कोशिकाओं से सेल लिसेट में हैं। सेलुलर परख के लिए वर्कफ़्लो सरल, तेजी से है, और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए डिज़ाइन किया गया है। परख प्रोटोकॉल लचीला है, एक कम मात्रा के नमूने (15 μL) का उपयोग करता है, केवल एक अभिकर्मक इसके अलावा कदम की आवश्यकता है, और कम थ्रूपुट और उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रत्येक फॉस्फो-स्टेट सैंडविच इम्यूनोएसे को ज्ञात एगोनिस्ट और अवरोधकों के साथ अनुकूलित परिस्थितियों में मान्य किया जाता है और अपेक्षित फार्माकोलॉजी और जेड-फैक्टर मूल्यों को उत्पन्न करता है। चूंकि टीआर-फ्रेट एसेस रेशियोमेट्रिक हैं और उन्हें धोने के चरणों की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए वे पारंपरिक दृष्टिकोणों की तुलना में बहुत बेहतर पुनरुत्पादकता प्रदान करते हैं। साथ में, assays का यह सूट सेल उपचार के बाद विशिष्ट फॉस्फोराइलेटेड स्टेट प्रोटीन के अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए नए लागत प्रभावी उपकरण प्रदान करता है और JAK / STAT सिग्नलिंग मार्ग के विशिष्ट और चयनात्मक मॉड्यूलेटरों की स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन करता है।

Introduction

JAK / STAT सिग्नलिंग मार्ग विविध साइटोकिन्स, इंटरफेरॉन, विकास कारकों और संबंधित अणुओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है1,2। विशिष्ट सेल-सतह रिसेप्टर्स के लिए इन लिगेंडों के बंधन के परिणामस्वरूप जेएके की सक्रियता होती है, जो बदले में विशिष्ट टायरोसिन अवशेषों के फॉस्फोराइलेशन द्वारा स्टेट प्रोटीन को सक्रिय करती है। STAT फॉस्फोराइलेशन के परिणामस्वरूप नाभिक में उनके dimerization और स्थानांतरण होता है, जहां वे विनियमित लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन पर अपना प्रभाव डालते हैं। STAT परिवार में सात सदस्य होते हैं: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, और STAT6। सदस्य शारीरिक सेल प्रक्रियाओं के विनियमन में एक जटिल और आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसमें प्रसार, भेदभाव, एपोप्टोसिस, एंजियोजेनेसिस और प्रतिरक्षा प्रणाली विनियमन शामिल हैं। STAT सिग्नलिंग मार्गों की असामान्य सक्रियण कई मानव बीमारियों, विशेष रूप से कैंसर और प्रतिरक्षा से संबंधित स्थितियों में फंस गई है3,4। इसलिए, देशी सेल सिग्नलिंग वातावरण के भीतर स्टेट प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन का आकलन करने की क्षमता अकादमिक और दवा खोज अनुसंधान दोनों के लिए महत्वपूर्ण है।

आज तक, इंट्रासेल्युलर फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन के स्तर को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक तरीके, एसटीएटी सहित, एंटीबॉडी-आधारित हैं और इसमें पश्चिमी ब्लोटिंग, एलिसा और फॉस्फोफ्लो साइटोमेट्री शामिल हैं। ये विषम तरीके श्रम-गहन, समय लेने वाली, त्रुटि-प्रवण, कम-थ्रूपुट, और अक्सर अविश्वसनीय (जैसे, विशिष्टता के मुद्दे) पश्चिमी ब्लोटिंग 5 के मामले में हैं। इसके विपरीत, सजातीय assays कम प्रयोगात्मक चरणों की आवश्यकता है, छोटे नमूना मात्रा का उपयोग करें, और HTS के लिए amenable हैं। व्यावसायिक रूप से पांच सजातीय सेल-आधारित इम्यूनोएसे प्लेटफ़ॉर्म उपलब्ध हैं जिनका उपयोग सेल लिसेट में एसटीएटी के जेएके-निर्भर फॉस्फोराइलेशन की मात्रात्मक रूप से निगरानी करने के लिए किया जा सकता है: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen, और Lumit। इन प्लेटफार्मों में से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं।

SureFire luminescent ऑक्सीजन चैनलिंग तकनीक पर आधारित है, जो विशेष रूप से एंटीबॉडी की एक जोड़ी पर कब्जा करने के लिए लेपित दाता और स्वीकर्ता मोतियों का उपयोग करता है, जिनमें से एक बायोटिनिलेटेड है। फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन की उपस्थिति में, दो एंटीबॉडी दाता और स्वीकर्ता मोतियों को निकटता में लाते हैं, जिससे एक केमिल्यूमिनेसेंट सिग्नल 6 की पीढ़ी को सक्षम किया जा सकता है। जबकि बहुमुखी और संवेदनशील है, यह तकनीक महंगी है, संस्कृति माध्यम में बायोटिन से प्रभावित है, परिवेश के तापमान और प्रकाश के प्रति बहुत संवेदनशील है, और पता लगाने के लिए एक विशेष पाठक की आवश्यकता होती है। HTRF और LANCE दोनों TR-FRET तकनीक पर आधारित हैं जो लंबे जीवनकाल के ल्यूमिनेसेंट लैंथेनाइड आयन परिसरों (यूरोपियम या टेरबियम चेलेट्स, या यूरोपियम क्रिप्टेट) का उपयोग दाता अणुओं के रूप में करते हैं और स्वीकर्ता अणुओं के रूप में दूर-लाल फ्लोरोफोरस 7। जब दाता या स्वीकर्ता अणुओं के साथ लेबल किए गए दो प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी को निकटता में लाया जाता है, तो FRET होता है, जिससे स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति में वृद्धि होती है और दाता प्रतिदीप्ति में कमी आती है। इन लंबे समय तक रहने वाले फ्लोरोसेंट संकेतों को परख हस्तक्षेप को कम करने और डेटा की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए एक समय-हल और रेशियोमेट्रिक तरीके से मापा जा सकता है। टीआर-फ्रेट के अन्य फायदे यह हैं कि यह प्रकाश-संवेदनशील नहीं है, बार-बार रीडिंग की अनुमति देता है, और लंबे समय तक सिग्नल स्थिरता प्रदर्शित करता है। जबकि टीआर-फ्रेट को एचटीएस में व्यापक रूप से अपनी बहुमुखी प्रतिभा, संवेदनशीलता और उच्च मजबूती के कारण लागू किया जाता है, सभी वाणिज्यिक टीआर-फ्रेट-आधारित परख प्लेटफ़ॉर्म महंगे होते हैं, जिससे अकादमिक और छोटे औद्योगिक प्रयोगशालाओं में व्यापक गोद लेने से पहले होता है। LanthaScreen परख भी एक TR-FRET आधारित रीडआउट का उपयोग करता है, लेकिन एक इंजीनियर U2OS सेल लाइन है कि stably हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -STAT1 संलयन प्रोटीन एक terbium लेबल फॉस्फो-विशिष्ट STAT1 एंटीबॉडी 8 के साथ संयुक्त व्यक्त पर निर्भर है. सिग्नलिंग प्रोटीन की पसंद के मामले में सीमित होने के अलावा, इस विधि को महंगी ट्रांसफेक्टेड सेल लाइनों को खरीदने, इसकी प्रयोज्यता को कम करने और प्रयोगात्मक कलाकृतियों की संभावना को बढ़ाने की आवश्यकता होती है। Lumit एक सामान्य bioluminescent immunoassay मंच है कि द्वितीयक एंटीबॉडी (विरोधी माउस और विरोधी खरगोश) रासायनिक रूप से NanoLuc Luciferase9 के छोटे और बड़े NanoBit subunits के साथ लेबल का उपयोग करता है. लक्ष्य प्रोटीन के लिए दो प्राथमिक एंटीबॉडी का बंधन द्वितीयक एंटीबॉडी को एक सक्रिय एंजाइम बनाने के लिए निकटता में लाता है जो एक ल्यूमिनेसेंस सिग्नल उत्पन्न करता है। जबकि luminescence आम तौर पर एक संवेदनशील और मजबूत readout है, प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए दो अलग अलग प्रजातियों में उठाया की आवश्यकता परख डिजाइन के लिए विकल्पों को सीमित. इसके अलावा, जटिल नमूना मैट्रिक्स में माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग परख हस्तक्षेप के लिए प्रवण हो सकता है।

इस प्रकार, एचटीएस के साथ संगत तरीके से व्यक्तिगत फॉस्फोराइलेटेड और कुल स्टेट प्रोटीन को मापने के लिए एक विश्वसनीय, तेजी से, अभी तक सस्ती सेल-आधारित परख मंच के लिए अभी भी एक आवश्यकता मौजूद है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, एक नया उच्च-थ्रूपुट सेल-आधारित इम्यूनोएसे प्लेटफ़ॉर्म एक एन्हांस्ड टीआर-फ्रेट तकनीक (थंडर) के आधार पर विकसित किया गया था और सेल लिसेट में अंतर्जात रूप से व्यक्त इंट्रासेल्युलर प्रोटीन (फॉस्फोराइलेटेड या कुल) के सरल, संवेदनशील, मजबूत और लागत प्रभावी माप को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इस तकनीक के फायदे एक दाता / स्वीकर्ता FRET जोड़ी के संयोजन से स्टेम असाधारण वर्णक्रमीय संगतता और टीआर-FRET संकेत, कड़ाई से मान्य एंटीबॉडी, और अनुकूलित लाइसिस बफर का प्रदर्शन करते हैं। इन assays सैंडविच immunoassays के रूप में स्वरूपित कर रहे हैं और एक सीधा, तीन कदम वर्कफ़्लो (चित्रा 1) का उपयोग करें. कोशिकाओं को पहले प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को संशोधित करने के लिए इलाज किया जाता है और फिर किट में प्रदान किए गए विशिष्ट लाइसिस बफर के साथ झूठ बोला जाता है। सेल लिसेट में लक्ष्य फॉस्फोराइलेटेड या कुल एसटीएटी प्रोटीन को एक एकल अभिकर्मक के अलावा और फ्लोरोफोर-लेबल एंटीबॉडी की एक जोड़ी के साथ इनक्यूबेशन चरण में पाया जाता है जो लक्ष्य प्रोटीन पर अलग-अलग एपिटोप को पहचानते हैं (चित्रा 2)। एक एंटीबॉडी को यूरोपियम चेलेट दाता (Eu-Ab1) के साथ लेबल किया गया है, जबकि दूसरे एंटीबॉडी को दूर-लाल स्वीकर्ता फ्लोरोफोर (FR-Ab2) के साथ लेबल किया गया है। दो लेबल एंटीबॉडी समाधान में प्रोटीन से बंधते हैं, जिससे दो लेबल निकटता में आते हैं। 320 या 340 एनएम पर दाता यूरोपियम चेलेट की उत्तेजना स्वीकर्ता को एक फ्रेट ट्रिगर करती है, जो सेल लिसेट में लक्ष्य प्रोटीन (फॉस्फोराइलेटेड या कुल) की एकाग्रता के लिए आनुपातिक 665 एनएम पर एक लंबे समय तक रहने वाले टीआर-फ्रेट सिग्नल का उत्सर्जन करती है।

Figure 1
चित्रा 1: TR-FRET परख वर्कफ़्लो. वर्कफ़्लो में तीन चरण होते हैं: सेल उपचार, सेल लाइसिस, और TR-FRET का उपयोग करके प्रोटीन का पता लगाना। दो-प्लेट परख प्रोटोकॉल में, लिसेट को एक सफेद 384-अच्छी तरह से पता लगाने वाली प्लेट में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जबकि एक-प्लेट प्रोटोकॉल में, सभी चरणों को एक ही सफेद 384-अच्छी तरह से पता लगाने वाली प्लेट (ऑल-इन-वन-वेल प्रोटोकॉल) में आयोजित किया जाता है। परख प्रोटोकॉल का उपयोग किया के बावजूद, प्रोटीन का पता लगाने एक ही कुल मात्रा (20 μL प्रति अच्छी तरह से) में किया जाता है. संक्षिप्त नाम: TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: TR-FRET सैंडविच immunoassay सिद्धांत. एक एंटीबॉडी को यूरोपियम चेलेट दाता (Eu-Ab1) के साथ लेबल किया गया है और दूसरा दूर-लाल छोटे फ्लोरोफोर स्वीकर्ता (FR-Ab2) के साथ है। दो लेबल एंटीबॉडी विशेष रूप से सेल लिसेट में लक्ष्य प्रोटीन (फॉस्फोराइलेटेड या कुल) पर अलग-अलग एपिटोप से बंधते हैं, जिससे दो फ्लोरोफोरेस निकटता में आते हैं। 320 या 340 एनएम पर दाता यूरोपियम चेलेट की उत्तेजना दाता से स्वीकर्ता अणुओं तक एक फ्रेट को ट्रिगर करती है, जो बदले में 665 एनएम पर एक संकेत का उत्सर्जन करती है। यह संकेत सेल लिसेट में प्रोटीन की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है। विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन की अनुपस्थिति में, दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरेस FRET होने के लिए एक दूसरे से बहुत दूर हैं। संक्षेप: FRET = Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; TR-FRET = समय हल FRET; Ab = एंटीबॉडी; FR = दूर-लाल; यूरोपीय संघ - यूरोपियम चेलेट; पी = फॉस्फोराइलेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यहां, विस्तृत प्रोटोकॉल को मापने के लिए प्रदान किया जाता है, एक 384-अच्छी तरह से प्रारूप में, फॉस्फोराइलेटेड STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/ Y699), और STAT6 (Y641), कुल STAT1, STAT3, STAT5, और STAT6 के इंट्रासेल्युलर स्तरों को, थंडर TR-FRET प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके अनुयायी या निलंबन कोशिकाओं से सेल लिसेट में। ये प्रोटोकॉल सेल उपचार, लाइसिस, और टीआर-फ्रेट-आधारित लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए चरणों को परिभाषित करते हैं या तो दो-प्लेट ट्रांसफर प्रोटोकॉल या एक-प्लेट ऑल-इन-वन-वेल प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं। इन सेल-आधारित assays ज्ञात activators और JAK / STAT मार्ग के अवरोधकों के औषधीय प्रोफ़ाइल का निर्धारण करने के लिए लागू कर रहे हैं। एचटीएस के लिए चयनित assays की मजबूती और उपयुक्तता का प्रदर्शन किया जाता है। अंत में, परख अनुकूलन के लिए प्रमुख प्रयोगों परख समस्या निवारण के लिए सिफारिशों के साथ, चर्चा कर रहे हैं.

