Summary
시투 혼성화(ISH)의 멀티플렉스는 성인 마우스의 전체 vagal ganglionic 복합체에서 2개의 G 단백질 결합 수용체 및 1개의 전사 인자에 대한 성적증명서를 동시에 시각화하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 vagal 포렌트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한 지도를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 연구는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 발현을 검출하는 데 특히 중점을 둔 마우스 경정맥 중형화(ISH)의 주악성화(ISH)에서 멀티플렉스에 대한 프로토콜을 설명합니다. 포르말린 고정 경정맥 신경리아는 RNAscope 기술로 처리되어 두 개의 대표적인 GPCRs(cholecystokinin 및 ghrelin 수용체)의 발현을 동시에 검출하여 nodose(쌍형 동종박스 2b, Phox2b) 또는 경정맥 성신경(PR도메인 아연+121)의 하나의 마커 유전자와 결합하여 동시에 검출하였다. 표지된 간리아는 앞서 언급한 성적증명서의 분포 및 발현 패턴을 결정하기 위해 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 간단히, Phox2b 포이퍼트 뉴런은 담낭스토키닌 수용체(Cck1r)를 풍부하게 표현하지만 그렐린 수용체(Ghsr)는 발현하는 것으로 나타났다. Prdm12 포퍼런트 뉴런의 작은 하위 집합은 또한 Ghsr 및/또는 Cck1r를 표현하는 것으로 나타났습니다. 이 문서에 설명 된 접근 방식은 vagal 포퍼런트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한지도를 생성하는 과학자를 도울 수 있습니다.
Introduction
vagal afferents의 세포 체는 경정맥, 석유, 및 nodose ganglia1,2,3에포함된다. 그들의 축축은 두개골, 흉부 및 복부 영토4,5,6,7에미주 신경의 여러 가지를 통해 함께 여행한다. 그들의 내장 엔딩에서, vagal afferents는 생리적이고 유해한 자극의 넓은 범위에 반응할 수 있습니다8,9,10. 그러나, 바갈 감지에 관여하는 신호 분자 및 수용체의 분포는 제대로 특성화 남아 있습니다. 이는 부분적으로 그들의 작은 크기에도 불구하고, 많은 수의GPCRs8,11,12,13을포함하여 광범위한 수용체 스펙트럼을 표현하기 때문이다. 더욱이, vagal 발포성 뉴런은 본질적으로 이질적이며 뚜렷한 분자프로파일(14)을표시한다. 문제를 복잡하게 하기 위해 경정맥, 석유 및 노도스 신경리아가 마우스에 부착되어 단일 신경절 질량을 형성합니다. 마지막으로, 동물의 하위 집합에서, 노도스 신경절은 공감 우수한 자궁 경부신경절(15)에부착된다.
과거에, 조사자들은 vagal 포퍼트 뉴런의 신경화학적 구성을 연구하기 위해 면역히토화학으로 전환했다16,17,18. 검증된 항체를 이용한 면역히스트토화학이 유용하지만, 면역히스토케미칼 연구의 결과는 주의해서 해석되어야 한다. 예를 들어, GPCRs에 대한 특정 항체를 식별하는 수많은 노력은19,20,21,22, 23,24,25에실패했으며, 주요 연구자들은 GPCRs에 대한 항체의 대부분이 신뢰할 수 없다는 결론을 내렸다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 정량적 PCR(qPCR)은 설치류 혈관 신경절 질량26,27,28,29에서유전자 발현을 평가하는 데 널리 사용되어 왔다. 그러나, qPCR을 이용한 유전자 발현을 검사하는 것은 공간 정보의 손실의 희생으로 발생한다. 특히, 관심 있는 특정 유전자(예를 들어, 노도스 대 경정맥 세포)를 발현하는 세포 또는 셀 유형(들)의 수를 예측할 수 없다. 되풀이되는 문제점은 또한 인접한 조직으로 오염및 해부15도중 미주 신경의 가변 길이, 우수한 자궁 경부 및 경정맥 의 포함을 포함합니다. 위의 어려움의 결과로, 논쟁은 vagal 포성 뉴런에서 여러 GPCRs의 표현과 분포를 둘러싸고 있습니다. 한 특히 수수께끼 예는 ghrelin 수용 체에 관한 (Ghsr). 일부 연구는 vagal afferent뉴런30,31,32에서이수용체의 광범위한 표현을 발견하는 반면, 다른 사람은 Ghsr mRNA가 nodose 신경절11,14에서거의 감지 할 수없는 것으로 나타났습니다. 따라서 vagal ganglionic 질량에 있는 Ghsr mRNA의 상세한 매핑은 그러므로 보증됩니다.
시투 혼성화(ISH)에서도 vagal ganglionic 질량7,11,12,33,34,35에서유전자 발현 패턴을 평가하는 데 사용되었습니다. RNA 기반 기술은 대부분의 상황에서 항체 기반 기술보다 더 신뢰할 수 있고 특이적으로 남아 있기 때문에36,37,ISH 연구는 vagal 포성 뉴런의 신경 화학 코딩을 더 잘 이해하는 데 가치가 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 전통적인 ISH 기술 자체는 주의없이하지 않습니다. 방사성 이스는 민감하지만 배경을 생성하고 성가신38남아있다. 비 방사성 ISH는 덜 복잡하지만 덜민감하지 도 38. 대조적으로, 최근에 개발된 RNAscope ISH 방법은 매우 민감하고 최소한의배경(39)을생성한다. 현재 연구는 마우스의 vagal 포성 뉴런에서 GPCRs의 검출에 멀티플렉스 형광 RNAscope를 적용. 우리는 Ghsr의 분포를 매핑에 초점을 맞추고 cholecystokinin 수용체 (Cck1r)의 분포를 비교, 또 다른 GPCR잘 노도스 신경절에서 발현 될 것으로 알려진(34). 마지막으로, 쌍과 같은 동종박스 2b(Phox2b) 및 PR 도메인 아연 핑거 단백질 12(Prdm12)는 각각14개의노도스와 경정맥 성신경에 대한 선택적 마커로 사용되었다. Phox2b 또는 Prdm12를 시각화하지 않으면 경정맥 대 노도스 포렌티를 확실하게 식별하는 것이 어려울 것입니다. 잠재적인 기술적 함정은 또한 기사 전반에 걸쳐 논의됩니다.
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Protocol
참고 : 이 연구에서 사용되는 마우스는 순수한 C57BL / 6J 배경에 야생 형 남성이었다. 총 4마리의 마우스가 멀티플렉스 ISH에 사용되었다. 모든 마우스는 희생 시에 약 8주 전에 생후이었습니다. 한 남성 마우스 (대략 1 세) 또한 노화와 관련 된 내 인 성형을 입증 하는 데 사용 되었다. 동물들은 음식과 물에 대한 광고 리비툼이 있는 장벽 시설 내의 통풍 케이지에 보관되었습니다. UT 남서부 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 아래에 설명 된 절차를 검토하고 승인했습니다. 시약 및 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표에서찾을 수 있습니다.
1. 샘플 컬렉션
- 희생의 날에, 염소 수화물의 과다 복용을 관리 (500 mg/kg, i.p.) 마우스에. 심층 마취 마우스를 1x 인산염 완충식식염수(PBS)의 5mL로 연동 펌프를 사용한 후 실온에서 10% 포르말린의 50mL가 뒤따릅니다.
참고 : 이것은 포르말린의 흡입을 방지하기 위해 연기 후드에서 수행됩니다. - 노도스, 페트로살 및 경정맥은마우스(15)에서단일 신경절 질량을 형성하기 위해 융합되기 때문에, 각 측면(왼쪽과 오른쪽)에서 전체 vagal ganglionic 질량을 신중하게 수집하고, 해부범위와 미세한 스프링 가위 및 포셉(재료의 표참조).
- 큰 가위 한 쌍으로 마우스를 참수 할 때 (재료의 표참조), 뇌간을 분쇄하지 마십시오.
- 쥐(40)에서이전에 설명된 해부 접근법에 따라, 후두뼈를 노출시키기 위해 작은 집게(재료표)로 기관으로 스테르노로이드 및 오모로이드 근육을 제거한다. 경동맥, 미주 신경, 저혈압 신경, 그리고 포멘 매그넘이 보일 때까지 근육, 지방 조직 및 결막 조직의 전체 영역을 취소합니다. 작은 스프링 가위로 전체 저혈압신경을잘라냅니다(재료의 표).
- 요새 매그넘15에가까운 반투명 질량으로 노도스 신경절을 찾습니다. 작은 가위(재료의 표)를사용하여, 조심스럽게 황두골 뼈를 깨고 경추 신경절을 더 노출합니다. 경구 표면에서 시각적 인 랜드 마크로 검은 멜라닌세포를 찾습니다.
- 미갈 신경절 질량 사이의 신경 부착물을 자르고 미주 신경의 말초 끝을 부드럽게 당기면서 동시에 작은 스프링 가위로 뇌간을 향해 경정맥을 절단하여 전체 신경절 질량을추출합니다(재료의 표).
- 가능한 한 미주 신경과 신경절 질량에 집착 하는 결막 조직 및 지방을 제거 합니다.
- 한 튜브에서 다른 튜브로 옮기는 동안 하나의 신경절을 잃기 쉽기 때문에 미주 신경의 ~0.5 cm를 유지하여 시료의 취급 및 국소화를 용이하게 하십시오.
- 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 미세포프의 도움으로 간리를 놓고 24시간 동안 포르말린의 4°C에서 배양하고 또 다른 24시간 동안 30% 자당합니다.
- 알루미늄 호일 조각에 최적의 절삭 온도(OCT) 매체의 작은 드롭(~4mm Ø) 내부에 간질을 배치합니다. 다음으로, 드라이 아이스 의 침대에 샘플을 동결.
- -20°C에서 저온으로 샘플을 14 μm 두께의 섹션으로 자르고 유리 현미경 슬라이드에서 3 시리즈 42 μm 떨어져 수집합니다.
참고: 슬라이드의 가장자리에 섹션이 가까이 놓지 마십시오. 시약을 저장하려면 조직 섹션을 가능한 한 단단히 포장하지만 겹치지 않도록 유지하십시오. - 적어도 6 개월 동안 ISH에 필요할 때까지 -80 °C 냉동고에 샘플을 저장합니다.
참고: 내인성 형광에 대한 문제 해결을 위한 그림 1을 참조하십시오.
2. 전처리 및 이시
- 실험 전날, autoclave 실험실 유리 제품은 설거지 염색 및 완충항아리 세척을 포함하여 ISH에 사용됩니다.
참고: RNase 가 없는 조건에서 일하는 것은 중요하지 않지만 항상 장갑을 착용하십시오. 오염이 의심되는 경우 RNase 오염 제거 용액병(재료 표)을손이 닿지 않는 곳에 보관하십시오. - 첫날, ISH 전용 벤치에 실온에 슬라이드를 가져. 슬라이드를 1x PBS로 헹구고 베이킹 오븐에서 60°C에서 30분 동안굽습니다(재료 표).
- 4°C에서 15분 동안 슬라이드를 4% 포르말린으로 수정합니다.
- 시약을 멀티플렉스 키트(재료표)에실온으로 가져옵니다.
- 슬라이드를 50%, 70%, 100% 에탄올로 탈수하여 각각 5분 동안 탈수합니다. H2O2 용액을 10분 동안 시료에 적용한 다음 이중 증류수(ddH2O)로 헹구습니다.
- 5분 동안 대상 검색 시약으로 샘플을 처리하고 ddH2O로 헹구고 100% 에탄올및 공기 건조를 처리합니다. 소수성 펜을 사용하여 샘플 주위에 장벽을 만듭니다.
참고: 소수성 장벽을 조직 섹션에 너무 가깝게 적용하지 마십시오. - 하이브리드화오븐(재료표)에40°C에서 30분 동안 프로테아이즈를 적용합니다.
- 그 동안, 40 °C에서 프로브를 예열하고 사용하기 전에 실온에서 냉각. 하이브리드화 오븐에서 40°C에서 2시간 동안 대상 프로브(Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; 또는 Cck1r-C3; 또는 Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2)의 원하는 조합으로 슬라이드를 배양한다.
- 혼성화 오븐에서 40°C에서 2시간 동안 디하이드로디피콜리나테 환원효소(DapB) 표적 C1 프로브를 통해 음극관 조직을 배양한다.
- 슬라이드를 세척 버퍼로 헹구고 실온에서 5배식식염수 나트륨 구연산나트륨(SSC)으로 하룻밤 을 보관하십시오. 편의를 위해 실험을 2일로 나눕이됩니다. 다음 날, 세척 버퍼로 슬라이드를 헹구고 아래에 나열된 증폭 시약으로 인큐베이션합니다(재료 표의사용자 설명서 참조).
- AMP1(40°C에서 30분), AMP2(40°C에서 30분), AMP 3(40°C에서 15분)을 적용합니다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
- 각 오팔염료(재료표)를디메틸 설플옥사이드에 녹이고 필요할 때까지 용액을 4°C로 저장합니다.
- 채널 1의 경우 HRP-C1(40°C에서 15분) 및 오팔 520(녹색 색, 희석 1/1,500; 40°C에서 30분)으로 슬라이드를 배양합니다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
- 채널 2의 경우 HRP-C2(40°C에서 15분) 및 오팔 570(노란색 색; 희석 1/1,500; 40°C에서 30분)으로 슬라이드를 배양한다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
- 채널 3의 경우 HRP-C3(40°C에서 15분) 및 오팔 690(먼 붉은 색; 희석 1/1,500; 40°C에서 30분)으로 슬라이드를 배양한다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
- 슬라이드를 세척하고 30 s에 대한 4′,6-diamidino-2-페닐린돌 (DAPI)에 노출.
- 각 슬라이드에 즉시 마운팅 배지를 바르고 티슈 섹션 에 커버슬립을 놓습니다.
- 이미징될 때까지 4°C의 슬라이드 홀더에 조직을 수평으로 유지합니다.
3. 현미경 검사 및 데이터 분석
참고: 멀티플렉스 ISH 데이터는 적절한 필터가 있는 다양한 계측기로 이미지화할 수 있습니다. 그러나, 바람직한 이미징 방법은 20x 및 63x(오일) 목표를 가진 공초점 현미경 검사법입니다. 이유를 위해 토론을 참조하십시오. 최적의 신호 대 잡음 비율을 측정하려면 그림 2를 참조하십시오.
- 488, 561 및 633 nm 레이저 라인을 갖춘 공초점 현미경을 사용합니다. 다음 획득 매개 변수(표 1참조): 오팔 690(HeNe 633 nm, 검출 범위 668-696 nm, 전원 2.0, 게인 724); 오팔 570 (DPSS 레이저 561 nm, 검출 범위 579-627 nm, <파워 15.0,
- 이미지의 품질을 향상하려면 평균 4개의 라인과 픽셀 크기가 1024 x 1024 이상인 경우 를 획득하십시오.
참고: 상기 매개변수는 예로만 제공되며, 특정 조직에 대한 하나의 계측기, 배율(20배 또는 63배), 발현 수준 및 내인성 수준의 형광에 따라 수정이 권장됩니다.- 획득 매개 변수에 만족하면 동일한 설정을 사용하여 이미지를 수집합니다. 시각화를 용이하게 하기 위해 각 채널에 거짓 색상을 특성화합니다.
참고: 예를 들어 빨간색(Phox2b 또는 Prdm12), 시안(Cck1r), 노란색(Ghsr), 회색(DAPI).- DAPI로 가볍게 염색된 핵 1개로 RNAscope 양성 프로파일의 윤곽을 식별하여 디지털 이미지를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 각 성적증명서를 표현하는 RNAscope 양성 프로파일의 백분율을 계산합니다 [ 그림3A-C].
- 추정의 엄격하고 정확도를 향상하기 위하여는, 적어도 4개의 다른 동물에서 적어도 2,000개의 신경 단면도를 계산합니다. 왼쪽과 오른쪽 간골에서 따로 계산을 수행합니다.
- 집계된 총 프로파일 수로 원형 차트에 데이터를 입력합니다.
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하고 20배 이미지를 함께 스티치합니다. ImageJ-Fiji와 다른 사진 및 디자인 소프트웨어를 사용하여 최종 플레이트를 생성합니다. 모든 이미지에 대비 및 가벼움을 균일하게 조정합니다.
- 이미지의 품질을 향상하려면 평균 4개의 라인과 픽셀 크기가 1024 x 1024 이상인 경우 를 획득하십시오.
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Representative Results
RNAScope는 모든 연령, 성별 또는 유전 적 배경의 동물에게 적용 될 수 있지만 젊은 성인 (<3 개월)과 함께 일하는 것이 좋습니다. 이는 형광 유물(예를 들어, 리포우신)이 구형 동물의뉴런(41)에서흔히 발견되기 때문이다. 오래된 마우스에서 포르말린 고정 된 간리아는 종종 쉽게 진짜 염색으로 착각 할 수있는 놀라 울 정도로 강렬한 내인성 형광을 포함(도 1A,B). 어쨌든, 처리하기 전에 조직에서 내인성 형광의 수준을 확인하는 것이 좋습니다.
도 2A,B에도시된 바와 같이 DapB 음성 프로브로 배양된 음의 대조군 조직에서 단면을 사용하여 각 레이저 및 배율에 대한 최적의 획득 파라미터 및 신호 대 잡음 비율을 결정하는 것이 중요하다. DapB는 대핵 유전자이기 때문에 RNAscope 신호는 음성 대조군 조직에서 완전히 없어야 합니다. 가끔 이물질과 결정 외에도, 무시할 수 있는 형광은 부정적인 제어 조직에서 이미지에서 볼 수 있으며, 획득 파라미터가 사용되는 경우 적절한 경우. 그러나, 특정 레이저 전력 및 게인 위에, 원치 않는 배경 및 임의의 형광점이 나타나기시작한다(그림 2C). 레이저 전력을 최소화하는 또 다른 목적은 픽셀 채도 및 광표백을 피하는 것입니다. 위의 매개 변수로 작업할 때 형광 표백의 주요 문제가 관찰되지 않았습니다. 이러한 문제가 발생할 수 있는 경우, 가능한 한 레이저 전력을 낮추는 것 외에도 형광 표시세포(재료 표)에대한 마운팅 배지로 조직을 커버하는 것이 좋습니다(표 1에서권장되는 파라미터 참조).
RNAscope 기술은 마우스의 vagal 신경절 질량의 조직 섹션에서 3 유전자의 검출을 위해 적용되었다(도 3 및 도 4). 한 프로파일은 Ghsr 및/또는 Cck1r에 대해 각각 노란색 및/또는 시안 점이 빨간색 점으로 채워진 하나의 프로파일을 오버레이하는 것으로 보였을 때 양성으로 간주되었습니다(그림3A-C). 도 3에 제공된 예는 Phox2b 및 Cck1r 전사체(그림3D)를모두 포함하는 많은 프로파일을 나타낸다. Phox2b는 nodose 발포성 뉴런을 식별하는 데 사용되었습니다. 노도스 신경절의 뉴런에 축적된 풍부한 Phox2b신호(도 4A,B). Cck1r 신호는 Phox2b 세포의 약 52%에서 검출되었다(도4C). 참고로 Cck1r의 발현 수준은 중간(프로파일당 ~20점)에서 강렬한 라벨링(세포질 채워진)에 이르기까지 세포마다 크게 변화합니다. 대조적으로, Ghsr에 대한 신호는 노도스 신경절에서 매우 희소했다(그림 4A,B). Phox2b 양성 세포의 추정된 0.65%만이 Ghsr 성적증명서(도4C)에대해서도 양성이었다. Ghsr 표현 세포는 종종 공동 발현 Cck1r. 조직에 대한 시각적 조사는 왼쪽과 오른쪽 간골 사이의 명백한 차이점을 밝히지 않았다. ISH 신호는 뉴런 (예를 들어, 에피뉴리움 및 섬유장)이없는 지역에서 사실상 결석했다.
Prdm12는 경정맥 성 신경세포를 식별하는 데 사용되었다. 예상대로, Prdm12 발현은 경정맥의 뉴런과 노도스 신경절의 로스트랄 부분에 침투하는 몇 가지 뉴런(도5A-C)에서높게 농축되었다. 흥미롭게도, Cck1r 신호는 Prdm12 세포의 하위 집합에서 검출되었다(도5B,C). Prdm12 양성 뉴런의 9% 미만도 Cck1r(도5D)를발현하였다. 그러나, 경정맥 신경절은 일반적으로 노도스 신경절에서 발견되는 강하게 표기된 Cck1r 양성 세포보다는 Cck1r(세포당 <20 점)의 적당한 수준을 가진 세포만 을 포함합니다. Ghsr 양성 세포는 노도스(도5C)보다경정맥에서 훨씬 더 널리 퍼졌다. Prdm12 세포의 약 3%는 또한 Ghsr양성(그림 5D)이었다. 흥미롭게도, 모든 Prdm12의 1%는 Ghsr와 Cck1r. Ghsr에 대한 표현 수준은 항상 보통(셀당 <20점)이었다. 어떤 ISH 신호 뉴런이 없는 지역에서 볼 수 없었다.
그림 1: 내인성 형광의 문제 해결. (A, B)내인성 형광은 하나의 노화 마우스 (~1세)의 노도스/경정맥 신경절에서 발생한다. 디지털 이미지는 젊은 마우스와 멀티 플렉스 ISH에 사용되는 것과 동일한 색상 및 획득 매개 변수에 표시된 레이저 라인을 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의해 획득되었다 (나중에 참조). 중요한 것은, 고정된 조직은 -80°C에 저장되고 DAPI에 노출된 것 이외의 어떤 식으로든 처리되지 않았다. A에도시된 바와 같이, 488nm 레이저(green)에 노출될 때, 특히 뉴런 및 비신경 세포에서 원치 않는 형광의 상당 수준이 관찰된다. 이것은 조직학에 있는 일반적인 사실 인정입니다, 조직학 분석 의 앞에 내인성 형광을 평가하는 보증합니다. (B)더 높은 배율에서 형광은 노화 세포에 자주 축적되는 리포우신 안료와 유사하며 정품 면역 반응성 및/또는 RNAScope 신호로 쉽게 착각할 수 있습니다. 스케일 바 = 158 μm(A)및 15 μm(B). (B).약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; NG = 노도스 신경절; ISH = 시투 혼성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 최적의 신호 대 잡음 비율을 결정합니다. (A, B)대핵 유전자 DapB에대한 RNAScope 검출으로 구성된 음극제어. 젊은 성인 마우스의 노도스 신경절에서 내인성 형광은 최소화되며 DapB 프로브와의 잠복은 신호로 이어지지 않았습니다. 획득 매개 변수는 멀티플렉스 ISH에 사용되는 매개 변수와 동일했습니다. 이는 인수 파라미터를 신중하게 선택하면 RNAScope 절차 자체가 중요한 배경을 생성하지 않음을 보여줍니다. (C)488 nm 레이저를 통해 파워 레이저와 게인을 증가시켜 획득한 동일한 조직의 디지털 이미지. 일부 퍼지 녹색 배경과 가끔 점 특정 레이저 전원 및 게인 위에 발생 하는 방법을 참고. 따라서, 부정적인 대조군 조직에서 얻어진 비특이적 형광의 양에 기초하여 각 레이저에 대한 획득 파라미터를 신중하게 선택하는 것이 중요하다. 스케일 바 = 158 μm(A)및 15 μm(B, C). 약어: DapB = 디하이드로디피콜리나테 환원효소; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; NG = 노도스 신경절; ISH = 시투 혼성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 긍정 프로파일의 식별 및 계산. (A)노도스 신경절의 장밋빛 부분에서 Phox2b 라벨 프로파일(red)의 대표적인 디지털 이미지. 이 예에서는 총 18개의 셀룰러 프로파일(1~18개로 표시)이 확인되었습니다. DAPI 염색은 일반적으로 빛 DAPI 얼룩으로 크고 둥근 핵을 표시하는 뉴런을 국소화하는 데 더 도움이 됩니다. 대조적으로, 비 신경 세포의 핵은 밝게 표지되고, 길어지고, 크기가 작습니다. 전반적으로, RNAScope 신호는 비 신경 세포 보다는 오히려 신경세포의 분포 그리고 모양에 부합합니다. (B)두 개의 표지된 Ghsr 양성 뉴런(노란색)이 도시된다(프로파일 19 및 20). Ghsr 신호는 희소하고 보기 가 어려웠습니다. 따라서 노란색 신호의 가벼움과 채도는 사진 소프트웨어에서 선택적으로 균일하게 향상되었습니다. (C)총 9개의 Cck1r 표지 프로파일(cyan)이 식별된다(2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 및 19로 표시). Cck1r 신호의 강도가 세포 간에 어떻게 크게 변화했는지 유의하십시오. 예를 들어 프로파일 11에는 몇 가지 양수 신호만 포함되어 있는 반면 프로파일 7은 거의 Cck1r 신호로 채워져 있습니다. (D)모든 채널의 병합된 뷰는 지역화 패턴을 식별할 수 있도록 허용하였다. 많은 Phox2b 양성 프로파일은 동일한 세포 프로파일 내에서 빨간색 및 시안 RNAScope 점에 의해 입증된 Cck1r(예를 들어, 프로파일 2, 8 및 14)를 공동 발현했다. 대조적으로, Phox2b 양성 프로파일은 Ghsr 성적 증명서 (프로필 19 및 20)를 표현하지 않았습니다. 그러나, 하나의 Ghsr 양성 세포는 또한 Cck1r의 낮은 수준을 표현 (프로파일 19). 백색 별표로 표지된 2개의 큰 DAPI 염색한 핵은 아마 RNAScope 신호가 없는 Phox2b 음성 포성 뉴런의 위치에 일치합니다. 아래에 설명된 대표적인 결과에서는, 적어도 2,000개의 신경 단면도는 4개의 다른 동물에게서 좌우 신경절 질량에서 계산되었습니다. 스케일 바 = 24 μm. 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; Phox2b = 페어링형 동종 상자 2b; Ghsr = 그렐린 수용체; Cck1r = 담낭토키닌 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 노도스 발포성 뉴런에서 멀티플렉스 ISH의 대표적인 결과. 포크스2b, Cck1r 및 Ghsr. 이미지에 대한 멀티플렉스 RNAscope로 표지된 대표적인 vagal ganglionic 질량의 디지털 이미지는 공초점 현미경(Zeiss LSM880)의20x(A)및 63x(B,C)목표로 인수되었다. A에서,20× 여러 이미지가 Zen 소프트웨어를 사용하여 함께 스티치되고 혼합되지 않은 채널로 표시되거나 병합되었습니다. 포스2b 신호 (빨간색) 특별히 노도스 신경절에 있는 포이성 뉴런에 축적. 예상대로, Cck1r 신호 (시안) 강렬하 게 많은 표시, 하지만 전부, 노도스 신경절에 뉴런. 낮은 배율에서, Cck1r의 낮은 수준을 발현하는 세포 또는 Ghsr 신호 (노란색)를 가진 어떤 세포든지 쉽게 관찰할 수 없었습니다. DAPI (회색)는 조직을 시각화하고 크고 가볍게 얼룩진 핵으로 vagal 포렌트 뉴런을 식별하는 데 도움이되었습니다. 병합된 이미지의 흰색 인셋은 아래에 포함된 이미지의 위치에 해당합니다. (B)높은 배율에서, Phox2b 양성 프로파일 (빨간색)은 분명하다. 많은 세포는 또한 Cck1r를 표현하지만, 다양한 수준에서, 매우 높은 중간에서 배열. 프로파일 "1"은 Cck1r 및 Ghsr. 프로파일 "2" 및 "3"에 대한 Phox2b 세포 음성의 예이며 각각 높고 중간Cck1r 신호가 있는 Phox2b 세포이다. Ghsr에 대 한 중간 신호 (노란색) 때때로 로스트랄 nodose 신경절에서 볼 수 있지만 거의 항상 Phox2b에 대 한 부정적인 세포에서, 프로필 "4"와 함께 도시 된 바와 같이. 흥미롭게도, 프로필 "4"는 Ghsr와 Cck1r를 모두 표현했다. 다음 그림에 나타난 바와 같이, Ghsr는 Prdm12 세포에서 더 풍부했다. (C)원형 차트는 Ghsr(노란색), Cck1r(시안) 또는 둘 다(회색)을 공동 발현하는 Phox2b 세포(red)의 백분율추정치를 요약한다. 계산된 총 프로파일 수는 차트 옆에 표시됩니다(n=4 서로 다른 간약, 왼쪽 및 오른쪽 결합). 차이점이 발견되지 않아 각 팀의 결과가 풀로 풀렸습니다. 스케일 바 = 158 μm(A)및 15 μm(B). 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; NG = 노도스 신경절; JG = 경정맥신경절; ISH = 시투 혼성화; Phox2b = 페어링형 동종 상자 2b; Ghsr = 그렐린 수용체; Cck1r = 담낭토키닌 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 경정맥 발포성 뉴런 멀티플렉스 ISH의 대표적인 결과. 멀티플렉스 RNAscope Prdm12, Cck1r 및 Ghsr. 이미지로 표지된 대표적인 vagal ganglionic 질량의디지털 이미지는 공초점 현미경(Zeiss LSM880)의 20x(A) 및 63x(B,C)목표로 인수되었다. A에서,20× 여러 이미지가 Zen 소프트웨어를 사용하여 함께 스티치되고 혼합되지 않은 채널로 표시되거나 병합되었습니다. Prdm12 성적 증명서 (빨간색) 특별히 경정맥 신경절에 위치한 포근 뉴런에 축적하고 노도스 신경절의 장밋빛 부분에 침투 단지 몇 뉴런. Cck1r 신호 (시안) 강렬하 게 노도스 신경절 표시. 낮은 배율에서, Cck1r의 낮은 수준을 표현하는 세포 또는 Ghsr 신호 (노란색)를 가진 어떤 세포든지 쉽게 볼 수 없었습니다. DAPI (회색)는 조직을 시각화하고 크고 가볍게 얼룩진 핵으로 vagal 포렌트 뉴런을 식별하는 데 도움이되었습니다. 병합된 이미지의 두 개의 흰색 인셋은 아래에 포함된 이미지의 위치에 해당합니다. (B, C) 높은 배율에서 Prdm12 양성 세포 프로파일(red)을 설명할 수 있습니다. Cck1r에 대한 중간 신호도 프로파일 "1"과 "2"에서 검출되었습니다. 프로파일 "3"은 Cck1r 또는 Ghsr에 대한 음성 Prdm12 세포의 대표이다. C에서,Ghsr 신호(노란색)는 대표 프로필 "4"에서 볼 수 있지만 "5"에서는 볼 수 없습니다. (D)원형 차트는 Ghsr(노란색), Cck1r(시안) 또는 둘 다(회색)을 공동 발현하는 Prdm12 세포(red)의 백분율추정치를 요약한 것이다. 계산된 총 프로파일 수는 차트 옆에 표시됩니다(n=4 서로 다른 간약, 왼쪽 및 오른쪽 결합). 차이점이 발견되지 않아 각 팀의 결과가 풀로 풀렸습니다. 스케일 바 = 158 μm(A)및 15 μm(B, C). 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; NG = 노도스 신경절; JG = 경정맥신경절; ISH = 시투 혼성화; Prdm12 = PR 도메인 아연 손가락 단백질 12; Phox2b = 페어링형 동종 상자 2b; Ghsr = 그렐린 수용체; Cck1r = 담낭토키닌 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 오팔 | 레이저 라인 | 검출 범위 | 힘 | 이득 | 라인 평균 | 픽셀 크기 |
| 오팔 690 | 헤네 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| 오팔 570 | DPSS 레이저 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| 오팔 520 | 아르곤 레이저 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI | 다이오드 레이저 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
표 1: 획득 매개 변수입니다. 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌.
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Discussion
ISH의 기술은 1960 년대 후반42에발명되었다. 그러나, 1980년대 중반까지는 중추 및 말초 신경계에서 mRNA검출을 위해 적용된 것이아니다(43·44). 신경계의 이질성과 항체에 대한 반복되는 문제를 고려할 때, 세포 수준에서 특정 성적증명서를 국소화하는 것은 여전히 귀중한 도구로 남아 있다. 그럼에도 불구하고 전통적인 ISH 방법은 힘들고 다양하게 민감하게 남아 있습니다. 다행히도, 이 연구는 RNAscope에게 불린 높게 민감한 ISH 절차를 채택했습니다, 일반적으로 배경을 생성하지 않으며 낮은 수준45,46에서표현된 몇몇 성적증명서의 검출을 허용합니다. 구체적으로, 멀티플렉스 형광 RNAScope는 Ghsr 및 Cck1r 전사체의 동시 검출을 위해 적용되었다. 전사 인자, Phox2b 및 Prdm12는 각각 노도스와 경정맥 포성 뉴런을 분화하기 위해 선택적 마커로 추가로 사용되었다. Phox2b와 Prdm12를 시각화하지 않으면 경정맥 대 노도스 포성 뉴런을 확실하게 식별하는 것이 어려울 것입니다. 위에서 설명한 바와 같이, 한 가지 중요한 단계에는 일관되고 적절한 해부 기술이 포함됩니다. 또한, 내인성 형광의 검증은 RNAScope 신호로 쉽게 오인될 수 있기 때문에 중요한 요소이기도 하다. 더욱이, 부정적인 통제 조직에 근거를 둔 적당한 취득 매개변수의 선택은 강하게 권고됩니다. 앞서 언급했듯이, 공초점 현미경검사는 20x 및 63x(오일) 목표를 가진 바람직한 이미징 방법인데, 왜냐하면 1) 낮은 수준에서 발현된 성적증명서 및/또는 희소세포에서만 높은 배율에서만 눈에 띄는 경우가 있기 때문이다. 2) 공초점 현미경 검사는 단일 초점 평면의 수집을 허용, 이는 서로의 상단에 두 세포가 잘못 epifluorescence에 의해 이미지 될 때 하나의 세포로 나타날 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요하다. 3) 공초점 현미경 검사는 또한 더 선택적이고 유연한 획득 매개 변수를 허용합니다. 상기 획득 파라미터는 예로만 제공되며, 주어진 조직에 대한 하나의 계측기, 배율(20x 또는 63배), 발현 수준 및 내인성 수준의 형광에 따라 수정이 권장됩니다. 염색 절차 자체는 약간의 조정만으로 권장 프로토콜에 매우 가깝게 남아 있었습니다. 분명히, 여기에 설명된 프로토콜은 GPCRs뿐만 아니라 모든 성적 증명서의 검출에 적용될 수 있습니다. 여기에 기재된 절차는 그럼에도 불구하고GPCRs(24)에대하여 제기된 항체를 가진 되풀이문제점을 고려하여 특히 유용하다.
앞서 논의된 바와 같이15,마우스 노도스 신경절은 때때로 세포 교량에 의해 우수한 자궁 경부 신경절에 부착된다. 이 세포 교량의 포함은 혼란 스러운 결과로 이어질 수 있습니다., 예를 들어, 비 vagal 마커 노도스 신경절에서 검출 되 고. 조사관은 노도스 신경절이 해부 중에 우수한 자궁 경부 신경절에 부착되어 있는지 여부를 체계적으로 확인할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 간질 사이의 일관성없는 해부 기술은 실험적 가변성을 소개합니다. 또한 석유 및 노도스 포성 뉴런모두 Phox2b47을발현한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리가 노도스 발포성 뉴런이라고 부르는 것은 석유 및 노도스 뉴런을 모두 포함했다. 마지막으로, 다른 연구를 비교할 때, 안락사의 다른 방법이 유전자발현(48)의변화를 일으킬 수 있다는 점을 명심해야 한다.
이론적으로 검출에 사용되는 형광은 모든 채널에 상호 교환될 수 있습니다. 그러나, 오팔 690녹색형광의 낮은 수준을 방출하는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 상황에서, 고발성 성적증명서(예를 들어, Prdm12)의 경우, 레이저 강도가 너무 높으면 원치 않는 녹색 형광이 보였다. 따라서 Opal 690은 보통/낮은 발현을 가진 유전자에 권장됩니다. 고도로 발현된 유전자로만 작업하는 경우 Opal 690(즉, 1/3,000)을 더 희석하고 이미지 수집 중에 특이하지 않은 녹색 형광을 포착하지 않는 것이 좋습니다. RNAscope 신호는 성적 증명서가 동일한 세포 프로파일 내에서 표현되는 경우에도 다른 색상의 별도의 점입니다. 그러나, 높게 표현된 녹취록을 위해, 개별 점을 보는 것이 불가능할지도 모르지만 오히려 세포질을 채우는 형광. 점이 다른 색상의 형광을 방출할 때, 다른 예들 중부적절한 획득 매개 변수 및 /또는 내인성 안료로 인해 특이하지 않은 형광의 문제를 고려할 수 있습니다. 마지막으로 오팔 570과 620은 배출 스펙트럼이 겹치기 때문에 동시에 사용해서는 안 됩니다.
관심 있는 조직에서 발현되는 것으로 알려진 유전자에 대해 RNAscope 신호가 관찰되지 않으면, 가능한 양성 프로브(즉, 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 isomerase B 하우스키핑 유전자)를 실행하여 조직의 무결성을 확인하는 것이 좋습니다. DAPI 카운터스테인링은 조직 품질을 결정하는 데도 도움이 됩니다. 잘게 썬 것처럼 보이는 DAPI 표지 된 핵은 과도한 소화 또는 부적절하게 고정 된 조직을 나타낼 수 있습니다.
그 결과, Ghsr는 Prdm12 양성 경구 포구성 뉴런의 작은 하위 집합으로 발현되었다. 대조적으로, 그리고 하나의 이전 연구 와 합의11, Ghsr mRNA는 노도스 발포성 뉴런에서 사실상 결석했다. qPCR및 ISH에 의해 이전에 검출된 Ghsr mRNA의 낮은 수준이 경정맥 성 포구성 뉴런30,31,32때문일 가능성이 있다고 추론된다. 한 이전 칼슘 신호 연구 보여주었다 3% 배양 vagal afferent 뉴런의 ghrelin에 응답49,Ghsr 표현 경구 포구성 뉴런의 백분율과 현저하게 유사한 숫자. Cck1r는 많은 Phox2b 양성 노도스 포이저트 뉴런에서 발현되었으며, 더 놀랍게도 Prdm12 양성 경구 성 포이퍼런트 뉴런의 하위 집합에서 발현되었습니다. 요약하자면, 이 논문은 경정맥고율 대강질량에서 선택된 GPCRs의 세포 분포를 평가하기 위해 기존 ISH 기법을 성공적으로 적응하는 것을 보여줍니다.
결론적으로, 멀티플렉스 ISH는 성인 마우스의 전체 vagal ganglionic 복합체에서 2개의 GPCR (Cck1r 및 Ghsr)와 1개의 전사 인자 (Phox2b 또는 Prdm12)에 대한 성적증명서를 검출하고 동시에 시각화하기 위해 사용되었다. 여기서 설명된 프로토콜은 RNA-시퀀싱, qPCR 및 전통적인 히스토로지에 대한 보완적인 도구가 될 수 있다. 그러나, 이 프로토콜은 유사한 크기의 다른 간질에 적용될 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 획득 매개 변수, 동물의 나이 및 해부의 일관성은 실험 설계 중에 고려해야 할 중요한 요소입니다. 따라서, 고이질 및 소형 신경절에서 지형 유전자 발현 패턴에 대한 고유 정보를 제공할 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 생리학적 및 병리 생리적 조건의 맥락에서 경구 대 노도스 포렌티트 뉴런의 전사 프로파일의 변화를 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 또한 영장류 및 돼지50,51을포함하여 전임상 연구에서 일반적으로 사용되는 동물 종에서 vagal 포퍼런트 뉴런의 신경 화학적 구성을 비교하는 데 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부금 #5P01DK119130-02에 의해 투자된 신경 해부학/히스토로지/뇌 주입 코어에 의해 지원되었습니다. 저자는 UT 남서부 라이브 세포 이미징 시설 (펠프스 박사가 이끄는)과 그 직원 (Abhijit Bugde 및 마르셀 Mettlen)의 도움을 인정하고 싶습니다, NIH 그랜트 #1S10OD021684-01에 의해 부분적으로 지원, 해롤드 C. 시몬스 암 센터의 공유 자원, NCI 암 센터 지원 보조금에 의해 부분적으로 지원, P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
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