Summary
Çift reçine döküm mikro hesaplamalı tomografi veya DUCT, organ mimarisinin 3D analizini kolaylaştırmak için aynı anda iki borulu sistemin görselleştirilmesini, dijitalleşmesini ve segmentasyonunu sağlar. DUCT, iki radyopak reçinenin ex vivo enjeksiyonunu ve ardından tomografik verilerin mikro bilgisayarlı tomografi taramasını ve segmentasyonunu birleştirir.
Abstract
Karaciğer, insanlarda ve farelerde en büyük iç organdır ve yüksek oto-floresan, organın üç boyutlu (3D) mimarisini tüm organ düzeyinde değerlendirmek için önemli bir zorluk teşkil eder. Karaciğer mimarisi, vasküler ve safra ağaçları da dahil olmak üzere reçine ile doldurulabilen ve aksi takdirde hepatosit bakımından zengin parankimde son derece kalıplaşmış bir desen oluşturan birden fazla dallanma lümenize yapı ile karakterizedir. Bu protokol, çift reçine döküm mikro bilgisayarlı tomografi veya "DUCT" gerçekleştirmek için işlem hattını açıklar. DUCT, portal damarı ve ortak safra kanalının iki farklı radyopak sentetik reçine ile enjekte edilmesini ve ardından doku fiksasyonunu gerektirir. Bir lobun veya tüm karaciğerin optik temizleme maddesi ile temizlenmesiyle kalite kontrolü, uygun şekilde enjekte edilen numunelerin ön taramasına izin verir. KANAL boru hattının ikinci bölümünde, mikro bilgisayarlı tomografi (mikroCT) taraması, (yarı)otomatik segmentasyon ve portal venöz ve safra ağlarının 3D işlenmesi için bir lob veya tüm karaciğer kullanılabilir. MikroCT, iki reçine için 3D koordinat verileri ile sonuçlanır ve iki sistemin nitel ve nicel analizine ve mekansal ilişkilerine izin verir. DUCT doğum sonrası ve yetişkin fare karaciğerine uygulanabilir ve akciğerlerdeki damar ağları ve hava yolları gibi diğer tübüler ağlara daha da genişletilebilir.
Introduction
Organ reçinesi dökümü 17. yüzyıla dayanan bir tekniktir1. Modern reçine dökümünün ilk örneklerinden biri bir otopsiden insan karaciğerine yapıldı. İntrahepatik safra kanalları jelatin ile karıştırılmış bir kontrast madde ile dolduruldu, ardından x-ışını CT taraması ile görüntüleme2. KANAL tekniğinin amacı, iki borulu reçine dökümlü ağı birlikte 3D olarak görselleştirmek, dijitalleştirmek ve analiz etmektir.
DUCT, tek sistemli karaciğer reçine dökümünün mevcut geniş bilgisine dayanmaktadır3,4,5,6,7,8 ve iki sistemin eşzamanlı 3D görselleştirme ve analizine kadar uzanır9. DUCT, farklı kontrastlı iki radyopak reçineyi karıştırarak ve bu reçineleri iki farklı ağa, özellikle ortak safra kanalı ve portal damarına enjekte ederek çift reçine dökümüne gelişmiş tek reçine dökümü. DUCT, doğum sonrası 15 (P15) gibi erken bir zamanda tekrarlanabilir sonuçlara sahip genç postnatal farelere uygulanabilir. Mikroskopi tabanlı görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığında, en büyük avantajı DUCT'nin daha hızlı, antikorsuz olması ve karaciğer dokusu otoflüoresansının görüntülemeyi engellememesidir. Ayrıca, DUCT lümenizasyon durumunu, iç çapı, ağ bağlantısını ve perfüzyonu açıklayan nicel veriler sağlar. Lümen oluşturan hücrelerin varlığı ile bunların fiil morfogenezini tüplere ayırma, Alagille sendromunda olduğu gibi ductular hücrelerin bulunduğu ancak tüp oluşturmadığı organları analiz etmek için gereklidir10. DUCT'nin ana dezavantajı, viskoz olan ve küçük kalibreli (<5 μm) tüplere girmeyen reçinenin sınırlı penetrasyonudur. DUCT, enjeksiyon giriş noktası belirlendikten sonra arteriyel ve venöz dolaşım sistemleri, hava yolları, ekstrahepatik safra kanalı veya lenfatik damarlar gibi herhangi bir tübüler yapı için uygulanabilir. Böylece akciğerler ve pankreas gibi diğer dokuların tüm organ mimarisi analizini kolaylaştırabilir.
MikroCT segmentli görüntüler, ImageJ gibi ticari olarak kullanılabilen görüntüleme yazılımı veya özel yazılı işlem hatları (örneğin, MATLAB) kullanılarak işlenebilir. Reçine enjekte edilen karaciğer, ağ genişlemesi ve bağlantısı için nitel olarak veya tek bir sistemin hacmi, uzunluğu, dallanması, işkencesi ve iki sistem arasındaki mesafe veya dallanma bağımlılığı gibi iki sistem arasındaki etkileşim için nitel olarak analiz edilebilir (sistem 1 dallanma sistemi 2 dallanma yakınlığında mı?). Reçine enjeksiyonu, mikroCT taraması ve BT veri segmentasyonunu kapsayan DUCT boru hattı, iki borulu sistemin mimari mekanizmalarının ayrıntılı nicel analizi ile birlikte, hayvan modellerinde tüm karaciğer analizi için bir standart sağlayabilir.
Protocol
Bu çalışmada açıklanan protokol onaylanmıştır ve Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd'ın (Stockholm hayvan araştırma etik kurulu) hayvan refahı kural ve yönetmeliklerine uyar. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, karışık C3H / N ve C57bl6J arka plan üzerinde vahşi tip veya homozigous Jag1H268Q mutant farelerdi. Çalışmaya hem erkekler hem de kadınlar dahil edildi. Hayvanlar doğum sonrası 15 günde veya 3 - 8 ay arasında yetişkin olarak kullanıldı.
1. Çift reçine enjeksiyonları
- Hazırlık
- Reçine çözeltisi hazırlayın. Çift sistemli reçine enjeksiyonları için, 1.1.2-1.1.4 adımlarında açıklandığı gibi hem sarı hem de yeşil reçineler hazırlayın.
- Fare başına 1 mL seyreltilmiş reçine aliquots hazırlayın.
- Sarı Reçine: Sarı reçineyi enjeksiyona hazırlamak için sarı silikon kauçuğunu (yüksek radyopaklık) 3:1 seyreltmede açık seyreltici ile seyreltin.
- Yeşil Reçine: Mavi reçine hazırlamak için mavi silikon kauçuk (tespit edilemeyen radyopaklık) ile 1:1 seyreltmede açık seyreltici ile karıştırın. Yeşil reçine üretmek için seyreltilmiş mavi reçineyi seyreltilmiş sarı reçine ile 1:1 oranında karıştırın. Renk homojen olana kadar yeşil reçineyi iyice girdapla.
NOT: Mavi reçine, mikroCT ile tespit edilemeyen çok düşük radyopaklığa sahiptir, bu nedenle farklı radyopaklıklara sahip iki reçine oluşturmak için sarı reçine ile seyreltilmesini gerektirir.
DİkKAT: Reçine, kanserojen olan kurşun kromat içerebilir. Yangında zehirli gazlar üretir. Reçineyi dikkatli bir şekilde işleyin ve tehlikeli atık olarak atın. - 1.1.6-1.1.11 adımlarında açıklandığı gibi iki enjeksiyon seti (enjeksiyon seti #1 ve enjeksiyon seti #2) boru ile hazırlayın.
NOT: Yetişkin fareler için (>P30 (doğum sonrası gün 30) = P30 - 2 yıl), portal damar enjeksiyonu için ortak safra kanalı enjeksiyonu ve enjeksiyon seti #2 (0,96 mm dış çapa sahip PE50 boru) için enjeksiyon seti #1 (0,6 mm dış çaplı PE10 boru) kullanın. Genç doğum sonrası fareler için (P30'a kadar), biri safra kanalı ve diğeri portal damar enjeksiyonu için olmak üzere iki #1 enjeksiyon seti hazırlayın (portal damarı PE50 borularına uyum sağlamak için çok dar olduğu için enjeksiyon seti #2 yok). - Enjeksiyon seti #1 hazırlamak için, 30 cm PE10 boruyu kesin ve borunun bir ucunu mümkün olduğunca ince hale gelinceye kadar çekerek elle uzatın (Şekil 1A, B, yaklaşık 0,15 mm çapında, gerilmemiş PE10 boru 0,6 mm çapındadır).
- Eğimli bir uç oluşturmak için gerilmiş PE10 borunun ucunu çapraz olarak kesin (Şekil 1B).
- PE10 borunun gerilmemiş ucunu 30 G iğneye bağlayın (Şekil 1A, Enjeksiyon seti #1).
- Enjeksiyon seti #2 hazırlamak için, 30 cm PE50 boruyu kesin ve borunun bir ucunu portal damarına sığacak kadar ince hale gelene kadar çekerek elle uzatın (Şekil 1A, B, yaklaşık 0,7 mm, gerilmemiş PE50 boru 0,96 mm çapındadır).
- Eğimli bir uç oluşturmak için gerilmiş PE50 borunun ucunu çapraz olarak kesin (Şekil 1B).
- PE50 borunun gerilmemiş ucunu 23 G iğneye bağlayın (Şekil 1A, enjeksiyon seti #2).
NOT: Reçine şırınna ve boruda sertleşeceğinden, her enjeksiyon seti sadece bir enjeksiyon için kullanılabilir. Gerilmiş ve eğimli ucun boyutunu, yaşına, genotipine ve fenotipine bağlı olarak farenin ortak safra kanalının ve portal damarının boyutuna göre ayarlayın. Borunun boyutundan ve uygun halinden emin değilken, boruyu kesiden sonra ve boru reçine ile doldurulmadan önce uygun kanala veya tekneye yerleştirin. Boru kanala/tekneye sığmayacak kadar genişse, daha da uzatın. - Hayvanı izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon odasında ilk% 4 ve burun konisini kullanarak ~ % 2).
- Fare burun konisine izofluran solurken fareyi havalandırmalı bir bankın üzerine bir diseksiyon pedi üzerine yerleştirin. Hayvanın, örneğin pençelerden birini kıstırarak enstitü / IRB tarafından önerilen bir yöntemle bilinçsiz olduğunu doğrulayın.
DİkKAT: İzofluran solunduğunda uyuşukluğa veya baş dönmesine neden olabilir ve uzun süreli veya tekrarlanan maruziyet yoluyla kardiyovasküler sisteme ve merkezi sinir sistemine zarar verebilir. Onu içine çekme. Maddeyi havalandırılmış bir bankta ve iyi havalandırılmış alanlarda ele alın.
NOT: Kardiyak perfüzyon ile uyumlu olduğu sürece başka bir anestezi yöntemi kullanmak mümkündür. - Hayvan bilinçsiz olduğunda, kürkün karışmasını önlemek için ventral tarafına% 70 etanol püskürtün.
- Cilt makası kullanarak, karın boşluğunun orta hattından başlayarak cildi, fasyayı ve kas tabakasını kesin ve iç organları açığa çıkarmak için torasik boşluğa kesin.
- Sternumu kaldırmak için 11oid işlemini tokmaklarla tutun ve kalbi ve akciğerleri açığa çıkarmak için her iki taraftaki diyaframı ve göğüs kafesini kesin.
- Göğüs kafesinin sol ve sağ tarafındaki kaburgaları makasla keserek göğüs kafesini çıkarın. Reçinenin sızmasına neden olacağından karaciğere zarar vermemeye ekstra özen gösterecektir.
- Düz tokparlamalar kullanarak kalbi karaciğere doğru çekin ve sağ kulakçık kesin.
- Peristaltik perfüzyon pompasına bağlı bir kelebek iğnesini (23 G) sol ventriküle yerleştirin. Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ve heparin (1 U/g fare vücut ağırlığı) ile fareyi transkardiyöz olarak kullanın. 5 mL / dk perfüzyon oranı ile 3 dakika perfuse.
NOT: Fare doğru şekilde perfüzyona maruz kalırsa, iç organlar, özellikle karaciğer soluklaşır. Bunun yerine, akciğerler beyaza dönüyorsa, iğne sağ ventriküle yerleştirilir ve yeniden konumlandırılmalıdır. Perfüzyondan sonra, fare çıkarılır ve burun konisi ve izoflurandan çıkarılabilir. - Izofluran pompasını kapatın.
- Reçine enjeksiyonu - Safra sistemi reçine dökümü
- Fareyi diseksiyon mikroskobuna, karnı yukarı, deneyciye doğru kuyruk ve deneyciden uzağa gidin. İlgi çekici anatomik simgesel yapılar Şekil 2A'da tasvir edilmektedir.
- Bağırsağı yana doğru hareket ettirerek alt vena kavasını (Şekil 2A) bulun. Hepatik damar basıncının salınmasını sağlamak için alt vena kavasında küçük bir transversal kesi yapmak için yay makası kullanın (Şekil 2Bi).
- 1.2.4- 1.2.6 adımlarında açıklandığı gibi ortak safra kanalını ve portal damarı ortaya çıkarın.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) ıslatılmış pamuklu çubuk kullanarak bağırsak ve pankreası sağ tarafa (deneycinin) hareket ettirin.
- Viseral yüzeyi ve hilar bölgeyi açığa çıkarmak için PBS ıslatılmış pamuklu çubuğu kullanarak karaciğerin ventral tarafını kalbe doğru çevirin.
- Hilar bölgesinden pankreas boyunca ve Oddi sfinkter'inde bağırsağa uzanan ortak safra kanalını bulun (Şekil 2Bii, sarı noktalı çizgi ile özetlenen ortak safra kanalı, siyah ok uçları Oddi'nin Sfinkter'ini gösterir).
NOT: Karaciğeri PBS ile serperek işlem boyunca nemli olduğundan emin olun. - Düz kümesler kullanarak ortak safra kanalından çevre dokuyu (alan ~ 5 mm) temizleyin. İpek dikiş ipliğini (boyut 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm uzunluğunda) ortak safra kanalının altına yerleştirin (Şekil 2Bii) ve ortak safra kanalının etrafına gevşek bir el üstü düğüm bağlayın (Şekil 2Biii).
NOT: Oddi'nin hilar bölgesi ile sfinkteri arasındaki düğüm için bir alan seçin ve portal damardan bir mesafede, böylece dikiş ortak safra kanalının etrafına sıkıldıktan sonra portal damar enjeksiyonuna müdahale etmeyecektir. - Ortak safra kanalının Oddi sfinkterinin yanındaki pankreas ve bağırsağa girdiği noktada ortak safra kanalına eğik bir kesi yapmak için yay makasını ortak safra kanalına karşı düz tutun. (Şekil 2Biv), sarı noktalı çizgi, siyah ok uçlarıyla vurgulanan Oddi bölgesinin sfinkterini özetler.
NOT: Bu çok önemli bir adımdır. Bir eğiklik yapın, bir transversal kesim yapmayın ve bir kesi yapın; safra kanalını kesmeyin. Tüm safra kanalını kesmek, borunun takılmasını çok zorlaştırır. - Kullanmadan hemen önce, sarı reçinenin 1 mL'lik kısmını kürleme maddesinin 50 μL'si ile karıştırın (1 mL şırınnayı doldurup boşaltarak) ve 1 mL Luer şırınnasını reçine - kürleyici madde karışımı ile doldurun.
- Dolu şırınnayı boruya bağlayın (ayar no 1). Boruyu tamamen doldurmak için pistona basın. Reçine/kürleme maddesinin borunun ucundan damlamasını sağlayın.
NOT: En iyi sonuçları elde etmek için şırınna ve borudaki kabarcıklardan kaçının ve çıkarın. - Uzun uçları kullanarak, ortak safra kanalı kesisinin etrafındaki alanı düzeltin ve boruyu ortak safra kanalındaki açıklığa yerleştirin (Şekil 2Bv), eğimli ucun en uzun kenarı safra kanalının dorsal tarafına doğru aşağı doğru. Bu yönlendirme, reçinenin yukarı bakan boru açıklığını kanala çıkarabilmesini sağlar (Şekil 2Bv).
- Boruyu ortak safra kanalının içine sabitlemek için ipek iplik düğümünü sıkın (Şekil 2Bvi).
- Reçineyi ortak safra kanalına enjekte edin. Safra kesesini ve bireysel karaciğer loblarını gözlemleyin.
- Reçinenin eşit şekilde yayılmasına yardımcı olmak için karaciğere PBS ıslatılmış pamuklu çubukla masaj yapın. Reçine dolu safra kanallarının terminal dalları (vahşi tip farelerde) karaciğer yüzeyinde hafifçe görülebilir.
NOT: Karaciğeri doldurmak için beklenen süre 30 -100 s'dir. - Karaciğerin yüzeyinde reçine noktaları göründüğünde (Şekil 2Ci, mavi ok uçları) veya direnç karşılandığında reçineyi enjekte etmeyi bırakın.
NOT: Reçine kürleme maddesini ekledikten sonra reçine sertleşmeye başladığından beri mümkün olduğunca hızlı çalışın. Kürleme maddesini eklemekten çalışma süresi yaklaşık 15 dakikadır. - Boruyu ortak safra kanalından çekerek çıkarın ve reçinenin dışarı sızmasını önlemek için tokalar kullanarak ipek düğümünü hızla sıkın. İpek dikişin gevşek uçlarını kesin, böylece portal damar enjeksiyonuna müdahale etmezler.
- Reçine içeren boruyu ve kalan reçineyi tehlikeli atıklara, iğneyi de keskin atıklara atın.
- Reçine enjeksiyonu - Portal ven reçine dökümü
- Portal damarı (alan ~5 mm) düz tokmaklar kullanarak karaciğere girişinden yaklaşık 2 cm uzaklıktaki çevresindeki dokusundan temizleyin. İpek dikiş ipliğini (boyut 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm uzunluğunda) portal damarın temizlenmiş alanının altına yerleştirin (Şekil 2Ci) ve gevşek bir el üstü düğüm bağlayın (Şekil 2Cii).
- Portal damarda karaciğere ve düğüme karşı uzunlamasına bir kesi yapın (Şekil 2Ciii).
- Yeşil reçinenin 1 mL'lik kısmını kürleme maddesinin 50 μL'si ile karıştırın (1 mL şırınna doldurup boşaltarak) ve 1 mL Luer şırındını reçine kürleyici madde karışımı ile doldurun.
- Dolu şırınnayı boruya bağlayın (>P30 fareler için 2 numaralı set,
NOT: En iyi sonuçları elde etmek için şırınna ve borudaki kabarcıklardan kaçının ve çıkarın. - Tostikleri kullanarak, çevredeki dokuyu deneyciye doğru çekerek portal damarı düzleştirin ve eğimli ucun en uzun kenarına sahip boruyu damarın dorsal tarafına doğru yerleştirin (Şekil 2Ciii).
- Portal damardaki boruyu sabitlemek için ipek ipliği sıkın.
- Reçineyi portal damara enjekte et. Reçine ile dolu kan damarlarını gözlemleyin. Reçinenin eşit şekilde yayılmasına yardımcı olmak için karaciğere PBS ıslatılmış pamuklu çubukla masaj yapın (Şekil 2Civ).
- Tüm kan damarları dolduğunda (portal damarların uçları karaciğer çevresinde görülebilir) veya direnç karşılandığında reçineyi enjekte etmeyi bırakın.
NOT: Kürleme maddesinin eklenmesinden sonra reçine sertleşmeye başladığından hızlı çalışın. Kürleme maddesini eklemeden elde edilen çalışma süresi, enjeksiyon kümesi #1 için yaklaşık 15 dakika ve enjeksiyon kümesi #2 için 25 dakikadır. - Boruyu portal damardan çekerek çıkarın ve reçinenin dışarı sızmasını önlemek için ipek düğümünü hızlı bir şekilde sertlaştırın.
- Reçine içeren boruyu ve kalan reçineyi tehlikeli atıklara, iğneyi de keskin atıklara atın.
- Karaciğer diseksiyonu ve fiksasyonu
- Tüm karaciğeri çevre dokudan ve diyaframdan keserek parçalara ayrıştırın.
- Karaciğerin deformasyonunu önlemek için tüm karaciğeri ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ve sırt tarafı konik tüpün duvarına yaslı boş bir 50 mL konik tüpe hafifçe yerleştirin. Reçinenin tamamen sertleşmesi için konik tüpü yatay olarak 4 °C'de gece boyunca saklayın.
NOT: Karaciğere sığacak kadar büyük olan herhangi bir kap 50 mL konik tüp yerine kullanılabilir. Düz bir alt kap kullanmak karaciğerin deforme olmama olasılığını artıracaktır. - Karaciğeri tek tek loblara ayırın. MikroCT analizi (1.4.4-1.4.5) veya kalite kontrol (1.4.6-1.4.8) için kullanılacak loblardan bir seçim yapın. İsteğe bağlı olarak, tüm karaciğeri tek tek loblara ayırmadan hem optik temizleme hem de mikroCT için kullanın.
NOT: Safra ve damar sistemlerinin karaciğer mimarisi her lobda farklıdır ve bu nedenle eşleştirilen lob analizleri gereklidir. Optik temizleme mikroCT taramasını engellemez ve kalite kontrolü için kullanılan loblar daha sonra mikroCT ile taranabilir. Buna karşılık, mikroCT ile taranan numuneler daha sonra karşılaştırma için optik olarak temizlenebilir. Böylece tüm karaciğer analizi mümkündür. Vahşi tip farelerde (C3H/C57bl6 genetik arka plan), sağ medial lob önce reçine enjeksiyonları ile doldurulur ve bu da bunu mikroCT analizi için uygun bir lob haline getirir ve en yüksek tekrarlanabilirlik ile. Sol lateral lob, enjeksiyon kalitesi için ön taramanın basit olduğu en büyük lobdur. Kalite kontrol ve mikroKT taraması için kullanılan lobun (veya tüm karaciğerin) seçimi hayvan modeli ve araştırma sorusuna bağlıdır. - Havalandırılmış bir davlumbazda% 4 formaldehit çözeltisi hazırlayın (tüp başına 10 -20 mL). MikroCT için kullanılan lobları 4 °C'de bir gecede %4 formaldehit ile sabitlayın ve daha sonra PBS ile bir kez yıkayın (tüp başına 10 -20 mL).
- Formaldehit atıklarını ayrı bir kapta toplayın. Karaciğer loblarını kısa süreli depolama için PBS'de 4 °C'de veya uzun süreli depolama için% 70 etanolde tutun. Bölüm 2: Mikro bilgisayarlı tomografi ile devam edin.
DİkKAT: Formaldehit yutulursa, solunursa veya ciltle temas halinde akut toksisiteye neden olur. Formaldehit yanıcı bir sıvı ve buhardır. Ciddi cilt yanıklara ve göz hasarına neden olur. Alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Solunduğunda ölümcüldür (konsantre veya toz halinde). Solunum tahrişi neden olabilir. Genetik bozukluklara yol açtığından şüphelenilmiş. Kansere neden olabilir. Organlarda hasara neden olur (gözler, merkezi sinir sistemi). Önlem ifadeleri - ısıdan, sıcak yüzeylerden, kıvılcımlardan, açık alevlerden ve diğer ateşleme kaynaklarından uzak tutun. Sigara içilmez. Koruyucu eldiven ve koruyucu giysiler giyin. Dökülme durumunda, kirlenmiş tüm kıyafetleri derhal çıkarın. Ciltle temas halindeyseniz: kirlenmiş bölgeyi suyla durulayın. Solunursa: kişiyi temiz havaya çıkarın ve rahatsa nefes almayı izleyin. Hemen bir zehir merkezi / doktor arayın. Gözlerde ise: gözleri birkaç dakika suyla durulayın. Varsa ve mümkünse kontakt lensleri çıkarın. - Kalite kontrolü için, kalan lobları (en az bir) % 50 metanol (deiyonize su ile karıştırılır) ile en az 4 saat boyunca sabitlayın, oda sıcaklığında sallanır, ardından oda sıcaklığında bir gecede sallanan% 100 metanol. Metanol atıklarını ayrı bir kapta toplayın.
DİkKAT: Metanol yutulursa, solunursa veya ciltle temas halinde akut toksisiteye neden olur. Metanol yanıcı bir sıvı ve buhardır. Koruyucu eldiven ve kıyafet giyin. Yol tutuşu yaparken nefes almaktan kaçının ve ateş ve ısıdan uzak durun. Kullandıktan sonra cildi iyice yıkayın. Dökülme durumunda, tüm kontamine giysileri derhal çıkarın. Cildi suyla durulayın. Solunursa: Kişiyi temiz havaya çıkarın ve nefes almak için rahat tutun. Solunduğunda, yutulmasında veya maruz kalınması durumunda bir zehir merkezi/ doktor çağırır. - Havalandırılmış bir kaputta benzil alkol ve benzil benzoat (BA: BB, 1:2) (lob başına 5 -10 mL) çözeltisi hazırlayın.
- Karaciğer lobunu BABB çözeltisi içeren 15 veya 50 mL'lik bir polipropilen tüpe (lobun büyüklüğüne bağlı olarak) yerleştirin. Şeffaf olana kadar oda sıcaklığında sallayın. Bu adım lobun büyüklüğüne bağlı olarak 2-16 saat arasında sürebilir.
NOT: BABB çözeltisi belirli plastik türlerini çözrür. Numuneleri polipropilen tüplerde veya cam kaplarda saklamak güvenlidir.
DİkKAT: Benzil benzoat yutuldığında akut toksisiteye neden olabilir. Uzun süreli etkileri olan sucul yaşam için toksiktir. Önlem ifadeleri: Kullanımdan sonra cildi iyice yıkayın. Yutulduğunda, ciltle temas ettiğinde veya solunduğunda zararlıdır. Duman/buhar solumaktan kaçının. Elleçlemeden sonra ellerinizi iyice yıkayın. Bu ürünü kullanırken yemeyin, içmeyin veya sigara içmeyin. Yutulursa - iyi değilse bir zehir merkezi / doktor çağıryın Havalandırılan alanlarda kullanın. Dökülmeyi toplayın. İçeriği/konteyneri onaylanmış bir atık bertaraf tesisine atın. - Enjeksiyonun kalitesini inceleyin. Sadece iyi enjekte edilmiş karaciğer mikroCT ile taranmalıdır.
2. Mikro bilgisayarlı tomografi
- Numune hazırlama
- 100 mL damıtılmış su ve 1 g agarose toz karıştırarak% 1 agarose jeli hazırlayın. Karışımı bir mikrodalga fırına yerleştirin ve agarose tozu çözünene kadar çözeltiyi kaynatın.
- Karaciğer örneğinin termal hasar görmesini önlemek için% 1 agarose jelini ~ 40 ° C'ye temperleyin.
- İlgi çekici lobları 15 mL konik bir tüpe yerleştirin ve tüpün toplam hacminin yaklaşık 2/3'üne% 1 agarose jel ile doldurun. Bu adım, CT ölçümü sırasında istenmeyen numune hareketini en aza indirir.
- CT ölçümü
NOT: Aşağıdaki adımlar CT cihazına bağlıdır ve farklı CT aygıtları ve üreticileri için belirli ayarlar ve eylemler farklılık gösterebilir. Bu protokolde, kullanılan mikro bilgisayarlı tomografi tarayıcısı, CT ölçümleri için nanofocus X-ray tüpü (180 kV/15 W) ve düz panel dinamiği 41|100 (4048 piksel x 4048 piksel, binning 2 ile piksel boyutu 100 mm) ile donatılmıştır.- 15 mL konik tüpü bir CT cihazının dönme aşamasına örnekle monte edin ve ölçüm odasına en az 1 saat boyunca termal olarak adapte olmasını sağlayın.
- Örnek termal olarak uyarlandığında, Görüş Alanı'nda (FOV) ortala.
- Kaynak numune ve numune dedektörü mesafelerini optimize edin (SSD, SDD) yeterli voksel çözünürlüğe ulaşmak için, örneğin, yetişkin bir murine karaciğer örneği için 12 μm veya
- Ct cihazı üreticisinin tespit edilen yeterli sinyal seviyesine ulaşmak için tavsiyelerini izleyerek alım parametrelerini (örneğin, voltaj ve akımın hızlandırılması, pozlama, binning, ortalama) ayarlayın. Bu parametreler sadece CT cihazına bağımlı değil, aynı zamanda örneğe de bağımlıdır ve her örnek için en iyi duruma getirilmelidir. Hankeova ve ark.9'da ayarlar şöyleydi: 80 kV hızlanan voltaj, 160 μA hızlanan akım, 400 ms pozlama süresi ve 2000 görüntü.
- Tomografiye başlayın. CT verilerini yeniden oluşturmak için özel bir tomografik rekonstrüksiyon yazılımı kullanın.
3. Analiz ve veri segmentasyonu
NOT: Aşağıdaki adımlar görüntü işleme yazılımına bağlıdır; belirli ayarlar ve eylemler kullanılan yazılıma bağlı olarak farklılık gösterebilir.
- CT verilerini yükleme: Dosya > > Al Komutunu seçin. Başka bir seçim, işlenecek CT verilerinin belirli biçimine bağlıdır.
- Genel eşik kullanarak verilerdeki reçineyi segmentlere ayırmak için üst paneldeki Yüzey Belirleme işlevini kullanın. İletişim penceresinde, kırmızı "Isovalue" çizgisinin konumunu yalnızca reçine dolu damarları (örneğin, sunulan "Önizleme panelinde" sarı çizgiyle kapsanan) segmentlere ayırarak histogram değerlendirmesiyle eşik değerini belirleyin (Şekil 3A).
- Sol panelde, reçine dolu gemilerin ilgi çekici bir bölgesini (ROI) oluşturmak için Hacim/CAD/Mesh'ten yatırım getirisi oluştur modülini seçin. İletişim penceresinde, Katı'dan yatırım getirisi oluştur seçeneğini kullanın, işlenen birimin adını seçin ve onaylayın.
- Bu yatırım getirisinin arka plan bölgesindeki gürültü kümelerinin hatalı segmentasyonunu ortadan kaldırın. Bu yatırım getirisini sağ panelde işaretleyin, üzerine sağ tıklayın ve Yatırım Getirisini Böl modülini seçin.
- İletişim penceresinde, Tüm gürültü parçacıklarını dışlamak için Minimum Ses Düzeyi [voxel] parametresini ayarlayın - bu değer deneme ve veriye bağımlıdır ve analiz edilecek her örnek için en iyi duruma getirilmelidir (Şekil 3B).
- Reçine döküm yatırım getirisinde eser olmadan pürüzsüz, sürekli ve katı kanal maskeleri oluşturun - örneğin, hava kabarcıklarının varlığı veya reçine sızıntısı.
- Sol panelde Yumuşatma modülunu kullanın, Yumuşatma Mukavemeti parametresini 1 veya 2 olarak ayarlayın (tek tek verilere bağlı olarak, daha yüksek değerlerin özellikle ince yapılarla uğraşırken model deformasyonuna yol açabileceği zaman). Gerekirse, bu işlemi iki kez çalıştırın (Şekil 3C).
- Parçalı reçine maskesinde tek tek borulu sistemleri tanımlayın ve ayırın.
- CT verilerinde daha yüksek yoğunluklu değerlere sahip daha absorptif reçine (ortak safra kanalı enjeksiyonu için kullanılan sarı reçine) ile dolu sistem için ayrı bir yatırım getirisi oluşturun. 3.2. adımda açıklanan yordamı izleyin. (Şekil 3Di).
- Yeni yatırım getirisini ve reçine maskesi yatırım getirisini işaretleyin, sağ tıklatın ve Yatırım Getirilerini Çıkar'ı seçin ve kalan tübüler sistem için yeni bir yatırım getirisi oluşturmak üzere yeni yatırım getirisini reçine maskesi yatırım getirisinden çıkarın (Şekil 3Dii, iii).
- Farklı yazılımlarda daha sonra işlem için operatör tercihlerine göre her iki borulu sistem için de elde eden ROI'leri çeşitli biçimlerde dışa aktarın. Ayrıca, elde eden ROI'leri bir birim grafik yazılımında işleyerek son görselleştirmeyi bir görüntü veya video biçiminde dışa aktarabilirsiniz.
Representative Results
Ne yapmalı
Hem intrahepatik safra kanalları hem de portal damar damarı iyi dolduğunda başarılı çift reçine enjeksiyonu sağlanır. Bir kalite kontrol adımı olarak, bir lobun temizlenmesi (örneğin, sol lateral lob) başarılı bir enjeksiyonun doğrulanmasına ve ardından ilgi çekici lobların görüntülenmesine izin verir. Optik olarak temizlenen lob daha sonra mikroCT kullanılarak taranabilir; bu nedenle tüm karaciğeri optik olarak temizlemek mümkündür. İyi enjekte edilmiş fare karaciğerinde portal damar damarı, karaciğer çevresi ve reçine yan dallarda görünene kadar reçine ile doldurulmalıdır (Şekil 4) ve bu mimari mikroCT taranmış ve segmentli verilerde sadık bir şekilde yeniden elde edilir. Ayrıca, iyi enjekte edilmiş intrahepatik safra kanalları, neredeyse çevreye uzanan ana portal damar dallarının yanında görünmeli ve reçine ana yan dallarda görülebilmelidir. Kontrol lobunun kalite kontrol adımını geçmesi durumunda, ilgi çekici loblar (optik olarak temizlenen lob dahil) mikroCT ile taranabilir. İyi enjekte edilmiş bir karaciğerden elde edilen segmentlere ayrılmıştı verilerin sonucu bir P15 faresi (Şekil 4A,B) ve yetişkin bir fare (Şekil 4C, D) için gösterilir.
Ne yapmamalı
Sağlam karaciğer dokusu başarılı enjeksiyon için bir ön koşuldur. Karaciğer dokusunu yanlışlıkla çalmamak için karın boşluğunu ve diyaframı keserken ekstra özenyi görün. Bu işlem sırasında karaciğerde fiziksel hasar varsa, reçinenin portal damar enjeksiyonu sırasında dışarı sızma olasılığı çok yüksektir (Şekil 5A). Karaciğer fiziksel olarak hasar görmüşse damar sisteminin iyi bir enjeksiyonu elde etmek mümkün değildir.
Yaygın hatalardan biri, karaciğeri görselleştirme veya analiz için zorluklara yol açabilecek reçine ile doldurmaktır. Sistem yetersiz doldurma nedenlerinden biri, enjeksiyon tamamlanmadan önce iğnede veya borunun ucunda erken sertleşen reçinedir (Şekil 5B, mavi ok uçları, braketler büyük kabarcıkları tasvir eder). İyi bir uygulama, hayvan başına bir enjeksiyon seti kullanmak ve kürleme maddesi reçineye eklendikten sonra hızlı çalışmaktır. Reçine enjeksiyon sırasında sertleşirse (yarı dolu bir sistem tarafından gözlemlenebilir, burada yarı dolu bir portal damar vaskülatıyla örneklenmiştir) boruyu çıkarın, borunun ucunu kesin (eğimli bir uç oluşturmak için her zaman çapraz olarak) ve pistonu itin. Reçine tekrar damlamaya başlarsa, boruyu dikkatlice yeniden takın ve dikişle sabitleyin. Reçine iğnede sertleşmişse, boruyu tamamen değiştirin, reçine ile doldurun (kabarcıklardan kaçının), boruyu dikkatlice yeniden yerleştirin ve dikişle sabitleyin. Doku daha kırılgan olduğu için, özellikle genç doğum sonrası farelerde
Tersine, sistemlerden biri veya her ikisi de reçine ile dolduruldu (Şekil 5D). Enjeksiyon boyunca karaciğeri görsel olarak izlemek gerekir. Reçine ile safra sistemi dökümü portal ven reçine dökümünden daha zordur, çünkü reçine dolu kanallar karaciğer yüzeyinde sadece hafifçe görülebilir ve sistemin ne zaman dolduğunu ve ne zaman dureceğini değerlendirmek zordur. Karaciğer yüzeyinde küçük sarı reçine noktaları göründüğünde (Şekil 2Ci, mavi ok ucu), bu safra sisteminin tamamen dolduğunun ve reçinenin kanallardan sızmaya başladığının bir işaretidir. Küçük reçine sızıntısı mikroCT veri segmentasyonu sırasında manuel olarak düzeltilebilir (Şekil 5D, sağ paneller).
Enjeksiyon basıncı çok yüksekse, bu damarların veya kanalların yırtılmasına neden olabilir (Şekil 5E), gemi veya kanal mimarisine geri dönüşümsüz olarak zarar verebilir. Karaciğer mikroCT taraması veya analizi için uygun olmayacaktır. Yeniden satış aşırı doldurmayı önlemek için, her fare modelinde enjeksiyon için kullanılan doğru hacmi ve basıncı optimize edin. Safra veya venöz sistemleri veya karaciğer sertliğini etkileyen toksik bir diyet, genetik modifikasyon veya karaciğer hasarı ile zorlanan farelerle çalışırken, enjeksiyon basıncının ve hacminin hacim olarak ayarlanması gerekebilir ve basınç tolere edilen vahşi tip farelerden farklı olabilir. Bu protokol iki sistemin manuel enjeksiyonunu açıklar, ancak enjeksiyon basıncını standartlaştırmak için şırınnayı bir pompaya bağlamak mümkündür. Kabarcıklar, borulu ağların seyrek doldurulmasına yol açan çok yaygın bir başka enjeksiyon yapıtıdır (Şekil 5F-H, mavi ok uçları). Kabarcık oluşumunu önlemek için, şırınnanın ve borunun herhangi bir kabarcık içermediğinden, tamamen reçine ile dolduğundan ve enjeksiyondan önce reçinenin borunun ucundan damladığına emin olun. MikroCT verilerinde negatif alanlar olarak görünen küçük kabarcıklar, işlem sonrası adımlar sırasında manuel olarak düzeltilebilir, ancak bu zahmetlidir.
Taze en iyisidir
Taze sarı reçine kullanmak, iki reçinenin kontrastını ve mikroCT veri segmentasyonunu önemli ölçüde etkileyen önemli bir faktördür. Yeni açılan reçine kullanıldığında (Şekil 6A), sarı reçine enjekte edilen safra kanalları (parlak beyaz) ile yeşil reçine enjekte edilen portal damarlar (parlak gri) arasında açık bir kontrast farkı vardır. Taze reçine ile enjekte edilen karaciğer, otomatik küresel eşik kullanılarak kolayca işlenir. Uzun süreli depolama ile reçine çökeltir ve kontrast azalır. 3 aylık depolamadan sonra, kontrast portal damarı safra kanalından ayırmak için hala yeterli olabilir (Şekil 6B), ancak yağış, dolu portal damarında heterojen bir opaklık olarak görülebilen iki reçinenin karıştırılmasını etkiler (Şekil 6B, mavi ok uçları). Heterojen kontrast otomatik eşiği olumsuz yönde etkiler ve işlem süresini artıran manuel düzeltmeleri gerektirir. Reçine altı aydan daha eskiyse, kontrast, sarı enjekte edilen safra kanalını sadece kontrastlarına göre yeşil enjekte edilen portal damardan ayırt etmenin mümkün olmadığı bir noktaya kadar bozulmuştur (Şekil 6C). Bu durumda, safra kanalı ve portal damar, hilar bölgesindeki çaplarına ve konumlarına göre manuel olarak parçalanmalıdır ve tüm mikroCT verileri boyunca manuel olarak takip edilmelidir. Bu prosedür son derece zaman alıcıdır ve en iyi şekilde kaçınılır.
Şekil 1: Reçine dökümü için enjeksiyon seti. (A) Enjeksiyon seti #1, ~30 cm uzunluğunda 30 G iğne ve PE10 borudan oluşur. Enjeksiyon seti #2, 23 G iğne ve PE50 boru ~30 cm uzunluğundadır. (B) Borunun ucu gerilir ve eğimli bir uç oluşturmak için bir açıyla kesilir. A ve B'deki cetvel, 1 cm'lik büyük artışlar, 5 mm'lik orta artışlar ve 1 mm'lik küçük artışlarla bir santimetre cetveldir.
Şekil 2: Çift reçine döküm akış şeması. (A) Perfüzyondan önce kesilmesi gereken murine venöz dolaşım sistemini ve kalbi vurgulanmış sağ kulakçıkla ve kanı dolaşım sisteminden temizlemek için perfüzyon için iğnenin yerleştirilmesi gereken sol ventrikül gösteren şematik. Vasküler basıncı azaltmak için alt vena kava böbreklerin altında kesilmelidir. (B) Safra kanalı reçine enjeksiyon akış şeması. (i) IVC'nin nerede kesilir olduğunu gösteren (A) görüntüsünü yakınlaştırın. (ii) Karaciğer hilar bölgesinden Oddi'nin sfinkterine (siyah ok uçları) kadar ortak safra kanalını (sarı noktalı çizgi) gösteren görüntü, temizlenmiş ortak safra kanalının altında dikiş ipliği ile. (iii) Ortak safra kanalı etrafında gevşek overhand knot için uygun konum. (iv) Sarı noktalı çizgi ve siyah ok uçları Oddi'nin sfinkterini etiketleerek kesi için eğik açıyı ve eğik açı kesiği sonrası açıklığın nasıl görünmesi gerektiğini gösterir. (v) Pe10 boru eğim açıklığının (yukarı) yerleştirilmesinden sonra yönünü gösteren şematik. (vi) Enjekte edilen sarı reçinenin görünümü; reçine gevşek bağlanmış düğümü kolayca geçirmelidir. IVC, alt vena kava; CBD, ortak safra kanalı. (C) Portal ven reçine enjeksiyon akış şeması. (i) Yeşil noktalı çizgi, hilar bölgesinden portal damarı işaretler. Mavi ok uçları aşırı doldurulmuş safra sistemini etiketler. (ii) Portal damar etrafında gevşek overhand düğüm için uygun konum. (iii) Ekleme sırasında eğim açıklığı (yukarı) gösteren şematik. (iv) Yeşil reçine ve sarı reçine enjeksiyonu üzerine karaciğerin görünümü; karaciğer çevresindeki reçine dolu kan damarına dikkat edin. PV, portal damar. Şekil 2A Biorender.com ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hacim grafik yazılımında mikro BT veri işleme. (A) Yüzey belirleme, (i) aşırı tahmin edilmiş isovalue (seçimin mevcut önizlemesi sarı renkte gösterilmiştir), (ii) hafife alınan isovalue, (iii) portal damar ve safra kanallarının uygun yüzey tayini için en uygun isovalue seçimi. (B) Yüzey belirleme ile oluşturulan ilgi alanının (ROI) bölünmesi, (i) iletişim penceresindeki değeri yalnızca bir segmentin (en büyüğü) kalacak kadar yüksek olarak ayarlayın, (ii) sarı çerçevelerde daha küçük (hariç) parçacıklar gösterilir. (C) Verilerin yüzey yumuşatması, (i) yumuşatma işlevi sol paneldedir, (ii) yumuşatma mukavemetini 1 (maks. 2) olarak ayarlayın ve yeni yumuşatılmış yatırım getirisi, (iii) düzeltilmiş veri oluşturun. (D) Bireysel borulu sistemlerin ayrılması, (i) yüzey belirleme fonksiyonunda isovalue'yi seçime sadece safra sisteminin dahil edilmesi için ayarlayın (seçimin mevcut önizlemesi sarı renkte gösterilir), (ii) hem sistemlerin hem de sadece safra sisteminin yatırım getirisini işaretlemek ve her iki sistemin yatırım getirisinden safra sistemi yatırım getirisini çıkarmak, (iii) Portal damar gri, safra sistemi yeşil olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İyi enjekte edilmiş safra kanalı (BD) ve portal damar (PV) sistemleri. (A) İki sisteme iki reçine enjekte edilen doğum sonrası 15 (P15) karaciğerinin sağ medial lob (RML) optik olarak temizlendi. Ölçek çubuğu 1 mm. (B) P15 RML'nin 3D işlemesi(A) portal damar vaskülatını beyaz ve safra sisteminde yeşil olarak gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. (C) İki sisteme iki reçine enjekte edilen yetişkin karaciğerinin RML'si optik olarak temizlendi. Ölçek çubuğu 1 mm. (D) Beyaz portal damar vaskülatını gösteren (C) ve yeşil biliyer sistemde gösterilen yetişkin RML'nin 3D işlemesi. H = hilar, P = periferik. Ölçek çubuğu 1 mm. Paneller A, B, D, Hankeova ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Çift reçine karaciğer enjeksiyonlarının yaygın zorlukları. (A) Görüntü, karın boşluğunun ilk açılması sırasında yanlışlıkla aşınmış bir karaciğeri tasvir eder ve reçine kesimden (mavi ok ucu) sızmaktadır. (B) Reçine sertleşmesi nedeniyle kötü enjekte edilmiş portal damar sistemi. Mavi ok uçları boş terminal dallarını, kırmızı köşeli ayraçlar ise büyük kabarcıkları etiketler. Ölçek çubuğu 1 mm. (C) Zayıf transkardiyal perfüzyon nedeniyle zayıf enjekte edilen portal damar sistemi. Mavi ok uçları, terminal dallarında görülebilen kanı etiketler. Ölçek çubuğu 1 mm. (D) İzole reçine topları ile kendini gösteren aşırı doldurulmuş safra sistemi. Sol paneller optik olarak temizlenmiş karaciğeri, sağ paneller ise 3D mikroCT işlenmiş görüntüyü gösterir. Mavi noktalı anahatlar yakınlaştırma bölgelerini tasvir eder. Siyah ok uçları, mikroCT taramasından sonra optik temizleme sırasında hasar gören karaciğerin bir kısmını etiketler. Ölçek çubuğu 1 mm. (E) Reçine enjeksiyonu sırasında yüksek basınç portal damarın yırtılmasına neden olabilir (bu paneldeki hayvan, mavi ok uçları ile işaretlenmiş bir Jag1H268Q mutasyonu taşır). Ölçek çubuğu 1 mm. (F) Portal damar enjeksiyonu sırasında reçinedeki kabarcıklar (mavi ok uçları) ve (G) safra sistemi enjeksiyonu (mavi ok ucu), ölçek çubuğu 1 mm. (H) Kabarcıkların mikroKT taraması (mavi ok ucu), kötü doldurulmuş terminal dalları (kırmızı braketler) ve reçine sızıntısı (sarı ok ucu), ölçek çubuğu 1 mm . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Diferansiyel reçine kontrastı. (A) Yeni açılmış sarı reçine, reçine enjekte edilen portal damarı (gri) ve safra kanallarını (beyaz) ayırt etmek için yeterli kontrast oluşturur. (B) Sarı reçinenin üç ay saklanması, reçinenin heterojen opaklığa (gri-beyaz portal damar, mavi ok ucu) neden olmasına neden olur. (C) Uzun süreli depolama (>6 ay) sarı reçine portal damar (gri) ve safra kanalları (gri) arasındaki kontrastı azaltır. Ölçek çubuğu 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Örnek hazırlamadan CT cihazının parametrelerine kadar çeşitli kritik adımlar KANAL başarısını belirler. En iyi sonuçları elde etmek için, 3D veri, görüntü ve film elde etmek için otomatik eşikleme ile basit dijital işlemeye izin vermek için iyi kontrastlı, iyi enjekte edilmiş ve kabarcıksız reçine kullanılmalıdır. Eğitim ve bu protokole uyulurken enjeksiyonların %90'ı başarılıdır ve tekrarlanabilir verilerle sonuçlanır. Enjekte edilen iki sistem arasında en iyi kontrastı elde etmek için taze sarı reçine kullanmak önemlidir. Sarı reçine çok güçlü bir radyopaklığa sahipken, mavi reçine tespit edilemeyen radyopaklığa sahiptir. En iyi sonuçlar, yeni bir sarı reçine şişesi açıldıktan sonraki ilk üç ay içinde elde edilir. Zamanla, reçine çökeltir ve daha uzun depolamadan sonra (>6 ay), sarı ve yeşil reçineler artık CT taramalarında ayırt edilemez. Kontrastı zayıf görüntüler, iki sistemin kapsamlı ve zaman alıcı manuel izleme ve segmentasyonunu gerektirir. Daha sonra, iyi gerilmiş boru, yetişkin farelerin ortak safra kanalına ve doğum sonrası farelerin ortak safra kanalına ve portal damarına sığmak için vazgeçilmezdir. Enjeksiyonun giriş noktası özenle oluşturulmalıdır. Ortak safra kanalı enine olarak kesilirse, borunun başarılı bir şekilde girmesini önleyerek çevredeki dokudan kopması muhtemeldir. Bu adım, özellikle ortak safra kanalının çevre dokusundan ayrılmışsa geri çekip "kıvrıldığı" doğum sonrası fareler için hassastır ve borunun yerleştirilmesini son derece zorlaştırır. Ortak safra yolu girişi ve enjeksiyonu biraz pratik gerektirebilir. Boruyu reçine ile ve enjeksiyon boyunca hazırlarken, kabarcıklar CT görüntülerinde negatif alan yaratacağından ve zaman alıcı manuel düzeltme gerektireceğinden kabarcık oluşumundan kaçının. Enjeksiyon işlemi sırasında ve sonrasında ıslanmış pamuklu çubukla yüzeyi üzerinden yuvarlanarak karaciğere hafifçe masaj yapmak önemlidir, çünkü bu reçine yayılmasını bile kolaylaştırır. Enjeksiyonun tamamlanmasından ve borunun çıkarılmasından sonra, ipek dikiş düğümü hızlı ve dikkatli bir şekilde sıkılmalıdır, böylece reçine tamamen polimerize olmadan önce karaciğerden akmaz. Başarılı mikroCT görüntüleme için, numune agarose ile düzgün bir şekilde sabitlenmeli ve BT verilerindeki hareket yapıtlarını ortadan kaldırmak için termal olarak uyarlanmalıdır. Alım ayarları, ince yapıları çözmek için yeterli bir uzamsal çözünürlüğe ulaşmak için optimize edilmesi gereken önemli öneme de sahiptir.
Genç farelerde enjeksiyon elde etmek için enjeksiyon prosedüründe teknik değişiklikler yapılabilir. Şu anda, genç fare karaciğerlerinin reçine dökümü, PE10'un piyasada bulunan en küçük boru olmasıyla yeterince ince boruların mevcudiyeti ile sınırlıdır. Tanimizu ve arkadaşları, cam kılcal damarlar kullanarak embriyonik gün 17 (E17) ortak safra kanalına karbon mürekkedeyi başarıyla enjekte etti11. Bu nedenle reçinenin cam kılcal damarlar aracılığıyla teslim edilip edilemeyeceği konusunda gelecekteki testler ilgi çekici olacaktır. DUCT ayrıca akciğerlerin hava yolları ve pulmoner arter vaskülatürü gibi diğer tübüler sistemleri enjekte etmek için uyarlandı9. Çift reçine enjeksiyonu, piyasada bulunan diğer reçinelerle kullanılmak üzere de değiştirilebilir veya bu protokol karbon mürekkepli enjeksiyonlar için kullanılabilir.
DUCT boru hattının ana sınırlayıcı faktörlerinden biri reçine viskozitesidir. DUCT sadece 5 μm çapındaki borulu yapıların reçine dökümü için kullanılabilir. Bu veri kümesinde, reçine en küçük çapı 5 μm9 olan tüplere nüfuz edebilir. Bu boyut sınırlaması ince kanallar ve küçük kılcal damarların analizini önler. DUCT boru hattını daha küçük kalibreli kaplara daha da ilerletmek için, piyasada bulunan diğer reçineler test edilmelidir veya yeni düşük viskoziteli radyopak ajanların geliştirilmesi lümen penetrasyonunu artırabilir.
Hankeova ve ark.9'da, DUCT yaygın olarak kullanılan diğer iki teknikle karşılaştırıldı, çift karbonlu mürekkep enjeksiyonları ve ardından doku temizleme ve standart fotoğrafçılık ve iDISCO + alfa-pürüzsüz kas hücresi aktin ve safra kanalları ile kan damarlarının lekelenmesi ile sitokeratin 7, ardından 3D görüntüleme9. DUCT, ikili analiz (yüksek karaciğer otoflüoresansı nedeniyle iDISCO+ için zorlayıcı olan), 3D görüntüleme ve nicelik (karbon mürekkep enjeksiyonu ile mümkün değildir) ve lümenizasyon (DUCT iç lümen mimarisi ve sistem perfüzyonu için veri sağlar) açısından diğer iki yöntemi geride bıraktı. Yukarıda belirtildiği gibi, DUCT'nin ana sınırlaması, hem karbon mürekkep enjeksiyonunun hem de iDISCO+'nın daha iyi performans gösterdiği bir parametre olan enjekte edilebilen ve analiz edilebilen minimum lümen boyutudur (5 μm sınırı). DUCT, enjekte edilen her sistemin ayrı ayrı analizini sağladığı ve ayrıca iki sistem arasındaki mimari ilişkiyi incelemek için çift 3D incelemeyi kolaylaştırdığı için tek sistemli reçine dökümünden daha üstündür3,5,6.
DUCT, herhangi iki borulu ağı 3D olarak incelemek için uygulanabilir. İlke kanıtı olarak, karaciğer safra ve portal damar sistemlerini ve akciğerdeki pulmoner arter vaskülatını ve hava yollarını görselleştirmek için DUCT kullanıldı9. İntrahepatik safra kanalları portal damara bitişik olarak gelişir ve portal damar, safra ağacının büyümesini ve farklılaştırılmasını düzenleyen yapısal bir şablon ve sinyal merkezi sağlar12. Hankeova ve ark.9'da DUCT, insan pediatrik hastalığı Alagille sendromu için bir fare modelinde safra rejenerasyonunu araştırdı. DUCT, safra sisteminin vahşi tip benzeri bir hacim elde etmek için kullandığı daha önce bildirilmemiş mimari mekanizmaları ortaya çıkardı9. Alagille sendromu fareleri iki farklı strateji kullandı: (1) karaciğerin hilar ve orta bölgelerinde, safra sistemi dallanmayı artırdı ve (2) karaciğer çevresinde, de novo tarafından üretilen safra kanalları oldukça işkenceliydi. Bu iki faktör, anormal mimariye rağmen, normale yakın bir safra sistemi hacmi sağlamak için bir araya gelir. Ayrıca, DUCT, portal damar dallanma ve safra kanallarından bağımsız olarak meydana gelen anormal safra kanalı dallanma tespit etti ve iki portal damarı arasında köprüler oluşturdu9. Bu fenotiplerin tek reçine dökümünde tespit edilmesi imkansızdır ve 2D histolojik bölümlerde safra kanalı çoğalması olarak yanlış yorumlanabilir. DUCT böylece tüm organ veya lob düzeyindeki iki borulu ağın 3D mimarisini nitel ve derinlemesine nicel analiz olasılığı ile açıklayan veriler sağlar. DUCT, farklı hayvan modellerinde doğum sonrası karaciğer gelişimi ve karaciğer rejenerasyon analizleri için yeni bir standart olabilir.
Disclosures
ERA laboratuvarındaki ayrı bir proje ModeRNA tarafından finanse edilir. ModeRNA'nın burada açıklanan projede/protokolde hiçbir rolü yoktu.
Acknowledgments
Kari Huppert ve Stacey Huppert'a safra yolu kanülasyonu ve laboratuvar misafirperverliği konusundaki uzmanlıkları ve yardımları için teşekkür ederiz. Nadja Schultz ve Charlotte L. Mattsson'a da ortak safra yolu kanülasyonuna yardımları için teşekkür ederiz.
Aşağıdaki Hibe Kuruluşlarına destekleri için teşekkür ederiz:
ERA Lab'de çalışmak için: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (İsveç Vakıfları Başlangıç Hibesi), Avrupa Karaciğer Araştırmaları Derneği (Daniel Alagille Ödülü), İsveç Kalp-Akciğer Vakfı (20170723) ve Vetenskapsrådet (2019-01350).
JK Lab'deki çalışmalar için: MEYS CR (LM2018110) tarafından desteklenen CzechNanoLab Araştırma Altyapısını kabul ediyoruz. Hibe FSI-S-20-6353 desteği sayesinde J.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