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. एक humidified 37 °C/5% CO2 इनक्यूबेटर और संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखें या तो DMEM के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (HeLa और A431 कोशिकाओं) या RPMI 15% FBS (U266B1 कोशिकाओं) के साथ पूरक के साथ पूरक। कोशिकाओं को तब तक संस्कृति करें जब तक कि वे 70-80% संगम तक नहीं पहुंच जाते हैं, फिर उन्हें ट्रिप्सिनाइज़ करें और पारित करें या उन्हें assays के लिए उपयोग करें।
    नोट: संस्कृति मीडिया में फिनोल लाल था। assays का संचालन करने से पहले किसी भी सेल लाइन के लिए कोई सीरम भुखमरी आयोजित नहीं की गई थी।

2. उत्तेजक या अवरोधक अनुमापन अनुयायी कोशिकाओं के साथ दो प्लेट परख प्रोटोकॉल का उपयोग कर अनुमापन

नोट:: यह कार्यविधि वर्णन करता है कि कैसे उत्तेजक या अवरोधक शक्तियाँ निर्धारित करने के लिए परीक्षण यौगिक की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला से एक एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करके।

  1. सेल सीडिंग
    1. पूर्व-अनुकूलित घनत्व (40,000 HeLa कोशिकाओं / अच्छी तरह से STAT3 और STAT6 दोनों के लिए अच्छी तरह से; 75,000 A431 कोशिकाओं / STAT5 के लिए अच्छी तरह से) पर कोशिकाओं के 50 μL को उपयुक्त संस्कृति माध्यम में 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेट में वितरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस / 5% CO2 पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इष्टतम सेल घनत्व और संस्कृति इनक्यूबेशन समय निर्धारित करने की आवश्यकता है।
  2. परीक्षण यौगिकों का तनुकरण
    1. सीरम मुक्त माध्यम में एक polypropylene 96-अच्छी तरह से प्लेट के 12 कुओं में क्रमिक रूप से पतला यौगिक (ओं) (आधा लॉग अंतराल dilutions) द्वारा परीक्षण यौगिक (ओं) की मध्यवर्ती 2x कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें।
      नोट:: यह EC50 या IC50 का एक सटीक अनुमान के लिए कम से कम डुप्लिकेट में एक 12-बिंदु, आधा-लॉग अंतराल एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र का संचालन करने के लिए अनुशंसित है।
    2. वैकल्पिक रूप से, हाइड्रोफोबिक, डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) -घुलनशील परीक्षण यौगिकों के लिए, 100% डीएमएसओ में प्रारंभिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करते हैं, और फिर यौगिक कमजोर पड़ने की श्रृंखला को सीरम-मुक्त माध्यम में पतला करते हैं।
      नोट: डीएमएसओ के लिए परख सहिष्णुता DMSO वाहन में एक परीक्षण यौगिक अनुमापन का संचालन करने से पहले स्थापित किया जाना चाहिए। उपचारित और अनुपचारित कोशिकाओं के बीच समान विलायक सांद्रता रखना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यौगिकों के सीरियल dilutions का परीक्षण करते समय, विलायक सांद्रता हमेशा कमजोर पड़ने की श्रृंखला में स्थिर रहना चाहिए।
  3. सेल उपचार
    1. सेल उत्तेजना के लिए, अकेले सीरम मुक्त माध्यम (अनुपचारित कोशिकाओं) के 50 μL जोड़ें या उत्तेजक (2x) युक्त।
    2. या तो कमरे के तापमान (आरटी) या 37 डिग्री सेल्सियस (इंटरफेरॉन (आईएफएन) α2b / 20 मिनट STAT3 के लिए आरटी पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें; एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ)/ STAT5 के लिए आरटी पर 10 मिनट; इंटरल्यूकिन (आईएल) -4/20 मिनट STAT6 के लिए आरटी पर)। फिर धारा 2.4 पर जाएं।
      नोट: इष्टतम इनक्यूबेशन तापमान निर्धारित करने की आवश्यकता है।
    3. सेल निषेध के लिए, अकेले सीरम-मुक्त माध्यम (अनुपचारित कोशिकाओं) के 25 μL जोड़ें या अवरोधक (4x) युक्त।
    4. या तो आरटी या 37 डिग्री सेल्सियस (जेएके इनहिबिटर 1/30 मिनट STAT3 और STAT6 के लिए आरटी पर) पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें; STAT5 के लिए RT पर Erlotinib/15 मिनट)।
    5. अकेले सीरम-मुक्त माध्यम (अनुपचारित कोशिकाओं) के 25 μL जोड़ें या इसके EC80 पर उत्तेजक (4x) युक्त।
    6. या तो RT या 37 °C (चरण 2.3.2 के लिए के रूप में एक ही शर्तों) पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. सेल लाइसिस
    1. किट के विशिष्ट 1x पूरक Lysis बफर के रूप में निर्माता द्वारा इंगित तैयार करें।
      नोट: यह 100x फॉस्फेट इनहिबिटर कॉकटेल 1x की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पतला के साथ 1x Lysis बफर पूरक करने के लिए अनिवार्य है। 1x पूरक Lysis बफर 1 mM सोडियम फ्लोराइड, 2 mM सोडियम orthovanadate, और 2 mM बीटा ग्लिसरोफॉस्फेट शामिल हैं। अन्य फॉस्फेट अवरोधकों की आवश्यकता नहीं है और इससे बचा जाना चाहिए। किट में शामिल लोगों के अलावा लिसिस बफर और फॉस्फेट अवरोधकों की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि उनमें ऐसी सामग्री हो सकती है जो माप में हस्तक्षेप कर सकती है।
    2. सावधानी से निकालें और supernatant aspirating द्वारा सेल संस्कृति माध्यम को त्याग दें।
    3. तुरंत 1x पूरक Lysis बफर के 50 μL जोड़ें.
      नोट:: Lysis बफ़र मात्रा (25-50 μL) ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है।
    4. मिलाते हुए के तहत आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (कक्षीय प्लेट शेकर 400 आरपीएम पर सेट; मध्यम आंदोलन)।
      नोट:: Lysis इनक्यूबेशन समय (30-60 मिनट) ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है। Lysates लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए.
  5. TR-FRET डिटेक्शन
    1. निर्माता द्वारा इंगित के रूप में 1x डिटेक्शन बफ़र में 4x एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स तैयार करें।
    2. इस हस्तांतरण चरण में, ध्यान से 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट से एक सफेद, कम मात्रा वाले 384-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कुएं तक सेल लिसेट के 15 μL को पिपेट करें।
    3. सकारात्मक नियंत्रण Lysate के 15 μL जोड़ें और 1x Lysis बफर (नकारात्मक नियंत्रण) के 15 μL परख कुओं को अलग करने के लिए.
    4. परख कुओं में से प्रत्येक के लिए 4x एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स (या तो Eu-Ab1/
    5. एक प्लेट सीलर के साथ प्लेट को कवर करें और परख के आधार पर आरटी पर रातभर तक 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें (संबंधित तकनीकी डेटा शीट देखें)।
      नोट: इष्टतम पढ़ने के समय प्रत्येक परख और सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जा करने की जरूरत है. प्लेट परख प्रदर्शन पर एक नकारात्मक प्रभाव के बिना कई बार पढ़ा जा सकता है.
    6. चिपकने वाला प्लेट सीलर निकालें और एक TR-FRET संगत microplate रीडर पर प्लेट पढ़ें।
      नोट: फ़िल्टर-आधारित फ्लोरोमीटर की सिफारिश की जाती है, हालांकि कुछ मोनोक्रोमेटर उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है। सत्यापित करें कि TR-FRET के लिए उपयुक्त ऑप्टिक मॉड्यूल (फ़िल्टर और दर्पण) स्थापित है। Europium chelate को उत्तेजित करने के लिए 320 या 340 nm की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें। दोनों 615 एनएम (या 620 एनएम) और 665 एनएम पर assays पढ़ें दाता Europium और स्वीकर्ता fluorophore से उत्सर्जन दोनों का पता लगाने के लिए, क्रमशः. साधन सेटिंग्स विशेष पाठक पर निर्भर करेगा। यहां प्रस्तुत डेटा को लैंप-आधारित उत्तेजना, 90 μs देरी, 300 μs एकीकरण समय, और 100 चमक प्रति अच्छी तरह से का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। फॉस्फो-STAT4 परख, हालांकि, उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड (एस / बी) अनुपात उत्पन्न करने के लिए लेजर उत्तेजना का उपयोग करके पढ़ा गया था।

3. उत्तेजक या अवरोधक अनुमापन निलंबन कोशिकाओं के साथ दो प्लेट परख प्रोटोकॉल का उपयोग कर

  1. परीक्षण यौगिकों का तनुकरण
    1. चरण 2.2.1 और 2.2.2 में वर्णित परीक्षण यौगिकों की मध्यवर्ती 2x तनुकरण श्रृंखला तैयार करें।
  2. सेल सीडिंग और उपचार
    1. पूर्व-अनुकूलित घनत्व (200,000 U266B1 कोशिकाओं / अच्छी तरह से STAT1 के लिए; 400,000 U266B1 कोशिकाओं / अच्छी तरह से STAT4 के लिए) पर कोशिकाओं के 20 μL को उचित संस्कृति माध्यम में 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेट में वितरित करें। सीधे सेल उपचार के लिए आगे बढ़ें या 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 2-4 घंटे इनक्यूबेट करें।
      नोट:: इस चरण को विभिन्न कक्ष प्रकारों के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता है।
    2. सेल उत्तेजना के लिए, अकेले सीरम-मुक्त माध्यम (अनुपचारित कोशिकाओं) के 20 μL जोड़ें या उत्तेजक (2x) युक्त।
    3. या तो आरटी या 37 डिग्री सेल्सियस (IFNα2b / 15 मिनट STAT1 के लिए RT पर) पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें; IFNα2b/25 मिनट पर 37 °C के लिए STAT4). फिर धारा 3.3 पर जाएं।
      नोट: इष्टतम इनक्यूबेशन तापमान निर्धारित करने की आवश्यकता है।
    4. सेल निषेध के लिए, अकेले सीरम-मुक्त माध्यम (अनुपचारित कोशिकाओं) के 10 μL जोड़ें या अवरोधक (4x) युक्त।
    5. या तो आरटी या 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें (STAT1 और STAT4 के लिए RT पर JAK अवरोधक 1/30 मिनट)।
    6. अकेले सीरम मुक्त माध्यम (अनुपचारित कोशिकाओं) के 10 μL जोड़ें या इसके EC80 पर उत्तेजक (4x) युक्त।
    7. या तो RT या 37 °C (चरण 3.2.3 के लिए के रूप में एक ही शर्तों) पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. सेल लाइसिस
    1. किट के विशिष्ट 5x पूरक Lysis बफर के रूप में निर्माता द्वारा इंगित तैयार करें।
      नोट: 5x Lysis बफर को 100x फॉस्फेट इनहिबिटर कॉकटेल के साथ पूरक करना अनिवार्य है जो 5x की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला है। 5x पूरक लाइसिस बफर में 5 mM सोडियम फ्लोराइड, 10 mM सोडियम ऑर्थोवैनाडेट और 10 mM बीटा-ग्लिसरोफॉस्फेट होता है। अन्य फॉस्फेट अवरोधकों की आवश्यकता नहीं है और इससे बचा जाना चाहिए।
    2. 5x पूरक लाइसिस बफर के 10 μL जोड़ें.
    3. मिलाते हुए के तहत आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (कक्षीय प्लेट शेकर 400 आरपीएम पर सेट; मध्यम आंदोलन)।
      नोट:: Lysis इनक्यूबेशन समय (30-60 मिनट) ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है। Lysates लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए.
  4. TR-FRET डिटेक्शन
    1. सेल lysis के बाद, TR-FRET का पता लगाने के चरण के रूप में अनुवर्ती कोशिकाओं के लिए 2-प्लेट परख प्रोटोकॉल के लिए अनुभाग 2.5 में वर्णित आचरण.

4. उत्तेजक अनुमापन अनुयायी या निलंबन कोशिकाओं के साथ एक प्लेट परख प्रोटोकॉल का उपयोग कर

  1. परीक्षण यौगिकों का तनुकरण
    1. सीरम मुक्त माध्यम में पॉलीप्रोपाइलीन 96-अच्छी तरह से प्लेट के 12 कुओं में क्रमिक रूप से पतला यौगिक (ओं) (आधा लॉग अंतराल dilutions) द्वारा 3x पर परीक्षण यौगिक (ओं) की मध्यवर्ती कमजोर पड़ने की श्रृंखला तैयार करें।
  2. सेल सीडिंग और उपचार
    1. पूर्व अनुकूलित घनत्व (160,000 U266B1 कोशिकाओं / STAT4 के लिए अच्छी तरह से) पर कोशिकाओं के 8 μL वितरित; 80,000 HeLa कोशिकाओं / सीधे सेल उपचार के लिए आगे बढ़ें या 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 2-4 घंटे इनक्यूबेट करें।
      नोट: उपचार से पहले एक सेल संस्कृति इनक्यूबेशन अवधि के लिए आवश्यकता को विभिन्न सेल प्रकारों के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है।
    2. सेल उत्तेजना के लिए, अकेले सीरम-मुक्त माध्यम (अनुपचारित कोशिकाओं) के 4 μL जोड़ें या उत्तेजक (3x) युक्त।
    3. या तो कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस (IFNα2b / 25 मिनट पर STAT4 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर) पर पूर्व-अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें; STAT6 के लिए 37 °C पर IL-4/20 मिनट)। फिर धारा 4.3 पर जाएं।
  3. सेल लाइसिस
    1. किट के विशिष्ट 5x पूरक Lysis बफर के रूप में निर्माता द्वारा इंगित तैयार करें।
      नोट: 5x Lysis बफर को 100x फॉस्फेट इनहिबिटर कॉकटेल के साथ पूरक करना अनिवार्य है जो 5x की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला है।
    2. 5x पूरक लाइसिस बफर के 3 μL जोड़ें.
    3. मिलाते हुए (400 आरपीएम पर कक्षीय प्लेट शेकर) के तहत आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट:: Lysis इनक्यूबेशन समय (30-60 मिनट) ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है। लिसेट का उपयोग तुरंत या 80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है।
  4. TR-FRET डिटेक्शन
    1. सकारात्मक नियंत्रण Lysate (undiluted) के 15 μL जोड़ें और 1x पूरक Lysis बफर (नकारात्मक नियंत्रण) के 15 μL परख कुओं को अलग करने के लिए.
    2. 4x एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स के 5 μL जोड़ें (या तो Eu-Ab1/
    3. एक प्लेट सीलर के साथ प्लेट को कवर करें और परख के आधार पर आरटी पर रातभर तक 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इष्टतम पढ़ने के समय प्रत्येक परख और सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जा करने की जरूरत है. प्लेट परख प्रदर्शन पर एक नकारात्मक प्रभाव के बिना कई बार पढ़ा जा सकता है.
    4. चिपकने वाला प्लेट सीलर निकालें। एक TR-FRET-संगत microplate रीडर पर प्लेट पढ़ें.

