Summary

Fabricação microfluida de microcápsulas core-shell carregando esferoides de células-tronco pluripotentes humanas

Published: October 13, 2021
doi:

Summary

Este artigo descreve o encapsulamento de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando um dispositivo de foco de fluxo coaxial. Demonstramos que essa tecnologia de encapsulamento microfluido permite a formação eficiente de esferoides hPSC.

Abstract

Culturas tridimensionais (3D) ou esferoides de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferecem os benefícios de melhores resultados de diferenciação e escalabilidade. Neste artigo, descrevemos uma estratégia para a formação robusta e reprodutível de esferoides hPSC onde um dispositivo de foco de fluxo coaxial é utilizado para prender hPSCs dentro de microcápsulas de conchas centrais. A solução central continha suspensão celular única de hPSCs e foi feita viscosa pela incorporação de poli de alto peso molecular (etileno glicol) (PEG) e mídia gradiente de densidade. O fluxo de conchas era composto por PEG-4 arm-maleimide ou PEG-4-Mal e fluiu ao lado do fluxo central em direção a duas junções de óleo consecutivas. A formação de gotículas ocorreu na primeira junção de óleo com a solução shell envolvendo-se em torno do núcleo. A interligação química da casca ocorreu na segunda junção de óleo introduzindo um crosslinker di-thiol (1,4-dithiothreitol ou DTT) nessas gotículas. O crosslinker reage com grupos funcionais de maleimiide via química de clique, resultando na formação de uma concha de hidrogel ao redor das microcápsulas. Nossa tecnologia de encapsulamento produziu cápsulas de 400 μm de diâmetro a uma taxa de 10 cápsulas por segundo. As cápsulas resultantes tinham uma concha de hidrogel e um núcleo aquoso que permitia que células únicas se reunissem rapidamente em agregados e formassem esferoides. O processo de encapsulamento não afetou negativamente a viabilidade dos hPSCs, com viabilidade >95% observada 3 dias após o encapsulamento. Para comparação, os hPSCs encapsulados em micropartículas de gel sólido (sem núcleo aquoso) não formavam esferoides e tinham <50% de viabilidade 3 dias após o encapsulamento. A formação esferoide de hPSCs dentro de microcápsulas de conchas núcleo ocorreu dentro de 48 h após o encapsulamento, com o diâmetro esferoide sendo uma função da densidade de inoculação celular. No geral, a tecnologia de encapsulamento microfluido descrita neste protocolo foi adequada para encapsulamento de hPSCs e formação de esferoides.

Introduction

Há um interesse considerável nas culturas 3D das células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação proporcionada por esse formato de cultura 1,2,3. hPSCs são tipicamente formados em esferoides ou outros formatos de cultura 3D por meio de bioreatores, microwells, hidrogéis e andaimes poliméricos 4,5,6. Encapsulamento oferece outro meio para organizar hPSCs únicos em esferoides. Uma vez encapsulados spheroids hPSC podem ser tratados com facilidade e transferidos para placas de microtiter para diferenciação, modelagem de doenças ou experimentos de teste de drogas. Encostendo hPSCs em uma camada de hidrogel também protege as células contra danos à tesoura e permite cultivar esferoides em um bioreator a altas taxas de agitação7.

Nossa metodologia de encapsulamento de células-tronco evoluiu ao longo do tempo. Primeiro, focamos em micropartículas de hidrogel sólido e demonstramos o sucesso do encapsulamento e cultivo de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs)8. No entanto, observou-se que as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) tinham baixa viabilidade quando encapsuladas em tais micropartículas de hidrogel, presumivelmente devido à maior necessidade dessas células de restabelecer contatos celulares após o encapsulamento. Argumentamos que a microcápsula heterogênea, possuindo um núcleo aquoso, pode ser mais adequada para o encapsulamento de células que dependem do rápido restaneamento de contatos celulares. O conceito de fluxo coaxial com foco de dispositivo microfluido para fazer microcápsulas de conchas de núcleo/hidrogel aquosos foi adaptado a partir de He et al.9, mas em vez de alginato empregado na abordagem original, um hidrogel à base de PEG foi incorporado à concha. Primeiro demonstramos encapsulamento bem sucedido e formação esferoide de hepatócito primário em microcápsulas de conchas núcleo10 e mais recentemente descreveu o encapsulamento das células hES e iPS7. Conforme descrito na Figura 1A, as cápsulas são fabricadas em um dispositivo de focalizar o fluxo onde os fluxos de fluxo da concha e do núcleo transitam de fluxo lateral para o coaxial antes da ejeção para a fase do óleo. O fluxo do núcleo contém células e aditivos que aumentam a viscosidade da solução (PEG MW 35kD não reativo e iodixanol – nome comercial OptiPrep), enquanto o fluxo de conchas contém moléculas reativas (PEG-4-Mal). O fluxo de fluxo coaxial contínuo é discretizado em gotículas que retêm a arquitetura de conchas de núcleo. A estrutura do núcleo-shell é permanente pela exposição ao di-thiol crosslinker (DTT), que reage com PEG-4-Mal via química de clique e resulta na formação de uma fina (~10 μm) pele ou concha de hidrogel. Depois que a emulsão é quebrada e as cápsulas são transferidas para uma fase aquosa, moléculas de PEG se difundem do núcleo e são substituídas por moléculas de água. Isso resulta em microcápsulas aquosas do núcleo e da concha de hidrogel.

Fornecidos abaixo estão instruções passo a passo sobre como fazer dispositivos microfluidos, como preparar células e como realizar o encapsulamento de hPSCs.

Protocol

1. Fabricação de dispositivos Faça os projetos para o dispositivo de microencapsulação e dispositivo de dissociação usando o software CAD10,11. Gire as três camadas de fotoresist SU-8 sequencialmente em um wafer de silício (Figura 2A) para alcançar estruturas com as alturas desejadas: 60, 100 e 150 μm.NOTA: O processo para os moldes superior e inferior é idêntico. Gire um wafer de silício…

Representative Results

Seguindo o protocolo acima mencionado, o leitor poderá fabricar dispositivos microfluidos e produzir microcápsulas portadoras de células. A Figura 3A mostra exemplos de microcápsulas ótimas e subótimas fabricadas usando geração de gotículas microfluídicas. Diferentes formulações de PEG-4-Mal resultaram em cápsulas de morfologias variadas – cápsulas enrugadas estavam associadas à má gelação, baixa integridade mecânica e não resistivam ao cultivo em um bioreator mexido. Cá…

Discussion

O processo de encapsulamento descrito aqui resulta na formação reprodutível de esferoides hPSC. O formato de microcápsula facilita a distribuição de esferoides em poços de uma placa de microtítiter para experimentos que visam melhorar/otimizar protocolos de diferenciação ou testar terapias. Esferoides de células-tronco encapsuladas também podem ser usados em culturas de suspensões onde a concha de hidrogel protege as células contra danos induzidos por tesoura7.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado em parte pelas bolsas do Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).

Materials

0.22 µm Syringe Filters Genesee Scientific 25-244
1 ml syringe luer-lock tip BD 309628
1x DPBS Corning 23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa Laysan Inc. 164-68
5 ml syringe luer-lock tip BD 309646
6-WELL NON-TREATED PLATE USA Scientific CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack Aquapel Glass Treatment 47100
CAD software Autodesk AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size cardinal 335583
Chlorotrimethylsilane Aldrich 386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter Life technology A27974
Digital hot plate Dataplate
Digital vortex mixer Fisher Scientific 215370
Distilled water Gibco 15230-162
Dithiotheritol (DTT) Sigma D0632-10G
DMEM/F12 media gibco 11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher scientific 14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge live 13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope Olympus Olympus IX83
Laurell Spin Coaters Laurell Technologies WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit Fisher L3224
Magic tape Staples 483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) Scientific Commodities, Inc BB31695-PE/2
Micro stir bar Daigger Scientific EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps Fisher scientific XX6200006P
Mineral oil Sigma M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium STEMCELL TECHNOLOGY 85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge CML supply 901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge CML supply 901-15-050
OptiPrep STEMCELL TECHNOLOGY 7820
Oven Thermo Scientific HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) Gemini 400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent Sarstedt, Inc. 82.1184.500
Plasma Cleaning System Yield Engineering System, Inc. YES-G500
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa Sigma 94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G BD 305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride SELLECK CHEM S1049-10mg
Silicon wafer 100mm University Wafer 452
Slide glass (75mm ´ 25mm) CardinalHealth M6146
Span 80 Sigma S6760-250ML
SpeedMixer Thinky ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) Costar 8160
SU-8 2025 Kayaku Advanced Materials Y111069 0500L1GL
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades fisher scientific 22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow Corning 2065622
Syringe pump New Era Pump System, Inc NE-4000
Triethanolamine Sigma-aldrich T58300-25G
TrypLE Express Gibco 12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) Cole-Parmer 06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) Cole-Parmer 06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D Fisher Scientific CPN-962-152R
Vacuum desiccator Bel-Art F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x ZEISS 435421-0000-000
μPG 101 laser writer Heidelberg Instruments HI 1128

References

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Cite This Article
Gwon, K., Hong, H. J., Gonzalez-Suarez, A. M., Stybayeva, G., Revzin, A. Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids. J. Vis. Exp. (176), e62944, doi:10.3791/62944 (2021).

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