Este artigo descreve o encapsulamento de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando um dispositivo de foco de fluxo coaxial. Demonstramos que essa tecnologia de encapsulamento microfluido permite a formação eficiente de esferoides hPSC.
Culturas tridimensionais (3D) ou esferoides de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferecem os benefícios de melhores resultados de diferenciação e escalabilidade. Neste artigo, descrevemos uma estratégia para a formação robusta e reprodutível de esferoides hPSC onde um dispositivo de foco de fluxo coaxial é utilizado para prender hPSCs dentro de microcápsulas de conchas centrais. A solução central continha suspensão celular única de hPSCs e foi feita viscosa pela incorporação de poli de alto peso molecular (etileno glicol) (PEG) e mídia gradiente de densidade. O fluxo de conchas era composto por PEG-4 arm-maleimide ou PEG-4-Mal e fluiu ao lado do fluxo central em direção a duas junções de óleo consecutivas. A formação de gotículas ocorreu na primeira junção de óleo com a solução shell envolvendo-se em torno do núcleo. A interligação química da casca ocorreu na segunda junção de óleo introduzindo um crosslinker di-thiol (1,4-dithiothreitol ou DTT) nessas gotículas. O crosslinker reage com grupos funcionais de maleimiide via química de clique, resultando na formação de uma concha de hidrogel ao redor das microcápsulas. Nossa tecnologia de encapsulamento produziu cápsulas de 400 μm de diâmetro a uma taxa de 10 cápsulas por segundo. As cápsulas resultantes tinham uma concha de hidrogel e um núcleo aquoso que permitia que células únicas se reunissem rapidamente em agregados e formassem esferoides. O processo de encapsulamento não afetou negativamente a viabilidade dos hPSCs, com viabilidade >95% observada 3 dias após o encapsulamento. Para comparação, os hPSCs encapsulados em micropartículas de gel sólido (sem núcleo aquoso) não formavam esferoides e tinham <50% de viabilidade 3 dias após o encapsulamento. A formação esferoide de hPSCs dentro de microcápsulas de conchas núcleo ocorreu dentro de 48 h após o encapsulamento, com o diâmetro esferoide sendo uma função da densidade de inoculação celular. No geral, a tecnologia de encapsulamento microfluido descrita neste protocolo foi adequada para encapsulamento de hPSCs e formação de esferoides.
Há um interesse considerável nas culturas 3D das células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação proporcionada por esse formato de cultura 1,2,3. hPSCs são tipicamente formados em esferoides ou outros formatos de cultura 3D por meio de bioreatores, microwells, hidrogéis e andaimes poliméricos 4,5,6. Encapsulamento oferece outro meio para organizar hPSCs únicos em esferoides. Uma vez encapsulados spheroids hPSC podem ser tratados com facilidade e transferidos para placas de microtiter para diferenciação, modelagem de doenças ou experimentos de teste de drogas. Encostendo hPSCs em uma camada de hidrogel também protege as células contra danos à tesoura e permite cultivar esferoides em um bioreator a altas taxas de agitação7.
Nossa metodologia de encapsulamento de células-tronco evoluiu ao longo do tempo. Primeiro, focamos em micropartículas de hidrogel sólido e demonstramos o sucesso do encapsulamento e cultivo de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs)8. No entanto, observou-se que as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) tinham baixa viabilidade quando encapsuladas em tais micropartículas de hidrogel, presumivelmente devido à maior necessidade dessas células de restabelecer contatos celulares após o encapsulamento. Argumentamos que a microcápsula heterogênea, possuindo um núcleo aquoso, pode ser mais adequada para o encapsulamento de células que dependem do rápido restaneamento de contatos celulares. O conceito de fluxo coaxial com foco de dispositivo microfluido para fazer microcápsulas de conchas de núcleo/hidrogel aquosos foi adaptado a partir de He et al.9, mas em vez de alginato empregado na abordagem original, um hidrogel à base de PEG foi incorporado à concha. Primeiro demonstramos encapsulamento bem sucedido e formação esferoide de hepatócito primário em microcápsulas de conchas núcleo10 e mais recentemente descreveu o encapsulamento das células hES e iPS7. Conforme descrito na Figura 1A, as cápsulas são fabricadas em um dispositivo de focalizar o fluxo onde os fluxos de fluxo da concha e do núcleo transitam de fluxo lateral para o coaxial antes da ejeção para a fase do óleo. O fluxo do núcleo contém células e aditivos que aumentam a viscosidade da solução (PEG MW 35kD não reativo e iodixanol – nome comercial OptiPrep), enquanto o fluxo de conchas contém moléculas reativas (PEG-4-Mal). O fluxo de fluxo coaxial contínuo é discretizado em gotículas que retêm a arquitetura de conchas de núcleo. A estrutura do núcleo-shell é permanente pela exposição ao di-thiol crosslinker (DTT), que reage com PEG-4-Mal via química de clique e resulta na formação de uma fina (~10 μm) pele ou concha de hidrogel. Depois que a emulsão é quebrada e as cápsulas são transferidas para uma fase aquosa, moléculas de PEG se difundem do núcleo e são substituídas por moléculas de água. Isso resulta em microcápsulas aquosas do núcleo e da concha de hidrogel.
Fornecidos abaixo estão instruções passo a passo sobre como fazer dispositivos microfluidos, como preparar células e como realizar o encapsulamento de hPSCs.
O processo de encapsulamento descrito aqui resulta na formação reprodutível de esferoides hPSC. O formato de microcápsula facilita a distribuição de esferoides em poços de uma placa de microtítiter para experimentos que visam melhorar/otimizar protocolos de diferenciação ou testar terapias. Esferoides de células-tronco encapsuladas também podem ser usados em culturas de suspensões onde a concha de hidrogel protege as células contra danos induzidos por tesoura7.
<p class="jove_con…The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado em parte pelas bolsas do Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).
0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
1x DPBS | Corning | 23220003 | |
4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
Digital hot plate | Dataplate | ||
Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
Magic tape | Staples | 483535 | |
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |