Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetisk fase overgang af TDP-43 i Spinal Motor Neuroner af Zebrafish Larver

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

Vi beskriver en protokol til at fremkalde fase overgang af TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) af lys i spinal motor neuroner ved hjælp af zebrafisk som model.

Abstract

Unormal protein aggregering og selektiv neuronal sårbarhed er to store kendetegn for neurodegenerative sygdomme. Årsagssammenhænge mellem disse funktioner kan afhøres ved at kontrollere faseovergangen af et sygdomsrelateret protein i en sårbar celletype, selv om denne eksperimentelle tilgang hidtil har været begrænset. Her beskriver vi en protokol, der skal fremkalde faseovergang af RNA/DNA-bindende protein TDP-43 i spinalmotoriske neuroner af zebrafisk larver til modellering af cytoplasmisk sammenlægning af TDP-43, der forekommer i degenererende motoriske neuroner i amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Vi beskriver en bakteriel kunstig kromosom (BAC)-baseret genetisk metode til at levere en optogenetisk TDP-43 variant selektivt til spinal motor neuroner af zebrafisk. Zebrafisk larvernes høje gennemskinnelighed giver mulighed for faseovergang af den optogenetiske TDP-43 i spinalmotorennene ved en simpel ekstern belysning ved hjælp af en lysdiode (LED) mod uhæmmet fisk. Vi præsenterer også en grundlæggende arbejdsgang for levende billeddannelse af zebrafisk spinal motor neuroner og billedanalyse med frit tilgængelige Fiji / ImageJ software til at karakterisere svarene fra optogenetiske TDP-43 til lysbelysning. Denne protokol muliggør karakterisering af TDP-43 faseovergang og aggregeret dannelse i et ALS-sårbart cellulært miljø, hvilket bør lette en undersøgelse af dets cellulære og adfærdsmæssige konsekvenser.

Introduction

Ribonucleoproteingranulatgranulat (RNP) kontrollerer et utal af cellulære aktiviteter i kernen og cytoplasmaet ved at samle membranløse skillevægge via væske-væske faseadskillelse (LLPS), et fænomen, hvor en homogen væske demixes i to forskellige flydende faser1,2. De dysregulerede LLPS af RNA-bindende proteiner, der normalt fungerer som RNP granulatkomponenter, fremmer unormal faseovergang, hvilket fører til proteinaggregation. Denne proces har været impliceret i neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme3,4,5. Den præcise vurdering af en årsagssammenhæng mellem afvigende LLPS af RNA-bindende proteiner og sygdomspatogenese er afgørende for at afgøre, om og hvordan LLPS kan udnyttes som et effektivt terapeutisk mål. LLPS af RNA-bindende proteiner er relativt let at studere in vitro og i encellede modeller, men er vanskelig i flercellede organismer, især i hvirveldyr. Et kritisk krav til at analysere sådanne LLPS i individuelle celler i et vævsmiljø er at stikke en sonde til billeddannelse og manipulation af LLPS i en sygdoms-sårbar celle type interesse.

Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en i sidste ende dødelig neurologisk lidelse, hvor motoriske neuroner i hjernen og rygmarven er selektivt og gradvist tabt på grund af degeneration. Til dato har mutationer i mere end 25 gener været forbundet med den arvelige (eller familiære) form af ALS, som tegner sig for 5%-10% af de samlede ALS-tilfælde, og nogle af disse ALS-forårsager gener koder RNA-bindende proteiner bestående af RNPs, såsom hnRNPA1, TDP-43 og FUS6,7. Desuden er den sporadiske form af ALS, som tegner sig for 90%-95% af de samlede ALS-tilfælde, karakteriseret ved den cytoplasmatiske sammenlægning af TDP-43 deponeret i degenererende motoriske neuroner. Et vigtigt kendetegn ved disse ALS-associerede RNA-bindende proteiner er deres iboende uordnede regioner (IDR) eller lav kompleksitet domæner, der mangler bestilt tre-dimensionelle strukturer og mægle svage protein-protein interaktioner med mange forskellige proteiner, der driver LLPS7,8. Det faktum, at ALS-forårsager mutationer ofte forekommer i de dybdegående har ført til tanken om, at afvigende LLPS og fase overgang af disse ALS-relaterede proteiner kan ligge til grund for ALS patogenese9,10.

For nylig blev optoDroplet-metoden, en Cryptochrome 2-baseret optogenetisk teknik, der gør det muligt at modulere proteinproteininteraktioner ved lys, udviklet for at fremkalde faseovergang af proteiner med IDR11. Da denne teknik er blevet udvidet med succes til TDP-43, er den begyndt at afdække de mekanismer, der ligger til grund for den patologiske faseovergang af TDP-43 og den tilhørende cytotoksicitet12,13,14,15. I denne protokol skitserer vi en genetisk metode til at levere en optogenetisk TDP-43 til ALS-sårbare celletyper, nemlig spinal motor neuroner i zebrafisk ved hjælp af BAC til mnr2b/mnx2b genet, der kodning et homeodomainprotein til motor neuronspecifikation16,17. Zebrafisk larvernes høje gennemskinnelighed giver mulighed for enkel, ikke-invasiv lysstimulering af den optogenetiske TDP-43, der udløser dens faseovergang i spinalmotorennenene. Vi præsenterer også en grundlæggende arbejdsgang for levende billeddannelse af zebrafisk spinal motor neuroner og billedanalyse ved hjælp af frit tilgængelige Fiji / ImageJ software til at karakterisere svarene fra optogenetiske TDP-43 til lysstimulering. Disse metoder giver mulighed for en undersøgelse af TDP-43 fase overgang i en ALS-sårbare cellulære miljø og bør bidrage til at udforske dens patologiske konsekvenser på cellulære og adfærdsmæssige niveauer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt fiskearbejde blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr i udvalget for institutionel dyrepleje og -anvendelse (godkendelsesidentifikationsnummer 24-2) fra National Institute of Genetics (Japan), som har en dyrevelfærdsforsikring på filen (sikringsnummer A5561-01) ved Kontoret for Laboratorie dyrevelfærd ved National Institutes of Health (NIH, USA).

1. Opførelse af TAC'er til udtryk for optogenetisk TDP-43 gen fra mnr2b promotor

  1. BAC forberedelse
    1. Køb en zebrafisk BAC klon, der indeholder zebrafisk mnr2b græshoppe (CH211-172N16, BACPAC Genomforskning). Rense BAC DNA fra en 5 mL natten LB kultur DH10B Escherichia coli (E. coli) huser CH211-172N16 som beskrevet i Warming et al.18.
    2. Omdanne CH211-172N16 til SW102 E. coli celler ved elektroporation, som beskrevet i Warming et al.18.
      BEMÆRK: Rensning af BAC DNA fra E. coli på samme dag af elektroporation normalt giver en højere succesrate af BAC transformation18. Ellers opbevares det rensede BAC DNA ved -20 °C, indtil det anvendes.
    3. Indfør iTol2-amp kassette til Tol2 transposon-medieret BAC transgenese19 i rygraden i CH211-172N16 ved elektroporation, som beskrevet i Asakawa et al.20.
      1. Lav en glycerol lager af E. coli celle kloner transporterer CH211-172N16 med iTol2-amp kassette integration (CH211-172N16-iTol2A) efter at have bekræftet den homologe rekombination-medieret integration ved polymerase kædereaktion (PCR) (Ex Taq) ved hjælp af grunderparret Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') og pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') og følgende betingelser: et denatureringstrin ved 98 °C i 1 min, efterfulgt af 25 denatureringscyklusser ved 95 °C i 10 s, primerudglødning ved 55 °C i 15 s og grundgrundsforlængelse ved 72 °C i 1 min, hvilket forstærker et PCR-produkt på 354 basispar (bp).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h byggeri
    1. Konstruere en plasmid transporterer udtrykket kassette til den menneskelige vilde-type TDP-43/TARDBP (TDP-43h), der er mærket med mRFP1 og CRY2olig på N- og C-termini, henholdsvis (herefter, opTDP-43h)14.
      BEMÆRK: OpTDP-43h-fragmentet skal flankeres med zebrafisk hsp70l genpromotorsekvensen (650 bp) og polyadenylations (polyA) signalsekvens efterfulgt af et kanamycinresistensgen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Forstærke hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan kassette med primere, der anneal hsp70l og Kan og indeholder 45 bp sekvenser af opstrøms og nedstrøms af initiator codons af mnr2b genet af PCR (GXL DNA Polymerase) ved hjælp af primer par mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') og Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atcg atc ctg aag ttc ttt gac tt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') med følgende betingelser: et denatureringstrin ved 98 °C i 1 min, efterfulgt af 30 cyklusser af denaturering ved 95 °C i 10 s, primer udglødning ved 55 °C i 15 s, og primer forlængelse ved 68 °C i 30 s forstærke et PCR-produkt på ~ 5,7 bp.
    3. Adskil PCR-produkterne ved agarosegelelektroforese (100 V) og rense hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-båndet med en DNA-kolonne. Koncentrationen af den rensede hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kassette justeres til 50 ng/μL i Tris-EDTA buffer (TE), der indeholder 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 1 mM EDTA.
    4. Indfør hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kassette i CH211-172N16-iTol2A ved elektroporation som beskrevet i Warming et al.18 og vælg ampicillin- og kanamycin-resistente transformanter på LB agar plader. CH211-172N16-iTol2A bærer hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kassette er udpeget som mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Rens mnr2b-hs:opTDP-43h ved hjælp af et BAC-rensningssæt, og opløs det ved 250 ng/μL i TE efter phenol/chloroform ekstraktion.
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z byggeri
    1. Konstruere en anden plasmid transporterer zebrafisk vilde-type tardbp, der er mærket med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) på sin N-terminus (EGFP-TDP-43z) i stedet for opTDP-43h, men er ellers identisk med hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan konstruktion (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Brug EGFP-TDP-43z som intern kontrol til lysstimulering af opTDP-43h.
    2. Konstruktion CH211-172N16-iTol2A huser hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kassette i mnr2b græshoppe som beskrevet i 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A med hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kassette er udpeget som mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Tol2 transposon-medieret BAC transgenese i zebrafisk

  1. Injektionsopløsningen indeholdende 40 mM KCl, phenolrød (10% v/v), 25 ng/μL af mnr2b-hs:opTDP-43h DNA og 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19.
  2. 1 nL af injektionsopløsningen (en dråbe med en diameter på ca. 123 μm kalibreret i mineralsk olie) i cytosolen af zebrafiskfostre af vilde på éncellede stadier. Screen den injicerede fisk til dannelse af rødt fluorescerende protein (RFP)-positive aggregater i forskellige embryonale væv, herunder spinal motor neuroner, under et fluorescens stereomikroskop ved 2-3 dage efter befrugtning (dpf). Hæv den RFP-positive fisk til voksenalderen.
  3. Indsprøjt mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA som beskrevet i punkt 2.1 og 2.2. Hæv EGFP-positive fisk til voksenalderen.
  4. Efter et par måneder sættes seksuelt modnet injiceret fisk og vilde fisk parvis i standard 2 L parringsbure for at opnå F1-afkom. Screen F1 fisk på 3 dpf for RFP (opTDP-43h) eller EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescens i spinal motor kolonne ved hjælp af en epifluorescence mikroskop udstyret med en Plan-Neofluar 5x/0.15 objektiv linse. Typisk identificeres en grundlæggerfisk fra 10−20 injicerede fisk (bakterielinjetransmissionshastigheden er 5%−10%).
  5. Isoler og sammenlign flere Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] og Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] skær fra forskellige grundlæggerfisk, da intensiteten, men ikke mønsteret, af opTDP-43h eller EGFP-TDP-43z udtryk kan variere mellem grundlæggerfisk på grund af kromosompositionseffekter.
  6. Kryds Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] og Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] fiskelinjer for at opnå afkom, der indeholder Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk i et mendeliansk forhold.
  7. Hæv fisken i en plastfad indeholdende 30 mL E3 buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Methylen Blue) og tilsæt 0,003% (w/v) N-phenylthiourea ved 8-10 h post-befrugtning (hpf) for at hæmme melanogenese.
  8. Dæk plastskålen med aluminiumsfolie efter 30 hkf.

3. Forberedelse af LED til blåt lys belysning

  1. Slå et LED-panel til ved hjælp af det tilknyttede program, der er installeret på en tablet/telefon. Sæt sonden af et spektrometer i en tom brønd af en 6 brønd skål og justere LED-lyset til bølgelængde toppede på ~ 456 nm gennem ansøgningen. Placer den optiske sensor på en optisk effektmåler i tom brønd, og juster led-lysets effekt (~0,61 mW/cm2). LED-lysindstillingen kan gemmes og kan hentes i programmet.
  2. Tilfør parabol/LED-panelindstillingen på inkubatoren ved 28 °C. Afslut dette trin, før billeddannelse af fisk starter ved 48 hkf.

4. Billeddannelse af zebrafisk larver udtrykker optogenetiske TDP-43

  1. Vælg Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk mindst før 47 hkf, baseret på RFP (opTDP-43h) eller EGFP (EGFP-TDP-43z) fluorescens i rygmarvskolonnen ved hjælp af epifluorescencemikroskopopsætningen, der er beskrevet ovenfor.
  2. Dechorionate Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelt-transgen fisk.
  3. Forvarm 1 % lav smeltetemperatur agarose indeholdende 250 μg/mL ethyl 3-aminobenzoatmethanesulfonatsalt ved 42 °C.
  4. Kort bedøve Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] dobbelt-transgen fisk på 48 hk i E3 buffer indeholdende samme koncentration af Tricane.
  5. Sæt et fald i den forvarmede 1% lav smeltetemperatur agarose på glasbunden ved stuetemperatur. Diameteren af den kuppelformede agarosedråbe på glasskålen er 8-10 mm.
  6. Ved hjælp af en Pasteur pipette skal du tilføje bedøvelsesfisken til den lave smeltetemperatur, der er agarose på glasbunden, og bland derefter ved at pipettere et par gange. Minimer mængden af E3 bufferen, der er tilsat agarose sammen med fisken.
  7. Opretholde fisken på sin side ved hjælp af en sprøjte nål under størkning af agarose (typisk ~ 1 min) for at sikre, at rygmarven er i en passende vandret position. Efter størkningen sættes et par dråber E3-buffer på den kuppelformede agarosemonterede fisk.
  8. Erhverve seriel confocal z-sektioner af rygmarven ved scanning med en konfokal mikroskop udstyret med en 20x vand nedsænkning objektive linse med den numeriske blænde 1,00, ved hjælp af en scanningshastighed på 4,0 μs per pixel (12 bits per pixel), et trin størrelse på 1,0 μm per skive for målet, og en kombination af excitation / emission bølgelængder: Kanal 1) 473/510 nm for EGFP og Kanal 2) 559/583 nm for mRFP1.
    BEMÆRK: Cloaca på den ventrale side af fisken er inkluderet i de områder af interesse (ROI) som en reference, som hjælper med at identificere og sammenligne spinal segmenter (niveauer 16-17) på tværs af tid punkter.
  9. Fjern fisken fra agarose ved forsigtigt at knække agarose med en sprøjtenål, så snart billeddannelsen er færdig. Hold den tid, fisken er indlejret i agarose så kort som muligt, selv om agarose indlejring i <30 min påvirker ikke fiskens levedygtighed.

5. Lysstimulering af opTDP-43h-udtrykkende fisk ved feltbelysning af et blåt lysdiode (LED) lys

  1. Tilføj 7,5 mL E3 buffer til brønden og placere afbildet Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelt-transgen fisk i brønden. Placer seks-brønd skålen på LED-panelet ved at holde fadet og LED-panelet 5 mm fra hinanden med en afstandsstykke (for eksempel med fem diasglas stablet).
  2. Tænd for det blå LED-lys. Opbevar nogle af Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelt-transgen fisk i en separat seks-brønds skål dækket med aluminiumsfolie, når uilluminerede kontrolfisk er nødvendige (dvs. under mørke forhold)14.
  3. Efter belysningen (f.eks. i 24 timer ved 72 hkf i figur 3) afbildes rygmarven på den belyste fisk ved at gentage trinene 4,3 - 4,9.

6. Visualisering af cytoplasmisk flytning af optogenetisk TDP-43 i spinal motor neuroner

  1. Åbn billedfilen i ImageJ/Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), et open source Java-billedbehandlingsprogram udviklet af NIH Image, som kan downloades fra https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Brug Z-rullepanelet til at bevæge sig gennem fokusplanerne. Opret en maksimal intensitetsfremskrivning af flere udsnit ved at klikke på | Stakke | Z projekt | Max Intensitet og indstilling Start skive og Stop skive, der dækker hemisegments af spinal motor kolonne.
  3. Opdele multikanalbilledet i to enkeltkanalsbilleder ved at klikke på Billede | Farve | Opdel kanaler.
  4. Forbedre EGFP-TDP-43z-signalet for at sikre, at cytoplasmisk EGFP-TDP-43z er synligt tydeligt ved at klikke på Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast og justering af minimum
  5. Åbn ROI Manager ved at klikke på Analyser | Værktøjer | Roi manager. Find de celler, der kan identificeres i begge billeder ved 48 hkf og 72 hkf, baseret på cellekroppenes relative positioner. Indstil ROI'erne ved at skitsere konturerne af cellelegemer af enkelt spinal motor neuroner visualiseret af EGFP-TDP-43z signal ved hjælp af Frihånd valg, og derefter klikke på Tilføj [t] i ROI manager.
  6. Angiv en overordnet akse i soma ved at tegne en lige linje ved hjælp af Lige og klikke på Analyser | Plot Profil for EGFP-TDP-43z (C1) og opTDP-43h (C2) billeder på 48 og 72 hkf.
  7. Normaliser plotprofilen ved at dividere værdierne med den største værdi for hvert EGFP-TDP-43z- og opTDP-43h-signal. Plot de normaliserede værdier med x-y koordinater, hvor x og y repræsenterer hovedaksen i henholdsvis soma og relative fluorescerende intensiteter ved hjælp af XY-grafen i en statistisk software.

7. Forholdetmetrisk sammenligning mellem opTDP-43h- og EGFP-TDP-43z-signaler ved hjælp af ImageJ/Fiji

  1. Åbn billedfilen i ImageJ/Fiji, og angiv INVESTERINGSAFKAST for enkelte mnr2b-positive celler ved hjælp af et billede af egfp-TDP-43z med maksimal intensitet som i 6.1-6.5. Tilføj et investeringsafkast uden for den ventrale rygmarv (f.eks. notochord) for at repræsentere baggrundssignalet (baggrunds-ROI).
  2. For hvert EGFP-TDP-43z- og opTDP-43-billede skal du oprette en projektion af flere udsnit ved at klikke på Billede | Stakke | Z projekt | Sum skiver og sæt Start skive og Stop skive, der dækker hemispinal motor kolonne.
  3. Åbn den ROI Manager, der er oprettet med det maksimale intensitetsprojektionsbillede. Vis INVESTERINGSAFKAST på billedet Sum Slices ved at vælge billedvinduet for EGFP-TDP-43z og derefter klikke på Vis alle i ROI-lederen. Klik på Mål i ROI-lederen for at opnå gennemsnitsværdier for hvert investeringsafkast.
  4. Erhverve middelværdier for opTDP-43h efter samme procedure, der er fastsat i 7.3.
  5. For hvert investeringsafkast divideres det subtraherede gennemsnit for opTDP-43h efter fradrag af gennemsnittet for EGFP-TDP-43z for at opnå den ratiometriske værdi. De ratiometriske værdier kan sammenlignes mellem forskellige tidspunkter og præsenteres ved hjælp af kolonnegraf i Prisme-software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Live imaging af optogenetiske og ikke-optogenetiske TDP-43 proteiner i mnr2b + spinal motor neuroner af zebrafisk larver
For at fremkalde TDP-43 fase overgang i spinal motor neuroner i zebrafisk, en menneskelig TDP-43h, der er mærket med mRFP1 og CRY2olig22 på N- og C-termini, henholdsvis blev konstrueret og udpeget som opTDP-43h14 (Figur 1A). OpTDP-43h-genfragmentet blev indført i en BAC, der indeholdt mnr2b-locus (figur 1B). Den resulterende BAC, udpeget som mnr2b-hs:opTDP-43h, blev indført i zebrafisk genomet af Tol2 transposon-medieret BAC transgenese19. For at overvåge lokaliseringen af ikke-optogenetiske TDP-43 i spinalmotorenne blev en zebrafisk TDP-43 kodet af tardbp-genet mærket med EGFP ved N-terminus (Figur 1A) og EGFP-TDP-43z-genfragmentet blev introduceret i mnr2b BAC, svarende til opTDP-43h (Figur 1B). Den resulterende BAC, udpeget som mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, blev introduceret i zebrafisk genomet af Tol2 transposon-medieret BAC transgenese. De fisk, der blev injiceret med hver BAC-konstruktion, blev krydset med en fisk af vildtypen, og de resulterende F1-fisk blev screenet på dag 3 for rød (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) eller grøn (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) fluorescens i ventral rygmarv. De isolerede røde eller grønne fluorescenspositive F1-fisk blev udpeget som henholdsvis Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] eller Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].

Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk på 48 hk blev bedøvet og indlejret i en lav smeltende agarose på deres side; efter agarose størkning, blev de dækket med E3 buffer til at tillade observationer af den laterale side af rygmarven ovenfra. Konfokal laserscanningsmikroskopi blev udført med en 20x vanddypningsmåle og en kombination af excitation/emission bølgelængder: 473/510 nm for EGFP og 559/583 nm for mRFP1. Den scannede fisk blev straks og omhyggeligt taget fra agarose, overført til E3-buffer i en seks-brønds plade og oplyst af et blåt LED-lys ved at placere pladen på et LED-panel ved 28 °C (figur 2A, B). Efter en 24-timers belysning blev fisken bedøvet og indlejret igen i agarose, før de blev scannet med en konfokal mikroskopi ved hjælp af de samme billeddannelsesbetingelser, bortset fra at investeringsafkast blev justeret til at omfatte den tilsvarende rygmarvsregion afbildet ved 48 hkf (Figur 2B). Hele hemispinal ledningen af 4-5 sammenhængende spinal segmenter blev afbildet under mikroskopi session (typisk 20-30 min), generere z-serie billeder, der indeholder 20-40 skiver afhængigt af vandrettelse af langsgående akse af rygmarven af den monterede fisk i forhold til confocal scanning plan.

Visualisering af cytoplasmisk flytning af optogenetiske TDP-43 i spinal motor neuroner
For at visualisere den cytoplasmatiske flytning af opTDP-43h i enkelt spinal motor neuroner, z-serien billeder (typisk 20-40 skiver) erhvervet på 48 og 72 hk blev åbnet med Fiji og adskilt i hver EGFP-TDP-43z og opTDP-43h kanal. Max intensitet projektion billeder af EGFP-TDP-43z blev skabt til billeder på 48 og 72 hk og en enkelt isoleret spinal neuron identificerbare i begge billeder på 48 og 72 hk blev valgt (Figur 2B, pile). Spinal motor neuroner med celle organer placeret på rygsiden af motorsøjlen blev anset for egnet til målinger af cellen kropsform på grund af deres sparsomme fordelingsmønstre.

Efter justering af intensiteten af EGFP-signalet i EGFP-TDP-43z-billeder blev ROI'er, der dækkede somaerne af motornuronerne, indstillet ved at spore kanten af EGFP-signalet ved 48 og 72 hkf (Figur 2C). Den fluorescerende intensitet langs somaens hovedakse blev målt for EGFP-TDP-43z- og opTDP-43h-signalerne ved 48 og 72 hk (figur 2C, til højre). Ved 48 hks signal overlappede mønstrene i opTDP-43h og EGFP-TDP-43z-signaler stort set hinanden.

I modsætning hertil blev toppen af opTDP-43h-signalet ved 72 hk fundet i den region, hvor EGFP-TDP-43z-signalet var lavt, nemlig i cytoplasmaet, hvilket indikerer den cytoplasmatiske udflytning af opTDP-43h. Den lysafhængige cytoplasmaiske opTDP-43h-udflytning påbegyndes stort set uafhængigt af ikke-optogenetisk TDP-4314. I denne analyse blev der anvendt maxintensitetsfremskrivningsbilleder til at estimere kernens/cytoplasmagrænsens position på bekostning af kvantitative målinger.

Forholdetmetrisk sammenligning af fluorescensintensiteten af optogenetiske og ikke-optogenetiske TDP-43 i spinalmotorennene
For at evaluere virkningerne af det blå lys stimulation på de svingende opTDP-43h proteinniveauer, opTDP-43h signaler i cellekroppen blev målt før og efter lysstimulering med henvisning til EGFP-TDP-43z signal. Z-serien billeder, herunder spinal hemisegment, blev åbnet med Fiji. For at indstille ROI, der dækker enkelt spinal motor neuroner, Max intensitet projektion billeder af EGFP-TDP-43z signal blev skabt til 48 og 72 hkf, og enkelt isolerede spinal neuroner, der kunne identificeres i både 48 og 72 hpf billeder blev valgt (Figur 3A). Ved hjælp af frihåndsvalg blev ROI'er tegnet og registreret i en ROI-leder for hvert af billederne på 48 og 72 hk (Figur 3A). Max intensitet fremskrivning af EGFP-TDP-43z signal blev anset for egnet til at indstille ROI på grund af sin høje kontrast.

For at kvantificere opTDP-43h- og EGFP-TDP-43z-signalerne blev Sum slices projektionbilleder for hver kanal af de samme z-seriebilleder produceret til 48 og 72 hk (Figur 3A). Ved hjælp af de registrerede ROI-sæt blev de fluorescerende intensiteter af opTDP-43h og EGFP-TDP-43z målt for hvert gangpunkt. Relative mængder af opTDP-43h til EGFP-TDP-43z (RFP/GFP-værdier) blev beregnet for hver celle og hvert klokkeslæt ved at dividere RFP-værdien med GFP-værdien (figur 3B). Af de fire mnr2b-positive celler, der blev undersøgt, viste celle #1 især et mættet EGFP-TDP-43z-signal (Figur 3A). Celler med mættede fluorescerende signaler bør udelukkes fra datasæt, når der foretages kvantitative analyser. Cellerne #2-#4 viste faldende tendenser for relative opTDP-43h-niveauer til EGFP-TDP-43z efter blåt lys belysning (Figur 3B), selv om en større analyse tidligere viste, at faldet i relative opTDP-43h niveauer til EGFP-TDP-43z ikke var statistisk signifikant (65 celler fra tre uafhængige dyr)14.

Figure 1
Figur 1: Konstruktion af BAC DNA ved hjælp af mnr2b locus. (A) Strukturer af udtrykket kassetter til opTDP-43h og EGFP-TDP-43z. (B) Den genomiske zebrafisk, der transporteres af CH211-172N16 BAC DNA. Pcr-forstærkede udtryk kassetter til opTDP-43h og EGFP-TDP-43z indsættes nedstrøms af 5′-uoversatte region (UTR) af mnr2b (rød pil) i den første exon af mnr2b ved homolog rekombination. Søjlerne angiver 500 (A) og 10k (B) bp. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Levende billeddannelse af opTDP-43h før og efter lysstimulering. (A) En ordning med lysstimulering af opTDP-43h udtrykt i spinalmotorennene af uhæmmet Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dobbelttransgen fisk gennem en feltbelysning af blåt LED-lys fra 48 til 72 hkf. (B) Max intensitet projektion billeder af z-serien confocal billeder af den ventrale rygmarv før (48 hkf) og efter (72 hkf) lys stimulation. De stiplede linjer afgrænser rygmarvens ventrale grænse. Figurerne er tilpasset fra Asakawa et al.14 (C) Cytoplasmisk fejllocalisering af opTDP-43 efter 24-timers blåt lys belysning. Konturerne af soma af en mnr2b-positiv celle (røde pile i B) observeret ved 48 og 72 hk er vist i magenta. De store akser i somaerne blev vist med lyseblå. Den normaliserede fluorescerende intensitet langs de store akser blev plottet. Stjernen angiver en klynge af stærke opTDP-43 signaler, der ikke viser en stærk EGFP-TDP-43z overlappende signal, der angiver cytoplasmisk opTDP-43h fejllocalization. Søjlerne angiver 1 mm (A), 20 μm (B) og 4 μm (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Forholdet mellem sammenlignende sammenligninger af opTDP-43h og EGFP-TDP-43z før og efter lysstimulering. (A) ROI'er, der dækker somaerne af fire enkelt mnr2b-positive celler ved 48 og 72 hk, blev tegnet baseret på EGFP-TDP-43z-signalet og er vist i magenta. De rektangulære ROI 'er (bg) blev brugt til at trække baggrundssignalet fra (baggrunds-INVESTERINGSAFKAST). Tallene er tilpasset fra Asakawa et al.14 (B) De relative intensiteter af opTDP-43h til EGFP-TDP-43z blev afbildet for hver celle på hvert tidspunkt som RFP / GFP-forholdet. Celle #1, angivet af stjernen, var ikke egnet til sammenligningen mellem forholdet, fordi dens EGFP-TDP-43z-signal var mættet, og dens RFP/GFP-værdi blev overvurderet. Linjen angiver 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mnr2b-BAC-medieret udtryk for opTDP-43h og EGFP-TDP-43z i zebrafisk giver en unik mulighed for levende billeddannelse af TDP-43 fase overgang i spinal motor neuroner. Den optiske gennemsigtighed af kropsvæv af zebrafisk larver giver mulighed for enkel og ikke-invasiv optogenetisk stimulering af opTDP-43h. Sammenligninger mellem enkelt spinal motor neuroner over tid viste, at den lysafhængige oligomerisering af opTDP-43h forårsager sin cytoplasmaiske klyngedannelse, som minder om ALS patologi.

En af de kritiske parametre, der definerer faseadfærden af et iboende uordnet protein, er intracellulær koncentration. Et højt niveau af opTDP-43h udtryk kan potentielt føre til lys-uafhængig opTDP-43h oligomerisering, fase overgang, og sammenlægning. Således induktion af et stabilt, ugiftigt niveau af opTDP-43h udtryk i spinal motor neuroner er nøglen til en vellykket evaluering af de fysiologiske og patologiske konsekvenser af opTDP-43 fase overgang på spinal motor neuroner. Den mnr2b-BAC-medieret udtryk for opTDP-43 h synes at være egnet til dette formål, fordi Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] fisk viser overvejende nukleare opTDP-43, de er i stand til fri svømning med en oppustet svømmeblære, og de opretholder fuld levedygtighed, selv efter at være blevet rejst under de kontinuerlige mørke forhold fra 1-5 dpf. I zebrafisk, en konventionel tilgang, der anvendes til eksogent udtrykke et gen af interesse er mRNA injektion på en-celle fase. Men en høj dosis af TDP-43 protein oversat fra injiceret mRNA alle på én gang forårsager tidlige udviklingsmæssige defekter14, der udelukker analyser af senere differentiere spinal motor neuroner. Men at sænke mængden af injiceret mRNA til et acceptabelt niveau giver imidlertid ikke tilstrækkelig opTDP-43h til optogenetisk graduering i spinalmotorennenene på tidspunktet for differentiering, hvilket indikerer, at mRNA-injektion ikke er en passende metode til at levere opTDP-43h til spinalmotorens neuroner af zebrafisk. En anden mulig tilgang, der anvendes til at udtrykke opTDP-43h i spinal motor neuroner er indsprøjtning, på en-celle fase, en plasmid eller BAC DNA huser opTDP-43h konstruere under kontrol af en promotor, der er aktiv i spinal motor neuron. Selv om injektion af mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA kan lede udtrykket af opTDP-43h i spinal motor neuroner, antallet af opTDP-43h-positive motoriske neuroner er lav, og i sådanne numerisk begrænset opTDP-43h-positive celler, udtryksniveauet er normalt højt, ofte forbundet med lys-uafhængig opTDP-43h sammenlægning. Disse observationer kollektivt tyder på, at transgene udtryk er en uerstattelig strategi for at stabilt udtrykke opTDP-43h i spinal motor neuroner på et ugiftigt niveau. Især, selv om mnr2b-BAC etiketter næsten alle spinal motor neuroner i zebrafisk20,23, udtryk niveauer af opTDP-43h kunne variere mellem individuelle mnr2b-positive celler. Denne variation kan til dels skyldes det iboende udtryksmønster af mnr2b forbundet med dets regulatoriske rolle i motor neuron differentiering. En anden potentiel årsag til det brogede udtryk kan skyldes en kromosompositionseffekt på mnr2b-BAC-indsatserne. Uanset årsagen kan de varierede opTDP-43 udtryksniveauer blandt mnr2b-positive celler forårsage variation i cytotoksicitet forbundet med lysafhængig opTDP-43h faseovergang.

I zebrafisk larver er somaerne af spinal motor neuroner tæt justeret i den ventrale rygmarv, og det somale cytoplasma har et meget lavere volumen end det axonale cytoplasma. Denne anatomiske funktion begrænser kvantitative analyser af cytoplasmisk opTDP-43h i spinalmotoren neuroner: opTDP-43h er kun kvantitativt målbar i kernen og somal cytoplasma, men ikke i hele cellen af motoriske neuroner. Kvantitativ billeddannelse af et protein i hele cellen af spinal motor neuroner, herunder soma og perifer nerve terminal, er fortsat en udfordrende opgave. På trods af restriktionerne på kvantitative analyser viste det sig, at forholdet mellem opTDP og 43h/EGFP-TDP-43z i somaen var forhøjet af den ALS-forårsagende mutation i dybdegående undersøgelse (A315T)14. Derfor gælder den nuværende metode for evaluering af virkningerne af TDP-43-mutationen på proteinstabilitet forbundet med faseovergang i soma af spinal motoriske neuroner.

I princippet kan mnr2b-BAC-tilgangen udvides til at modulere LLPS og evaluere cytotoksiciteten af andre ALS-relaterede RNP-proteiner med dybdegående undersøgelser ud over TDP-43. Flere protokoltrin kan være nødvendigt at justere for at opnå et optimalt udtryksniveau af sådanne optogenetiske sonder i spinal motor neuroner. For det første blev hsp70l-promotoren i Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] transgen konstruktion brugt som en basal promotor til at øge opTDP-43h udtryk drevet af mnr2b forstærkere. HSP70l promotoren kan fjernes fra BAC-konstruktionen, hvis udtryksniveauet for et protein af interesse er så højt, at det forårsager lysfri ektopisk faseovergang. For det andet er opTDP-43h udstyret med CRY2olig tag, som er et fotolyasehomology (PHR) domæne, der bærer en punktmutation, der forbedrer klyngekapaciteten på blåt lys belysning22. Det vilde protein CRY2PHR kan anvendes som et lysafhængigt oligomeriseringsmærke, hvis der er behov for at dæmpe lysafhængig klyngeaktivitet. Endelig er det for mere trofast at generobre ALS-patologien i zebrafisk ønskeligt at etablere en belysningsprotokol, hvor fiskefysiologi er minimalt påvirket af feltbelysningen af blåt lys i de unge og voksne faser. Den nuværende metode anvender en kontinuerlig blåt lysbelysning fra 48 til 72 hk (i 24 timer), og belysningsvarigheden kan forlænges til 120 hk (i 72 timer) uden at miste fiskens levedygtighed14, selvom lysfølsomme fysiologiske funktioner, såsom syn, kan blive påvirket. Ved at udvikle en protokol for periodisk lysbelysning kan meget mere langsigtet lysstimulering blive mulig, hvilket igen kan lette udviklingen af opTDP-43h til mere modne patologiske aggregater. For at opnå dette kan andre optogenetiske sonder til modulering af proteinproteininteraktioner ved hjælp af forskellige lysbølgelængder, der er mindre fysiologisk forstyrrende24 , også være værd at undersøge yderligere. Kombinationer af sådanne forbedrede optogenetiske TDP-43 sonder, passende initiativtagere rettet mod sygdoms-sårbare celletyper, og belysning protokoller med minimale virkninger på fysiologiske funktioner ville åbne veje for trofast modellering patologier af TDP-43 proteinopatier ikke kun i rygmarven, men også i hjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

KA og KK er opfinderne af den intellektuelle ejendomsret, der er beskrevet i dette manuskript, og foreløbige patenter er blevet indsendt af National Institute of Genetics.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numre JP19K06933 (KA) og JP20H05345 (KA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Tags

Neurovidenskab neurodegenerativ sygdom ALS optoDroplet system Cryptochrome 2 TDP-43 zebrafisk spinal motor neuron, mnr2b BAC transgenese
Optogenetisk fase overgang af TDP-43 i Spinal Motor Neuroner af Zebrafish Larver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. … More

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter