Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Оптогенетический фазовый переход TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах личинок рыбок данио

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932

Summary

Мы описываем протокол для индуцирования фазового перехода TAR-ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) светом в спинальных двигательных нейронах, используя рыбок данио в качестве модели.

Abstract

Аномальная агрегация белка и селективная уязвимость нейронов являются двумя основными признаками нейродегенеративных заболеваний. Причинно-следственные связи между этими признаками могут быть изучены путем контроля фазового перехода белка, связанного с заболеванием, в уязвимом типе клеток, хотя этот экспериментальный подход до сих пор был ограничен. Здесь мы описываем протокол индуцирования фазового перехода РНК/ДНК-связывающего белка TDP-43 в спинальных двигательных нейронах личинок рыбок данио для моделирования цитоплазматической агрегации TDP-43, происходящей в дегенерирующих двигательных нейронах при боковом амиотрофическом склерозе (БАС). Мы описываем генетический метод на основе бактериальной искусственной хромосомы (BAC) для выборочной доставки оптогенетического варианта TDP-43 к спинальным двигательным нейронам рыбок данио. Высокая прозрачность личинок рыбок данио позволяет осуществлять фазовый переход оптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах простым внешним освещением с использованием светодиода (LED) против несдержанных рыб. Мы также представляем базовый рабочий процесс визуализации спинальных двигательных нейронов рыбок данио и анализа изображений с помощью свободно доступного программного обеспечения Fiji / ImageJ для характеристики реакций оптогенетического TDP-43 на световое освещение. Этот протокол позволяет характеризовать фазовый переход TDP-43 и образование агрегатов в уязвимой к БАС клеточной среде, что должно облегчить исследование его клеточных и поведенческих последствий.

Introduction

Гранулы рибонуклеопротеина (RNP) контролируют множество клеточных активностей в ядре и цитоплазме, собирая безмембранные перегородки посредством разделения жидкой и жидкой фазы (LLPS), явление, при котором однородная жидкость демиксирует в две различные жидкие фазы1,2. Дисрегулируемые LLPS РНК-связывающих белков, которые обычно функционируют как гранулярные компоненты RNP, способствуют аномальному фазовому переходу, что приводит к агрегации белка. Этот процесс был вовлечен в нейроразвитие и нейродегенеративные заболевания3,4,5. Точная оценка причинно-следственной связи между аберрантными LLPS РНК-связывающих белков и патогенезом заболевания имеет решающее значение для определения того, можно ли и как LLPS использовать в качестве эффективной терапевтической мишени. LLPS РНК-связывающих белков относительно легко изучать in vitro и в одноклеточных моделях, но трудно в многоклеточных организмах, особенно у позвоночных. Критическим требованием для анализа таких LLPS в отдельных клетках в тканевой среде является стабильная экспрессия зонда для визуализации и манипулирования LLPS в уязвимом к заболеванию типе клеток.

Боковой амиотрофический склероз (БАС) является в конечном счете смертельным неврологическим расстройством, при котором двигательные нейроны головного и спинного мозга избирательно и постепенно теряются из-за дегенерации. На сегодняшний день мутации в более чем 25 генах были связаны с наследственной (или семейной) формой БАС, на которую приходится 5%-10% от общего числа случаев БАС, и некоторые из этих генов, вызывающих БАС, кодируют РНК-связывающие белки, состоящие из РНК, такие как hnRNPA1, TDP-43 и FUS6,7. Более того, спорадическая форма БАС, на которую приходится 90%-95% от общего числа случаев БАС, характеризуется цитоплазматической агрегацией TDP-43, депонированного в дегенеративных двигательных нейронах. Основной характеристикой этих ALS-ассоциированных РНК-связывающих белков является их внутренне неупорядоченные области (IDR) или домены низкой сложности, которые не имеют упорядоченных трехмерных структур и опосредуют слабые белково-белковые взаимодействия со многими различными белками, которые управляют LLPS7,8. Тот факт, что бас-вызывающие мутации часто встречаются в IDR, привел к идее, что аберрантный LLPS и фазовый переход этих связанных с ALS белков могут лежать в основе патогенеза ALS9,10.