5. डेटा विश्लेषण

  1. निम्न सूत्र (1) का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए TR-FRET अनुपात की गणना करें:
    Equation 1 (1)
    नोट:: TR-FRET संकेत एक समय-हल मोड में पढ़ा जाता है, क्योंकि पृष्ठभूमि घटाव आमतौर पर आवश्यक नहीं है। पृष्ठभूमि घटाव आयोजित किया जाता है, तो पृष्ठभूमि घटाव के लिए 1x पूरक Lysis बफ़र (नकारात्मक नियंत्रण) युक्त सेल-मुक्त कुओं का उपयोग करें। सेल-मुक्त कुओं से औसत TR-FRET अनुपात निर्धारित करें और फिर प्रत्येक अच्छी तरह से TR-FRET अनुपात से इस मान को घटाएं।
  2. एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्रों के लिए, 4 पैरामीटर लॉजिस्टिक समीकरण (चर ढलान के साथ अवग्रहीय खुराक-प्रतिक्रिया वक्र) और EC50 या IC50 मानों को उत्पन्न करने के लिए 1/Y2 डेटा भार का उपयोग करके एक nonlinear प्रतिगमन के अनुसार डेटा का विश्लेषण करें।
  3. Z' कारक प्रयोग के लिए, निम्न सूत्र (2)10 के अनुसार डेटा का विश्लेषण करें
    Equation 2 (2)
    जहां μ और σ क्रमशः सकारात्मक नियंत्रण (पी; उत्तेजित कोशिकाओं) और नकारात्मक नियंत्रण (एन; अनुपचारित कोशिकाओं) के लिए औसत मूल्य और मानक विचलन हैं।

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Representative Results

प्रत्येक थंडर टीआर-FRET परख औषधीय रूप से अनुयायी (HeLa या A431) या निलंबन कोशिकाओं (U266B1) JAK / STAT Pathway-विशिष्ट activators या inhibitors के साथ इलाज द्वारा मान्य किया गया था और फिर विशिष्ट फॉस्फोराइलेटेड और कुल STATs के स्तर को मापने, जब लागू हो। Assays 384-अच्छी तरह से प्रारूप में दो प्लेट हस्तांतरण प्रोटोकॉल और पूर्व अनुकूलित परख शर्तों का उपयोग कर आयोजित किए गए थे. चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, और चित्रा 7 सभी STAT assays के लिए प्राप्त प्रतिनिधि एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता संक्षेप में। कुल मिलाकर, फॉस्फो-स्टेट assays के लिए सभी उत्तेजक और अवरोधक एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता मजबूत TR-FRET संकेतों, व्यापक गतिशील श्रेणियों, भिन्नता के कम अंतर-अच्छी तरह से गुणांक (आमतौर पर ≤5%) और स्वीकार्य एस / बी अनुपात दिखाया। यहाँ रिपोर्ट किए गए EC50 और IC50 मान अपेक्षित मानों की सीमा के भीतर हैं.

JAK activators IFNα2b (फॉस्फो-STAT1, फॉस्फो-STAT3, और फॉस्फो-STAT4), IL-4 (फॉस्फो-STAT6), और EGF (फॉस्फो-STAT5) के साथ कोशिकाओं के उपचार ने विशिष्ट टायरोसिन अवशेषों पर STAT फॉस्फोराइलेशन में प्रत्याशित एकाग्रता-निर्भर वृद्धि को दिखाया, जबकि संबंधित कुल STAT प्रोटीन (STAT1, STAT3, STAT5, और STAT6) स्थिर रहे (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, और चित्रा 7) , पैनल ए)। STAT5 फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि के साथ कुल STAT5 के लिए देखे गए सिग्नल में कमी (20% से कम) की उम्मीद है और यह स्टेरिक बाधा के कारण है, जहां STAT5 का फॉस्फोराइलेशन अपने संबंधित एंटीजन के लिए दो एंटी-टोटल STAT5 एंटीबॉडी में से एक के बंधन में बाधा डालता है। EC50 मान IFNα2b और IL-4 (0.083 से 0.47 nM) के लिए उप-नैनोमोलर रेंज में और EGF (12 nM) के लिए कम नैनोमोलर रेंज में थे। ये मान प्रकाशित डेटा 6,11 के साथ समझौते में हैं।

यह पुष्टि करने के लिए कि उत्प्रेरकों द्वारा प्रेरित सिग्नल अंतर्जात रिसेप्टर्स के सक्रियण द्वारा मध्यस्थता की गई थी, कोशिकाओं को स्टेट एक्टिवेटर के साथ सबमैक्सिमल उत्तेजना (EC80) से पहले या तो JAK Inhibitor 1 (एक पैन JAK अवरोधक) या एर्लोटिनिब (एक EGFR tyrosine kinase inhibitor) की बढ़ती सांद्रता के साथ पहले से इलाज किया गया था। जैसा कि प्रत्याशित है, JAK Inhibitor 1 और Erlotinib दोनों ने एकाग्रता-निर्भर तरीके से संबंधित फॉस्फो-STAT स्तरों को बाधित किया, IC50 मूल्यों के साथ कम नैनोमोलर और JAK अवरोधक 1 (29-759 nM) के लिए उच्च नैनोमोलर रेंज के बीच और एर्लोटिनिब (10 nM) के लिए कम नैनोमोलर रेंज में (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, और चित्रा 7) के लिए, पैनल बी)। IC50 मान प्रकाशित data11,12,13 के साथ संगत हैं। जैसा कि उत्तेजना प्रयोगों के लिए मामला था, संबंधित कुल स्टेट के स्तर या तो उपचार से प्रभावित नहीं थे। एक साथ लिया, इन परिणामों को अपने अंतर्जात लक्ष्य STAT प्रोटीन (फॉस्फोराइलेटेड या कुल) के लिए प्रत्येक परख की विशिष्टता का प्रदर्शन और उनकी क्षमता प्रोफ़ाइल activators या potencies की एक श्रृंखला का प्रदर्शन inhibitors करने के लिए.

Assays जिसमें पूरे वर्कफ़्लो (सेल उपचार, lysis, और प्रोटीन का पता लगाने) एक हस्तांतरण कदम के बिना एक 384-अच्छी तरह से प्लेट के एक ही कुएं में आयोजित किया जाता है एचटीएस के लिए अधिक उपयुक्त हैं। तदनुसार, फॉस्फो-STAT4 और फॉस्फो-STAT6 assays एक-प्लेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके किए गए थे। अनुकूलित परिस्थितियों के तहत प्राप्त प्रतिनिधि डेटा को चित्र 8 और चित्र 9 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। एक निलंबन सेल लाइन (U266B1) में IFNα2b द्वारा या तो फॉस्फोराइलेटेड STAT4 की उत्तेजना; चित्र 8) या एक अनुयायी सेल लाइन (HeLa) में IL-4 द्वारा फॉस्फोराइलेटेड STAT6; चित्र 9) स्वीकार्य एस / बी अनुपात और EC50 मूल्यों के साथ दो-प्लेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किए गए लोगों के अनुरूप प्राप्त किया गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि फॉस्फो-स्टेट एसेस को दो-प्लेट ट्रांसफर प्रोटोकॉल से एक-प्लेट ऑल-इन-वन-वेल प्रोटोकॉल में सफलतापूर्वक अनुकूलित किया जा सकता है।

Z'-कारक आमतौर पर HTS10 के लिए एक परख की उपयुक्तता और मजबूती के मूल्यांकन के लिए HTS समुदाय में प्रयोग किया जाता है। फॉस्फो-स्टेट एसेस को और अधिक मान्य करने के लिए, प्रारंभिक जेड'-फैक्टर अध्ययन मैन्युअल रूप से दो-प्लेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके आयोजित किए गए थे। परख स्थिरता का आकलन करने के लिए, प्लेटों को 4-एच इनक्यूबेशन और रात भर के इनक्यूबेशन दोनों के बाद पढ़ा गया था। फॉस्फो-STAT1 और फॉस्फो-STAT3 assays के लिए प्राप्त परिणाम, एक निलंबन सेल लाइन (U266B1) या एक अनुयायी सेल लाइन (HeLa) का उपयोग करके, क्रमशः, चित्रा 10 में संक्षेप में दिए गए हैं। परिकलित Z′-कारक मान फॉस्फो-STAT1 के लिए 0.85 और फॉस्फो-STAT3 के लिए 0.79 थे। रात भर के इनक्यूबेशन के बाद, Z'-factor मान स्थिर रहे (फॉस्फो-STAT1 के लिए 0.83 और फॉस्फो-STAT3 के लिए 0.78)। इसी तरह के Z'-factor values को अन्य फॉस्फो-STAT assays (STAT4: 0.79) के लिए प्राप्त किया गया था; STAT5: 0.78; STAT6: 0.63). 0.40 ≥ एक Z'-कारक के साथ एक सेल आधारित परख HTS15 के लिए उपयुक्त माना जाता है. तदनुसार, ये परिणाम एचटीएस अनुप्रयोगों के लिए इन फॉस्फो-स्टेट assays की मजबूती का प्रदर्शन करते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: U266B1 कोशिकाओं में फॉस्फो-STAT1 (Y701) मॉडुलन का पता लगाना। एक 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में सीड की गई कोशिकाओं (200,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को आरटी या (बी) जेएके इनहिबिटर 1 पर 15 मिनट के लिए या तो (ए) IFNα2b की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था आरटी में 30 मिनट के लिए, फिर RT पर 15 मिनट के लिए IFNα2b के 1 nM (EC80) के साथ। लाइसिस के बाद, लिसेट को कम मात्रा में 384-अच्छी तरह से सफेद प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स के अलावा। प्लेट को आरटी में 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था और फिर एक टीआर-फ्रेट-संगत रीडर पर पढ़ा गया था। डेटा परख बिंदु प्रति तीन गुना कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कुछ त्रुटि पट्टियाँ प्रतीक आकार से छोटी होती हैं. संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; IFN = इंटरफेरॉन; RT = कमरे का तापमान; JAK = Janus kinase; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; S/B = संकेत/पृष्ठभूमि अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हेला कोशिकाओं में फॉस्फो-STAT3 (Y705) और कुल STAT3 मॉडुलन का पता लगाना। कोशिकाओं (40,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) एक 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में रात भर सुसंस्कृत या तो (ए) IFNα2b की बढ़ती सांद्रता के साथ RT या (बी) JAK अवरोधक 1 पर 30 मिनट के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए तो RT पर 20 मिनट के लिए IFNα2b के 1.5 nM के साथ इलाज किया गया था। मीडिया हटाने और lysis के बाद, lysates एक कम मात्रा में 384 अच्छी तरह से सफेद प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स के अलावा. प्लेट को आरटी में 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था और फिर एक टीआर-फ्रेट-संगत रीडर पर पढ़ा गया था। डेटा परख बिंदु प्रति तीन गुना कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कुछ त्रुटि पट्टियाँ प्रतीक आकार से छोटी होती हैं. संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; IFN = इंटरफेरॉन; RT = कमरे का तापमान; JAK = Janus kinase; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; S/B = संकेत/पृष्ठभूमि अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: U266B1 कोशिकाओं में फॉस्फो-STAT4 (Y693) मॉडुलन का पता लगाना। एक 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में सीड की गई कोशिकाओं (400,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को 37 डिग्री सेल्सियस या (बी) जेएके इनहिबिटर 1 पर 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस या (बी) जेएके इनहिबिटर 1 की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए IFNα2b के 1 एनएम के साथ। मीडिया हटाने और lysis के बाद, lysates एक कम मात्रा में 384 अच्छी तरह से सफेद प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स के अलावा. प्लेट को आरटी पर रात भर इनक्यूबेट किया गया था और फिर एक टीआर-फ्रेट-संगत रीडर पर पढ़ा गया था। डेटा परख बिंदु प्रति तीन गुना कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कुछ त्रुटि पट्टियाँ प्रतीक आकार से छोटी होती हैं. संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; IFN = इंटरफेरॉन; RT = कमरे का तापमान; JAK = Janus kinase; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; S/B = संकेत/पृष्ठभूमि अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: फॉस्फो-STAT5 (Y694/Y699) का पता लगाना और A431 कोशिकाओं में कुल STAT5 मॉडुलन। 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में रातभर सुसंस्कृत कोशिकाओं (75,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को आरटी या (बी) एर्लोटिनिब में 10 मिनट के लिए या तो (ए) ईजीएफ की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, आरटी में 15 मिनट के लिए एर्लोटिनिब, फिर आरटी में 10 मिनट के लिए ईजीएफ के 73 एनएम के साथ। मीडिया हटाने और lysis के बाद, lysates एक कम मात्रा में 384 अच्छी तरह से सफेद प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स के अलावा. प्लेट को आरटी पर रात भर इनक्यूबेट किया गया था और फिर एक टीआर-फ्रेट-संगत रीडर पर पढ़ा गया था। डेटा परख बिंदु प्रति तीन गुना कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कुछ त्रुटि पट्टियाँ प्रतीक आकार से छोटी होती हैं. संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; EGF = एपिडर्मल विकास कारक; RT = कमरे का तापमान; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; S/B = संकेत/पृष्ठभूमि अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: हेला कोशिकाओं में फॉस्फो-STAT6 (Y641) और कुल STAT6 मॉडुलन का पता लगाना। 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में रातभर सुसंस्कृत कोशिकाओं (40,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को आरटी या (बी) जेएके इनहिबिटर 1 में 20 मिनट के लिए आरटी या (बी) जेएके इनहिबिटर 1 में आरटी में 30 मिनट के लिए या तो (ए) आईएल -4 की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, फिर आरटी में 20 मिनट के लिए आईएल 4 के 0.5 एनएम के साथ। मीडिया हटाने और lysis के बाद, lysates एक कम मात्रा में 384 अच्छी तरह से सफेद प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स के अलावा. प्लेट को आरटी में 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था और फिर एक टीआर-फ्रेट-संगत रीडर पर पढ़ा गया था। डेटा परख बिंदु प्रति तीन गुना कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कुछ त्रुटि पट्टियाँ प्रतीक आकार से छोटी होती हैं. संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; आईएल = इंटरल्यूकिन; JAK = Janus kinase; RT = कमरे का तापमान; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; S/B = संकेत/पृष्ठभूमि अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एक-प्लेट प्रोटोकॉल के साथ U266B1 कोशिकाओं में फॉस्फो-STAT4 (Y693) उत्तेजना का पता लगाना। कोशिकाओं (160,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) एक कम मात्रा में 384-अच्छी तरह से सफेद प्लेट में seeded तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए IFNα2b की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। lysis के बाद, एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स को सीधे लिसेट में जोड़ा गया था। प्लेट को आरटी पर रात भर इनक्यूबेट किया गया था और फिर फ्लैश लैंप या लेजर उत्तेजना का उपयोग करके टीआर-फ्रेट-संगत रीडर पर पढ़ा गया था। डेटा परख बिंदु प्रति तीन गुना कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कुछ त्रुटि पट्टियाँ प्रतीक आकार से छोटी होती हैं. संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; IFN = इंटरफेरॉन; RT = कमरे का तापमान; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; S/B = संकेत/पृष्ठभूमि अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: एक-प्लेट प्रोटोकॉल के साथ हेला कोशिकाओं में फॉस्फो-स्टेट 6 (Y641) उत्तेजना का पता लगाना। कोशिकाओं (80,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) एक कम मात्रा में 384-अच्छी तरह से सफेद प्लेट में seeded तुरंत आरटी पर 20 मिनट के लिए IL-4 की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। lysis के बाद, एंटीबॉडी डिटेक्शन मिक्स को सीधे लिसेट में जोड़ा गया था। प्लेट को आरटी में 4 ज इनक्यूबेट किया गया था और फिर एक टीआर-फ्रेट-संगत रीडर पर पढ़ा गया था। डेटा परख बिंदु प्रति तीन गुना कुओं के मतलब के रूप में दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कुछ त्रुटि पट्टियाँ प्रतीक आकार से छोटी होती हैं. संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; आईएल = इंटरल्यूकिन; RT = कमरे का तापमान; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; S/B = संकेत/पृष्ठभूमि अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: फॉस्फो-STAT1 (Y701) और फॉस्फो-STAT3 (Y705) assays के इंट्राप्लेट परिवर्तनशीलता अध्ययन( A) फॉस्फो-STAT1 परख: निलंबन कोशिकाओं (200,000 U266B1 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को 15 मिनट के लिए IFNα2b के 10 nM या अकेले सीरम-मुक्त माध्यम (कम नियंत्रण) के साथ इलाज किया गया था। (बी) फॉस्फो-STAT3 परख: अनुयायी कोशिकाओं (20,000 HeLa कोशिकाओं / अच्छी तरह से) या तो 20 मिनट के लिए IFNα2b के 5 nM के साथ या अकेले सीरम मुक्त माध्यम के साथ इलाज किया गया था। दोनों assays के लिए, TR-FRET संकेत इनक्यूबेशन के 4 ज के बाद पढ़ा गया था। संक्षेप: STAT = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन के उत्प्रेरक; IFN = इंटरफेरॉन; TR-FRET = समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण; एस / बी = संकेत / पृष्ठभूमि अनुपात; CV = भिन्नता गुणांक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस तरह के पश्चिमी blotting और एलिसा आधारित तरीकों के रूप में phosphoprotein विश्लेषण के लिए पारंपरिक तरीकों की तुलना में, एक थंडर TR-FRET सेलुलर परख के लिए वर्कफ़्लो सरल और तेज है, एक कम मात्रा के नमूने (15 μL) का उपयोग करता है, एक 384-अच्छी तरह से प्रारूप में HTS के लिए डिज़ाइन किया गया है, और स्वचालन के लिए अत्यधिक अनुकूल है। परख प्रोटोकॉल लचीला है और आसानी से दोनों मध्यम और उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Assays या तो एक दो प्लेट स्थानांतरण प्रोटोकॉल या एक-384-अच्छी तरह से प्लेट प्रोटोकॉल का उपयोग करके चलाया जा सकता है। दो-प्लेट ट्रांसफर प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को एक सेल कल्चर प्लेट में बीज, उपचार और झूठ बोला जाता है, और बाद में विश्लेषण के लिए लिसेट को एक अलग सफेद पहचान प्लेट (आधा क्षेत्र 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्लेट) में स्थानांतरित कर दिया जाता है। एक-384-वेल प्लेट प्रोटोकॉल में, पूरे वर्कफ़्लो को उसी कुएं में आयोजित किया जाता है, जिससे तरल स्थानांतरण चरण की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। assays आसानी से आनुपातिक रूप से मात्रा को कम करके 1536-अच्छी तरह से प्रारूप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। परख प्रोटोकॉल के बावजूद, वहाँ केवल तीन अभिकर्मक समाधान तैयार करने के लिए और कोई धोने के कदम हैं, और assays एक "इसके अलावा केवल" प्रोटोकॉल के बाद चलाया जा सकता है, समय पर कम से कम हाथ की आवश्यकता है.

किसी भी सेल-आधारित परख प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण कदम सेल संस्कृति और उपचार की स्थिति 16 का अनुकूलन है। दोनों सेल संख्या और उपचार की स्थिति एक परख चलाने से पहले सावधानीपूर्वक अनुकूलन की आवश्यकता है, के रूप में इन प्रमुख मापदंडों अक्सर प्रत्येक सेल लाइन और प्रत्येक phosphoprotein के लिए भिन्न होते हैं. इन मापदंडों का अनुकूलन परख खिड़की को अधिकतम करने की अनुमति देता है, एक उच्च एस / बी अनुपात और भिन्नता के कम अंतर-अच्छी तरह से गुणांक के साथ एक इष्टतम प्रदर्शन प्राप्त करता है, और परिणामों की मजबूती और पुनरुत्पादन सुनिश्चित करता है। सेल नंबर, सीरम-भुखमरी (जब उपयुक्त हो), और उत्तेजना या निषेध समय (या तो कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर) को प्रत्येक सेल लाइन और लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। बहुत अधिक या बहुत कम सेल संख्या इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों के मॉडुलन को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। 40,000-80,000 कोशिकाओं के सेल सीडिंग घनत्व / अनुयायी कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से या निलंबन कोशिकाओं के लिए 100,000-200,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से निलंबन कोशिकाओं के लिए आम तौर पर अधिकांश सेल लाइनों के लिए स्वीकार्य हैं। ध्यान दें, उत्तेजना और निषेध के लिए समय की इष्टतम लंबाई सेल लाइनों और लक्षित प्रोटीन के बीच व्यापक रूप से भिन्न हो सकती है, कुछ मिनटों से लेकर कई घंटों तक। इस प्रकार, इष्टतम उत्तेजना और निषेध इनक्यूबेशन बार निर्धारित करने के लिए एक समय पाठ्यक्रम अध्ययन की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है, आदर्श रूप से कमरे के तापमान और 37 डिग्री सेल्सियस दोनों पर, क्योंकि इनक्यूबेशन तापमान लक्ष्य प्रोटीन उत्तेजना के कैनेटीक्स को प्रभावित करता है।

एक सेल आधारित परख समस्या निवारण मुश्किल और समय लेने वाली क्योंकि कई कार्यप्रवाह (सेल संस्कृति, सेल उपचार, lysis, और प्रोटीन का पता लगाने) में शामिल चरणों की हो सकती है. इन परख किट एक सकारात्मक नियंत्रण lysate शामिल हैं. प्रत्येक प्रयोग में इन सकारात्मक नियंत्रण लिसेट और नकारात्मक नियंत्रण (अकेले 1x पूरक Lysis बफर) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। उचित नियंत्रण का उपयोग समस्या निवारण की सुविधा प्रदान करता है, क्योंकि समस्याओं को तब जल्दी से या तो पता लगाने के चरण (गलत अभिकर्मक तैयारी और / या परख निष्पादन) या प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले लिसेट की गुणवत्ता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। उत्तरार्द्ध आमतौर पर सबऑप्टिमल सेलुलर स्थितियों के उपयोग के कारण होता है।

इस प्लेटफ़ॉर्म का एक अतिरिक्त लाभ विभिन्न stringencies के साथ अनुकूलित lysis buffers के एक सूट की उपलब्धता है। यह आंशिक उपकोशिकीय फ्रैक्शनेशन से अधिक या कम विषम लिसेट उत्पन्न करने की अनुमति देता है। यह उपयोगी है क्योंकि सिग्नलिंग प्रोटीन विभिन्न इंट्रासेल्युलर डिब्बों में स्थित हैं, और कुछ, जैसे स्टेट प्रोटीन, डिब्बों के बीच शटल (उदाहरण के लिए, साइटोप्लाज्म और नाभिक के बीच)। ध्यान दें, फॉस्फोराइलेटेड और कुल STAT1 lysis बफर 1 का उपयोग करते हैं क्योंकि उन्हें अन्य STAT प्रोटीन के लिए उपयोग किए जाने वाले lysis बफर 2 के साथ अच्छी तरह से पता नहीं लगाया जा सकता है। इसके विपरीत, अन्य सजातीय तरीके एक एकल "सार्वभौमिक" लाइसिस बफर पर भरोसा करते हैं, जो एक अधिक जटिल नमूना उत्पन्न करता है जो एंटीबॉडी के साथ गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन बना सकता है। हालांकि, विभिन्न लाइसिस बफ़र्स का उपयोग एक एकल लिसेट नमूने से कई सिग्नलिंग प्रोटीन के विश्लेषण को रोक सकता है। फिर भी, कोई भी अभी भी समानांतर मार्ग विश्लेषण के लिए एक ही प्लेट पर एक साथ विभिन्न लाइसिस बफर के साथ उत्पन्न लिसेट का परीक्षण कर सकता है।

अंत में, इस सजातीय TR-FRET सेलुलर immunoassay प्लेटफ़ॉर्म के आधार पर यहां प्रस्तुत विधियां अंतर्जात फॉस्फोराइलेटेड STAT1/3/4/5/6 प्रोटीन का पता लगाने और परिमाणीकरण के माध्यम से JAK/ STAT सिग्नलिंग की निगरानी के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विकल्प प्रदान करती हैं, साथ ही साथ कुल STAT1/3/5/6, सेल लिसेट में। ये assays सेल उपचार के बाद विशिष्ट STAT प्रोटीन के अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए नए उपकरण प्रदान करते हैं और JAK / STAT सिग्नलिंग मार्गों के विशिष्ट और चयनात्मक मॉड्यूलेटर की स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन करते हैं। अपनी सादगी, विशिष्टता, संवेदनशीलता, reproducibility, और लागत प्रभावशीलता को देखते हुए, यह नया परख मंच पारंपरिक immunoassays के लिए एक आकर्षक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, दोनों एक अकादमिक सेटिंग में और एचटीएस अनुप्रयोगों के लिए औद्योगिक प्रयोगशालाओं में।

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Disclosures

प्रतिस्पर्धी रुचियां: Jaime Padros, Mireille Caron, और Geneviève Chatel BioAuxilium अनुसंधान के कर्मचारी हैं, जो इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले थंडर टीआर-फ्रेट परख किट का निर्माण करता है। इसके अलावा, Jaime Padros और Mireille Caron BioAuxilium Research के शेयरधारक हैं। यह डेटा और सामग्री साझा करने पर सभी JoVE नीतियों के लिए लेखकों के पालन को नहीं बदलता है।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile Corning 3595 This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used
384-well microplate, white, low-volume PerkinElmer 6007290 This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used
A431 cell line ATCC CRL-1555
Adhesive microplate seal PerkinElmer 6050185
DMSO Fisher D159-4
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Wisent 319-005-CL  THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
EnVision Xcite Multilabel plate reader PerkinElmer 2104-0020A The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option
Erlotinib hydrochloride Sigma CDS022564
Falcon tissue culture treated flasks Fisher 13-680-65
Fetal bovine serum (FBS) Wisent 098-150
HeLa cell line ATCC CCL-2
JAK Inhibitor 1 Cayman Chemical 15146
Orbital plate shaker Many options available Not applicable
Recombinant human EGF PeproTech AF-100-15
Recombinant human IFNα2b ProSpec CYT-460
Recombinant human IL-4 R&D Systems 204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Wisent 350-007-CL THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT4P-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT6PT-500
Trypsin/EDTA 0.05% Wisent 325-542-CL
U266B1 cell line ATCC TIB-196
Ultrapure water NA NA Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer

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References

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जैव रसायन अंक 175 JAK / STAT सिग्नलिंग STAT प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन सजातीय assays TR-FRET Immunoassay सेल आधारित परख किनेसेस सेल सिग्नलिंग उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग साइटोकाइन सिग्नलिंग
मानव कोशिकाओं में अंतर्जात फॉस्फोराइलेटेड स्टेट प्रोटीन के मापन के लिए समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण Assays
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Padros, J., Chatel, G., Caron, M.… More

Padros, J., Chatel, G., Caron, M. Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells. J. Vis. Exp. (175), e62915, doi:10.3791/62915 (2021).

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