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Neuroscience

Zebrafish लार्वा के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में TDP-43 के ऑप्टोजेनेटिक चरण संक्रमण

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/62932
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Summary

हम एक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करके स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में प्रकाश द्वारा टीएआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन 43 (टीडीपी -43) के चरण संक्रमण को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

असामान्य प्रोटीन एकत्रीकरण और चयनात्मक न्यूरोनल भेद्यता न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के दो प्रमुख लक्षण हैं। इन विशेषताओं के बीच कारण संबंधों को एक कमजोर सेल प्रकार में एक बीमारी से जुड़े प्रोटीन के चरण संक्रमण को नियंत्रित करके पूछताछ की जा सकती है, हालांकि यह प्रयोगात्मक दृष्टिकोण अब तक सीमित है। यहां, हम एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) में मोटर न्यूरॉन्स को विघटित करने वाले टीडीपी -43 के साइटोप्लाज्मिक एकत्रीकरण के लिए जेब्राफ़िश लार्वा के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में आरएनए / डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन टीडीपी -43 के चरण संक्रमण को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) -आधारित आनुवंशिक विधि का वर्णन करते हैं जो ज़ेब्राफ़िश के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को चुनिंदा रूप से एक ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 संस्करण प्रदान करता है। ज़ेब्राफ़िश लार्वा की उच्च पारभासी अनियंत्रित मछली के खिलाफ एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) का उपयोग करके एक साधारण बाहरी रोशनी द्वारा स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 के चरण संक्रमण की अनुमति देती है। हम ज़ेब्राफ़िश स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स के लाइव इमेजिंग का एक बुनियादी वर्कफ़्लो भी प्रस्तुत करते हैं और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी / इमेजजे सॉफ़्टवेयर के साथ छवि विश्लेषण प्रकाश रोशनी के लिए ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 की प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करते हैं। यह प्रोटोकॉल टीडीपी -43 चरण संक्रमण के लक्षण वर्णन और एएलएस-कमजोर सेलुलर वातावरण में कुल गठन को सक्षम बनाता है, जो इसके सेलुलर और व्यवहारिक परिणामों की जांच की सुविधा प्रदान करना चाहिए।

Introduction

राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) ग्रैन्यूल्स तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) के माध्यम से झिल्ली-कम विभाजन को इकट्ठा करके नाभिक और साइटोप्लाज्म में सेलुलर गतिविधियों के असंख्य को नियंत्रित करते हैं, एक घटना जिसमें एक सजातीय तरल पदार्थ दो अलग-अलग तरल चरणों में डीमिक्स करता है1,2। आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के डिस्रेगुलेटेड एलएलपीएस जो आमतौर पर आरएनपी ग्रेन्युल घटकों के रूप में कार्य करते हैं, असामान्य चरण संक्रमण को बढ़ावा देते हैं, जिससे प्रोटीन एकत्रीकरण होता है। इस प्रक्रिया को न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों 3,4,5 में फंसाया गया है। आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन और रोग रोगजनन के अनियमित एलएलपीएस के बीच एक कारण संबंध का सटीक मूल्यांकन यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या और कैसे एलएलपीएस को एक प्रभावी चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में शोषण किया जा सकता है। आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के एलएलपीएस को विट्रो और एककोशिकीय मॉडल में अध्ययन करना अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन बहुकोशिकीय जीवों में मुश्किल है, खासकर कशेरुकियों में। एक ऊतक वातावरण के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं में इस तरह के एलएलपीएस का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता एक रोग-कमजोर सेल प्रकार के ब्याज में एलएलपीएस की इमेजिंग और हेरफेर के लिए एक जांच को स्थिर रूप से व्यक्त करना है।

एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) एक अंततः घातक न्यूरोलॉजिकल विकार है जिसमें मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स चुनिंदा और उत्तरोत्तर अपघटन के कारण खो जाते हैं। आज तक, 25 से अधिक जीनों में उत्परिवर्तन एएलएस के वंशानुगत (या पारिवारिक) रूप से जुड़े हुए हैं, जो कुल एएलएस मामलों के 5% -10% के लिए जिम्मेदार है, और इनमें से कुछ एएलएस-कारण जीन आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन को एन्कोड करते हैं, जिसमें आरएनपी शामिल हैं, जैसे कि एचएनआरएनपीए 1, टीडीपी -43, और एफयूएस 6, 7। इसके अलावा, एएलएस का छिटपुट रूप, जो कुल एएलएस मामलों का 90% -95% है, को टीडीपी -43 के साइटोप्लाज्मिक एकत्रीकरण की विशेषता है जो मोटर न्यूरॉन्स में जमा होता है। इन एएलएस-संबद्ध आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन की एक प्रमुख विशेषता उनके आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र (आईडीआर) या कम जटिलता वाले डोमेन हैं जिनमें आदेशित तीन आयामी संरचनाओं की कमी है और कई अलग-अलग प्रोटीनों के साथ कमजोर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मध्यस्थता करते हैं जो एलएलपीएस 7,8 चलाते हैं। तथ्य यह है कि एएलएस-कारण उत्परिवर्तन अक्सर आईडीआर में होते हैं, इस विचार को जन्म दिया है कि इन एएलएस से संबंधित प्रोटीनों के एलएलपीएस और चरण संक्रमण एएलएस रोगजनन 9,10 को रेखांकित कर सकते हैं।

हाल ही में, ऑप्टोड्रॉपलेट विधि, एक क्रिप्टोक्रोम 2-आधारित ऑप्टोजेनेटिक तकनीक जो प्रकाश द्वारा प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के मॉडुलन की अनुमति देती है, को आईडीआर 11 के साथ प्रोटीन के चरण संक्रमण को प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया था। चूंकि इस तकनीक को सफलतापूर्वक टीडीपी -43 तक विस्तारित किया गया है, इसने टीडीपी -43 और इसके संबंधित साइटोटॉक्सिसिटी 12,13,14,15 के पैथोलॉजिकल चरण संक्रमण के अंतर्निहित तंत्र को उजागर करना शुरू कर दिया है। इस प्रोटोकॉल में, हम एएलएस-कमजोर सेल प्रकारों को एक ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 देने के लिए एक आनुवंशिक विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं, अर्थात्, ज़ेब्राफ़िश में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स mnr2b / mnx2b जीन के लिए बीएसी का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन विनिर्देश 16,17 के लिए एक होमोडोमेन प्रोटीन एन्कोडिंग। ज़ेब्राफ़िश लार्वा की उच्च पारभासी ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 के सरल, noninvasive प्रकाश उत्तेजना के लिए अनुमति देता है जो रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स में अपने चरण संक्रमण को ट्रिगर करता है। हम ज़ेब्राफ़िश स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की लाइव इमेजिंग के लिए एक बुनियादी वर्कफ़्लो भी प्रस्तुत करते हैं और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी / इमेजजे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण प्रकाश उत्तेजना के लिए ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 की प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करते हैं। ये तरीके एक एएलएस-कमजोर सेलुलर वातावरण में टीडीपी -43 चरण संक्रमण की जांच के लिए अनुमति देते हैं और सेलुलर और व्यवहारिक स्तरों पर इसके रोग संबंधी परिणामों का पता लगाने में मदद करनी चाहिए।

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Protocol

सभी मछली कार्य राष्ट्रीय आनुवंशिकी संस्थान (जापान) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन पहचान संख्या 24-2) के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार आयोजित किए गए थे, जिसमें राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के प्रयोगशाला पशु कल्याण कार्यालय में फाइल (आश्वासन संख्या A5561-01) पर पशु कल्याण आश्वासन है, यूएसए)।

1. mnr2b प्रमोटर से optogenetic TDP-43 जीन की अभिव्यक्ति के लिए BACs का निर्माण

  1. बीएसी तैयारी
    1. Zebrafish BAC क्लोन खरीदें जिसमें zebrafish mnr2b लोकस (CH211-172N16, BACPAC जीनोमिक्स) शामिल है। DH10B Escherichia coli (E. coli) की 5 mL रातोंरात LB संस्कृति से बीएसी डीएनए को शुद्ध करें, जैसा कि वार्मिंग एट अल.18 में वर्णित CH211-172N16 को आश्रय देता है।
    2. CH211-172N16 को SW102 ई कोलाई कोशिकाओं में इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा परिवर्तित करें, जैसा कि वार्मिंग एट अल.18 में वर्णित है।
      नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन के एक ही दिन ई कोलाई से बीएसी डीएनए का शुद्धिकरण आमतौर पर बीएसी ट्रांसफॉर्मेशन 18 की उच्च सफलता दर देता है। अन्यथा, शुद्ध बीएसी डीएनए को उपयोग करने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है।
    3. Tol2 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता बीएसी transgenesis19 के लिए iTol2-amp कैसेट को इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा CH211-172N16 की रीढ़ में पेश करें, जैसा कि असाकावा एट अल.20 में वर्णित है।
      1. ई कोलाई सेल क्लोन का एक ग्लिसरॉल स्टॉक बनाने के लिए CH211-172N16 iTol2-amp कैसेट एकीकरण (CH211-172N16-iTol2A) के साथ ले जाने के बाद होमोलोगस पुनर्संयोजन-मध्यस्थता एकीकरण की पुष्टि करने के बाद पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) (एक्स टैक) द्वारा प्राइमर जोड़ी Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC टैग AAT CTT ACT 3') का उपयोग करके प्राइमर जोड़ी Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC टैग AAT CTT ACT 3') और '5'-AAA GTA TCT GGC टैग AAT CTT ACT'3') 1 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर एक विकृतीकरण चरण, इसके बाद 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 25 चक्र, 15 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर एनीलिंग, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर एक्सटेंशन, 354 बेस जोड़े (बीपी) के पीसीआर उत्पाद को बढ़ाते हुए।
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h निर्माण
    1. मानव जंगली प्रकार TDP-43 / TARDBP (TDP-43h) के लिए अभिव्यक्ति कैसेट ले जाने वाले एक प्लास्मिड का निर्माण करें जिसे क्रमशः N- और C-termini में mRFP1 और CRY2olig के साथ टैग किया गया है ( इसके बाद, opTDP-43h)14।
      नोट: opTDP-43h टुकड़ा zebrafish hsp70l जीन प्रमोटर अनुक्रम (650 bp) और polyadenylation (polyA) संकेत अनुक्रम के साथ flanked किया जाना चाहिए, एक kanamycin प्रतिरोध जीन (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan) 14 के बाद।
    2. hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan कैसेट को प्राइमरों के साथ बढ़ाएं जो कि एनील hsp70l और Kan के साथ है और इसमें पीसीआर (GXL DNA Polymerase) द्वारा mnr2b जीन के प्रारंभकर्ता कोडोन के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम के 45 bp अनुक्रम होते हैं, जो प्राइमर जोड़ी mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc aca caa aca caa aag tgt tgc aca caa aca cata aca cca aca cata सीटीजी aag ttc ttt gtt ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') निम्नलिखित शर्तों के साथ: 1 मिनट के लिए 98 °C पर एक विकृतीकरण चरण, 10 s के लिए 95 °C पर विकृतीकरण के 30 चक्रों के बाद, 15 s के लिए 55 °C पर प्राइमर एनीलिंग, और 30 s के लिए 68 °C पर प्राइमर एक्सटेंशन, ~ 5.7 bp के एक पीसीआर उत्पाद को बढ़ाना।
    3. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (100 V) द्वारा पीसीआर उत्पादों को अलग करें और एक डीएनए कॉलम के साथ hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan डीएनए बैंड को शुद्ध करें। शुद्ध hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan कैसेट की एकाग्रता को ट्राइस-ईडीटीए बफर (TE) में 50 ng/μL में समायोजित करें जिसमें 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) और 1 mM EDTA शामिल है।
    4. HSP70lp-opTDP-43h-polyA-Kan कैसेट CH211-172N16-iTol2A में इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा परिचय के रूप में वार्मिंग एट al.18 में वर्णित है और एलबी आगर प्लेटों पर ampicillin- और kanamycin-प्रतिरोधी transformants का चयन करें। CH211-172N16-iTol2A hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan कैसेट को ले जाने के लिए mnr2b-hs: opTDP-43h के रूप में नामित किया गया है।
    5. Mnr2b-hs: opTDP-43h को एक बीएसी शुद्धिकरण किट का उपयोग करके शुद्ध करें और फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के बाद टीई में 250 एनजी / μL पर इसे भंग करें।
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z निर्माण
    1. zebrafish जंगली प्रकार tardbp कि बढ़ाया हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के साथ टैग किया गया है कि अपने N-टर्मिनस (EGFP-TDP-43z) opTDP-43h के बजाय बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के साथ टैग किया गया है, लेकिन अन्यथा hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan निर्माण (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan) 14 के समान है। OpTDP-43h के प्रकाश उत्तेजना के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में EGFP-TDP-43z का उपयोग करें।
    2. CH211-172N16-iTol2A hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan कैसेट mnr2b लोकस में के रूप में 1.2.1-1.2.5 में वर्णित harboring का निर्माण करें। CH211-172N16-iTol2A hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan कैसेट को mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z के रूप में नामित किया गया है।

2. Tol2 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता बीएसी zebrafish में transgenesis

  1. 40 mM KCl, फिनोल लाल (10% v /v), mnr2b-hs के 25 ng/μL: opTDP-43h DNA, और 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19 युक्त इंजेक्शन समाधान तैयार करें।
  2. इंजेक्शन समाधान के 1 एनएल इंजेक्ट करें (खनिज तेल में कैलिब्रेट किए गए लगभग 123 μm के व्यास के साथ एक बूंद) एक-सेल चरण में जंगली-प्रकार के ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के साइटोसोल में। लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के गठन के लिए इंजेक्ट की गई मछली की स्क्रीन- स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स सहित विभिन्न भ्रूण ऊतकों में सकारात्मक समुच्चय, 2-3 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) पर एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत। वयस्कता के लिए आरएफपी-सकारात्मक मछली उठाएं।
  3. mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z डीएनए इंजेक्ट करें जैसा कि 2.1 और 2.2 में वर्णित है। वयस्कता के लिए ईजीएफपी-पॉजिटिव मछली उठाएं।
  4. कुछ महीनों के बाद, एफ 1 संतानों को प्राप्त करने के लिए मानक 2 एल संभोग पिंजरों में जोड़े में यौन रूप से परिपक्व इंजेक्टेड मछली और जंगली प्रकार की मछली डालें। RFP (opTDP-43h) या EGFP (EGFP-TDP-43z) के लिए 3 dpf पर स्क्रीन F1 मछली रीढ़ की हड्डी के मोटर स्तंभ में प्रतिदीप्ति एक योजना-Neofluar 5x/ आमतौर पर, एक संस्थापक मछली की पहचान 10-20 इंजेक्टेड मछली से की जाती है (जर्मलाइन ट्रांसमिशन दर 5% -10% है)।
  5. अलग और तुलना एकाधिक Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] और Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] विभिन्न संस्थापक मछली से आवेषण, तीव्रता के रूप में, लेकिन पैटर्न नहीं, opTDP-43h या EGFP-TDP-43z अभिव्यक्ति गुणसूत्र स्थिति प्रभाव के कारण संस्थापक मछली के बीच भिन्न हो सकता है।
  6. क्रॉस Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] और Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] मछली लाइनें Tg युक्त संतानों को प्राप्त करने के लिए [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] एक मेंडेलियन अनुपात में डबल-ट्रांसजेनिक मछली।
  7. E3 बफर (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 10-5% मेथिलीन ब्लू) के 30 mL युक्त प्लास्टिक डिश में मछली को उठाएं और मेलानोजेनेसिस को रोकने के लिए 8-10 h पोस्ट-फर्टिलाइजेशन (hpf) पर 0.003% (w/ v) N-phenylthiourea जोड़ें।
  8. प्लास्टिक डिश को 30 एचपीएफ के बाद एल्यूमीनियम फॉइल के साथ कवर करें।

3. नीली रोशनी रोशनी के लिए एलईडी की तैयारी

  1. किसी टैबलेट/फ़ोन पर स्थापित संबद्ध अनुप्रयोग का उपयोग करके एक LED पैनल चालू करें. एक 6 अच्छी तरह से पकवान के एक खाली कुएं में एक स्पेक्ट्रोमीटर की जांच रखो और आवेदन के माध्यम से ~ 456 एनएम पर चरम तरंग दैर्ध्य के लिए एलईडी प्रकाश को समायोजित करें। खाली कुएं में एक ऑप्टिकल पावर मीटर के ऑप्टिकल सेंसर को रखें और एलईडी लाइट (~ 0.61 mW / cm2) की शक्ति को समायोजित करें। एलईडी प्रकाश सेटिंग को सहेजा जा सकता है और एप्लिकेशन में पुनर्प्राप्त करने योग्य है।
  2. 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर के लिए डिश / एलईडी पैनल सेटिंग का परिचय दें। मछली की इमेजिंग 48 hpf पर शुरू होने से पहले इस चरण को समाप्त करें।

4. zebrafish लार्वा की इमेजिंग optogenetic TDP-43 व्यक्त

  1. Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] डबल-ट्रांसजेनिक मछली का चयन करें, जो कम से कम 47 hpf से पहले, RFP (opTDP-43h) या EGFP (EGFP-TDP-43z) प्रतिदीप्ति के आधार पर रीढ़ की हड्डी के मोटर स्तंभ में ऊपर वर्णित एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सेट-अप का उपयोग करके।
  2. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] डबल-ट्रांसजेनिक मछली को dechorionate करें।
  3. 42 डिग्री सेल्सियस पर एथिल 3-एमिनोबेंजोएट मीथेनसल्फोनेट नमक के 250 μg / mL युक्त 1% कम पिघलने वाले तापमान agarose preheat.
  4. संक्षेप में anesthetize Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] डबल-ट्रांसजेनिक मछली E3 बफर में 48 hpf पर जिसमें Tricane की समान सांद्रता होती है।
  5. कमरे के तापमान पर ग्लास बेस डिश पर प्रीहीटेड 1% कम पिघलने वाले तापमान agarose की एक बूंद रखो। कांच के पकवान पर गुंबद के आकार के एगरोज ड्रॉप का व्यास 8-10 मिमी है।
  6. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करते हुए, कांच के आधार पकवान पर कम पिघलने वाले तापमान agarose के लिए anesthetized मछली जोड़ें, और फिर कुछ बार pipetting द्वारा मिश्रण। मछली के साथ agarose करने के लिए जोड़ा E3 बफर की मात्रा को कम से कम.
  7. एगारोज़ (आमतौर पर ~ 1 मिनट) के ठोसीकरण के दौरान एक सिरिंज सुई का उपयोग करके मछली को अपनी तरफ बनाए रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि रीढ़ की हड्डी एक उपयुक्त क्षैतिज स्थिति में है। solidification के बाद, गुंबद के आकार के agarose घुड़सवार मछली पर E3 बफर की बूंदों की एक जोड़ी डाल दिया.
  8. संख्यात्मक एपर्चर 1.00 के साथ 20x पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ स्कैन करके रीढ़ की हड्डी के सीरियल कॉन्फोकल जेड-सेक्शन प्राप्त करें, 4.0 μs प्रति पिक्सेल (12 बिट्स प्रति पिक्सेल) की स्कैन गति का उपयोग करके, उद्देश्य के लिए प्रति स्लाइस 1.0 μm का एक चरण आकार, और उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का एक संयोजन: चैनल 1) EGFP के लिए 473/510 nm और चैनल 2) mRFP1 के लिए 559/583 nm।
    नोट: मछली के वेंट्रल पक्ष पर क्लोआका को एक संदर्भ के रूप में ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों में शामिल किया गया है, जो समय बिंदुओं में रीढ़ की हड्डी के खंडों (स्तर 16-17) की पहचान करने और तुलना करने में मदद करता है।
  9. इमेजिंग पूरा होते ही एक सिरिंज सुई के साथ एगारोज़ को सावधानीपूर्वक क्रैक करके एगारोज़ से मछली को हटा दें। मछली को जितना संभव हो उतना कम हो उतना कम रखें, हालांकि <30 मिनट के लिए एगरोज एम्बेडिंग मछली की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करती है।

5. opTDP-43h की प्रकाश उत्तेजना-एक नीले प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश के क्षेत्र रोशनी द्वारा मछली व्यक्त

  1. E3 बफर के 7.5 mL को अच्छी तरह से जोड़ें और छवि Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] डबल-ट्रांसजेनिक मछली को कुएं में रखें। डिश और एलईडी पैनल को स्पेसर के साथ 5 मिमी अलग रखकर एलईडी पैनल पर छह-अच्छी तरह से पकवान रखें (उदाहरण के लिए, पांच स्लाइड चश्मे के साथ)।
  2. नीली एलईडी लाइट चालू करें। Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] डबल-ट्रांसजेनिक मछली को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किए गए एक अलग छह-अच्छी तरह से पकवान में रखें जब अप्रकाशित नियंत्रण मछली आवश्यक होती है (यानी, अंधेरे परिस्थितियों में)14।
  3. रोशनी के बाद (उदाहरण के लिए, चित्र 3 में 72 एचपीएफ पर 24 घंटे के लिए), चरणों 4.3 - 4.9 को दोहराकर प्रबुद्ध मछली की रीढ़ की हड्डी की छवि।

6. स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 के साइटोप्लाज्मिक स्थानांतरण का विज़ुअलाइज़ेशन

  1. ImageJ/Fiji21 (संस्करण: 2.1.0 /1.53c) में छवि फ़ाइल खोलें, जो NIH छवि द्वारा विकसित एक ओपन-सोर्स जावा इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम है, जिसे https://imagej.net/Fiji/Downloads से डाउनलोड किया जा सकता है।
  2. फोकल विमानों के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए जेड स्क्रॉलबार का उपयोग करें। छवि | क्लिक करके एकाधिक स्लाइस का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाएँ स्टैक्स | Z परियोजना | अधिकतम तीव्रता और सेटिंग प्रारंभ स्लाइस और स्टॉप स्लाइस है कि रीढ़ की हड्डी मोटर स्तंभ के hemisegments को कवर.
  3. छवि | पर क्लिक करके मल्टीचैनल छवि को दो एकल-चैनल छवियों में विभाजित करें रंग | चैनलों को विभाजित करें.
  4. EGFP-TDP-43z संकेत को बढ़ाने के लिए सुनिश्चित करें कि साइटोप्लाज्मिक EGFP-TDP-43z छवि | पर क्लिक करके स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है | समायोजित करें चमक / कंट्रास्ट और न्यूनतम समायोजित करना
  5. विश्लेषण | पर क्लिक करके ROI प्रबंधक खोलें उपकरण | ROI प्रबंधक. उन कोशिकाओं का पता लगाएं जो सेल निकायों की सापेक्ष स्थितियों के आधार पर 48 hpf और 72 hpf पर दोनों छवियों में पहचाने जाने योग्य हैं। Freehand चयन का उपयोग कर EGFP-TDP-43z संकेत द्वारा विज़ुअलाइज़ किए गए एकल स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स के सेल निकायों की रूपरेखा को रेखांकित करके ROIs सेट करें, और फिर ROI प्रबंधक में जोड़ें [t] पर क्लिक करें।
  6. सीधे का उपयोग करके एक सीधी रेखा खींचकर और विश्लेषण | EGFP-TDP-43z (C1) और opTDP-43h (C2) छवियों के लिए प्लॉट प्रोफ़ाइल 48 और 72 hpf पर।
  7. प्रत्येक EGFP-TDP-43z और opTDP-43h संकेत के लिए सबसे बड़े मान से मानों को विभाजित करके प्लॉट प्रोफ़ाइल को सामान्य करें। एक्स-वाई निर्देशांक के साथ सामान्यीकृत मूल्यों को प्लॉट करें, जहां एक्स और वाई एक सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर में XY ग्राफ का उपयोग करके क्रमशः सोमा और सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता के प्रमुख अक्ष का प्रतिनिधित्व करते हैं।

7. OpTDP-43h और EGFP-TDP-43z ImageJ/

  1. ImageJ/Fiji में छवि फ़ाइल खोलें और 6.1-6.5 के रूप में EGFP-TDP-43z की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि का उपयोग करके एकल mnr2b-positive कोशिकाओं के लिए ROIs सेट करें। पृष्ठभूमि संकेत (पृष्ठभूमि ROI) का प्रतिनिधित्व करने के लिए वेंट्रल स्पाइनल कॉर्ड (जैसे, notochord) के बाहर एक ROI जोड़ें।
  2. प्रत्येक EGFP-TDP-43z और opTDP-43 छवि के लिए, छवि | पर क्लिक करके एकाधिक स्लाइस का एक प्रक्षेपण बनाएँ स्टैक्स | Z परियोजना | स्लाइस का योग करें और स्लाइस शुरू करें सेट करें और स्लाइस रोकें जो हेमिसपिनल मोटर कॉलम को कवर करते हैं।
  3. अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि के साथ बनाए गए ROI प्रबंधक को खोलें। EGFP-TDP-43z के लिए छवि विंडो का चयन करके और उसके बाद ROI प्रबंधक में सभी दिखाएँ क्लिक करके SUM स्लाइस छवि पर ROIs प्रदर्शित करें। प्रत्येक ROI के लिए माध्य मान प्राप्त करने के लिए ROI प्रबंधक में मापें क्लिक करें.
  4. 7.3 में प्रदान की गई एक ही प्रक्रिया का पालन करते हुए opTDP-43h के लिए माध्य मान प्राप्त करें।
  5. प्रत्येक ROI के लिए, पृष्ठभूमि ROI के लिए माध्य घटाने के बाद, ratiometric मान प्राप्त करने के लिए EGFP-TDP-43z के लिए घटाए गए माध्य से opTDP-43h के लिए घटाए गए माध्य को विभाजित करें। रेशियोमेट्रिक मानों की तुलना विभिन्न समय बिंदुओं के बीच की जा सकती है और प्रिज्म सॉफ़्टवेयर में स्तंभ ग्राफ़ का उपयोग करके प्रस्तुत की जा सकती है।

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Representative Results

ज़ेब्राफ़िश लार्वा के mnr2b+ स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक और गैर-ऑप्टोजेनेटिक TDP-43 प्रोटीन की लाइव इमेजिंग
जेब्राफ़िश में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में TDP-43 चरण संक्रमण को प्रेरित करने के लिए, एक मानव TDP-43h जिसे क्रमशः N- और C-termini में mRFP1 और CRY2olig22 के साथ टैग किया गया है, का निर्माण किया गया था और opTDP-43h14 (चित्रा 1A) के रूप में नामित किया गया था। opTDP-43h जीन टुकड़ा एक बीएसी में पेश किया गया था जिसमें mnr2b लोकस (चित्रा 1B) होता है। परिणामी बीएसी, जिसे mnr2b-hs: opTDP-43h के रूप में नामित किया गया था, को टोल 2 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता बीएसी ट्रांसजेनेसिस 19 द्वारा ज़ेब्राफ़िश जीनोम में पेश किया गया था। स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में गैर-ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 के स्थानीयकरण की निगरानी करने के लिए, टार्डबीपी जीन द्वारा एन्कोडेड एक ज़ेबराफ़िश टीडीपी -43 को एन-टर्मिनस (चित्रा 1 ए) पर ईजीएफपी के साथ टैग किया गया था और ईजीएफपी-टीडीपी -43 जेड जीन टुकड़ा को एनपीआर 2 बी बीएसी में पेश किया गया था, जो opTDP-43h (चित्रा 1 बी) के समान था। परिणामी बीएसी, जिसे mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z के रूप में नामित किया गया था, को टोल 2 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता बीएसी ट्रांसजेनेसिस द्वारा ज़ेब्राफ़िश जीनोम में पेश किया गया था। प्रत्येक बीएसी निर्माण के साथ इंजेक्ट की गई मछली को एक जंगली-प्रकार की मछली के साथ पार किया गया था और परिणामस्वरूप एफ 1 मछली को वेंट्रल स्पाइनल कॉर्ड में लाल (Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) या हरे (Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]) प्रतिदीप्ति के लिए दिन 3 पर स्क्रीन किया गया था। अलग-थलग लाल या हरे रंग की प्रतिदीप्ति-सकारात्मक F1 मछली को क्रमशः Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] या Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] के रूप में नामित किया गया था।

Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 48 hpf पर डबल-ट्रांसजेनिक मछली को एनेस्थेटिक किया गया था और उनकी तरफ कम पिघलने वाले एगारोज़ में एम्बेडेड किया गया था; agarose solidification के बाद, वे E3 बफर के साथ कवर किया गया था ऊपर से रीढ़ की हड्डी के पार्श्व पक्ष के अवलोकन की अनुमति देने के लिए. Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी एक 20x जल विसर्जन उद्देश्य लेंस और उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के संयोजन के साथ किया गया था: EGFP के लिए 473/510 एनएम और mRFP1 के लिए 559/583 एनएम। स्कैन की गई मछली को तुरंत और सावधानी से एगारोज़ से लिया गया था, जिसे छह-अच्छी तरह से प्लेट में ई 3 बफर में स्थानांतरित कर दिया गया था, और 28 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 ए, बी) पर एक एलईडी पैनल पर प्लेट रखकर एक नीले एलईडी प्रकाश द्वारा रोशन किया गया था। 24-एच रोशनी के बाद, मछली को एनेस्थेटिक किया गया था और उसी इमेजिंग स्थितियों का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ स्कैन किए जाने से पहले एगारोज़ में फिर से एम्बेडेड किया गया था, सिवाय इसके कि आरओआई को 48 एचपीएफ (चित्रा 2 बी) पर चित्रित संबंधित रीढ़ की हड्डी के क्षेत्र को शामिल करने के लिए समायोजित किया गया था। माइक्रोस्कोपी सत्र (आमतौर पर 20-30 मिनट) के दौरान 4-5 सन्निहित रीढ़ की हड्डी के पूरे हेमिसपिनल कॉर्ड को चित्रित किया गया था, जिससे 20-40 स्लाइस युक्त जेड-श्रृंखला छवियां उत्पन्न होती हैं, जो कॉन्फोकल स्कैनिंग प्लेन के सापेक्ष घुड़सवार मछली की रीढ़ की हड्डी के अनुदैर्ध्य अक्ष की क्षैतिजता पर निर्भर करती हैं।

स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 के साइटोप्लाज्मिक स्थानांतरण का विज़ुअलाइज़ेशन
एकल स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में opTDP-43h के साइटोप्लाज्मिक स्थानांतरण की कल्पना करने के लिए, 48 और 72 hpf पर अधिग्रहित z-श्रृंखला छवियों (आमतौर पर 20-40 स्लाइस) को फिजी के साथ खोला गया था और प्रत्येक EGFP-TDP-43z और opTDP-43h चैनल में अलग किया गया था। EGFP-TDP-43z की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों को 48 और 72 hpf पर छवियों के लिए बनाया गया था और 48 और 72 hpf पर दोनों छवियों में पहचाने जाने वाले एक एकल अलग स्पाइनल न्यूरॉन का चयन किया गया था (चित्रा 2B, तीर)। मोटर स्तंभ के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित सेल निकायों के साथ स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को उनके विरल वितरण पैटर्न के कारण सेल शरीर के आकार के माप के लिए उपयुक्त माना जाता था।

ईजीएफपी-टीडीपी -43 जेड छवियों में ईजीएफपी सिग्नल की तीव्रता को समायोजित करने के बाद, मोटर न्यूरॉन्स के सोमा को कवर करने वाले आरओआई को 48 और 72 एचपीएफ (चित्रा 2 सी) पर ईजीएफपी सिग्नल के किनारे का पता लगाकर सेट किया गया था। सोमा के प्रमुख अक्ष के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता को EGFP-TDP-43z और opTDP-43h संकेतों के लिए 48 और 72 hpf (चित्रा 2C, दाएं) पर मापा गया था। 48 hpf पर, opTDP-43h और EGFP-TDP-43z संकेतों के पैटर्न काफी हद तक एक दूसरे को ओवरलैप करते हैं।

इसके विपरीत, 72 hpf पर, opTDP-43h सिग्नल का शिखर उस क्षेत्र में पाया गया था जहां EGFP-TDP-43z सिग्नल कम था, अर्थात् साइटोप्लाज्म में, opTDP-43h के साइटोप्लाज्मिक स्थानांतरण का संकेत देता है। प्रकाश-निर्भर साइटोप्लाज्मिक opTDP-43h स्थानांतरण काफी हद तक गैर-ऑप्टोजेनेटिक TDP-4314 से स्वतंत्र रूप से शुरू किया जाता है। इस परख में, अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों का उपयोग मात्रात्मक माप की कीमत पर नाभिक / साइटोप्लाज्म सीमा की स्थिति का अनुमान लगाने के लिए किया गया था।

स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक और गैर-ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 की प्रतिदीप्ति तीव्रता की अनुपातमितीय तुलना
उतार-चढ़ाव वाले opTDP-43h प्रोटीन स्तरों पर नीली रोशनी उत्तेजना के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, सेल शरीर में opTDP-43h संकेतों को EGFP-TDP-43z सिग्नल के संदर्भ में प्रकाश उत्तेजना से पहले और बाद में मापा गया था। जेड-श्रृंखला की छवियां, जिसमें रीढ़ की हड्डी की हेमिसेगमेंट भी शामिल है, फिजी के साथ खोली गई थी। एकल स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को कवर करने वाले आरओआई को सेट करने के लिए, ईजीएफपी-टीडीपी -43 जेड सिग्नल की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों को 48 और 72 एचपीएफ के लिए बनाया गया था, और एकल अलग-थलग रीढ़ की हड्डी के न्यूरॉन्स जो 48 और 72 एचपीएफ छवियों दोनों में पहचाने जा सकते थे, का चयन किया गया था (चित्रा 3 ए)। फ्रीहैंड चयन का उपयोग करते हुए, आरओआई को 48 और 72 एचपीएफ छवियों (चित्रा 3 ए) में से प्रत्येक के लिए आरओआई प्रबंधक में तैयार और पंजीकृत किया गया था। EGFP-TDP-43z सिग्नल की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण को इसके उच्च विपरीत के कारण ROIs सेट करने के लिए उपयुक्त माना जाता था।

opTDP-43h और EGFP-TDP-43z संकेतों को मापने के लिए, एक ही z-श्रृंखला छवियों के प्रत्येक चैनल के लिए Sum स्लाइस प्रोजेक्शन छवियों को 48 और 72 hpf (चित्रा 3A) के लिए उत्पादित किया गया था। पंजीकृत ROI सेट का उपयोग करते हुए, opTDP-43h और EGFP-TDP-43z की फ्लोरोसेंट तीव्रता को प्रत्येक समय बिंदु के लिए मापा गया था। OPTDP-43h से EGFP-TDP-43z (RFP/GFP मान) की सापेक्ष मात्रा की गणना प्रत्येक कक्ष और समय बिंदु के लिए GFP मान (चित्रा 3B) द्वारा RFP मान को विभाजित करके की गई थी। जांच की गई चार mnr2b-सकारात्मक कोशिकाओं में से, सेल # 1 ने विशेष रूप से एक संतृप्त EGFP-TDP-43z सिग्नल (चित्रा 3A) प्रदर्शित किया। संतृप्त फ्लोरोसेंट संकेतों वाली कोशिकाओं को मात्रात्मक विश्लेषण करते समय डेटा सेट से बाहर रखा जाना चाहिए। सेल # 2-# 4 ने नीली रोशनी (चित्रा 3 बी) के बाद ईजीएफपी-टीडीपी -43z के सापेक्ष opTDP-43h स्तरों के घटते रुझानों को प्रदर्शित किया, हालांकि एक बड़े पैमाने पर विश्लेषण ने पहले प्रदर्शित किया कि ईजीएफपी-टीडीपी -43z के सापेक्ष opTDP-43h स्तरों में कमी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थी (तीन स्वतंत्र जानवरों से 65 कोशिकाएं)14।

Figure 1
चित्रा 1: mnr2b लोकस का उपयोग करके बीएसी डीएनए का निर्माण( A) opTDP-43h और EGFP-TDP-43z के लिए अभिव्यक्ति कैसेट की संरचनाएं। (बी) जेब्राफ़िश जीनोमिक क्षेत्र CH211-172N16 बीएसी डीएनए द्वारा किया जाता है। OPTDP-43h और EGFP-TDP-43z के लिए PCR-प्रवर्धित अभिव्यक्ति कैसेट को होमोलोगस पुनर्संयोजन द्वारा mnr2b के पहले एक्सोन में mnr2b (लाल तीर) के 5'-untranslated क्षेत्र (UTR) के डाउनस्ट्रीम में डाला जाता है। पट्टियाँ 500 (A) और 10k (B) bp को इंगित करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रकाश उत्तेजना से पहले और बाद में opTDP-43h की लाइव इमेजिंग। (A) opTDP-43h की प्रकाश उत्तेजना की एक योजना अनियंत्रित Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 48 से 72 hpf तक नीले LED प्रकाश के क्षेत्र की रोशनी के माध्यम से डबल-ट्रांसजेनिक मछली। (बी) प्रकाश उत्तेजना से पहले (48 एचपीएफ) और (72 एचपीएफ) के बाद (वेंट्रल स्पाइनल कॉर्ड की जेड-श्रृंखला कॉन्फोकल छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियां। धराशायी रेखाएं रीढ़ की हड्डी की वेंट्रल सीमा का सीमांकन करती हैं। आंकड़े Asakawa et al.14 (C) से अनुकूलित कर रहे हैं साइटोप्लाज्मिक 24-h नीली रोशनी रोशनी के बाद opTDP-43 के mislocalization. एक mnr2b-धनात्मक सेल (B में लाल तीर) के सोमा की रूपरेखा 48 और 72 hpf पर देखी गई है, जो मैजेंटा में दिखाई गई है। सोमा के प्रमुख अक्षों को हल्के नीले रंग के साथ दिखाया गया था। प्रमुख अक्षों के साथ सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता की साजिश रची गई थी। तारांकन मजबूत opTDP-43 संकेतों के एक क्लस्टर को इंगित करता है जो एक मजबूत EGFP-TDP-43z ओवरलैपिंग सिग्नल प्रदर्शित नहीं करते हैं, जो साइटोप्लाज्मिक opTDP-43h mislocalization को इंगित करता है। सलाखों को इंगित करता है 1 मिमी (ए), 20 μm (बी), और 4 μm (सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रकाश उत्तेजना से पहले और बाद में opTDP-43h और EGFP-TDP-43z की रेशियोमेट्रिक तुलना। (A) 48 और 72 hpf पर चार एकल mnr2b-सकारात्मक कोशिकाओं के सोमा को कवर करने वाले ROIs को EGFP-TDP-43z सिग्नल के आधार पर तैयार किया गया था और मैजेंटा में दिखाया गया है। आयताकार ROIs (bg) पृष्ठभूमि संकेत (पृष्ठभूमि ROI) घटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। आंकड़े Asakawa et al.14 (B) से अनुकूलित कर रहे हैं opTDP-43h से EGFP-TDP-43z के सापेक्ष तीव्रता RFP / GFP अनुपात के रूप में प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक सेल के लिए प्लॉट किए गए थे। सेल # 1, तारांकन द्वारा इंगित किया गया था, अनुपातमितीय तुलना के लिए उपयुक्त नहीं था क्योंकि इसका ईजीएफपी-टीडीपी -43 जेड सिग्नल संतृप्त था और इसके आरएफपी / जीएफपी मूल्य को कम करके आंका गया था। पट्टी 10 μm को इंगित करती है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ज़ेब्राफ़िश में opTDP-43h और EGFP-TDP-43z की mnr2b-BAC-मध्यस्थता अभिव्यक्ति रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स में TDP-43 चरण संक्रमण की लाइव इमेजिंग के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करती है। ज़ेब्राफ़िश लार्वा के शरीर के ऊतकों की ऑप्टिकल पारदर्शिता opTDP-43h के सरल और noninvasive optogenetic उत्तेजना के लिए अनुमति देता है। समय के साथ एकल स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स के बीच तुलना से पता चला है कि opTDP-43h का प्रकाश-निर्भर ओलिगोमेराइजेशन इसके साइटोप्लाज्मिक क्लस्टरिंग का कारण बनता है, जो एएलएस पैथोलॉजी की याद दिलाता है।

एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के चरण व्यवहार को परिभाषित करने वाले महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक इंट्रासेल्युलर एकाग्रता है। opTDP-43h अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर संभावित रूप से प्रकाश-स्वतंत्र opTDP-43h oligomerization, चरण संक्रमण, और एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व कर सकता है। इस प्रकार, स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में opTDP-43h अभिव्यक्ति के एक स्थिर, nontoxic स्तर का प्रेरण रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स पर opTDP-43 चरण संक्रमण के शारीरिक और रोग संबंधी परिणामों के सफल मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है। opTDP-43 h की mnr2b-BAC-मध्यस्थता अभिव्यक्ति इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त प्रतीत होती है क्योंकि Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] मछली मुख्य रूप से परमाणु opTDP-43 प्रदर्शित करती है, वे एक फुलाया हुआ तैरने वाले मूत्राशय के साथ मुक्त तैराकी करने में सक्षम हैं और वे 1-5 dpf से निरंतर अंधेरे परिस्थितियों में उठाए जाने के बाद भी पूर्ण व्यवहार्यता बनाए रखते हैं। ज़ेब्राफ़िश में, ब्याज के जीन को बहिर्जात रूप से व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक पारंपरिक दृष्टिकोण एक-सेल चरण में एमआरएनए इंजेक्शन है। हालांकि, टीडीपी -43 प्रोटीन की एक उच्च खुराक का अनुवाद इंजेक्शन वाले एमआरएनए से किया गया है, जो एक बार में प्रारंभिक विकासात्मक दोषों का कारण बनता है14 जो बाद में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को अलग करने के विश्लेषण को रोकता है। हालांकि, इंजेक्ट किए गए एमआरएनए की मात्रा को एक सहनीय स्तर तक कम करने से इसके भेदभाव के समय तक स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक मॉडुलन के लिए पर्याप्त opTDP-43h की आपूर्ति करने में विफल रहता है, यह दर्शाता है कि mRNA इंजेक्शन एक उपयुक्त विधि नहीं है जिसके द्वारा zebrafish के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को opTDP-43h वितरित किया जा सके। स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में opTDP-43h को व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक और संभावित दृष्टिकोण एक-सेल चरण में, एक प्लास्मिड या बीएसी डीएनए को इंजेक्ट कर रहा है, जो एक प्रमोटर के नियंत्रण में opTDP-43h निर्माण को आश्रय देता है जो स्पाइनल मोटर न्यूरॉन में सक्रिय है। हालांकि mnr2b-hs का इंजेक्शन: opTDP-43h बीएसी डीएनए रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स में opTDP-43h की अभिव्यक्ति को निर्देशित कर सकता है, opTDP-43h-सकारात्मक मोटर न्यूरॉन्स की संख्या कम है, और इस तरह के संख्यात्मक रूप से प्रतिबंधित opTDP-43h-सकारात्मक कोशिकाओं में, अभिव्यक्ति का स्तर आमतौर पर उच्च होता है, जो अक्सर प्रकाश-स्वतंत्र opTDP-43h एकत्रीकरण से जुड़ा होता है। इन टिप्पणियों से सामूहिक रूप से पता चलता है कि ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति एक अपूरणीय रणनीति है जिसके द्वारा एक गैर-विषैले स्तर पर स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में opTDP-43h को स्थिर रूप से व्यक्त किया जाता है। विशेष रूप से, हालांकि mnr2b-BAC zebrafish20,23 में लगभग सभी स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को लेबल करता है, opTDP-43h की अभिव्यक्ति का स्तर व्यक्तिगत mnr2b-सकारात्मक कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकता है। यह भिन्नता आंशिक रूप से मोटर न्यूरॉन भेदभाव में इसकी नियामक भूमिका से जुड़े mnr2b के आंतरिक अभिव्यक्ति पैटर्न के कारण हो सकती है। भिन्न अभिव्यक्ति के लिए एक और संभावित कारण mnr2b-बीएसी आवेषण पर एक गुणसूत्र स्थिति प्रभाव के परिणामस्वरूप हो सकता है। जो भी कारण हो, mnr2b-सकारात्मक कोशिकाओं के बीच विभिन्न opTDP-43 अभिव्यक्ति के स्तर प्रकाश-निर्भर opTDP-43h चरण संक्रमण से जुड़े cytotoxicity में भिन्नता का कारण बन सकते हैं।

ज़ेब्राफ़िश लार्वा में, रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स के सोमास को वेंट्रल स्पाइनल कॉर्ड में घनी रूप से संरेखित किया जाता है, और सोमल साइटोप्लाज्म में अक्षीय साइटोप्लाज्म की तुलना में बहुत कम मात्रा होती है। यह संरचनात्मक विशेषता स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में साइटोप्लाज्मिक opTDP-43h के मात्रात्मक विश्लेषण को सीमित करती है: opTDP-43h केवल नाभिक और सोमल साइटोप्लाज्म में मात्रात्मक रूप से औसत दर्जे का है, लेकिन मोटर न्यूरॉन्स की पूरी कोशिका में नहीं। सोमा और परिधीय तंत्रिका टर्मिनल सहित रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स की पूरी कोशिका में एक प्रोटीन की मात्रात्मक इमेजिंग, एक चुनौतीपूर्ण कार्य बनी हुई है। मात्रात्मक assays पर प्रतिबंधों के बावजूद, सोमा में opTDP-43h / EGFP-TDP-43z अनुपात को IDR (A315T) 14 में ALS-कारण उत्परिवर्तन द्वारा ऊंचा दिखाया गया था। इसलिए, वर्तमान विधि रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स के सोमा में चरण संक्रमण से जुड़े प्रोटीन स्थिरता पर टीडीपी -43 उत्परिवर्तन के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए लागू होती है।

सिद्धांत रूप में, MNR2b-BAC दृष्टिकोण को एलएलपीएस को संशोधित करने और टीडीपी -43 से परे आईडीआर के साथ अन्य एएलएस-संबंधित आरएनपी प्रोटीन की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स में इस तरह के ऑप्टोजेनेटिक जांच के इष्टतम अभिव्यक्ति स्तर को प्राप्त करने के लिए कई प्रोटोकॉल चरणों को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। सबसे पहले, Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] ट्रांसजेनिक निर्माण में, hsp70l प्रमोटर का उपयोग mnr2b enhancers द्वारा संचालित opTDP-43h अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए एक बेसल प्रमोटर के रूप में किया गया था। HSP70l प्रमोटर को बीएसी निर्माण से हटाया जा सकता है यदि ब्याज के प्रोटीन का अभिव्यक्ति स्तर इतना अधिक है कि यह प्रकाश-स्वतंत्र अस्थानिक चरण संक्रमण का कारण बनता है। दूसरा, opTDP-43h CRY2olig टैग से सुसज्जित है, जो एक फोटोलाइज़ होमोलॉजी (PHR) डोमेन है जो नीले प्रकाश रोशनी 22 पर क्लस्टरिंग क्षमता को बढ़ाने वाले बिंदु उत्परिवर्तन को ले जाता है। जंगली प्रकार के प्रोटीन CRY2PHR का उपयोग प्रकाश-निर्भर ओलिगोमेराइजेशन टैग के रूप में किया जा सकता है यदि प्रकाश-निर्भर क्लस्टरिंग गतिविधि को क्षीण करने की आवश्यकता है। अंत में, ज़ेब्राफ़िश में एएलएस पैथोलॉजी को अधिक ईमानदारी से दोहराने के लिए, एक रोशनी प्रोटोकॉल स्थापित करना वांछनीय है जहां मछली शरीर विज्ञान किशोर और वयस्क चरणों के दौरान नीली रोशनी के क्षेत्र की रोशनी से कम से कम प्रभावित होता है। वर्तमान विधि 48 से 72 एचपीएफ (24 घंटे के लिए) तक एक निरंतर नीली रोशनी का उपयोग करती है, और रोशनी की अवधि को मछली की व्यवहार्यता 14 को खोने के बिना 120 एचपीएफ (72 एच के लिए) तक बढ़ाया जा सकता है, हालांकि प्रकाश-उत्तरदायी शारीरिक कार्य, जैसे कि दृष्टि, प्रभावित हो सकते हैं। आंतरायिक प्रकाश रोशनी के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करके, बहुत लंबी अवधि की प्रकाश उत्तेजना संभव हो सकती है, जो बदले में अधिक परिपक्व पैथोलॉजिकल समुच्चय में opTDP-43h के विकास की सुविधा प्रदान कर सकती है। इसे प्राप्त करने के लिए, विभिन्न प्रकाश तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को मॉड्युलेट करने के लिए अन्य ऑप्टोजेनेटिक जांच जो कम शारीरिक रूप से परेशान हैं24 भी आगे की जांच के लायक हो सकते हैं। इस तरह के बेहतर ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 जांच के संयोजन, रोग-कमजोर सेल प्रकारों को लक्षित करने वाले उपयुक्त प्रमोटर, और शारीरिक कार्यों पर न्यूनतम प्रभाव के साथ रोशनी प्रोटोकॉल न केवल रीढ़ की हड्डी में बल्कि मस्तिष्क में भी टीडीपी -43 प्रोटीनोपैथी की विकृतियों को ईमानदारी से मॉडलिंग करने के लिए रास्ते खोलेंगे।

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Disclosures

केए और केके इस पांडुलिपि में वर्णित बौद्धिक संपदा के आविष्कारक हैं और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जेनेटिक्स द्वारा अनंतिम पेटेंट प्रस्तुत किए गए हैं।

Acknowledgments

इस काम को SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant Numbers JP19K06933 (KA) और JP20H05345 (KA) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Olympus FV1200
Epifluorescence microscope ZEISS Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope Leica MZ16FA
Glass base dish IWAKI 3910-035
Incubator MEE CN-25C
LED panel Nanoleaf Limited Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus TAKARA AD110
NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579
NuSieve GTG Agarose LONZA 50181
Objective lens Olympus XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter HIOKI 3664
Optical sensor HIOKI 9742-10
Phenol red solution 0.5% Merck P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase TAKARA R050A
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Six-well dish FALCON 353046
Spectrometer probe BLUE-Wave StellerNet Inc. VIS-50
Syringe needle TERUMO NN-2725R
TaKaRa Ex Taq TAKARA RR001A
Tricane Sigma-Aldrich A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16 BACPAC Genomics CH211-172N16

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 180 न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग एएलएस ऑप्टोड्रॉपलेट सिस्टम क्रिप्टोक्रोम 2 टीडीपी -43 ज़ेब्राफ़िश स्पाइनल मोटर न्यूरॉन, mnr2b बीएसी ट्रांसजेनेसिस
Zebrafish लार्वा के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में TDP-43 के ऑप्टोजेनेटिक चरण संक्रमण
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Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (180), e62932, doi:10.3791/62932 (2022).

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