Недавно был разработан метод optoDroplet, оптогенетический метод на основе Cryptochrome 2, который позволяет модулировать белково-белковые взаимодействия светом, чтобы индуцировать фазовый переход белков с помощью IDR11. Поскольку этот метод был успешно распространен на TDP-43, он начал раскрывать механизмы, лежащие в основе патологического фазового перехода TDP-43 и связанной с ним цитотоксичности12,13,14,15. В этом протоколе мы описываем генетический метод доставки оптогенетического TDP-43 к ALS-уязвимым типам клеток, а именно спинальным моторным нейронам у рыбок данио с использованием BAC для гена mnr2b / mnx2b, кодирующего гомеодоменный белок для спецификации двигательных нейронов16,17. Высокая прозрачность личинок рыбок данио позволяет проводить простую, неинвазивную световую стимуляцию оптогенетического TDP-43, который запускает его фазовый переход в спинномозговых двигательных нейронах. Мы также представляем базовый рабочий процесс для визуализации спинальных двигательных нейронов рыбок данио и анализа изображений с использованием свободно доступного программного обеспечения Fiji / ImageJ для характеристики реакций оптогенетического TDP-43 на световую стимуляцию. Эти методы позволяют исследовать фазовый переход TDP-43 в уязвимой к БАС клеточной среде и должны помочь изучить его патологические последствия на клеточном и поведенческом уровнях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все работы с рыбой проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (идентификационный номер одобрения 24-2) Национального института генетики (Япония), которое имеет гарантию благополучия животных в файле (номер гарантии A5561-01) в Управлении благосостояния лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (NIH, США).

1. Построение БАС для экспрессии оптогенетического гена TDP-43 из промотора mnr2b

  1. Подготовка БАК
    1. Приобретите клон BAC рыбки данио, содержащий локус рыбки данио mnr2b (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Очистите ДНК BAC из 5 мл ночной культуры LB DH10B Escherichia coli (E. coli), содержащей CH211-172N16, как описано в Warming et al.18.
    2. Преобразование CH211-172N16 в ячейки SW102 E. coli путем электропорации, как описано в Warming et al.18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка ДНК BAC от E. coli в тот же день электропорации обычно дает более высокую успешность трансформации BAC18. В противном случае очищенная ДНК BAC сохраняется при -20 °C до использования.
    3. Представьте iTol2-амперную кассету для транспозонно-опосредованного Tol2 BAC трансгенеза19 в основу CH211-172N16 путем электропорации, как описано в Asakawa et al.20.
      1. Сделайте глицериновый запас клонов клеток E. coli , несущих CH211-172N16 с интеграцией кассеты iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) после подтверждения гомологичной рекомбинационно-опосредованной интеграции полимеразной цепной реакцией (PCR) (Ex Taq) с использованием пары праймеров Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') и pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') и следующих условий: стадия денатурации при 98 °C в течение 1 мин, за которой следуют 25 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с, отжиг грунтовки при 55 °C в течение 15 с и удлинение грунтовки при 72 °C в течение 1 мин, усиливая продукт ПЦР из 354 пар оснований (bp).
  2. mnr2b-hs:конструкция opTDP-43h
    1. Построить плазмиду, несущую кассету выражений для человеческого дикого типа TDP-43/TARDBP (TDP-43h), которая помечена mRFP1 и CRY2olig на N- и C-терминах соответственно (далее opTDP-43h)14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагмент opTDP-43h должен быть окружен последовательностью промотора гена рыбки данио hsp70l (650 bp) и сигнальной последовательностью полиаденилирования (polyA), за которым следует ген устойчивости к канамицину (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Амплифицируйте кассету hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan с помощью праймеров, которые отжигают hsp70l и Kan и содержат 45 последовательностей bp вверх и вниз по течению кодонов инициатора гена mnr2b методом ПЦР (GXL DNA Polymerase) с использованием пары праймеров mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') и Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') со следующими условиями: шаг денатурации при 98 °C в течение 1 мин, за которым следуют 30 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с, отжиг грунтовки при 55 °C в течение 15 с и удлинение грунтовки при 68 °C в течение 30 с, амплифицирующий продукт ПЦР ~5,7 bp.
    3. Отделите продукты ПЦР электрофорезом агарозного геля (100 В) и очистите полосу ДНК hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan с помощью днк-колонки. Отрегулируйте концентрацию очищенной кассеты hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan до 50 нг/мкл в буфере Tris-EDTA (TE), содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА.
    4. Введите кассету hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan в CH211-172N16-iTol2A путем электропорации, как описано в Warming et al.18, и выберите ампициллин- и канамицин-устойчивые трансформанты на пластинах агара LB. CH211-172N16-iTol2A, несущий кассету hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan, обозначается как mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Очистите mnr2b-hs:opTDP-43h с помощью набора для очистки BAC и растворите его при 250 нг/мкл в TE после экстракции фенола/хлороформа.
  3. mnr2b-hs:Конструкция EGFP-TDP-43z
    1. Постройте другую плазмиду, несущую tardbp дикого типа рыбок данио, которая помечена улучшенным зеленым флуоресцентным белком (EGFP) на своем N-конце (EGFP-TDP-43z) вместо opTDP-43h, но в остальном идентична конструкции hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Используют EGFP-TDP-43z в качестве внутреннего контроля для световой стимуляции opTDP-43h.
    2. Конструкция CH211-172N16-iTol2A с кассетой hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan в локусе mnr2b, как описано в 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A, несущий кассету hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan, обозначается как mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Транспозон-опосредованный TOL2 BAC трансгенез у рыбок данио

  1. Готовят инъекционный раствор, содержащий 40 мМ KCl, фенол красный (10% v/v), 25 нг/мкл mnr2b-hs:opTDP-43h ДНК и 25 нг/мкл Tol2 транспозазы мРНК19.
  2. Вводят 1 нл инъекционного раствора (каплю диаметром приблизительно 123 мкм, откалиброванную в минеральном масле) в цитозоль эмбрионов рыбок данио дикого типа на одноклеточной стадии. Скрининг введенной рыбы на образование красного флуоресцентного белка (RFP)-положительных агрегатов в различных эмбриональных тканях, включая спинальные двигательные нейроны, под флуоресцентным стереомикроскопом через 2-3 дня после оплодотворения (dpf). Поднимите RFP-положительную рыбу до зрелого возраста.
  3. Введите ДНК mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, как описано в 2.1 и 2.2. Поднимите EGFP-положительную рыбу до зрелого возраста.
  4. Через несколько месяцев поместите половозрелых инъекционных рыб и рыб дикого типа парами в стандартные 2-литровые брачные клетки для получения потомства F1. Экран рыбы F1 при 3 dpf для флуоресценции RFP (opTDP-43h) или EGFP (EGFP-TDP-43z) в позвоночном моторном столбе с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом Plan-Neofluar 5x/0.15. Как правило, одна рыба-основатель идентифицируется из 10−20 введенных рыб (скорость передачи зародышевой линии составляет 5%−10%).
  5. Изолируйте и сравните несколько Вставок Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] и Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] от разных рыб-основателей, поскольку интенсивность, но не паттерн экспрессии opTDP-43h или EGFP-TDP-43z может варьироваться между рыбами-основателями из-за эффектов хромосомного положения.
  6. Скрестите Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] и Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] для получения потомства, содержащего Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу в менделевском соотношении.
  7. Вырастите рыбу в пластиковую посуду, содержащую 30 мл буфера E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, 10-5% Methylene Blue) и добавьте 0,003% (мас./об.) N-фенилтемочевины через 8-10 ч после оплодотворения (HPF) для ингибирования меланогенеза.
  8. Накройте пластиковую тарелку алюминиевой фольгой после 30 л.с.

3. Подготовка светодиода к освещению синим светом

  1. Включите светодиодную панель с помощью соответствующего приложения, установленного на планшете или телефоне. Поместите зонд спектрометра в пустой колодец из 6 лунок и отрегулируйте светодиодный свет до длины волны, достигающей максимума ~ 456 нм через приложение. Поместите оптический датчик измерителя оптической мощности в пустой колодец и отрегулируйте мощность светодиодного фонаря (~0,61 мВт/см2). Настройка светодиодного индикатора может быть сохранена и извлекается в приложении.
  2. Введите настройку тарелки / светодиодной панели в инкубатор при 28 °C. Завершите этот шаг до того, как изображение рыб начнется с 48 л.с.

4. Визуализация личинок рыбок данио, экспрессирующих оптогенетический TDP-43

  1. Выберите Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу, по крайней мере, до 47 л.с.ф., на основе флуоресценции RFP (opTDP-43h) или EGFP (EGFP-TDP-43z) в позвоночно-двигательном столбе с использованием эпифлуоресцентного микроскопа, описанного выше.
  2. Дехорионат Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойная трансгенная рыба.
  3. Разогреть 1% агарозу с низкой температурой плавления, содержащую 250 мкг/мл этил-3-аминобензоата метансульфонатной соли при 42 °C.
  4. Кратковременно обезболивают Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] двойную трансгенную рыбу при 48 л.с.ф. в буфере E3, содержащем ту же концентрацию трикана.
  5. Нанесите каплю предварительно нагретой 1% агарозы низкой температуры плавления на стеклянную основу посуды при комнатной температуре. Диаметр куполообразной капли агарозы на стеклянной посуде составляет 8-10 мм.
  6. Используя пипетку Пастера, добавьте обезболенную рыбу к агарозе с низкой температурой плавления на стеклянной посуде, а затем перемешайте, пипеткой несколько раз. Сведите к минимуму количество буфера E3, добавляемого к агарозе вместе с рыбой.
  7. Поддерживайте рыбу на боку, используя шприцевую иглу во время затвердевания агарозы (обычно ~ 1 мин), чтобы убедиться, что спинной мозг находится в соответствующем горизонтальном положении. После затвердевания нанесите пару капель буфера Е3 на куполообразную агарозную рыбу.
  8. Получение последовательных конфокальных z-срезов спинного мозга путем сканирования с помощью конфокального микроскопа, оснащенного объективом с погружением в воду 20x с числовой диафрагмой 1,00, используя скорость сканирования 4,0 мкс на пиксель (12 бит на пиксель), размер шага 1,0 мкм на срез для объектива и комбинацию длин волн возбуждения/излучения: Канал 1) 473/510 нм для EGFP и канал 2) 559/583 нм для mRFP1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клоака на вентральной стороне рыбы включена в области интереса (ROI) в качестве эталона, что помогает идентифицировать и сравнить сегменты позвоночника (уровни 16-17) по временным точкам.
  9. Удалите рыбу из агарозы, осторожно расщеблив агарозу шприцевой иглой, как только визуализация будет завершена. Держите количество времени, в течение которого рыба внедряется в агарозу, как можно короче, хотя встраивание агарозы в течение <30 мин не влияет на жизнеспособность рыбы.

5. Световая стимуляция opTDP-43h-экспрессирующих рыб полевым освещением синего светодиодного (LED) света

  1. Добавьте 7,5 мл буфера E3 в скважину и поместите в скважину изображенную Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу. Поместите тарелку из шести лунок на светодиодную панель, удерживая тарелку и светодиодную панель на расстоянии 5 мм друг от друга с помощью распорки (например, с пятью сложенными стаканами).
  2. Включите синий светодиод. Храните часть Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] в отдельной шестилуночной посуде, покрытой алюминиевой фольгой, когда необходима неосвещенная контрольная рыба (т.е. в темных условиях)14.
  3. После освещения (например, в течение 24 ч при 72 л.с.ф . на рисунке 3) визуализируйте спинной мозг освещенной рыбы, повторив шаги 4.3 - 4.9.

6. Визуализация цитоплазматического перемещения оптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах

  1. Откройте файл изображения в ImageJ/Fiji21 (версия: 2.1.0/1.53c), программе обработки изображений Java с открытым исходным кодом, разработанной NIH Image, которую можно загрузить с https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Используйте полосу прокрутки Z для перемещения по фокальным плоскостям. Создайте проекцию максимальной интенсивности нескольких фрагментов, щелкнув Изображение | Стеки | | проекта Z Максимальная интенсивность и установка Стартового среза и Стоп-среза, которые покрывают полушария позвоночного моторного столба.
  3. Разделите многоканальное изображение на два одноканальных изображения, щелкнув Изображение | Цвет | Разделенные каналы.
  4. Улучшите сигнал EGFP-TDP-43z, чтобы убедиться, что цитоплазматический EGFP-TDP-43z хорошо виден, щелкнув Изображение | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность и минимальная регулировка
  5. Откройте менеджер окупаемости инвестиций, щелкнув Анализ | Инструменты | Менеджер roi. Найдите ячейки, которые идентифицируются на обоих изображениях при 48 л.с.ф. и 72 л.с.ф., на основе относительных положений тел клеток. Установите ROI, очертив контуры клеточных тел одиночных спинальных двигательных нейронов, визуализированных сигналом EGFP-TDP-43z с помощью выбора От руки, а затем щелкнув Add[t] в менеджере ROI.
  6. Установите большую ось сомы, нарисовав прямую линию с помощью прямой и щелкнув Анализировать | Профиль печати для изображений EGFP-TDP-43z (C1) и opTDP-43h (C2) при 48 и 72 л.с.
  7. Нормализуйте профиль графика, разделив значения на наибольшее значение для каждого сигнала EGFP-TDP-43z и opTDP-43h. Постройте нормализованные значения с координатами x-y, где x и y представляют большую ось сомы и относительную интенсивность флуоресцентной активности соответственно, используя график XY в статистическом программном обеспечении.

7. Ратиометрическое сравнение сигналов opTDP-43h и EGFP-TDP-43z с использованием ImageJ/Fiji

  1. Откройте файл изображения в ImageJ/Fiji и установите ROI для одиночных mnr2b-положительных ячеек, используя проекционное изображение максимальной интенсивности EGFP-TDP-43z, как в 6.1-6.5. Добавьте ROI за пределами вентрального спинного мозга (например, notochord), чтобы представить фоновый сигнал (фоновый ROI).
  2. Для каждого образа EGFP-TDP-43z и opTDP-43 создайте проекцию из нескольких фрагментов, щелкнув Изображение | Стеки | | проекта Z Суммируйте фрагменты и установите Начальный фрагмент и Стоп-фрагмент, которые покрывают гемиспинальный моторный столбец.
  3. Откройте менеджер ROI, созданный с максимальной интенсивностью проекционного изображения. Отобразите окупаемость инвестиций на изображении Sum Slices, выбрав окно изображения для EGFP-TDP-43z и нажав кнопку Показать все в диспетчере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить средние значения для каждой окупаемости инвестиций.
  4. Получите средние значения для opTDP-43h в соответствии с той же процедурой, что и в 7.3.
  5. Для каждого ROI, после вычитания среднего для фонового ROI, разделите вычитаемое среднее для opTDP-43h на вычитаемое среднее для EGFP-TDP-43z для получения ратиометрического значения. Ратиометрические значения могут быть сопоставлены между различными точками времени и представлены с помощью графа столбцов в программном обеспечении Prism.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Живая визуализация оптогенетических и неоптогенетических белков TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах личинок рыбок данио mnr2b+
Чтобы индуцировать фазовый переход TDP-43 в спинальных двигательных нейронах у рыбок данио, человеческий TDP-43h, помеченный mRFP1 и CRY2olig22 на N- и C-концах, соответственно, был построен и обозначен как opTDP-43h14 (рисунок 1A). Фрагмент гена opTDP-43h вводили в BAC, содержащий локус mnr2b (рисунок 1B). Полученный BAC, обозначенный как mnr2b-hs:opTDP-43h, был введен в геном рыбки данио транспозонно-опосредованным Tol2 трансгенезом BAC19. Для мониторинга локализации неоптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах TDP-43 рыбки данио, кодируемый геном tardbp, был помечен EGFP на N-конце (рисунок 1A), а фрагмент гена EGFP-TDP-43z был введен в Mnr2b BAC, аналогично opTDP-43h (рисунок 1B). Полученный BAC, обозначенный как mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, был введен в геном рыбки данио транспозонно-опосредованным Tol2 трансгенезом BAC. Рыбу, введенную с каждой конструкцией BAC, скрещивали с рыбой дикого типа, и полученную рыбу F1 проверяли на 3-й день на красную (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) или зеленую (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) флуоресценцию в вентральном спинном мозге. Изолированные красные или зеленые флуоресцентно-положительные F1 рыбы были обозначены как Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] или Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] соответственно.

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойные трансгенные рыбы при 48 л.с.ф. были обезболены и встроены в низкоплавкую агарозу на боку; после затвердевания агарозы их покрывали буфером Е3, чтобы можно было наблюдать боковую сторону спинного мозга сверху. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия проводилась с помощью объектива с погружением в воду 20x и комбинации длин волн возбуждения/излучения: 473/510 нм для EGFP и 559/583 нм для mRFP1. Отсканированную рыбу немедленно и осторожно извлекали из агарозы, переносили в буфер E3 в шестилуночной пластине и освещали синим светодиодным светом, помещая пластину на светодиодную панель при 28 °C (рисунок 2A, B). После 24-часового освещения рыбу анестезировали и снова встраивали в агарозу, прежде чем сканировать с помощью конфокальной микроскопии с использованием тех же условий визуализации, за исключением того, что ROI был скорректирован для включения соответствующей области спинного мозга, изображенной при 48 л.с. (рисунок 2B). Весь гемиспинальный канатик из 4-5 смежных сегментов позвоночника был изображен во время сеанса микроскопии (обычно 20-30 мин), генерируя изображения z-серии, содержащие 20-40 срезов в зависимости от горизонтальности продольной оси спинного мозга конной рыбы относительно плоскости конфокального сканирования.

Визуализация цитоплазматического перемещения оптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах
Чтобы визуализировать цитоплазматическое перемещение opTDP-43h в одиночных спинальных двигательных нейронах, изображения z-серии (обычно 20-40 срезов), полученные при 48 и 72 hpf, были открыты с Фиджи и разделены на каждый канал EGFP-TDP-43z и opTDP-43h. Проекционные изображения максимальной интенсивности EGFP-TDP-43z были созданы для изображений при 48 и 72 л.с.ф., и был выбран один изолированный спинномозговой нейрон, идентифицируемый на обоих изображениях при 48 и 72 л.с.ф. (рисунок 2В, стрелки). Спинальные двигательные нейроны с клеточными телами, расположенными на спинной стороне двигательного столба, считались подходящими для измерения формы тела клетки из-за их разреженных моделей распределения.

После регулировки интенсивности сигнала EGFP в изображениях EGFP-TDP-43z roi, покрывающие сомы моторных нейронов, были установлены путем трассировки края сигнала EGFP на уровне 48 и 72 л.с. (рисунок 2C). Интенсивность флуоресцентной жидкости вдоль основной оси сомы измеряли для сигналов EGFP-TDP-43z и opTDP-43h при 48 и 72 л.с. (рисунок 2C, справа). При 48 л.с. паттерны сигналов opTDP-43h и EGFP-TDP-43z в значительной степени перекрывали друг друга.

Напротив, при 72 л.с.ф. пик сигнала opTDP-43h был обнаружен в области, где сигнал EGFP-TDP-43z был низким, а именно в цитоплазме, что указывает на цитоплазматическое перемещение opTDP-43h. Светозависимая цитоплазматическая релокация opTDP-43h инициируется в значительной степени независимо от неоптогенетического TDP-4314. В этом анализе проекционные изображения максимальной интенсивности использовались для оценки положения границы ядра/цитоплазмы за счет количественных измерений.

Ситометрическое сравнение интенсивности флуоресценции оптогенетического и неоптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах
Чтобы оценить влияние стимуляции синего света на колебания уровня белка opTDP-43h, сигналы opTDP-43h в организме клетки измеряли до и после световой стимуляции со ссылкой на сигнал EGFP-TDP-43z. Изображения z-серии, включая гемисегмент позвоночника, были открыты с Фиджи. Для установки ROI, охватывающих одиночные спинальные двигательные нейроны, были созданы проекционные изображения максимальной интенсивности сигнала EGFP-TDP-43z для 48 и 72 л.с.ф., и были выбраны одиночные изолированные спинномозговые нейроны, которые были идентифицированы как на изображениях 48, так и на 72 л.с.ф. (рисунок 3A). Используя выбор от руки, ROI были нарисованы и зарегистрированы в менеджере ROI для каждого из 48 и 72 изображений hpf (рисунок 3A). Проекция максимальной интенсивности сигнала EGFP-TDP-43z была сочтена подходящей для установки ROI из-за его высокой контрастности.

Для количественной оценки сигналов opTDP-43h и EGFP-TDP-43z были получены проекционные изображения срезов Sum для каждого канала одних и тех же изображений z-серий для 48 и 72 hpf (рисунок 3A). Используя зарегистрированные наборы ROI, флуоресцентные интенсивности opTDP-43h и EGFP-TDP-43z измеряли для каждой точки времени. Относительные количества opTDP-43h к EGFP-TDP-43z (значения RFP/GFP) были рассчитаны для каждой ячейки и точки времени путем деления значения RFP на значение GFP (рисунок 3B). Из четырех mnr2b-положительных клеток, которые были исследованы, ячейка No 1, в частности, отображала насыщенный сигнал EGFP-TDP-43z (рисунок 3A). Клетки с насыщенными флуоресцентными сигналами должны быть исключены из наборов данных при проведении количественного анализа. Клетки #2-#4 демонстрировали тенденции к снижению относительных уровней opTDP-43h до EGFP-TDP-43z после освещения синим светом (рисунок 3B), хотя более масштабный анализ ранее показал, что снижение относительных уровней opTDP-43h до EGFP-TDP-43z не было статистически значимым (65 клеток от трех независимых животных)14.

Figure 1
Рисунок 1: Построение ДНК BAC с использованием локуса mnr2b . (A) Структуры экспрессионных кассет для opTDP-43h и EGFP-TDP-43z. (B) Геномная область рыбок данио, переносимая ДНК CH211-172N16 BAC. Кассеты экспрессии с ПЦР-амплифицированием для opTDP-43h и EGFP-TDP-43z вставляются ниже по потоку 5'-нетранслируемой области (UTR) mnr2b (красная стрелка) в первом экзоне mnr2b путем гомологичной рекомбинации. Полосы обозначают 500 (A) и 10k (B) bp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Живая визуализация opTDP-43h до и после световой стимуляции. (A) Схема световой стимуляции opTDP-43h, экспрессируемая в спинальных двигательных нейронах неограниченного Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойной трансгенной рыбы через полевую подсветку синего светодиодного света от 48 до 72 л.с. (B) Проекционные изображения максимальной интенсивности конфокальных изображений вентрального спинного мозга серии z до (48 л.с.ф.) и после (72 л.с.ф.) световой стимуляции. Пунктирные линии разграничивают вентральный предел спинного мозга. Рисунки адаптированы из Asakawa et al.14 (C) Цитоплазматической мислокализации opTDP-43 после 24-часового освещения синим светом. Контуры сомы mnr2b-положительной ячейки (красные стрелки в B), наблюдаемые при 48 и 72 л.с.ф., показаны пурпурным цветом. Основные оси сомы были показаны светло-голубым цветом. Была построена нормализованная интенсивность флуоресценции вдоль основных осей. Звездочка указывает на кластер сильных сигналов opTDP-43, которые не отображают сильный перекрывающийся сигнал EGFP-TDP-43z, что указывает на цитоплазматическую неправильную локализацию opTDP-43h. Столбики обозначают 1 мм (A), 20 мкм (B) и 4 мкм (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Ратиометрические сравнения opTDP-43h и EGFP-TDP-43z до и после световой стимуляции. (A) ROI, охватывающие сомы четырех одиночных mnr2b-положительных клеток при 48 и 72 hpf, были нарисованы на основе сигнала EGFP-TDP-43z и показаны пурпурным цветом. Прямоугольные ROI (bg) использовались для вычитания фонового сигнала (background ROI). Цифры адаптированы из Asakawa et al.14 (B) Относительные интенсивности opTDP-43h к EGFP-TDP-43z были построены для каждой ячейки в каждый момент времени в качестве соотношения RFP/GFP. Ячейка No 1, обозначенная звездочкой, не подходила для ратиометрического сравнения, поскольку ее сигнал EGFP-TDP-43z был насыщен, а ее значение RFP/GFP было завышено. Столбик указывает на 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mnr2b-BAC-опосредованная экспрессия opTDP-43h и EGFP-TDP-43z у рыбок данио предоставляет уникальную возможность для живой визуализации фазового перехода TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах. Оптическая прозрачность тканей тела личинок рыбок данио позволяет проводить простую и неинвазивную оптогенетическую стимуляцию opTDP-43h. Сравнения между одиночными спинальными двигательными нейронами с течением времени показали, что светозависимая олигомеризация opTDP-43h вызывает его цитоплазматическую кластеризацию, что напоминает патологию БАС.

Одним из критических параметров, определяющих фазовое поведение внутренне неупорядоченного белка, является внутриклеточная концентрация. Высокий уровень экспрессии opTDP-43h потенциально может привести к светонезависимой олигомеризации opTDP-43h, фазовому переходу и агрегации. Таким образом, индукция стабильного, нетоксичного уровня экспрессии opTDP-43h в спинномозговых двигательных нейронах является ключом к успешной оценке физиологических и патологических последствий фазового перехода opTDP-43 на спинномозговые двигательные нейроны. Mnr2b-BAC-опосредованная экспрессия opTDP-43 h, по-видимому, подходит для этой цели, поскольку рыбы Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] демонстрируют преимущественно ядерный opTDP-43, они способны свободно плавать с раздутым плавательным пузырем и сохраняют полную жизнеспособность даже после выращивания в непрерывных темных условиях от 1-5 dpf. У рыбок данио традиционным подходом, используемым для экзогенной экспрессии гена, представляющего интерес, является инъекция мРНК на одноклеточной стадии. Однако высокая доза белка TDP-43, транслируемого из введенной мРНК сразу, вызывает ранние дефекты развития14, которые исключают анализ более поздних дифференцирующих спинномозговых двигательных нейронов. Однако снижение количества вводимой мРНК до приемлемого уровня не обеспечивает достаточное количество opTDP-43h для оптогенетической модуляции в спинальных двигательных нейронах к моменту ее дифференцировки, что указывает на то, что инъекция мРНК не является подходящим методом доставки opTDP-43h к спинальным моторным нейронам рыбок данио. Другим возможным подходом, используемым для экспрессии opTDP-43h в спинномозговых двигательных нейронах, является введение на одноклеточной стадии плазмиды или BAC ДНК, содержащей конструкцию opTDP-43h под контролем промотора, который активен в спинномозговом моторном нейроне. Хотя инъекция mnr2b-hs:opTDP-43h BAC ДНК может направлять экспрессию opTDP-43h в спинномозговые двигательные нейроны, количество opTDP-43h-положительных моторных нейронов низкое, и в таких численно ограниченных opTDP-43h-положительных клетках уровень экспрессии обычно высок, часто связанный со светонезависимой агрегацией opTDP-43h. Эти наблюдения в совокупности свидетельствуют о том, что трансгенная экспрессия является незаменимой стратегией, с помощью которой можно стабильно экспрессировать opTDP-43h в спинномозговых двигательных нейронах на нетоксичном уровне. Примечательно, что, хотя mnr2b-BAC маркирует почти все спинальные двигательные нейроны у рыбок данио20,23, уровни экспрессии opTDP-43h могут варьироваться среди отдельных mnr2b-положительных клеток. Это изменение может быть частично связано с внутренней картиной экспрессии mnr2b, связанной с его регуляторной ролью в дифференцировке двигательных нейронов. Другая потенциальная причина пестрой экспрессии может быть вызвана эффектом хромосомного положения на вставках mnr2b-BAC. Какова бы ни была причина, различные уровни экспрессии opTDP-43 среди mnr2b-положительных клеток могут вызывать изменение цитотоксичности, связанное со светозависимым фазовым переходом opTDP-43h.

У личинок рыбок данио сомы спинальных двигательных нейронов плотно выровнены в вентральном спинном мозге, а сомальная цитоплазма имеет гораздо меньший объем, чем у аксональной цитоплазмы. Эта анатомическая особенность ограничивает количественный анализ цитоплазматического opTDP-43h в спинномозговых двигательных нейронах: opTDP-43h измеряется только количественно в ядре и сомальной цитоплазме, но не во всей клетке двигательных нейронов. Количественная визуализация белка во всей клетке спинномозговых двигательных нейронов, включая сому и периферический нервный терминал, остается сложной задачей. Несмотря на ограничения на количественные анализы, было показано, что соотношение opTDP-43h/EGFP-TDP-43z в соме повышено из-за вызывающей БАС мутации в IDR (A315T)14. Поэтому настоящий метод применим для оценки влияния мутации TDP-43 на стабильность белка, связанную с фазовым переходом в соме спинальных двигательных нейронов.

В принципе, подход mnr2b-BAC может быть расширен для модуляции LLPS и оценки цитотоксичности других связанных с ALS белков RNP с IDR за пределами TDP-43. Возможно, потребуется скорректировать несколько этапов протокола для получения оптимального уровня экспрессии таких оптогенетических зондов в спинномозговых двигательных нейронах. Во-первых, в трансгенной конструкции Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] промотор hsp70l использовался в качестве базального промотора для повышения экспрессии opTDP-43h, управляемой усилителями mnr2b . Промотор hsp70l может быть удален из конструкции BAC, если уровень экспрессии интересующего белка настолько высок, что он вызывает светонезависимый эктопический фазовый переход. Во-вторых, opTDP-43h оснащен меткой CRY2olig, которая представляет собой домен фотолиазной гомологии (PHR), несущий точечную мутацию, повышающую способность кластеризации при освещении синим светом22. Белок дикого типа CRY2PHR может быть использован в качестве светозависимой метки олигомеризации, если есть необходимость ослабить светозависимую кластерную активность. Наконец, чтобы более точно повторить патологию БАС у рыбок данио, желательно установить протокол освещения, где на физиологию рыб минимально влияет полевое освещение синего света во время ювенильной и взрослой стадий. Настоящий метод использует непрерывное освещение синим светом от 48 до 72 л.с. (в течение 24 ч), а продолжительность освещения может быть увеличена до 120 л.с. (в течение 72 ч) без потери жизнеспособности рыбы14, хотя могут быть затронуты светочувствительные физиологические функции, такие как зрение. При разработке протокола прерывистого светового освещения может стать возможной гораздо более долгосрочная световая стимуляция, что, в свою очередь, может способствовать развитию opTDP-43h в более зрелые патологические агрегаты. Чтобы достичь этого, другие оптогенетические зонды для модуляции белково-белковых взаимодействий с использованием различных длин волн света, которые менее физиологически тревожны24 , также могут заслуживать дальнейшего изучения. Комбинации таких улучшенных оптогенетических зондов TDP-43, соответствующих промоторов, нацеленных на уязвимые к заболеваниям типы клеток, и протоколов освещения с минимальным воздействием на физиологические функции откроют возможности для точного моделирования патологий протеинопатий TDP-43 не только в спинном мозге, но и в головном мозге.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KA и KK являются изобретателями интеллектуальной собственности, описанной в этой рукописи, и предварительные патенты были представлены Национальным институтом генетики.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant Numbers JP19K06933 (KA) и JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Tags

Неврология Выпуск 180 нейродегенеративное заболевание БАС оптодроплетная система криптохром 2 TDP-43 рыбка данио спинномозговой двигательный нейрон, mnr2b трансгенез BAC
Оптогенетический фазовый переход TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах личинок рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. More

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter