Summary
Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.
Abstract
Este estudo descreve um protocolo para o multiplex in situ hibridização (ISH) do gânglio jugular-nodose do mouse, com ênfase especial na detecção da expressão de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). A gália jugular-nodose com formalina fixa foi processada com a tecnologia RNAscope para detectar simultaneamente a expressão de dois GPCRs representativos (receptores de colecistocina e grelina) em combinação com um gene marcador de nodose (homeobox emparelhado 2b, Phox2b) ou neurônios afferent (proteína de dedo de zinco 12, Prdm12). Os gânglios rotulados foram imagens usando microscopia confocal para determinar os padrões de distribuição e expressão das transcrições acima mencionadas. Resumidamente, os neurônios aferentes phox2b foram encontrados para expressar abundantemente o receptor de colecistocina (Cck1r), mas não o receptor de grelina (Ghsr). Um pequeno subconjunto de neurônios aferentes Prdm12 também foi encontrado para expressar Ghsr e/ou Cck1r. Potenciais ressalvas técnicas no projeto, processamento e interpretação do MULTIPLEX ISH são discutidas. A abordagem descrita neste artigo pode ajudar os cientistas a gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.
Introduction
Os corpos celulares de afferents vagais estão contidos na jugular, petrosal e nodose ganglia1,2,3. Seus axônios viajam juntos através de vários ramos do nervo vago para os territórios craniocervical, torácico e abdominal4,5,6,7. A partir de seus finais viscerais, os aferentes vagais podem responder a uma ampla gama de estímulos fisiológicos e nocivos8,9,10. No entanto, a distribuição de moléculas de sinalização e receptores envolvidos no sensor de detecção vagal permanece pouco caracterizada. Isso ocorre em parte porque os gânglios vagais, apesar de seu pequeno tamanho, expressam um amplo espectro de receptores, incluindo um grande número de GPCRs8,11,12,13. Além disso, os neurônios aferentes vagal são inerentemente heterogêneos e apresentam perfis moleculares distintos14. Para complicar a questão, a jugular, petrosal e nodose gânglios estão presos no rato, formando assim uma única massa gangliônica. Por último, em um subconjunto de animais, o gânglio de nodose é ligado ao simpático gânglio cervical superior15.
No passado, os pesquisadores recorreram à imunohistoquímica para estudar a maquiagem neuroquímica dos neurônios aferentesvagal 16,17,18. Embora a imunohistoquímica usando anticorpos validados seja útil, os resultados de estudos imunohistoquímicos devem ser interpretados com cautela. Por exemplo, inúmeros esforços para identificar anticorpos específicos contra GPCRs falharam19,20,21,22,23,24,25, levando os investigadores a concluir que a maioria dos anticorpos contra GPCRs não são confiáveis. Para contornar essas questões, o PCR quantitativo (qPCR) tem sido amplamente utilizado para avaliar a expressão genética na massa gangliônica do rodente vagal26,27,28,29. No entanto, examinar a expressão genética usando qPCR ocorre ao custo de uma perda de informações espaciais. Em particular, não se pode prever quantas células ou quais tipos de células expressam um determinado gene de interesse (por exemplo, nodose vs. células jugulares). As questões recorrentes também incluem a contaminação com tecidos adjacentes e a inclusão de comprimentos variáveis do nervo vago, gânglio cervical superior e jugular durante a dissecação15. Como resultado das dificuldades acima, a controvérsia envolve a expressão e distribuição de vários GPCRs em neurônios aferentes vagal. Um exemplo particularmente intrigante diz respeito ao receptor de grelina (Ghsr). Considerando que alguns estudos encontraram expressão generalizada deste receptor em neurônios aferentes vagal30,31,32, outros descobriram que Ghsr mRNA é quase indetectável no gânglio nodose11,14. O mapeamento detalhado do MRNA ghsr na massa gânnica vagal é, portanto, justificado.
A hibridização in situ (ISH) também tem sido utilizada para avaliar padrões de expressão genética na massa gânnica vagal7,11,12,33,34,35. Como as técnicas baseadas em RNA permanecem mais confiáveis e específicas do que as técnicas baseadas em anticorpos na maioria das circunstâncias36,37, estudos do ISH têm se mostrado valiosos para uma melhor compreensão da codificação neuroquímica de neurônios aferentes vagais. No entanto, as técnicas tradicionais do ISH em si não são sem ressalvas. O ISH radioativo é sensível, mas gera antecedentes e permanece pesado38. O ISH não radioativo é menos complicado, mas também menos sensível38. Em contraste, o método RNAscope ISH recentemente desenvolvido é altamente sensível e gera um mínimo de fundo39. O presente estudo aplicou o RNAscope fluorescente multiplex à detecção de GPCRs em neurônios aferentes do camundongo. Focamos no mapeamento da distribuição de Ghsr e comparamos sua distribuição com a do receptor de colecistocina (Cck1r), outro GPCR bem conhecido por ser expresso no gânglio34. Por fim, os dois fatores de transcrição, homeobox emparelhado 2b (Phox2b) e proteína de dedo de zinco de domínio pr 12 (Prdm12), foram usados como marcadores seletivos para neurônios aferentes de nodose e jugular,respectivamente 14. Sem visualizar Phox2b ou Prdm12, seria desafiador identificar as diferenças jugular vs. nodose com certeza. Potenciais armadilhas técnicas também são discutidas ao longo do artigo.
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Protocol
NOTA: Os camundongos utilizados neste estudo eram machos do tipo selvagem em um fundo C57BL/6J puro. Um total de 4 camundongos foram usados para multiplex ISH. Todos os ratos tinham aproximadamente 8 semanas de idade na época do sacrifício. Um rato macho (aproximadamente um ano de idade) também foi usado para demonstrar fluorescência endógena associada ao envelhecimento. Os animais estavam alojados em gaiolas ventiladas dentro de uma instalação de barreira com acesso a ad libitum a alimentos e água. O Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais do Centro Médico do Sudoeste da UT Southwestern analisou e aprovou os procedimentos descritos abaixo. Detalhes sobre reagentes e ferramentas podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
1. Coleta de amostras
- No dia do sacrifício, administre uma overdose de hidrato de cloro (500 mg/kg, i.p.) aos camundongos. Perfume os camundongos profundamente anestesiados transcardialmente usando uma bomba peristáltica com 5 mL de soro fisco tamponado de fosfato de 1x (PBS), seguido por 50 mL de 10% de formalina à temperatura ambiente.
NOTA: Isto é feito em um capô de fumaça para evitar a inalação de formalina. - À medida que a gânglios nodose, petrosal e jugular são fundidos para formar uma única massa gangliônica no rato15, coletar cuidadosamente toda a massa gânnica vagal de cada lado (esquerda e direita) com a ajuda de um escopo dissecando e tesouras de mola fina e fórceps (ver a Tabela dos Materiais).
- Ao decapitar o rato com um par de tesouras grandes (veja a Tabela de Materiais),evite esmagar o tronco cerebral.
- Seguindo uma abordagem de dissecção descrita antes no rato40,remova os músculos esternonóides e omohioides laterais à traqueia com pequenos fórceps(Tabela de Materiais) para expor o osso occipital. Limpe toda a região do músculo, tecido adiposo e tecido conjuntivo até que a artéria carótida, o nervo vago, o nervo hipoglossal e o foien magnum sejam visíveis. Corte todo o nervo hipoglossal com uma pequena tesoura de mola(Tabela de Materiais).
- Procure o gânglio de nodose como uma massa translúcida perto do foramen magnum15. Utilizando uma tesoura pequena(Tabela de Materiais),quebre cuidadosamente o osso occipital para expor ainda mais o gânglio jugular. Procure por melanócitos negros na superfície da jugular como um marco visual.
- Corte os apegos nervosos entre a massa gangliônica vagal e extraia toda a massa gangliônica puxando suavemente a extremidade periférica do nervo vago enquanto simultaneamente corta o gânglio jugular em direção ao tronco cerebral com uma pequena tesoura de mola(Tabela de Materiais).
- Remova o tecido conjuntivo e a gordura grudando no nervo vago e na massa gangliônica o máximo possível.
- Como é fácil perder um gânglio durante a transferência de um tubo para o outro, mantenha ~0,5 cm do nervo vago para facilitar o manuseio e localização das amostras.
- Coloque gânglios com a ajuda de fórceps finos em tubos de microcentrifus de 1,5 mL e incubar a 4 °C em formalina por 24h e com 30% de sacarose por mais 24 h.
- Posicione o gânglio dentro de uma pequena gota (~4 mm Ø) do meio de temperatura de corte ideal (OCT) em um pedaço de papel alumínio. Em seguida, congele a amostra em um leito de gelo seco.
- Corte as amostras com um criostat a -20 °C em seções de 14 μm de espessura e colete em lâminas de microscópio de vidro como 3 séries 42 μm de distância.
NOTA: Evite colocar seções próximas às bordas do slide. Para salvar os reagentes, mantenha as seções de tecido o mais apertadas possível, mas sem sobrepor. - Armazene as amostras em um congelador de -80 °C até que seja necessário para ish por pelo menos 6 meses.
NOTA: Consulte a Figura 1 para solucionar problemas para fluorescência endógena.
2. Pré-tratamento e ISH
- Antes do dia dos experimentos, vidros de laboratório autoclave para serem usados para ISH, incluindo pratos de coloração e frascos de tampão de lavagem.
NOTA: Enquanto trabalhar em condições sem RNase não é crítico, use luvas o tempo todo. Mantenha as garrafas de solução de descontaminação RNase(Tabela de Materiais) ao alcance no caso de suspeita de contaminação. - No primeiro dia, leve os slides à temperatura ambiente em um banco especificamente dedicado ao ISH. Enxágüe os slides em 1x PBS e asse-os por 30 minutos a 60 °C em um forno de cozimento(Tabela de Materiais).
- Corrija os slides em 4% de formalina para 15 min a 4 °C.
- Leve os reagentes no kit multiplex(Tabela de Materiais)para temperatura ambiente.
- Desidratar os slides em 50%, 70% e 100% etanol por 5 min cada. Aplique solução H2O2 às amostras por 10 minutos e depois enxágue em água duplamente destilada (ddH2O).
- Trate as amostras com o reagente de recuperação alvo por 5 min, enxágue em ddH2O seguido de 100% etanol e ar-seca. Usando uma caneta hidrofóbica, crie uma barreira ao redor das amostras.
NOTA: Não aplique a barreira hidrofóbica muito próxima das seções teciduais. - Aplique protease por 30 min a 40 °C em forno de hibridização(Tabela de Materiais).
- Enquanto isso, pré-aquece as sondas a 40 °C e esfrie-as à temperatura ambiente antes de usar. Incubar os slides com a combinação desejada de sondas-alvo (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; ou Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) por 2h a 40 °C em um forno de hibridização.
- Incubar tecido de controle negativo com a sonda C1 (Dihydrodipicolinate reductase) por 2h a 40 °C em forno de hibridização.
- Enxágüe os slides no tampão de lavagem e armazene durante a noite em 5x citrato de sódio salino (SSC) à temperatura ambiente. Por conveniência, divida o experimento em dois dias. No dia seguinte, enxágue os slides com tampão de lavagem e incuba-os com reagentes de amplificação listados abaixo (veja o manual do usuário na Tabela de Materiais).
- Aplique AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) e AMP 3 (15 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
- Dissolva cada corante opala (Tabela de Materiais) em sulfóxido de dimetil e armazene as soluções a 4 °C até que seja necessário.
- Para o canal 1, incubar os slides com HRP-C1 (15 min a 40 °C) e Opal 520 (cor verde; diluição 1/1.500; 30 minutos a 40°C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
- Para o canal 2, incubar os slides com HRP-C2 (15 min a 40 °C) e Opal 570 (cor amarela; diluição 1/1.500; para 30 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
- Para o canal 3, incubar os slides com HRP-C3 (15 min a 40 °C) e Opal 690 (cor vermelha distante; diluição 1/1.500; para 30 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.
- Lave os slides e exponha-os a 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) por 30 s.
- Aplique imediatamente o meio de montagem em cada lâmina e coloque uma mancha de cobertura sobre a seção tecidual.
- Mantenha os tecidos horizontais em um suporte de deslizamento a 4 °C até a imagem.
3. Microscopia e análise de dados
NOTA: Os dados multiplex ISH podem ser visualizados com uma ampla gama de instrumentos com os filtros apropriados. No entanto, um método de imagem preferido é a microscopia confocal com objetivos de 20x e 63x (óleo); referem-se à discussão pelas razões. Consulte a Figura 2 para determinar a relação sinal-ruído ideal.
- Use um microscópio confocal equipado com linhas laser de 488, 561 e 633 nm. Use os seguintes parâmetros de aquisição (ver Tabela 1): Opal 690 (HeNe 633 nm, faixa de detecção 668-696 nm, potência 2.0, ganho 724); Opala 570 (laser DPSS 561 nm, faixa de detecção 579-627 nm,
- Para melhorar a qualidade das imagens, adquira com uma média de linha de 4 e um tamanho de pixel de pelo menos 1024 x 1024.
NOTA: Os parâmetros acima são fornecidos apenas como exemplo, e modificações são recomendadas dependendo de um instrumento, ampliação (20x ou 63x), níveis de expressão e níveis endógenos de fluorescência para qualquer tecido.- Uma vez satisfeito com os parâmetros de aquisição, colete imagens usando as mesmas configurações. Atribua cores falsas a cada canal para facilitar a visualização.
NOTA: Por exemplo, vermelho (Phox2b ou Prdm12), ciano (Cck1r), amarelo (Ghsr) e cinza (DAPI).- Realize a contagem de células usando as imagens digitais identificando o contorno de perfis RNAscope positivos com um núcleo levemente manchado com DAPI. Calcule a porcentagem de perfis rnascope-positivos expressando cada transcrição [Figura 3A-C].
- Para melhorar o rigor e a precisão das estimativas, conte pelo menos 2.000 perfis neuronais de pelo menos 4 animais diferentes. Faça a contagem de gânglios esquerdo e direito separadamente.
- Insira os dados em um gráfico de tortas com o número total de perfis contados.
- Use software de imagem para adquirir imagens e costurar imagens 20x. Use ImageJ-Fiji e outro software de foto e design para gerar as placas finais. Aplique ajustes de contraste e leveza uniformemente a todas as imagens.
- Para melhorar a qualidade das imagens, adquira com uma média de linha de 4 e um tamanho de pixel de pelo menos 1024 x 1024.
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Representative Results
Embora o RNAScope possa ser aplicado a animais de qualquer idade, sexo ou origem genética, é aconselhável trabalhar com adultos jovens (<3 meses de idade). Isso ocorre porque artefatos fluorescentes (por exemplo, lipofuscina) são achados comuns em neurônios de animais mais velhos41. Os gânglios fixos formalina de camundongos mais velhos geralmente contêm fluorescência endógena surpreendentemente intensa que pode ser facilmente confundida com coloração genuína(Figura 1A, B). De qualquer forma, é aconselhável verificar os níveis de fluorescência endógena no tecido antes do processamento.
É importante determinar os parâmetros de aquisição ideais e a relação sinal-ruído para cada laser e ampliação utilizando seções de um tecido de controle negativo incubado com a sonda negativa DapB, conforme mostrado na Figura 2A,B. Como o DapB é um gene procariótico, os sinais rnascope devem estar completamente ausentes do tecido de controle negativo. Além de detritos e cristais ocasionais, a fluorescência insignificante é vista em imagens de tecidos de controle negativos, desde que os parâmetros de aquisição sejam usados. No entanto, acima de um certo poder e ganho de laser, o fundo indesejado e pontos fluorescentes aleatórios começam a aparecer(Figura 2C). Outro objetivo de minimizar a potência do laser é evitar a saturação de pixels e o fotobleaching. Não foram observadas grandes questões de branqueamento de fluorescência ao trabalhar com os parâmetros acima. Se tal problema surgir, é aconselhável cobrir o tecido com um meio de montagem para células fluorescentes rotuladas(Tabela de Materiais),além de diminuir a potência do laser o máximo possível (veja os parâmetros recomendados na Tabela 1).
A técnica RNAscope foi aplicada para a detecção de 3 genes em seções teciduais da massa gangliônica vagal do camundongo (Figura 3 e Figura 4). Um perfil foi considerado positivo para Ghsr e/ou Cck1r quando pontos amarelos e/ou cianos, respectivamente, foram vistos sobrepondo um perfil preenchido com pontos vermelhos(Figura 3A-C). O exemplo dado na Figura 3 mostra muitos perfis contendo transcrições phox2b e Cck1r(Figura 3D). Phox2b foi usado para identificar neurônios aferentes nodose. Sinais abundantes de Phox2b acumulados nos neurônios do gânglio de nodose (Figura 4A, B). Os sinais de Cck1r foram detectados em aproximadamente 52% das células Phox2b(Figura 4C). Note-se que os níveis de expressão para Cck1r variaram muito entre as células, variando de moderada (~20 pontos por perfil) a rotulagem intensa (preenchimento de citoplasma). Em contraste, os sinais para Ghsr eram extremamente escassos no gânglio de nodose (Figura 4A,B). Apenas 0,65% das células phox2b positivas também foram positivas para transcrições de Ghsr(Figura 4C). Células que expressam ghsr muitas vezes co-expressavam Cck1r. Um levantamento visual dos tecidos não revelou diferenças óbvias entre os gânglios esquerdo e direito. Os sinais ish estavam praticamente ausentes de áreas desprovidas de neurônios (por exemplo, epineurium e trato de fibras).
Prdm12 foi usado para identificar neurônios aferentes jugular. Como esperado, a expressão prdm12 foi altamente enriquecida nos neurônios do gânglio jugular e alguns neurônios infiltrando-se na porção rostral do gânglio nodose (Figura 5A-C). Curiosamente, os sinais de Cck1r foram detectados em um subconjunto de células Prdm12(Figura 5B,C). Pouco menos de 9% dos neurônios prdm12 positivos também expressaram Cck1r (Figura 5D). No entanto, o gânglio jugular contém apenas células com níveis moderados de Cck1r (<20 pontos por células) em vez das células Cck1r-positivas fortemente rotuladas comumente encontradas no gânglio de nodose. As células ghsr-positivas foram significativamente mais prevalentes na jugular do que na nodose (Figura 5C). Aproximadamente 3% das células Prdm12 também eram Ghsr-positive (Figura 5D). Curiosamente, 1% de todos os Prdm12 co-expressos tanto Ghsr quanto Cck1r. Os níveis de expressão para Ghsr sempre foram moderados (<20 pontos por célula). Nenhum sinal ish podia ser visto em áreas desprovidas de neurônios.
Figura 1: Problemas de solução de problemas de fluorescência endógena. (A, B) Fluorescência endógena no gânglio nodose/jugular de um rato envelhecido (~1 ano de idade). As imagens digitais foram adquiridas por microscopia confocal usando as linhas laser indicadas em cores e parâmetros de aquisição idênticos aos utilizados para multiplex ISH com camundongos mais jovens (ver mais tarde). É importante ressaltar que o tecido fixo não foi processado de forma diferente de ser armazenado a -80 °C e exposto ao DAPI. Como mostrado em A, um nível significativo de fluorescência indesejada é observado em células neuronais e não-neuronais, especialmente quando exposto ao laser de 488 nm (verde). Este é um achado comum na histologia, que garante avaliar fluorescência endógena antes da análise histológica. (B) Na ampliação mais elevada, a fluorescência se assemelhava a pigmentos lipofuscina que muitas vezes se acumulam em células envelhecidas e poderiam ser facilmente confundidos com sinais genuínos de imunoreatividade e/ou RNAScope. Barras de escala = 158 μm(A) e 15 μm(B). (B). Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôle; NG = gânglio de nodose; ISH = hibridização in situ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Determinando a relação sinal-ruído ideal. (A, B) Controle negativo consistindo na detecção de RNAScope para o gene procariótico DapB. Note que a fluorescência endógena no gânglio de nodose de um rato adulto jovem é mínima, e que a incubação com a sonda DapB não resultou em sinais. Os parâmetros de aquisição eram idênticos aos utilizados para o MULTIPLEX ISH. Isso mostra que o procedimento RNAScope em si não produz nenhum fundo significativo se os parâmetros de aquisição forem escolhidos cuidadosamente. (C) Imagens digitais do mesmo tecido adquirido no aumento do laser de potência e ganho com o laser de 488 nm. Observe como alguns fundos verdes felpudos e pontos ocasionais surgem acima de um certo poder laser e ganho. Assim, é importante escolher cuidadosamente parâmetros de aquisição para cada laser com base na quantidade de fluorescência inespecífica obtida no tecido de controle negativo. Barras de escala = 158 μm(A) e 15 μm(B, C). Abreviaturas: DapB = dihidrodipicolinate reductase; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; NG = gânglio de nodose; ISH = hibridização in situ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Identificação e contagem de perfis positivos. (A) Imagem digital representativa de perfis rotulados por Phox2b (vermelho) na parte rostral do gânglio nodose. Neste exemplo, foram identificados 18 perfis celulares (rotulados como 1 a 18). Observe que a coloração da DAPI ajuda ainda mais na localização de neurônios, que tipicamente exibiam um núcleo grande e redondo com mancha da DAPI leve. Em contraste, os núcleos das células não neuronais são brilhantemente rotulados, alongados e menores em tamanho. No geral, os sinais do RNAScope estão de acordo com a distribuição e forma das células neuronais e não neuronais. (B) Dois neurônios ghsr-positivos rotulados (amarelo) são mostrados (perfis 19 e 20). Os sinais de ghsr eram escassos e difíceis de ver. Portanto, a leveza e a saturação dos sinais amarelos foram seletivamente e uniformemente aprimoradas no software fotográfico. (C) São identificados nove perfis rotulados por Cck1r (ciano) (rotulados como 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 e 19). Note como a intensidade dos sinais de Cck1r variava muito entre as células. Por exemplo, o perfil 11 contém apenas alguns sinais positivos, enquanto o perfil 7 está quase preenchido com sinais Cck1r. (D) Uma visão mesclada de todos os canais permitiu a identificação de padrões de colocalização. Muitos perfis phox2b positivos também co-expressaram Cck1r (por exemplo, perfis 2, 8 e 14), como evidenciado por pontos RNAScope vermelhos e cianos dentro do mesmo perfil celular. Em contraste, os perfis phox2b positivos não expressaram transcrições de Ghsr (perfis 19 e 20). No entanto, uma célula ghsr-positiva também expressou baixos níveis de Cck1r (perfil 19). Os dois grandes núcleos manchados de DAPI rotulados com um asterisco branco presumivelmente correspondem à localização de neurônios aferentes phox2b-negativos desprovidos de sinais RNAScope. Nos resultados representativos descritos abaixo, pelo menos 2.000 perfis neuronais foram contados a partir de massas gangliônicas esquerda e direita de 4 animais diferentes. Barras de escala = 24 μm. Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôdole; Phox2b = homeobox emparelhado 2b; Ghsr = receptor de grelina; Cck1r = receptor de colecistocina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos do multiplex ISH em neurônios aferentes nodose. Imagens digitais de uma massa gangliônica vagal representativa rotulada com multiplex RNAscope para Phox2b, Cck1r e Ghsr. Foram adquiridas imagens com os objetivos de 20x (A) e 63x(B, C)de um microscópio confocal (Zeiss LSM880). Em A, 20× várias imagens foram costuradas usando o software Zen e apresentadas como canais não misturados ou mesclados. Sinais de phox2b (vermelho) especificamente acumulados em neurônios diferentes localizados no gânglio de nodose. Como esperado, os sinais de Cck1r (ciano) rotularam intensamente muitos, mas não todos, neurônios no gânglio de nodose. Em baixa ampliação, as células expressas baixos níveis de Cck1r ou quaisquer células com sinais de Ghsr (amarelo) não puderam ser observadas facilmente. O DAPI (cinza) ajudou a visualizar o tecido e identificar neurônios aferentes vagal com um núcleo grande e levemente manchado. O inset branco na imagem mesclada corresponde aos locais da imagem incluída abaixo. (B) Em alta ampliação, perfis phox2b positivos (vermelho) são evidentes. Muitas células também expressavam Cck1r, mas em níveis variados, variando de moderada a muito alta. O perfil "1" é um exemplo de uma célula phox2b negativa para Cck1r e Ghsr. Perfis "2" e "3" são células Phox2b com sinais Cck1r altos e moderados, respectivamente. Sinais moderados para Ghsr (amarelo) eram ocasionalmente vistos no gânglio de nodose rostral, mas quase sempre em células negativas para Phox2b, como mostrado com o perfil "4". Curiosamente, o perfil "4" expressou ghsr e Cck1r. Como mostrado na figura seguinte, Ghsr foi mais abundante em células Prdm12. (C) Gráfico de tortas resumindo as estimativas da porcentagem de células Phox2b (vermelhas) co-expressando ghsr (amarelo), Cck1r (ciano) ou ambos (cinza). O número total de perfis contados é indicado ao lado do gráfico (n=4 gânglios diferentes, esquerda e direita combinados). Os resultados de cada lado foram agrupados porque não foram notadas diferenças. Barras de escala = 158 μm(A) e 15 μm(B). Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôdole; NG = gânglio de nodose; JG = gânglio jugular; ISH = hibridização in situ; Phox2b = homeobox emparelhado 2b; Ghsr = receptor de grelina; Cck1r = receptor de colecistocina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos de neurônios afferentares jugular multiplex ISH. Imagens digitais de uma massa gangliônica vagal representativa rotulada com multiplex RNAscope Prdm12, Cck1r e Ghsr. Foram adquiridas imagens com os objetivos de 20x (A) e 63x(B, C)de um microscópio confocal (Zeiss LSM880). Em A, 20× várias imagens foram costuradas usando o software Zen e apresentadas como canais não misturados ou mesclados. Transcrição prdm12 (vermelho) especificamente acumulada em neurônios diferentes localizados no gânglio jugular e apenas alguns neurônios infiltrando-se na parte rostral do gânglio nodose. Sinais Cck1r (ciano) intensamente rotulados o gânglio nodose. Em baixa ampliação, as células expressando baixos níveis de Cck1r ou qualquer célula com sinais de Ghsr (amarelo) não podiam ser vistas facilmente. O DAPI (cinza) ajudou a visualizar o tecido e identificar neurônios aferentes vagal com um núcleo grande e levemente manchado. Os dois insets brancos na imagem mesclada correspondem aos locais das imagens incluídas abaixo. (B, C) Em alta ampliação, perfis celulares prdm12 positivos (vermelho) podem ser delineados. Sinais moderados para Cck1r também foram detectados nos perfis "1" e "2". O perfil "3" é representativo de células Prdm12 negativas para Cck1r ou Ghsr. Em C,os sinais de Ghsr (amarelo) são vistos no perfil representativo "4" mas não em "5". (D) Gráfico de tortas resumindo as estimativas da porcentagem de células Prdm12 (vermelhas) co-expressando ghsr (amarelo), Cck1r (ciano) ou ambos (cinza). O número total de perfis contados é indicado ao lado do gráfico (n=4 gânglios diferentes, esquerda e direita combinados). Os resultados de cada lado foram agrupados porque não foram notadas diferenças. Barras de escala = 158 μm(A) e 15 μm(B, C). Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôdole; NG = gânglio de nodose; JG = gânglio jugular; ISH = hibridização in situ; Prdm12 = Proteína do dedo de zinco de domínio PR 12; Phox2b = homeobox emparelhado 2b; Ghsr = receptor de grelina; Cck1r = receptor de colecistocina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Opala | Linha laser | Faixa de detecção | poder | ganhar | Média da linha | Tamanho do pixel |
| Opala 690 | HeNe 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opala 570 | Laser DPSS 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opala 520 | laser de argônio 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI | laser de diodo 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
Tabela 1: Parâmetros de aquisição. Abreviação: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôle.
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Discussion
A técnica do ISH foi inventada no final da década de 196042. No entanto, não é até meados da década de 1980 que foi aplicado para a detecção de mRNAs nos sistemas nervosos central e periférico43,44. Considerando a heterogeneidade do sistema nervoso e questões recorrentes com anticorpos, a localização de uma transcrição específica no nível celular continua sendo uma ferramenta inestimável. No entanto, os métodos tradicionais do ISH têm permanecido laboriosos e variavelmente sensíveis. Felizmente, este estudo utilizou um procedimento ISH altamente sensível chamado RNAscope, que geralmente não gera antecedentes e permite a detecção de várias transcrições expressas em níveis baixos45,46. Especificamente, multiplex fluorescente RNAScope foi solicitado para a detecção simultânea das transcrições ghsr e Cck1r. Os fatores de transcrição, Phox2b e Prdm12, foram ainda utilizados como marcadores seletivos para diferenciar neurônios aferentes de nodose e jugular, respectivamente. Sem visualizar Phox2b e Prdm12, seria desafiador identificar neurônios aferentes jugular vs. nodose com certeza. Como explicado acima, um passo crítico inclui uma técnica de dissecção consistente e adequada. Além disso, a verificação da fluorescência endógena também é um fator importante, pois pode ser facilmente confundida com sinais de RNAScope. Além disso, a escolha de parâmetros de aquisição adequados com base no tecido de controle negativo é fortemente aconselhável. Como mencionado anteriormente, a microscopia confocal é o método de imagem preferido com objetivos de 20x e 63x (óleo) porque 1) transcrições expressas em níveis baixos e/ou em células esparsas só podem ser perceptíveis em alta ampliação. 2) A microscopia confocal permite a coleta de um único plano focal, o que é importante considerando que duas células em cima uma da outra podem aparecer erroneamente como uma célula quando imagens por epifluorescência. 3) A microscopia confocal também permite parâmetros de aquisição mais seletivos e flexíveis. Os parâmetros de aquisição acima são fornecidos apenas como exemplo, e modificações são recomendadas dependendo de um instrumento, ampliação (20x ou 63x), níveis de expressão e níveis endógenos de fluorescência para qualquer tecido. O procedimento de coloração em si permaneceu muito próximo ao do protocolo recomendado com apenas pequenos ajustes. Obviamente, o protocolo descrito aqui pode ser aplicado à detecção de quaisquer transcrições, não apenas GPCRs. O procedimento aqui descrito é, no entanto, particularmente útil considerando as questões recorrentes com anticorpos levantados contra as GPCRs24.
Como discutido anteriormente15, o gânglio de nodose do rato às vezes é anexado ao gânglio cervical superior por uma ponte celular. A inclusão desta ponte celular pode levar a resultados confusos, por exemplo, marcadores não-vagais sendo detectados no gânglio de nodose. O investigador pode querer verificar sistematicamente se o gânglio de nodose está ligado ao gânglio cervical superior durante a dissecção. Caso contrário, habilidades inconsistentes de dissecção entre gânglios introduzirão variabilidade experimental. Também é importante notar que tanto os neurônios petrosal quanto o nodose expressam Phox2b47. Assim, o que chamamos de neurônios diferentes incluíam neurônios petrosais e nodoses. Por fim, ao comparar diferentes estudos, deve-se ter em mente que diferentes métodos de eutanásia podem causar alterações na expressão genética48.
Em teoria, os fluoroforos utilizados para detecção podem ser intercambiavelmente atribuídos a qualquer canal. No entanto, o Opal 690 foi encontrado para emitir um baixo nível de fluorescência verde. Na maioria das circunstâncias, no caso de transcrições altamente expressas (por exemplo, Prdm12), a fluorescência verde indesejada era vista se a intensidade do laser era muito alta. Opala 690 é, portanto, recomendado para genes com expressão moderada/baixa. Se apenas trabalhar com genes altamente expressos, recomenda-se diluir o Opal 690 ainda mais (ou seja, 1/3.000) e não capturar fluorescência verde inespecífica durante a aquisição de imagem. Os sinais rnascope são pontos separados de cores diferentes, mesmo quando as transcrições são expressas dentro do mesmo perfil de célula. No entanto, para transcrições altamente expressas, pode não ser possível ver pontos individuais, mas sim fluorescência preenchendo o citoplasma. Quando os pontos emitem fluorescência de cores diferentes, pode-se considerar um problema de fluorescência inespecífica devido, entre outros exemplos, parâmetros de aquisição inadequados e/ou pigmentos endógenos. Por último, o Opal 570 e 620 não devem ser utilizados simultaneamente porque seus espectros de emissão se sobrepõem.
Se nenhum sinal rnascope for observado para um gene conhecido por ser expresso no tecido de interesse, é aconselhável verificar a integridade do tecido executando uma sonda positiva disponível (ou seja, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B housekeeping gene). A contra-retenção de DAPI também é útil para determinar a qualidade do tecido. Núcleos rotulados pelo DAPI que parecem triturados podem indicar digestão excessiva ou tecido mal fixado.
Como resultado, Ghsr foi expresso em um pequeno subconjunto de neurônios aferentes de Jugular Prdm12 positivo. Em contraste, e de acordo com um estudo anterior11, Ghsr mRNA estava praticamente ausente de neurônios diferentes. Deduz-se que os baixos níveis de Ghsr mRNA detectados anteriormente por qPCR e ISH foram provavelmente devido aos neurônios aferentes jugular30,31,32. Um estudo anterior de sinalização de cálcio mostrou que 3% dos neurônios aferentes de vagal cultivados respondem à grelina49, um número que é notavelmente semelhante à porcentagem de neurônios afferent expressantes de jugular que expressam ghsr. Cck1r foi expresso em muitos neurônios nodose positivos phox2b e, mais surpreendentemente, em um subconjunto de neurônios afferent de Jugular Prdm12 positivo. Em resumo, este artigo demonstra a adaptação bem-sucedida das técnicas ish existentes para avaliar a distribuição celular de GPCRs selecionados na massa gangliônica jugular-nodose em sua totalidade.
Em conclusão, multiplex ISH foi empregado para detectar e visualizar simultaneamente as transcrições de dois GPCRs (Cck1r e Ghsr) e um fator de transcrição (Phox2b ou Prdm12) em todo o complexo ganglítico vagal do mouse adulto. O protocolo descrito aqui pode ser uma ferramenta complementar ao RNA-Sequencing, qPCR e histologia tradicional. No entanto, este protocolo pode ser aplicado a outros gânglios de tamanho semelhante. Como discutido acima, parâmetros de aquisição, idade dos animais e consistência da dissecção são fatores importantes a serem considerados durante o desenho experimental. Portanto, pode oferecer informações únicas sobre os padrões topográficos de expressão genética em um gânglio altamente heterogêneo e pequeno. Este protocolo poderia ser usado para determinar alterações nos perfis transcritivos de neurônios aferentes jugular vs. nodose no contexto de várias condições fisiológicas e fisiofisiológicas, incluindo, mas não se limitando a, mudanças no estado alimentar. Também pode ser usado para comparar a maquiagem neuroquímica de neurônios aferentes vagal em espécies animais comumente utilizadas em pesquisas pré-clínicas, incluindo primatas e suínos50,51.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Núcleo de Neuronatomia/Histologia/Injeção Cerebral financiado pela concessão do NIH #5P01DK119130-02. Os autores gostariam de reconhecer a assistência do UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (liderado pelo Dr. Phelps) e sua equipe (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), apoiado em parte pelo NIH Grant #1S10OD021684-01, um recurso compartilhado do Centro de Câncer Harold C. Simmons, apoiado em parte por uma subvenção de apoio ao Centro de Câncer NCI, P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
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