Summary
Этот проктокол призван обеспечить метод визуализации митохондрий Ca2+ in vitro и in vivo в астроцитах и нейронах.
Abstract
Митохондриальный Ca2+ играет решающую роль в контроле цитозольной буферизации Ca2+, энергетического метаболизма и трансдукции клеточного сигнала. Перегрузка митохондриального Ca2+ способствует различным патологическим состояниям, включая нейродегенерацию и апоптотическую гибель клеток при неврологических заболеваниях. Здесь мы представляем специфический клеточный тип и митохондрии, нацеленные на молекулярный подход для визуализации митохондрий Ca2 + в астроцитах и нейронах in vitro и in vivo. Мы построили ДНК-плазмиды, кодирующие митохондрии-таргетные генетически закодированные индикаторы Ca2+ (GECI) GCaMP5G или GCaMP6s (GCaMP5G/6s) с астроцитарными и нейрон-специфическими промоторами gfaABC1D и CaMKII и последовательностью нацеливания на митохондрии (mito-). Для визуализации митохондрий Ca2+ in vitro плазмиды трансфектировались в культивируемых астроцитах и нейронах для экспрессии GCaMP5G/6s. Для визуализации in vivo митохондриального Ca2+ аденоассоциированные вирусные векторы (AAV) были подготовлены и введены в мозг мыши для экспрессии GCaMP5G/6s в митохондриях в астроцитах и нейронах. Наш подход предоставляет полезные средства для изображения динамики митохондриального Ca2+ в астроцитах и нейронах для изучения взаимосвязи между цитозольной и митохондриальной сигнализацией Ca2+, а также взаимодействиями астроцитов и нейронов.
Introduction
Митохондрии являются динамическими субклеточными органеллами и считаются клеточными электростанциями для производства энергии. С другой стороны, митохондрии могут поглощать Ca2+ в матрицу в ответ на локальное или цитозольное повышение Ca2+. Поглощение митохондриальной Ca2+ влияет на митохондриальную функцию, включая метаболические процессы, такие как реакции в цикле трикарбоновой кислоты (TCA) и окислительное фосфорилирование, и регулирует Ca2+-чувствительные белки в физиологических условиях1,2,3,4. Перегрузка митохондрий Ca2+ также является определяющим фактором гибели клеток, включая некроз и апоптоз при различных заболеваниях головного мозга5,6,7. Это вызывает открытие переходных пор митохондриальной проницаемости (мПТП) и высвобождение кофактора каспазы, которые инициируют апоптотическую гибель клеток. Поэтому важно изучать динамику митохондриального Ca2+ и обработку в живых клетках, чтобы лучше понять клеточную физиологию и патологию.
Митохондрии поддерживают матричный гомеостаз Ca2 + через баланс между поглощением Ca2 + и эффлюксом. Поглощение митохондриального Ca2+ в основном опосредовано митохондриальными Ca2+ унипортерами (MCU), в то время как митохондриальный Ca2+ эффлюкс опосредован Na+-Ca2 +-Li+ теплообменниками (NCLX) и H+/ Ca2 + обменниками (mHCX)8. Баланс может быть нарушен посредством стимуляции рецепторов, связанных с G-белком (GPCR)9. Митохондриальный гомеостаз Ca2+ также подвержен влиянию митохондриальной буферизации путем образования нерастворимых комплексов xCa2+-xPO4x-xOH8.
Внутриклеточные и митохондриальные изменения концентрации Ca2+ ([Ca2+]) могут быть оценены по флуоресцентным или люминесцентным показателям Ca2+. Связывание Ca2+ с индикаторами вызывает спектральные модификации, позволяющие регистрировать свободную клетку [Ca2+]в реальном времени в живых клетках. В настоящее время доступны два типа зондов для мониторинга изменений Ca2+ в клетках: органические химические индикаторы и генетически закодированные индикаторы Ca2+ (GECI). Как правило, для исследуемых биологических вопросов доступны различные варианты с различными сродствами Ca2+ (на основе Kd),спектральными свойствами (волны возбуждения и излучения), динамическими диапазонами и чувствительностью. Хотя многие синтетические органические индикаторы Ca2+ использовались для цитозольной визуализации Ca2+, только некоторые из них могут быть избирательно загружены в митохондриальный матрикс для визуализации митохондриального Ca2+, причем Род-2 является наиболее широко используемым (для обзоров см.10,11). Тем не менее, Rhod-2 имеет серьезный недостаток утечки во время длительных экспериментов; кроме того, он разделен между митохондриями, другими органеллами и цитозолом, что затрудняет абсолютные измерения в разных подкомпартментах. Напротив, используя специфические промоторы клеточного типа и последовательности нацеливания на субклеточный компартмент, GECI могут быть экспрессированы в различных типах клеток и субклеточных компартментах для клеточной и компартмент-специфической визуализации Ca2+ in vitro или in vivo. Одноволновые индикаторы интенсивности флуоресценции на основе GCaMP Ca2+ недавно стали основными GECI12,13,14,15,16. В этой статье мы предоставляем протокол для нацеливания на митохондрии и специфической экспрессии GCaMP5G и GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) в астроцитах и нейронах, а также визуализации поглощения митохондриального Ca2 + в этих типах клеток. Используя этот протокол, экспрессия GCaMP6G/6s в отдельных митохондриях может быть выявлена, а поглощение Ca2+ в одном митохондриальном разрешении может быть достигнуто в астроцитах и нейронах in vitro и in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Миссури-Колумбия.
1. Построение плазмид ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации in vitro и in vivo построены плазмиды ДНК, кодирующие GCaMP5G/6s с астроцитарными и нейрон-специфическими промоторами и митохондриальными целевыми последовательностями.
- Вставить митохондриальный матрикс (MM)-таргетную последовательность (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 в сайты клонирования EcoRI и BamHI в основе аденоассоциированного вируса (AAV) плазмиды pZac2.1 для получения плазмид, содержащих астроцитарный промотор gfaABC1D или промотор нейронов CaMKII18,19,20.
- Субклон GCaMP5G/6s в места клонирования BamH I и Not 1 в вышеуказанных плазмидах для получения новых плазмид pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s и pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s, которые нацелены на трансгенную экспрессию в митохондриях в астроцитах и нейронах20,21 (рисунок 1A).
- Готовят плазмиды ДНК pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G и pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s для трансфекции для исследования in vitro (раздел 2). Получение векторов AAV с серотипом 5 для астроцитов и серотипом 9 для нейронов для исследования in vivo 18 (Раздел 3).
2. In vitro митохондриальная визуализация Ca2+ в астроцитах и нейронах
- Подготовить первичные астроциты из коры неонатальных мышей P1 и первичные нейроны из коры эмбрионов E15-1618,22,23,24и культивировать их на стеклянных покровах диаметром 12 мм в 24-луночных пластинах с использованием модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и нейрональной базальной среды (NBM), содержащей 2% B27, соответственно.
- Трансфектировать зрелые астроциты и нейроны с помощью плазмид pZac-gfaABC1D-GCaMP6s и pZac-CaMKII-GCaMP5G с использованием трансфекционного реагента на основе липидов для экспрессии GCaMP6s в митохондриях астроцитов и GCaMP5G в митохондриях нейронов18,20,21. Трансфектируйте клетки в каждую лунку с 0,5 мкг ДНК и изменяйте среду через 6 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Астроциты и нейроны готовы к визуализации через 1-2 дня после трансфекции. - Выполняйте in vitro митохондриальную визуализацию Ca2+ через 1-2 дня после трансфекции.
- Перенесите стеклянные покровы, культивируемые астроцитами или нейронами, в перфузионную камеру PH-1 под эпифлуоресцентным или двухфотонным микроскопом.
- Стимулируют поглощение астроцитарных митохондрий Ca2+ 100 мкМ АТФ в ACSF или стимулируют нейронные митохондрии 100 мкМ глутамата/10 мкМглицина 20,25 (Рисунок 2 и Рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения раствора от ACSF к АТФ- и глутамат/глициносодержащему ACSF контролируются перфузионной системой ALA-VM821. Скорость замены раствора контролируется на уровне 1-2 мл/мин путем регулировки клапана.
3. In vivo митохондриальная визуализация Ca2+ в астроцитах и нейронах
- Препараты AAV.
- Подготовьте следующие рекомбинантные векторы аденоассоциированного вируса (rAAV) с использованием плазмид ДНК, полученных в разделе 1: векторы rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G и rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте векторы rAAV серотипа 5 были подготовлены для экспрессии GCaMP5G в митохондриях в астроцитах, а векторы rAAV серотипа 9 были подготовлены для экспрессии GCaMP6 в митохондриях в нейронах.
- Подготовьте следующие рекомбинантные векторы аденоассоциированного вируса (rAAV) с использованием плазмид ДНК, полученных в разделе 1: векторы rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G и rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
- Стереотаксическая инъекция ААВ.
- Обезболить мышь 3% изофлураном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позже во время операции уровень изофлурана снижается до 2%. - После того, как мышь достигнет хирургического уровня анестезии, определяемого по защемлению хвоста и пальца ноги, сбрите волосы над местом операции, моторной или соматосенсорной корой, с помощью триммера для волос.
- Расположите мышь на стереотаксическом устройстве мыши и зафиксируйте голову ушными вкладышами. Наносите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы защитить их во время операции. Используйте грелку, чтобы поддерживать температуру тела мыши на уровне 37 °C на протяжении всей операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте операции с использованием асептических процедур. Все хирургические инструменты должны быть стерилизованы либо автоклавированием, либо горячим стерилизатором из бисера. - После того, как мышь установлена на стереотаксическое устройство, стерилизуйте кожу головы чередующимся скрабом на основе йода и 70% этанолом три раза. Сделайте разрез в средней линии кожи головы, чтобы обнажить место инъекции.
- Отрежьте кожу в оси брегма-ламда и создайте отверстие для заусенцев диаметром ~1 мм с помощью высокоскоростного сверла в предполагаемом месте впрыска моторной или соматосенсорной коры.
- Используйте шприц Гамильтона 33 Г, содержащий аденоассоциированный вирус (векторы rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x10 11 GC] или rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x10 11 GC]), чтобы ввести до 1 мкл вируса в целевую область.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для доставки вируса коры головного мозга вводите раствор вируса на две глубины в несколько этапов. Сначала вставьте иглу на глубину 1 мм от твердой мозговой оболочки и дайте мозгу 5 минут восстановиться. Затем переместите иглу на глубину до ~700 мкм и введите 500 нл раствора вируса со скоростью впрыска 10 нл/с с помощью шприца Гамильтона, управляемого контроллером микрошприцевого насоса. После того, как инъекция будет завершена, подождите 5 минут, чтобы позволить вирусу диффундировать в мозг. Затем переместите иглу вверх ко второму месту инъекции на глубину 300 мкм. Здесь вводят дополнительно 500 нЛ раствора вируса. Подождите 10 минут, чтобы вирус диффундировал в мозг. - Закройте кожу головы и кожу с помощью тканевого клея. Дайте мышам восстановиться на грелке. Отправьте мышей обратно в животное учреждение после выздоровления.
- Обезболить мышь 3% изофлураном.
- Черепно-оконная интсталляция и in vivo двухфотонная (2-P) визуализация митохондриальных сигналов Ca2+.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация черепного окна проводится через 3 недели после инъекции AAV над моторной или соматосенсорной корой26,27,28,29. Карпрофен (10 мг / кг) вводится подкожно, чтобы обеспечить облегчение от потенциальной боли перед операцией. Хирургические процедуры черепного окна идентичны хирургическим процедурам инъекции AAV и выполняются в асептических условиях.- Обезболить мышь 3% изофлураном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это начальная доза и уменьшить до 2% для операции в дальнейшем. Во время визуализации для анестезии используется внутрибрюшинная (IP) инъекция 130 мг кетамина / 10 мг ксилазина / кг массы тела, растворенной в ACSF. - Расположите мышь на стереотаксическом устройстве мыши и зафиксируйте голову ушными вкладышами. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза. Используйте грелку, чтобы поддерживать температуру тела мыши на уровне 37 °C на протяжении всей операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть стерилизованы. - Сделайте разрез длиной 5-8 мм в средней линии кожи головы и удалите лоскут кожи ножницами.
- После того, как череп обнажен, выполните краниотомию диаметром 2,0-3,0 мм с помощью высокоскоростного сверла над областью инъекции вируса (т. Е. Моторной корой или соматосенсорной корой, рисунок 1B). Сначала сделайте четыре небольших отверстия, а затем просверлите по кругу, соединяющему отверстия. Затем поднимите и удалите кость острыми ножницами и удалите. Открытая твердая мозговая оболочка может быть удалена или сохранена неповрежденной для пропитывания черепного окна.
- Поместите стеклянную крышку диаметром 3-5 мм, неся прозрачный силикон поверх краниотомии. Используйте зубочистку, чтобы осторожно протолкнуть краниальное окно на поверхность мозга. Затем запечатайте край небольшим количеством силиконового клея.
ПРИМЕЧАНИЯ: Альтернативно, вместо силиконового диска, 1,2% агарозный гель с низкой температурой плавления может быть использован между покровным стеклом и мозговой тканью. - Наконец, запечатайте края обшивки зубным цементом. Позаботьтесь о том, чтобы нанести цемент немного на край краниального окна для прочного склеивания. Прикрепите изготовленную на заказ металлическую головную пластину к черепу с помощью зубного цемента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Металлическая пластина используется для фиксации головки мыши на стадии 2-P микроскопа во время сеанса визуализации(рисунок 1C). - Добавьте 0,5 мл раствора ACSF поверх крышки на краниальном окне для погружения в воду во время визуализации.
- Выполняют покадровую in vivo 2-P визуализацию mito-GCaMP5G в астроцитах и mito-GCaMP6s в нейронах с длиной волны 910 нм через краниальное окно(рисунок 1C)18,20,27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуализации мыши находятся на грелке для поддержания физиологической температуры. Мыши будут принесены в жертву сразу после завершения сеанса визуализации. - Метка астроцитов in vivo сульфородамином 101 (SR101) при необходимости определения колокализации.
- В конце шага 3.3.4 наносят 100 мкл 100 мкМ SR101 в ACSF на кортикальную поверхность в течение 1-5 мин.
- Промойте поверхность с помощью ACSF, чтобы смыть несвязанный SR101. Используя 2-P визуализацию, ко-маркировка mito-GCaMP5G и SR101 в астроцитах может наблюдаться через 45-60 мин(рисунок 4A).
- Обезболить мышь 3% изофлураном.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целью этого исследования было предоставление методологии для изображения митохондриальных сигналов Ca2+ с использованием GECI в астроцитах и нейронах in vitro и in vivo. Здесь представлены результаты как in vitro, так и in vivo митохондриальной визуализации Ca2+.
In vitro митохондриальнаяпередача сигналов Ca2+ в культивируемых астроцитах и нейронах
Поглощение митохондриального Ca2+ в астроцитах может быть вызвано применением АТФ, а поглощение митохондриального Ca2+ в нейронах может быть вызвано применением глутамата и глицина через перфузионную систему. На рисунках 2 и 3 показано, что GCaMP6s экспрессируется в культивируемых астроцитах и GCaMP5G в нейронах соответственно. Поглощение митохондриального Ca2+ в астроцитах вызывалось 100 мкМ АТФ с одним митохондриальным разрешением(рисунок 2B-D). Поглощение митохондриальным Ca2+ в нейронах вызывалось 100 мкМ глутамата и 10 мкМ глицина с одним митохондриальным разрешением(рисунок 3B-D).
Визуализация in vivo 2-P митохондриальной экспрессии GCaMP5G или 6S в астроцитах и нейронах
Визуализация выполняется путем сбора покадровой in vivo 2-P визуализации митохондриальных флуоресцентных сигналов в астроцитах и нейронах с помощью системы микроскопа Ultima 2-P. Мы используем длину волны возбуждения 880-910 нм. На рисунке 4 показана экспрессия GCaMP5G в митохондриях в астроцитах коры мыши. Астроцитарно-специфическая экспрессия GCaMP5G была подтверждена колокализацией SR101 с GCaMP5G с одним митохондриальным разрешением(Рисунок 4A),и можно наблюдать спонтанные изменения Ca2+ в отдельных митохондриях(Рисунок 4B-E). На рисунке 5A показана нейрон-специфическая экспрессия mito-GCaMP6s, колокализованная нейронным маркером NeuN. Флуоресценция мито-GCaMP6 в нейронах показывает митохондриальную морфологию в дендритах(рисунок 5B). Можно наблюдать спонтанное митохондриальное увеличение дендритов Ca2+ (рисунок 5C-F).
Анализ митохондриальных сигналов Ca2+
Количественно оцените флуоресцентные сигналы, вычислив среднюю интенсивность пикселей тела клетки или отдельных митохондрий в астроцитах и нейронах с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Изменения Ca2+ со временем (t) выражаются в виде значений F/Fo (t) по отношению ко времени, где Fo - фоновая вычитаемая базовая флуоресценция, а F - базовое вычитаемое изменение флуоресценции20,21. Используйте пиковые значения F/Fo для сравнения амплитуды сигналов Ca2+.
Рисунок 1:ДНК конструкты для астроцит- и нейрон-специфических митохондрий-таргетирующих трансгенной экспрессии и визуализации in vivo 2-P. (A)ДНК-конструкции генетически закодированного индикатора Ca2+ GCaMP5G или GcaMP6s в плазмиде pZac2.1 с промоторами gfaABC1D (вверх) и CaMKII (низкий) для доставки в астроцитарный и нейрональный митохондриальный матрикс соответственно. Нацеливание на митохондрии достигается с использованием специфической последовательности митохондриальной матрицы (ММ) (мито), прикрепленной к N-концу флуоресцентных белков. (B) Трепанация черепа над корой мыши. (C)Череп мыши прикреплен к металлической пластине, соединенной с столбом, закрепленным на ступени 2-П микроскопа. На вставке изображено краниальное окно с металлической пластиной, прикрепленной к черепу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Митохондриальная ca2+ визуализация культивируемых астроцитов. (A-B) 2-P изображение астроцита, экспрессирующего mito-GCaMP6s(A)и его ответ на стимуляцию 100 мкм АТФ в указанное время(B). (C)Изображения мито-GCaMP6 в четырех отдельных митохондриях (в кругах А) в разное время после стимуляции АТФ. (D) Временные курсы флуоресцентных изменений мито-GCaMP6s, построенные как ΔF/Fo, в четырех отдельных митохондриях после стимуляции АТФ. Красная стрелка указывает на время начала визуализации. Псевдоцветная шкала представляет собой линейное представление интенсивности флуоресценции на этом и других рисунках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Митохондриальная ca2+ визуализация культивируемых нейронов. (А-Б) 2-P изображение мито-GCaMP5G экспрессирующего нейрона(A)и его реакции на 100 мкМ глутамата и 10 мкМ глицина в указанное время(B). (C) Изображения мито-GCaMP5G в четырех отдельных митохондриях (в А, кругах) в разное время после стимуляции глутамата. (D) Временные ходы изменения флуоресценции mito-GCaMP5G в четырех отдельных митохондриях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:In vivo 2-P визуализация митохондриальной передачи сигналов Ca2+ в астроцитах. (A)2-P изображения мито-GCaMP5G экспрессирующих астроцитов, колокализованных с SR101. (B-C) 2-P изображение астроцита, экспрессирующего мито-GCaMP5G для анализа спонтанного повышения Ca2+. (C-E) Изображения мито-GCaMP5G в четырех отдельных митохондриях в астроците (в B, кругах) в разное время (C) и временные ходы изменений флуоресценции mito-GCaMP5G, построенные как ΔF / Fo, в четырех отдельных митохондриях (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:In vivo 2-P визуализация митохондриальной передачи сигналов Ca2+ в нейронах. (A)Колокализация GCaMP6s (верхняя) с нейронным маркером NeuN (средняя) в головном мозге. (B) Изображения дендритов с высоким разрешением, экспрессирующих GCaMP6s с митохондриальной морфологией (обозначено *s). (C)GCaMP6s, экспрессируемые в нейронных митохондриях. (D-F) Анализ спонтанного митохондриального ca2+ увеличения нейронов. Псевдоцветное 2-P изображение митохондрий, экспрессирующих мито-GCaMP6s в C в разное время(D). Изображения мито-GCaMP6s в четырех отдельных митохондриях в C (кругах) в разное время(E-F)и временные ходы изменений флуоресценции mito-GCaMP6s, построенные как ΔF / Fo, в четырех отдельных митохондриях(F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Фильм: Митохондриальный Ca2+ увеличивается на основе изменений флуоресценции GCaMP5G в ответ на 100 μMАТФ в культивируемых астроцитах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем метод и протокол визуализации митохондриальных сигналов Ca2+ в астроцитах и нейронах. Мы внедрили стратегии таргетирования митохондрий и типа клеток для экспрессии GECI GCaMP5G/6s. Чтобы нацелиться на GCaMP5G/6s в митохондриях, мы включили последовательность, нацеленную на митохондрии, в плазмидах. Чтобы экспрессировать GCaMP5G/6s в астроцитах и нейронах in vivo,мы вставили в плазмиды астроцит-специфический промотор gfaABC1D и нейрон-специфический промотор CaMKII. Специфическая экспрессия GCaMP5G/6s клеточного типа в астроцитах и нейронах может быть подтверждена маркировкой SR101 в астроцитах и иммуноокрашиванием нейронов NeuN. Исходя из наших данных, эти стратегии обеспечивают надежный подход к специфическому типу клеток для визуализации митохондрий Ca2 + в астроцитах и нейронах in vivo.
Одна из потенциальных проблем для выражения GECI заключается в том, что это может вызвать буферизацию Ca2+, поскольку это может уменьшить свободное Ca2+ на Ca2+ связывание. Еще одна проблема, на которую можно обратить внимание, — это количество вводимого вируса. Отдельные клетки, экспрессирующие GECI, могут быть не идентифицированы, если вводится чрезмерный вирус. Эти проблемы могут быть эффективно устранены путем снижения титра AAV. Фотоотбеливание также может быть проблемой. Теоретически все флуоресцентные индикаторы подвержены фотоотбеливанию. GCaMP5G/6s довольно стабильны, но они будут отбеливаться при постоянном воздействии света возбуждения. Одной из общих практик, позволяющих избежать фотоотбеливания, является сокращение времени воздействия лазерного света на ткани, обеспечивая при этом достаточный сбор флуоресценции. Это может быть достигнуто, если использовать высокочувствительные PMT и цели с высокой светопроницаемостью. Фотоотбеливание также можно уменьшить, закрыв затвор между изображениями.
В наших результатах визуализации in vivo 2-P спонтанное митохондриальное увеличение может наблюдаться как в астроцитах, так и в нейронах. Примечательно, что эти митохондриальные переходные процессы Ca2+ имеют длительные длительности(рисунок 4E и рисунок 5E),что согласуется с недавним отчетом Gobel et al.30. Основополагающий механизм этого явления не ясен, но его стоит продолжать. Для повышения цитозольного Ca2+ астроциты и нейроны имеют разные механизмы. Стимуляция рецепторов G-белка вызывает увеличение ER Ca2+ в астроцитах, в то время как активация напряженных каналов Ca2+ или глутаматных рецепторов вызывает цитозольное ca2+ увеличение нейронов, которые могут быть поглощены митохондриями. В нашем предыдущем исследовании20мы обнаружили, что, когда мито-GCaMP5G котрансфицировался с культивируемыми астроцитами IP3 5-фосфатазы (5ppase), АТФ-индуцированное митохондриальное увеличение Ca2+ может быть в значительной степени отменено. Однако два мутанта 5ppase, то есть R343A и R343A/R350A 5ppase, которым не хватает ферментативной активности, не повлияли на повышение митохондриального Ca2+ после стимуляции АТФ. Эти результаты показывают, что цитозольный и митохондриальный уровни Ca2+ сильно связаны, вероятно, из-за тесной физической связи между ER и митохондриями в астроцитах, при этом цитозоль служит промежуточным каналом для доставки Ca2+. Мы также обнаружили, что стимуляция глутамата вызывает митохондриальное увеличение нейронов Ca2 +, предполагая, что рецепторы глутамата играют роль в проникновении Ca2 + из внеклеточного пространства. В будущем будет интересно изучать сенсорное увеличение митохондриального Ca2+ в астроцитах и нейронах.
Наш подход может быть использован для одновременного изображения цитозольных и митохондриальных сигналов Ca2+ в одном и том же типе клеток, когда экспрессируются два GECI разных длин волн флуоресценции, например, красная флуоресценция GECI RCaMP в цитоплазме и GCaMP в митохондриях или наоборот31. Этот подход также может быть использован для изучения in vivo астроцитарно-нейронных взаимодействий в физиологии и патологии с GCaMP, экспрессируемым в астроцитах и RCaMP в нейронах, или наоборот.
GCaMP представляет собой одноволновый флуорофор GECI на основе GFP. В настоящее время GCaMP являются наиболее предпочтительными индикаторами Ca2+ из-за их высокого отношения сигнал/шум (SNR) и больших динамических диапазонов (DR). Недавно сообщалось о датчиках jGCaMP7, оптимизированной версии GCaMP6, с улучшенной чувствительностью к отдельным всплескам16. Датчики GCaMP7 могут быть легко субклонированы в наших плазмидах для митохондриальной визуализации Ca2 +. Таким образом, стратегии, которые мы представили здесь, могут быть использованы для изображения поглощения и обработки митохондриального Ca2 + в нейронах и астроцитах с достаточной чувствительностью для разрешения изменений Ca2 + на одном митохондриальном уровне in vivo. Этот протокол представляет собой полезное средство для изучения цитозольной и митохондриальной передачи сигналов Ca2+ в астроцитах и нейронах, а также астроцитарно-нейронных взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS) грантами R01NS069726 и R01NS094539 для SD. Благодарим Эрику ДеМерс за аудиозапись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: The calcium connection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
