Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации In Situ

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62945
Automatic Translation
1, 1
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Summary

Мультиплексная гибридизация in situ (ISH) использовалась для одновременной визуализации транскриптов для двух рецепторов, связанных с G-белком, и одного фактора транскрипции во всем вагусном ганглионном комплексе взрослой мыши. Этот протокол может быть использован для создания точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.

Abstract

В этом исследовании описывается протокол мультиплексной гибридизации in situ (ISH) яремно-узловатых ганглиев мышей с особым акцентом на обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Формалин-фиксированные яремно-узловатые ганглии обрабатывали с помощью технологии RNAscope для одновременного обнаружения экспрессии двух репрезентативных GPCR (холецистокининовых и грелиновых рецепторов) в сочетании с одним маркерным геном либо узелка (парно-подобный гомеобокс 2b, Phox2b), либо яремных афферентных нейронов (PR-домен цинкового белка пальца 12, Prdm12). Меченые ганглии были изображены с использованием конфокальной микроскопии для определения распределения и паттернов экспрессии вышеупомянутых транскриптов. Вкратце, было обнаружено, что афферентные нейроны Phox2b обильно экспрессируют рецептор холецистокинина (Cck1r), но не рецептор грелина (Ghsr). Было также обнаружено, что небольшое подмножество афферентных нейронов Prdm12 экспрессирует Ghsr и / или Cck1r. Обсуждаются потенциальные технические предостережения при проектировании, обработке и интерпретации мультиплексного ISH. Подход, описанный в этой статье, может помочь ученым в создании точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.

Introduction

Клеточные тела вагусных афферентов содержатся в яремных, петрозальных и узловыхганглиях 1,2,3. Их аксоны путешествуют вместе через несколько ветвей блуждающего нерва в краниоцервикальную, грудную и брюшную зоны4,5,6,7. Из своих висцеральных окончаний вагусные афференты могут реагировать на широкий спектр физиологических и вредных раздражителей8,9,10. Однако распределение сигнальных молекул и рецепторов, участвующих в вагусном зондировании, остается плохо охарактеризованным. Отчасти это связано с тем, что вагусные ганглии, несмотря на свои небольшие размеры, экспрессируют широкий спектр рецепторов, включая большое количество GPCR8,11,12,13. Кроме того, вагусные афферентные нейроны по своей природе неоднородны и имеют различные молекулярные профили14. Чтобы усложнить дело, яремные, петрозальные и узловые ганглии прикрепляются к мыши, образуя тем самым единую ганглионную массу. Наконец, у подмножества животных узелковый ганглий прикреплен к симпатическому верхнему шейному ганглию15.

В прошлом исследователи обращались к иммуногистохимии для изучения нейрохимического состава вагусных афферентных нейронов16,17,18. Хотя иммуногистохимия с использованием валидированных антител полезна, результаты иммуногистохимических исследований следует интерпретировать с осторожностью. Например, многочисленные усилия по выявлению специфических антител против GPCR потерпели неудачу19,20,21,22,23,24,25,что привело исследователей к выводу, что большинство антител против GPCR ненадежны. Чтобы обойти эти проблемы, количественная ПЦР (qPCR) широко используется для оценки экспрессии генов у ганглионной массы блуждающего блуждающего нерва26,27,28,29. Однако изучение экспрессии генов с помощью qPCR происходит за счет потери пространственной информации. В частности, невозможно предсказать, сколько клеток или какой тип (типы) клеток экспрессируют конкретный ген, представляющий интерес (например, узелковые или яремные клетки). Повторяющиеся проблемы также включают загрязнение соседними тканями и включение переменной длины блуждающего нерва, верхнего шейного отдела и яремных ганглиев во время рассечения15. В результате вышеуказанных трудностей споры окружают экспрессию и распределение нескольких GPCR в вагусных афферентных нейронах. Один особенно загадочный пример относится к рецептору грелина (Ghsr). В то время как некоторые исследования обнаружили широкую экспрессию этого рецептора в вагусных афферентных нейронах30,31,32,другие обнаружили, что мРНК Ghsr почти не обнаруживается в узловом ганглиях11,14. Поэтому детальное картирование мРНК Ghsr в ганглионной массе блуждающего нерва оправдано.

Гибридизация in situ (ISH) также использовалась для оценки паттернов экспрессии генов в вагусной ганглионной массе7,11,12,33,34,35. Поскольку методы на основе РНК остаются более надежными и специфичными, чем методы на основе антител в большинстве случаев36,37,исследования ISH оказались ценными для лучшего понимания нейрохимического кодирования вагусных афферентных нейронов. Тем не менее, традиционные техники ISH сами по себе не лишены предостережений. Радиоактивный ISH чувствителен, но генерирует фон и остается громоздким38. Нерадиоактивный ISH менее сложен, но именее чувствителен 38. Напротив, недавно разработанный метод RNAscope ISH является высокочувствительным и генерирует минимальный фон39. В текущем исследовании применялся мультиплексный флуоресцентный РНКАскоп для обнаружения GPCR в вагусных афферентных нейронах мыши. Мы сосредоточились на картировании распределения Ghsr и сравнили его распределение с распределением рецептора холецистокинина (Cck1r), другого GPCR, который, как известно, экспрессируется в узловом ганглии34. Наконец, два фактора транскрипции, пароподобный гомеобокс 2b (Phox2b) и PR-домен цинкового белка пальца 12 (Prdm12), были использованы в качестве селективных маркеров для узловых и яремных афферентных нейронов, соответственно14. Без визуализации Phox2b или Prdm12 было бы сложно с уверенностью идентифицировать яремные и узловатые афференты. Потенциальные технические подводные камни также обсуждаются на протяжении всей статьи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, использованные в этом исследовании, были самцами дикого типа на чистом фоне C57BL/6J. В общей сложности 4 мыши были использованы для мультиплексного ISH. Всем мышам было примерно 8 недель на момент жертвоприношения. Один самец мыши (примерно годовалый) также использовался для демонстрации эндогенной флуоресценции, связанной со старением. Животные содержались в вентилируемых клетках в барьерном помещении с доступом ad libitum к пище и воде. Комитет по институциональному уходу и использованию животных Юго-Западного медицинского центра UT рассмотрел и одобрил процедуры, описанные ниже. Подробности о реагентах и инструментах можно найти в Таблице материалов.

1. Сбор образцов

  1. В день жертвоприношения вводят мышам передозировку хлоралгидрата (500 мг/кг, т.п.). Перфьюзируйте глубоко обезболенных мышей транскардиально с помощью перистальтического насоса с 5 мл 1x фосфат-буферного физиологического раствора (PBS), за которым следует 50 мл 10% формалина при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается в вытяжном капюшоне, чтобы предотвратить вдыхание формалина.
  2. По мере того, как узелковые, петрозальные и яремные ганглии сливаются в единую ганглионную массу у мыши15,тщательно соберите всю вагусную ганглионную массу с каждой стороны (слева и справа) с помощью рассекающего прицела и тонких пружинных ножниц и щипцов (см. Таблицу материалов).
  3. При обезглавливании мыши парой больших ножниц (см. Таблицу материалов)избегайте раздавливания ствола мозга.
  4. Следуя подходу к рассечению, описанному ранее в крысе40,удаляют грудиногиоидные и омогиоидные мышцы, расположенные сбоку от трахеи, с помощьюнебольших щипцов (Таблица материалов), чтобыобнажить затылочную кость. Очистите всю область мышц, жировую ткань и соединительную ткань до тех пор, пока не будут видны сонная артерия, блуждающий нерв, подъязычный нерв и большое отверстие. Перережьте весь подъязычный нерв маленькими пружинными ножницами(Таблица материалов).
  5. Ищите узелковый ганглий в виде полупрозрачной массы, близкой к отверстию magnum15. Используя небольшие ножницы(Таблица материалов),аккуратно разбейте затылочную кость, чтобы еще больше обнажить яремный ганглий. Ищите черные меланоциты на поверхности югулара в качестве визуального ориентира.
  6. Разрежьте нервные соединения между вагусной ганглионной массой и извлеките всю ганглионную массу, осторожно потянув за периферический конец блуждающего нерва, одновременно разрезая яремный ганглий к стволу мозга небольшими пружинными ножницами(Таблица материалов).
  7. Максимально удалите соединительную ткань и жир, прилипший к блуждающему нерву и ганглионную массу.
  8. Поскольку легко потерять один ганглий во время переноса из одной трубки в другую, держите ~ 0,5 см блуждающего нерва, чтобы облегчить обработку и локализацию образцов.
  9. Поместите ганглии с помощью мелкодисперсных щипцов в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл и инкубируйте при 4 °C в формалине в течение 24 ч и с 30% сахарозой еще 24 ч.
  10. Расположите ганглии внутри небольшой капли (~4 мм Ø) среды оптимальной температуры резания (OCT) на куске алюминиевой фольги. Далее заморозьте образец на ложе сухого льда.
  11. Разрежьте образцы с помощью криостата при -20 °C на участки толщиной 14 мкм и соберите на стеклах микроскопа в виде 3 серий на расстоянии 42 мкм друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения секций близко к краям слайда. Чтобы сохранить реагенты, держите участки тканей как можно плотнее упакованными, но без перекрытия.
  12. Храните образцы в морозильной камере при температуре -80 °C до тех пор, пока это не понадобится для ISH в течение не менее 6 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рисунку 1 для поиска и устранения неисправностей для эндогенной флуоресценции.

2. Предварительная обработка и ISH

  1. Перед днем экспериментов автоклавная лабораторная посуда будет использоваться для ISH, включая окрашивание посуды и мытье буферных банок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как работа в условиях, свободных от RNase, не является критичной, носите перчатки в любое время. Держите бутылки с раствором для обеззараживания РНКазы(Таблица материалов)в пределах досягаемости на случай подозрения на загрязнение.
  2. В первый день доведите горки до комнатной температуры на скамейке, специально посвященной ISH. Промойте горки в 1x PBS и выпекайте их в течение 30 минут при 60 °C в духовке длявыпечки (Таблица материалов).
  3. Постфиксируйте слайды в 4% формалине в течение 15 мин при 4 °C.
  4. Доведите реагенты в мультиплексном наборе(Таблица материалов)до комнатной температуры.
  5. Обезвоживайте слайды в 50%, 70% и 100% этаноле в течение 5 мин каждый. Применяют растворH2O2 к образцам в течение 10 мин, а затем смывают в двойной дистиллированной воде (ddH2O).
  6. Обработайте образцы целевым реагентом извлечения в течение 5 мин, промойте в ddH2Oс последующим 100% этанолом и высушите на воздухе. Используя гидрофобную ручку, создайте барьер вокруг образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не наносите гидрофобный барьер слишком близко к участкам тканей.
  7. Применяют протеазу в течение 30 мин при 40 °C в гибридизационнойпечи (Таблица материалов).
  8. Тем временем перед использованием прогрейте зонды при температуре 40 °C и охладите их при комнатной температуре. Инкубируйте слайды с желаемой комбинацией целевых зондов (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; или Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) в течение 2 ч при 40 °C в гибридизационной печи.
  9. Инкубировать отрицательную контрольную ткань с дигидродипиколинатредуктазой (DapB) мишенью C1 в течение 2 ч при 40 °C в гибридизационной печи.
  10. Промойте слайды в буфере для стирки и храните на ночь в 5x физиологическом растворе цитрата натрия (SSC) при комнатной температуре. Для удобства разделите эксперимент на два дня. На следующий день промойте слайды с помощью промывочного буфера и инкубируйте их с помощью реагентов для усиления, перечисленных ниже (см. руководство пользователя в Таблице материалов).
  11. Применяют AMP1 (30 мин при 40 °C), AMP2 (30 мин при 40 °C) и AMP 3 (15 мин при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  12. Растворите каждый опаловый краситель(Таблица материалов)в диметилсульфоксиде и храните растворы при 4 °C до тех пор, пока это не понадобится.
  13. Для канала 1 инкубируют слайды с HRP-C1 (15 мин при 40 °C) и Opal 520 (зеленый цвет; разведение 1/1 500; 30 минут при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  14. Для канала 2 инкубируют слайды с HRP-C2 (15 мин при 40 °C) и Opal 570 (желтый цвет; разведение 1/1 500; в течение 30 мин при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  15. Для канала 3 инкубируют слайды с HRP-C3 (15 мин при 40 °C) и Opal 690 (дальний красный цвет; разведение 1/1 500; в течение 30 мин при 40 °C). Смойте в буфере для стирки между каждым шагом.
  16. Вымойте горки и подвергайте их воздействию 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 30 с.
  17. Сразу же нанесите монтажную среду на каждый слайд и поместите крышку на участок ткани.
  18. Держите ткани горизонтально в держателе слайда при температуре 4 °C до получения изображения.

3. Микроскопия и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Мультиплексные данные ISH могут быть визуализированы с помощью широкого спектра инструментов с соответствующими фильтрами. Однако предпочтительным методом визуализации является конфокальная микроскопия с 20x и 63x (масляными) объективами; обратитесь к обсуждению по причинам. Обратитесь к рисунку 2 для определения оптимального отношения сигнал/шум.

  1. Используйте конфокальный микроскоп, оснащенный лазерными линиями 488, 561 и 633 нм. Используйте следующие параметры сбора (см. таблицу 1):Opal 690 (HeNe 633 нм, дальность обнаружения 668-696 нм, мощность 2.0, коэффициент усиления 724); Opal 570 (DPSS лазер 561 нм, дальность обнаружения 579-627 нм, мощность < 15,0,
  2. Чтобы улучшить качество изображений, приобретайте с усреднением линии 4 и размером пикселя не менее 1024 x 1024.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше параметры приведены только в качестве примера, и рекомендуются модификации в зависимости от одного инструмента, увеличения (20x или 63x), уровней экспрессии и эндогенных уровней флуоресценции для любой данной ткани.
  3. Убедившись в параметрах получения, собирайте изображения, используя те же настройки. Приписывайте ложные цвета каждому каналу для облегчения визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, красный (Phox2b или Prdm12), голубой (Cck1r), желтый (Ghsr) и серый (DAPI).
  4. Выполняйте подсчет клеток с помощью цифровых изображений, идентифицируя контур РНКАскоп-положительных профилей с одним ядром, слегка окрашенным DAPI. Рассчитайте процент положительных профилей RNAscope, выражающих каждую расшифровку [Рисунок 3A-C].
  5. Чтобы повысить строгость и точность оценок, подсчитайте не менее 2000 профилей нейронов по крайней мере от 4 различных животных. Выполняйте подсчет с левого и правого ганглиями отдельно.
  6. Введите данные в круговую диаграмму с общим количеством подсчитанных профилей.
  7. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для получения изображений и сшивания 20-кратных изображений. Используйте ImageJ-Fiji и другое программное обеспечение для фото и дизайна для создания конечных пластин. Применяйте корректировки контраста и легкости равномерно ко всем изображениям.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В то время как RNAScope может применяться к животным любого возраста, пола или генетического фона, рекомендуется работать с молодыми людьми (<3 месяца). Это связано с тем, что флуоресцентные артефакты (например, липофусцин) являются общими находками в нейронах пожилых животных41. Формалин-фиксированные ганглии у старых мышей часто содержат удивительно интенсивную эндогенную флуоресценцию, которую можно легко принять за подлинное окрашивание(рисунок 1A,B). В любом случае перед обработкой целесообразно проверить уровни эндогенной флуоресценции в ткани.

Важно определить оптимальные параметры сбора и отношение сигнал/шум для каждого лазера и увеличения с помощью участков из отрицательной управляющей ткани, инкубированной с отрицательным зондом DapB, как показано на рисунке 2A,B. Поскольку DapB является прокариотическим геном, сигналы РНКАскопа должны полностью отсутствовать в отрицательной контрольной ткани. Помимо случайных обломков и кристаллов, незначительная флуоресценция видна на изображениях с отрицательных контрольных тканей, при условии, что параметры сбора используются соответствующим образом. Однако выше определенной мощности и усиления лазера начинают появляться нежелательные фоновые и случайные флуоресцентные точки(рисунок 2C). Еще одна цель минимизации мощности лазера — избежать насыщения пикселей и фотоотбеливания. При работе с вышеуказанными параметрами серьезных проблем флуоресцентного отбеливания не наблюдалось. Если такой вопрос может возникнуть, целесообразно покрыть ткань монтажной средой для флуоресцентно меченых клеток(Таблица материалов)в дополнение к максимальному снижению мощности лазера (см. рекомендуемые параметры в таблице 1).

Методика РНКАскопа применялась для обнаружения 3 генов в тканевых участках вагусной ганглионной массы мыши(Рисунок 3 и Рисунок 4). Один профиль считался положительным для Ghsr и/или Cck1r, когда желтые и/или голубые точки, соответственно, были замечены накладывающимися на один профиль, заполненный красными точками(рисунок 3A-C). Пример, приведенный на рисунке 3, показывает множество профилей, содержащих транскрипты Phox2b и Cck1r(рисунок 3D). Phox2b использовался для идентификации узловых афферентных нейронов. Обильные сигналы Phox2b накапливаются в нейронах узлового ганглия(Рисунок 4A,B). Сигналы Cck1r были обнаружены примерно в 52% клеток Phox2b(рисунок 4C). Следует отметить, что уровни экспрессии для Cck1r сильно варьировались между клетками, начиная от умеренных (~ 20 точек на профиль) до интенсивной маркировки (заполненной цитоплазмой). Напротив, сигналы для Ghsr были чрезвычайно редкими в узловом ганглии(рисунок 4A,B). Только приблизительно 0,65% Phox2b-положительных клеток также были положительными для транскриптов Ghsr(рисунок 4C). Ghsr-экспрессирующие клетки часто совместно экспрессируют Cck1r. Визуальный осмотр тканей не выявил явных различий между левыми и правыми ганглиями. Сигналы ISH практически отсутствовали в областях, лишенных нейронов (например, адреналин и волоконный тракт).

Prdm12 использовался для идентификации яремных афферентных нейронов. Как и ожидалось, экспрессия Prdm12 была высокообогащена в нейронах яремного ганглия и нескольких нейронах, проникающих в ростральную часть узловогоганглия (Рисунок 5A-C). Интересно, что сигналы Cck1r были обнаружены в подмножестве ячеек Prdm12(рисунок 5B,C). Чуть менее 9% Prdm12-положительных нейронов также экспрессировали Cck1r(рисунок 5D). Тем не менее, яремный ганглий содержит только клетки с умеренным уровнем Cck1r (<20 точек на клетку), а не сильно меченые Cck1r-положительные клетки, обычно встречающиеся в узловом ганглии. Ghsr-положительные клетки были значительно более распространены в югуларе, чем в узелке(рисунок 5C). Приблизительно 3% клеток Prdm12 также были Ghsr-положительными(рисунок 5D). Интересно, что 1% всех Prdm12 совместно экспрессировал как Ghsr, так и Cck1r. Уровни экспрессии для Ghsr всегда были умеренными (<20 точек на клетку). Никаких сигналов ISH не было видно в областях, лишенных нейронов.

Figure 1
Рисунок 1:Устранение неполадок эндогенной флуоресценции. (A, B) Эндогенная флуоресценция в узелковом/яремном ганглии одной стареющей мыши (~1 год). Цифровые изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии с использованием лазерных линий, обозначенных цветами и параметрами сбора, идентичными тем, которые используются для мультиплексного ISH с более молодыми мышами (см. Далее). Важно отметить, что фиксированная ткань не обрабатывалась каким-либо иным образом, кроме как хранилась при -80 °C и подвергалась воздействию DAPI. Как показано в А,значительный уровень нежелательной флуоресценции наблюдается в нейронных и ненейрональных клетках, особенно при воздействии лазера 488 нм (зеленый). Это распространенное открытие в гистологии, которое требует оценки эндогенной флуоресценции до гистологического анализа. (B)При более высоком увеличении флуоресценция напоминала пигменты липофусцина, которые часто накапливаются в стареющих клетках и могут быть легко ошибочно приняты за подлинную иммунореактивность и / или сигналы RNAScope. Шкала стержней = 158 мкм(A)и 15 мкм(B). (B). Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; NG = узелковый ганглий; ISH = гибридизация in situ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Определение оптимального отношения сигнал/шум. (A, B) Отрицательный контроль, состоящий из обнаружения RNAScope для прокариотического гена DapB. Обратите внимание, что эндогенная флуоресценция в узловом ганглии молодой взрослой мыши минимальна, и что инкубация с зондом DapB не привела к сигналам. Параметры сбора были идентичны тем, которые использовались для мультиплексного ISH. Это показывает, что сама процедура RNAScope не дает какого-либо значимого фона, если параметры приобретения выбраны тщательно. (C) Цифровые изображения той же ткани, полученные при увеличении мощности лазера и усиления с помощью лазера 488 нм. Обратите внимание, как некоторые нечеткие зеленые фоны и случайные точки возникают над определенной мощностью и усилением лазера. Таким образом, важно тщательно выбирать параметры сбора для каждого лазера исходя из количества неспецифической флуоресценции, полученной в отрицательной контрольной ткани. Шкала стержней = 158 мкм(A)и 15 мкм(B, C). Сокращения: DapB = дигидродипиколинатредуктаза; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; NG = узелковый ганглий; ISH = гибридизация in situ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Идентификация и подсчет положительных профилей. (A) Репрезентативное цифровое изображение профилей, меченных Phox2b (красный) в ростральной части узлового ганглия. В этом примере было идентифицировано в общей сложности 18 клеточных профилей (помеченных как от 1 до 18). Обратите внимание, что окрашивание DAPI дополнительно помогает в локализации нейронов, которые обычно отображают большое и круглое ядро со светлым окрашиванием DAPI. Напротив, ядра ненейрональных клеток ярко помечены, удлинены и меньше по размеру. В целом, сигналы RNAScope соответствовали распределению и форме нейронных, а не ненейрональных клеток. (B)Показаны два меченых Ghsr-положительных нейрона (желтый) (профили 19 и 20). Сигналы GHSR были редкими и их было трудно увидеть. Поэтому легкость и насыщенность желтых сигналов были выборочно и равномерно усилены в фотопрограммном обеспечении. (C)В общей сложности идентифицировано девять профилей, меченных Cck1r (голубой) (помеченных как 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 и 19). Обратите внимание, как интенсивность сигналов Cck1r сильно варьировалась между клетками. Например, профиль 11 содержит только несколько положительных сигналов, тогда как профиль 7 почти заполнен сигналами Cck1r. (D) Объединенный вид всех каналов позволил идентифицировать паттерны колокализации. Многие Phox2b-положительные профили также совместно экспрессировали Cck1r (например, профили 2, 8 и 14), о чем свидетельствуют красные и голубые точки RNAScope в пределах одного клеточного профиля. Напротив, Phox2b-положительные профили не выражали транскрипты Ghsr (профили 19 и 20). Однако одна Ghsr-положительная клетка также экспрессировала низкие уровни Cck1r (профиль 19). Два больших ядра, окрашенных DAPI, помеченных белой звездочкой, предположительно соответствуют расположению Phox2b-отрицательных афферентных нейронов, лишенных сигналов RNAScope. В репрезентативных результатах, описанных ниже, по меньшей мере 2000 нейронных профилей были подсчитаны из левых и правых ганглионных масс от 4 разных животных. Шкала стержней = 24 мкм. Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; Phox2b = парообразный гомеобокс 2b; Ghsr = рецептор грелина; Cck1r = холецистокининовый рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Репрезентативные результаты мультиплекса ISH в узловых афферентных нейронах. Цифровые изображения репрезентативной вагусной ганглионной массы, помеченной мультиплексным РНКАскопом для Phox2b, Cck1r и Ghsr. Изображения были получены с 20x(A)и 63x(B, C)объективами конфокального микроскопа (Zeiss LSM880). В A,20× несколько изображений были сшиты вместе с помощью программного обеспечения Zen и представлены либо как несмешанные каналы, либо объединены. Сигналы Phox2b (красный) специфически накапливаются в афферентных нейронах, расположенных в узловом ганглии. Как и ожидалось, сигналы Cck1r (голубой) интенсивно маркировали многие, но не все, нейроны в узловом ганглии. При низком увеличении клетки, экспрессирующие низкие уровни Cck1r или любые клетки с сигналами Ghsr (желтый), не могли легко наблюдаться. DAPI (серый) помог визуализировать ткань и идентифицировать вагусные афферентные нейроны с большим и слегка окрашенным ядром. Белая вставка в объединенном изображении соответствует расположению изображения, включенного ниже. (B) При большом увеличении видны Phox2b-положительные профили (красный). Многие клетки также экспрессировали Cck1r, но на различных уровнях, от умеренных до очень высоких. Профиль «1» является примером отрицательной ячейки Phox2b для Cck1r и Ghsr. Профили «2» и «3» представляют собой клетки Phox2b с высокими и умеренными сигналами Cck1r соответственно. Умеренные сигналы для Ghsr (желтый) иногда наблюдались в ростральном узловом ганглии, но почти всегда в клетках, отрицательных для Phox2b, как показано с профилем «4». Интересно, что профиль «4» выражал как Ghsr, так и Cck1r. Как показано на следующем рисунке, Ghsr был более распространен в клетках Prdm12. (C) Круговая диаграмма, обобщающая оценки процента клеток Phox2b (красный), совместно экспрессирующих ghsr (желтый), Cck1r (голубой) или оба (серый). Общее количество подсчитанных профилей указано рядом с графиком (n=4 различных ганглия, левых и правых вместе взятых). Результаты с каждой стороны были объединены, потому что не было замечено никаких различий. Шкала стержней = 158 мкм(A)и 15 мкм(B). Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; NG = узелковый ганглий; JG = яремный ганглий; ISH = гибридизация in situ; Phox2b = парообразный гомеобокс 2b; Ghsr = рецептор грелина; Cck1r = холецистокининовый рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Репрезентативные результаты яремных афферентных нейронов мультиплекса ISH. Цифровые изображения репрезентативной вагусной ганглионной массы, помеченной мультиплексным РНКАскопом Prdm12, Cck1r и Ghsr. Изображения были получены с 20x(A)и 63x(B, C)объективами конфокального микроскопа (Zeiss LSM880). В A,20× несколько изображений были сшиты вместе с помощью программного обеспечения Zen и представлены либо как несмешанные каналы, либо объединены. Транскрипт Prdm12 (красный) специфически накапливается в афферентных нейронах, расположенных в яремном ганглии и лишь нескольких нейронах, проникающих в ростральную часть узлового ганглия. Сигналы Cck1r (голубой) интенсивно маркируются узловым ганглием. При низком увеличении клетки, экспрессирующие низкие уровни Cck1r или любые клетки с сигналами Ghsr (желтый), не могли быть легко замечены. DAPI (серый) помог визуализировать ткань и идентифицировать вагусные афферентные нейроны с большим и слегка окрашенным ядром. Две белые вставки на объединенном изображении соответствуют расположению изображений, включенных ниже. (B, C) При большом увеличении prdm12-положительные профили клеток (красный) могут быть очерчены. Умеренные сигналы для Cck1r также были обнаружены в профилях «1» и «2». Профиль "3" является представителем клеток Prdm12, отрицательных для Cck1r или Ghsr. В Cсигналы Ghsr (желтый) видны в репрезентативном профиле «4», но не в «5». (D) Круговая диаграмма, обобщающая оценки процента клеток Prdm12 (красный), совместно экспрессирующих либо Ghsr (желтый), Cck1r (голубой), либо оба (серый). Общее количество подсчитанных профилей указано рядом с графиком (n=4 различных ганглия, левых и правых вместе взятых). Результаты с каждой стороны были объединены, потому что не было замечено никаких различий. Шкала стержней = 158 мкм(A)и 15 мкм(B, C). Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; NG = узелковый ганглий; JG = яремный ганглий; ISH = гибридизация in situ; Prdm12 = PR домен цинкового белка пальца 12; Phox2b = парообразный гомеобокс 2b; Ghsr = рецептор грелина; Cck1r = холецистокининовый рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Опал Лазерная линия Дальность обнаружения сила прибыль Среднее линейное Размер пикселя
Опал 690 HeNe 633 нм 668-696 морских миль 2 724 4 1024 х 1024
Опал 570 DPSS лазер 561 нм 579-627 морских миль 15 450 4 1024 х 1024
Опал 520 аргоновый лазер 488 нм 499-535 морских миль 6 830 4 1024 х 1024
ДАПИ диодный лазер 405 415-502 нм 12 532 4 1024 х 1024

Таблица 1: Параметры приобретения. Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Техника ISH была изобретена в конце 1960-х годов42года. Однако только в середине 1980-х годов он был применен для обнаружения мРНК в центральной и периферической нервной системах43,44. Учитывая неоднородность нервной системы и повторяющиеся проблемы с антителами, локализация того или иного транскрипта на клеточном уровне остается бесценным инструментом. Тем не менее, традиционные методы ISH остаются трудоемкими и переменно чувствительными. К счастью, в этом исследовании использовалась высокочувствительная процедура ISH, называемая RNAscope, которая обычно не генерирует фон и позволяет обнаружить несколько транскриптов, выраженных на низких уровнях45,46. В частности, мультиплексный флуоресцентный РНКскоп был применен для одновременного обнаружения транскриптов Ghsr и Cck1r. Факторы транскрипции, Phox2b и Prdm12, были дополнительно использованы в качестве селективных маркеров для дифференциации узловых и яремных афферентных нейронов соответственно. Без визуализации Phox2b и Prdm12 было бы сложно с уверенностью идентифицировать яремные и узловые афферентные нейроны. Как объяснялось выше, один критический шаг включает в себя последовательную и правильную технику рассечения. Кроме того, проверка эндогенной флуоресценции также является важным фактором, поскольку ее можно легко принять за сигналы RNAScope. Кроме того, настоятельно рекомендуется выбор соответствующих параметров приобретения на основе отрицательной контрольной ткани. Как упоминалось ранее, конфокальная микроскопия является предпочтительным методом визуализации с 20x и 63x (масляными) целями, потому что 1) транскрипты, выраженные на низких уровнях и / или в разреженных клетках, могут быть заметны только при большом увеличении. 2) Конфокальная микроскопия позволяет собирать одну фокальную плоскость, что важно, учитывая, что две клетки друг на друге могут ошибочно выглядеть как одна клетка при визуализации эпифлуоресценцией. 3) Конфокальная микроскопия также позволяет более селективно и гибко получать параметры. Приведенные выше параметры приобретения приведены только в качестве примера, и рекомендуются модификации в зависимости от одного инструмента, увеличения (20x или 63x), уровней экспрессии и эндогенных уровней флуоресценции для любой данной ткани. Сама процедура окрашивания оставалась очень близкой к рекомендуемому протоколу с небольшими корректировками. Очевидно, что протокол, описанный здесь, может быть применен к обнаружению любых расшифровок, а не только GPCR. Процедура, описанная здесь, тем не менее, особенно полезна, учитывая повторяющиеся проблемы с антителами, поднятыми против GPCR24.

Как обсуждалосьранее 15,узелковый ганглий мыши иногда прикрепляется к верхнему шейному ганглию клеточным мостом. Включение этого клеточного моста может привести к запутанным результатам, например, к обнаружению невагусных маркеров в узловом ганглии. Исследователь может захотеть систематически проверять, прикреплен ли узелковый ганглий к верхнему шейному ганглию во время рассечения. В противном случае непоследовательные навыки рассечения между ганглиями приведут к экспериментальной изменчивости. Также важно отметить, что как петрозальные, так и узловые афферентные нейроны экспрессируют Phox2b47. Таким образом, то, что мы называли афферентными нейронами кузнечной афферентности, включало как петрозальные, так и узловые нейроны. Наконец, при сравнении различных исследований следует иметь в виду, что различные методы эвтаназии могут вызывать изменения в экспрессии генов48.

Теоретически флуорофоры, используемые для обнаружения, могут быть взаимозаменяемо отнесены к любому каналу. Тем не менее, было обнаружено, что Opal 690 испускает низкий уровень зеленой флуоресценции. В большинстве случаев, в случае высоко выраженных транскриптов (например, Prdm12), нежелательная зеленая флуоресценция наблюдалась, если интенсивность лазера была слишком высокой. Поэтому опал 690 рекомендуется для генов с умеренной/низкой экспрессией. При работе только с высокоэкспрессированными генами рекомендуется дополнительно разбавлять опал 690 (т.е. 1/3000) и не захватывать неспецифическую зеленую флуоресценцию во время получения изображения. Сигналы РНКАскопа представляют собой отдельные точки разных цветов, даже если транскрипты выражены в пределах одного и того же профиля клетки. Однако для высоко выраженных транскриптов может быть невозможно увидеть отдельные точки, а скорее флуоресценцию, заполняющую цитоплазму. Когда точки излучают флуоресценцию разных цветов, можно рассмотреть проблему неспецифической флуоресценции из-за, среди других примеров, неадекватных параметров приобретения и / или эндогенных пигментов. Наконец, Opal 570 и 620 не должны использоваться одновременно, потому что их спектры излучения перекрываются.

Если сигналы РНКАскопа не наблюдаются для гена, который, как известно, экспрессируется в интересующей ткани, рекомендуется проверить целостность ткани, запустив доступный положительный зонд (т. Е. Пептидил-пролил цис-транс-изомеразы B). Контрокрашивание DAPI также полезно для определения качества тканей. Меченые DAPI ядра, которые кажутся измельченными, могут указывать на чрезмерное пищеварение или неправильно закрепленную ткань.

В результате Ghsr был выражен в небольшом подмножестве Prdm12-положительных яремных афферентных нейронов. В отличие от этого, и в согласии с одним предыдущим исследованием11,мРНК Ghsr практически отсутствовала в афферентных нейронах ноз. Сделан вывод, что низкие уровни мРНК Ghsr, ранее обнаруженные qPCR и ISH, вероятно, были обусловлены яремными афферентными нейронами30,31,32. Одно предыдущее исследование передачи сигналов кальция показало, что 3% культивируемых вагусных афферентных нейронов реагируют на грелин49,число, которое удивительно похоже на процент ghsr-экспрессирующих яремных афферентных нейронов. Cck1r экспрессировался во многих Phox2b-положительных узловых афферентных нейронах и, что более удивительно, в подмножестве Prdm12-положительных яремных афферентных нейронов. Таким образом, эта статья демонстрирует успешную адаптацию существующих методов ISH для оценки клеточного распределения избранных GPCR в яремно-узловой ганглионной массе в целом.

В заключение, мультиплексный ISH был использован для обнаружения и одновременной визуализации транскриптов для двух GPCR (Cck1r и Ghsr) и одного транскрипционного фактора (Phox2b или Prdm12) во всем вагусном ганглионном комплексе взрослой мыши. Протокол, описанный здесь, может быть дополнительным инструментом к РНК-секвенированию, qPCR и традиционной гистологии. Однако этот протокол может быть применен к другим ганглиям аналогичного размера. Как обсуждалось выше, параметры приобретения, возраст животных и консистенция рассечения являются важными факторами, которые следует учитывать при экспериментальном проектировании. Поэтому он может предложить уникальную информацию о топографических паттернах экспрессии генов в очень гетерогенном и небольшом ганглии. Этот протокол может быть использован для определения изменений транскрипционных профилей яремных и узловых афферентных нейронов в контексте различных физиологических и патофизиологических состояний, включая, но не ограничиваясь, изменениями в статусе кормления. Он также может быть использован для сравнения нейрохимического состава вагусных афферентных нейронов у видов животных, обычно используемых в доклинических исследованиях, включая приматов и свиней50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core, финансируемой грантом NIH #5P01DK119130-02. Авторы хотели бы отметить помощь Юго-западного центра визуализации живых клеток UT (возглавляемого доктором Фелпсом) и его сотрудников (Абхиджит Бугде и Марсель Меттлен), частично поддерживаемых грантом NIH Grant #1S10OD021684-01, общим ресурсом Онкологического центра Гарольда С. Симмонса, частично поддерживаемым грантом поддержки онкологического центра NCI, P30 CA142543.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
20x SSC Invitrogen AM9763
-80°C freezer PHCBI MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021 Adobe photo and design software
Baking oven Thermo Scientific Model:658
Confocal microscope Zeiss LSM880 Airyscan
Cover glass Brain Research Laboratories 2460-1.5D
Cryostat Leica CM 3050 S
Dumont #5 Forceps F.S.T. 11252-20
Ecomount Biocare Medical EM 897L mounting medium
HybEZ oven hybridization oven
Hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
ImageJ-Fiji NIH
Large scissors Henry Schein 100-7561
Micro centrifuge tubes VWR 20170-333
Minipump variable flow Fisher Scientific 13-876-1
Opal 520 Akoya biosciences FP1 1487001KT Fluorescent biomarker
Opal 570 Akoya biosciences FP1 1488001KT Fluorescent biomarker
Opal 690 Akoya biosciences FP1 1497001KT Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACD /Bio-Techne 323100 multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 ACD /Bio-Techne 313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB ACD /Bio-Techne 310043
RNAscope probe Mouse Ghsr ACD /Bio-Techne 426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 ACD /Bio-Techne 407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 ACD /Bio-Techne 524371-C2
RnaseZap Sigma R2020 Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors Millipore Sigma Z265977
Superfrost Plus slides Fisherbrand 1255015
Tissue Tek OCT medium Sakura 4583
User manual ACD 323100 USM
Vannas Spring Scissors Roboz RS 5620
ZEN Imaging Software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).

Tags

Неврология Выпуск 175 Нейроанатомия сигнализация гистология транскрипция трансмембранные рецепторы периферическая нервная система рассечение конфокальная микроскопия флуоресценция
Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации <em>In Situ</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bob-Manuel, J., Gautron, L.… More

Bob-Manuel, J., Gautron, L. Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (175), e62945, doi:10.3791/62945 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter