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Neuroscience

सीटू संकरण में मल्टीप्लेक्स का उपयोग करके माउस वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स में जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर अभिव्यक्ति का पता लगाना

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62945
Automatic Translation
1, 1
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Summary

सीटू संकरण (ISH) में मल्टीप्लेक्स को वयस्क माउस के पूरे वागल गैंगलियोनिक परिसर में दो जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स और एक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के लिए टेप की कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वेगल एफेरेंट न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सटीक नक्शे उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

इस अध्ययन में माउस जुगलबंदी-नोज गैंगलिया के सीटू संकरण (ISH) में मल्टीप्लेक्स के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसमें जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) की अभिव्यक्ति का पता लगाने पर विशेष जोर दिया गया है। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड जुगलबंदी-नोडोज गैंगलिया को आरएनएस्कोप तकनीक के साथ संसाधित किया गया था ताकि एक साथ दो प्रतिनिधि जीपीसीआरएस (कोलेसिस्टोकिनिन और घोरलिन रिसेप्टर्स) की अभिव्यक्ति का पता लगाया जा सके, जो या तो नोडोज (जोड़ी-जैसे होमोबॉक्स 2b, फोक्स2बी) या जुगुलर एफेरेंट न्यूरॉन्स (पीआर डोमेन जिंक फिंगर प्रोटीन 12, Prdm12) के एक मार्कर जीन के संयोजन में था। लेबल किए गए गैंगलिया को उपरोक्त टेप के वितरण और अभिव्यक्ति पैटर्न निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेज किया गया था। संक्षेप में, Phox2b afferent न्यूरॉन्स बहुतायत से कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर (Cck1r) व्यक्त करने के लिए पाया गया, लेकिन नहीं ghrelin रिसेप्टर (Ghsr) । Prdm12 afferent न्यूरॉन्स का एक छोटा सा सबसेट भी Ghsr और/या Cck1r व्यक्त करने के लिए पाया गया था । मल्टीप्लेक्स ISH के डिजाइन, प्रसंस्करण और व्याख्या में संभावित तकनीकी चेतावनी पर चर्चा की जाती है । इस लेख में वर्णित दृष्टिकोण वैज्ञानिकों को वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सटीक नक्शे उत्पन्न करने में मदद कर सकता है।

Introduction

वागल एफरेंट्स के सेल निकायों में जुगुलर, पेट्रोसल और नोडोज गैंगलिया1,2,3शामिल हैं। उनके अक्षों को एक साथ वेगस तंत्रिका की कई शाखाओं के माध्यम से क्रैनियोसर्विकल,वक्ष और पेट केक्षेत्रों 4,5,6, 7तक यात्राकरतेहैं। उनके आंत के अंत से, वैगल एफरेंट्स शारीरिक और हानिकारक उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का जवाब दे सकते हैं8,9,10। हालांकि, वैगल सेंसिंग में शामिल सिग्नलिंग अणुओं और रिसेप्टर्स का वितरण खराब विशेषता बना हुआ है। यह आंशिक रूप से इसलिए है क्योंकि वागल गैंगलिया, अपने छोटे आकार के बावजूद, रिसेप्टर्स का एक व्यापक स्पेक्ट्रम व्यक्त करते हैं, जिसमें बड़ी संख्या में जीपीसीआर8,11,12, 13शामिल हैं। इसके अलावा, vagal afferent न्यूरॉन्स स्वाभाविक विषम हैं और अलग आणविक प्रोफाइल14प्रदर्शित करते हैं । मामले को जटिल बनाने के लिए, माउस में जुगुलर, पेट्रोसल और नोडोज गैंगलिया संलग्न होते हैं, जिससे एक ही गैंगलियोनिक द्रव्यमान बन जाता है। अंत में, जानवरों के सबसेट में, नोडोज गैंगलियन सहानुभूति बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलियन15से जुड़ा हुआ है।

अतीत में, जांचकर्ताओं ने वैगल एफेरेंट न्यूरॉन्स16, 17, 18के न्यूरोकेमिकल मेकअप का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोहिस्टकेमिस्ट्री की ओर रुख किया है। जबकि मान्य एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री उपयोगी है, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययनों के परिणामों की सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, जीपीसीआर के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने के कईप्रयास19, 20,21,22,23,24,25,प्रमुख जांचकर्ताओं को यह निष्कर्ष निकालने में विफल रहे हैं कि जीपीसीआर के खिलाफ अधिकांश एंटीबॉडी अविश्वसनीय हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, कृंतक वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान 26 , 27 ,28,29में जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है । हालांकि, क्यूपीसीआर का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति की जांच स्थानिक जानकारी के नुकसान की कीमत पर होती है। विशेष रूप से, यह अनुमान नहीं लगाया जा सकता कि कितनी कोशिकाएं या कौन सी कोशिका प्रकार (एस) ब्याज के एक विशेष जीन को व्यक्त करती हैं (उदाहरण के लिए, नोडोज बनाम जुगुलर कोशिकाएं)। आवर्ती मुद्दों में आसन्न ऊतकों के साथ संदूषण और विच्छेदन15के दौरान वेगस तंत्रिका, बेहतर गर्भाशय ग्रीवा और जुगुलर गैंगलिया की चर लंबाई को शामिल करना भी शामिल है। उपरोक्त कठिनाइयों के परिणामस्वरूप, विवाद वैगल एफेरेंट न्यूरॉन्स में कई जीपीसीआर की अभिव्यक्ति और वितरण को घेरे हुए है। एक विशेष रूप से पेचीदा उदाहरण ghrelin रिसेप्टर (Ghsr) से संबंधित है। जबकि कुछ अध्ययनों में इस रिसेप्टर की व्यापक अभिव्यक्ति वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स30 , 31,32में पाई गई है , अन्य ने गस्सर एमआरएनए को नोडोज गैंगलियन 11,14में लगभग अज्ञेय पाया है । इसलिए वागल गैंगलियोनिक द्रव्यमान में जीएचएसआर एमआरएनए की विस्तृत मैपिंग की आवश्यकता है।

सीटू संकरण (ISH) में भी वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान 7 , 11,12,33,34,35में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। चूंकि आरएनए-आधारित तकनीकें अधिकांश परिस्थितियों में एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों की तुलना में अधिक विश्वसनीय और विशिष्ट बनी हुई हैं36,37,ईश अध्ययन ने वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स के न्यूरोकेमिकल कोडिंग की बेहतर समझ के लिए मूल्यवान साबित किया है। बहरहाल, पारंपरिक ISH तकनीकों खुद चेतावनी के बिना नहीं कर रहे हैं । रेडियोधर्मी ईश संवेदनशील है लेकिन पृष्ठभूमि उत्पन्न करता है और38बोझिल रहता है । गैर रेडियोधर्मी ISH कम जटिल है, लेकिन यह भी कम संवेदनशील३८। इसके विपरीत, हाल ही में विकसित आरएनएस्कोप ईश विधि अत्यधिक संवेदनशील है और न्यूनतम पृष्ठभूमि39उत्पन्न करती है। वर्तमान अध्ययन ने माउस के वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स में जीपीसीआर का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आरएनएस्कोप को लागू किया। हमने जीएचएसआर के वितरण की मैपिंग पर ध्यान केंद्रित किया और इसके वितरण की तुलना कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर (Cck1r) से की, एक और जीपीसीआर जिसे नोडोज गैंगलियन34में व्यक्त किया जाना जाता है। अंत में, दो प्रतिलेखन कारकों, बनती-जैसे होमोबॉक्स 2b (Phox2b) और पीआर डोमेन जिंक फिंगर प्रोटीन 12 (Prdm12), क्रमशः14,nodose और जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स के लिए चयनात्मक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया । Phox2b या Prdm12 की कल्पना किए बिना, निश्चितता के साथ जुगलबंदी बनाम नोडोज afferents की पहचान करना चुनौतीपूर्ण होगा। संभावित तकनीकी नुकसान भी लेख भर में चर्चा कर रहे हैं ।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहों एक शुद्ध C57BL/6J पृष्ठभूमि पर जंगली प्रकार के पुरुष थे । मल्टीप्लेक्स ईश के लिए कुल 4 चूहों का इस्तेमाल किया गया। बलिदान के समय सभी चूहे लगभग 8 सप्ताह पुराने थे। एक पुरुष माउस (लगभग एक साल का) भी उम्र बढ़ने के साथ जुड़े अंतर्जात फ्लोरेसेंस प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । जानवरों को भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum उपयोग के साथ एक बाधा सुविधा के भीतर हवादार पिंजरों में रखे गए थे । यूटी वेस्टर्न मेडिकल सेंटर इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमिटी ने नीचे वर्णित प्रक्रियाओं की समीक्षा की और उन्हें मंजूरी दी । सामग्री की तालिका में अभिकर् ती और उपकरणों के बारे में विवरण पाया जा सकता है।

1. नमूना संग्रह

  1. बलिदान के दिन, चूहों को क्लोरल हाइड्रेट (500 मिलीग्राम/किलो, यानी) का ओवरडोज दिलाएं। 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 5 एमएल के साथ एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके गहराई से एनेस्थेटाइज्ड चूहों को पर्फ्यूज करें और इसके बाद कमरे के तापमान पर 10% फॉर्मेलिन के 50 एमएल।
    नोट: यह फॉर्मेलिन के साँस लेने को रोकने के लिए एक धुएं हुड में किया जाता है।
  2. जैसे ही नोडोज, पेट्रोसल और जुगलबंदी गैंगलिया को माउस15में एक ही गैंगलियोनिक द्रव्यमान बनाने के लिए जोड़ा जाता है, ध्यान से प्रत्येक पक्ष (बाएं और दाएं) से पूरे वागल गैंगलियोनिक द्रव्यमान को विच्छेदन गुंजाइश और ठीक वसंत कैंची और संदंश (सामग्रियों की मेजदेखें) की मदद से इकट्ठा करें।
  3. बड़ी कैंची की एक जोड़ी के साथ माउस को काटना (सामग्री की मेजदेखें), ब्रेनस्टेम को कुचलने से बचें।
  4. चूहे40में पहले वर्णित विच्छेदन दृष्टिकोण के बाद, ऑक्सीपिटल हड्डी को बेनकाब करने के लिए छोटे संदंश(सामग्री की मेज) केसाथ ट्रेकिया के लिए स्टर्नोहाइड्र और ओमोहॉयइड मांसपेशियों को हटा दें। मांसपेशियों के पूरे क्षेत्र को साफ़ करें, ऊतक, और संयुक्त ऊतक जब तक कैरोटिड धमनी, वेगस तंत्रिका, हाइपोग्लोसल तंत्रिका, और फोरमेन मैग्नम दिखाई नहीं देते। छोटे वसंत कैंची(सामग्री की मेज)के साथ पूरे हाइपोग्लॉसल तंत्रिका काटें।
  5. नोडोज गैंगलियन की तलाश फोर्लुज़ गैंगलियन के रूप में फोरमेन मैग्नम15के करीब एक पारदर्शी द्रव्यमान के रूप में। छोटी कैंची(सामग्री की मेज) काउपयोग करना, सावधानी से जुगलबंदी गैंगलियन को बेनकाब करने के लिए ऑक्सीपिटल हड्डी को तोड़ें। एक दृश्य मील का पत्थर के रूप में जुगलबंदी की सतह पर काले मेलानोसाइट्स के लिए देखो।
  6. वेगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान के बीच तंत्रिका अनुलग्नकों को काटें और धीरे-धीरे वायस तंत्रिका के परिधीय छोर पर खींचकर पूरे गैंगलियोनिक द्रव्यमान को निकालें, जबकि साथ ही छोटे वसंत कैंची(सामग्री की तालिका) केसाथ ब्रेनस्टेम की ओर जुगुलर गैंगलियन को काटते हुए।
  7. जितना हो सके वैगस तंत्रिका और गैंगलियोनिक द्रव्यमान से चिपके हुए कंजक्टिव टिश्यू और फैट को हटा दें।
  8. चूंकि एक ट्यूब से दूसरे में स्थानांतरण के दौरान एक गैंगलियन खोना आसान है, इसलिए नमूनों की हैंडलिंग और स्थानीयकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए ~ 0.5 सेमी वैगस तंत्रिका रखें।
  9. 1.5 मिली लीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में ठीक संदंश की मदद से गंगलिया रखें और 24 घंटे के लिए फॉर्मलिन में 4 डिग्री सेल्सियस पर और अन्य 24 घंटे के लिए 30% सुक्रोज के साथ।
  10. एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर इष्टतम काटने के तापमान (OCT) माध्यम की एक छोटी बूंद (~ 4 मिमी Ø) के अंदर गैंगलिया की स्थिति। इसके बाद, सूखे बर्फ के बिस्तर पर नमूना फ्रीज करें।
  11. 14 माइक्रोन मोटाई के वर्गों में -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट के साथ नमूनों को काटें और 3 श्रृंखला 42 माइक्रोन के अलावा ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एकत्र करें।
    नोट: स्लाइड के किनारों के करीब अनुभाग रखने से बचें। अभिकर् ती को बचाने के लिए, ऊतक वर्गों को यथासंभव कसकर पैक रखें लेकिन ओवरलैपिंग के बिना।
  12. कम से कम 6 महीने के लिए ISH के लिए आवश्यक होने तक नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    नोट: अंतर्जात फ्लोरेसेंस के लिए समस्या निवारण के लिए चित्रा 1 का उल्लेख करें।

2. प्रीट्रीटमेंट और ईश

  1. प्रयोगों के दिन से पहले, ऑटोक्लेव प्रयोगशाला ग्लासवेयर का उपयोग ईश के लिए किया जाएगा, जिसमें धुंधला व्यंजन और बफर जार धोना शामिल है।
    नोट: जबकि RNase मुक्त शर्तों के तहत काम कर महत्वपूर्ण नहीं है, हर समय दस्ताने पहनते हैं । संदूषण संदिग्ध होने की स्थिति में पहुंच के भीतर RNase विसंदूषण समाधानबोतलें (सामग्री की तालिका)रखें।
  2. पहले दिन, विशेष रूप से ISH को समर्पित एक बेंच पर कमरे के तापमान के लिए स्लाइड लाओ । स्लाइड्स को 1x पीबीएस में कुल्ला करें और उन्हें बेकिंग ओवन(सामग्री की टेबल)में 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बेक करें।
  3. स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4% फॉर्मलिन में ठीक करने के बाद।
  4. मल्टीप्लेक्स किट(सामग्रीकी मेज) में रिएजेंट्स को कमरे के तापमान में लाएं।
  5. 50%, 70%, और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड निर्जलित। 10 मिनट के लिए नमूनों के लिए एच2O2 समाधान लागू करें और फिर डबल-डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच2ओ) में कुल्ला करें।
  6. 5 मिनट के लिए लक्ष्य पुनर्प्राप्ति रिएजेंट के साथ नमूनों का इलाज करें, डीडीएच2ओ में कुल्ला 100% इथेनॉल और हवा-शुष्क के बाद। हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके, नमूनों के चारों ओर एक बाधा बनाएं।
    नोट: हाइड्रोफोबिक बाधा भी ऊतक वर्गों के करीब लागू न करें।
  7. संकरण ओवन(सामग्री की तालिका)में 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रोटीज़ लागू करें।
  8. इस बीच, 40 डिग्री सेल्सियस पर जांच को पूर्वामाल करें और उपयोग से पहले उन्हें कमरे के तापमान पर ठंडा करें। एक संकरण ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए लक्ष्य जांच (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; या Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) के वांछित संयोजन के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें ।
  9. एक संकरण ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए dihydrodipicolinate रिडक्टेज (डीएपीबी) लक्ष्य C1 जांच के साथ नकारात्मक नियंत्रण ऊतक को इनक्यूबेट करें।
  10. वॉश बफर में स्लाइड्स कुल्ला और कमरे के तापमान पर 5x नमकीन सोडियम साइट्रेट (एसएससी) में रात भर स्टोर करें । सुविधा के लिए, प्रयोग को दो दिनों में विभाजित करें। अगले दिन, स्लाइड्स को वॉश बफर के साथ कुल्ला करें और नीचे सूचीबद्ध प्रवर्धन रिएजेंट्स के साथ उन्हें इनक्यूबेट करें (सामग्री की टेबलमें उपयोगकर्ता मैनुअल देखें)।
  11. एएमपी1 (40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट), एएमपी2 (40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट), और एएमपी 3 (40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट) लागू करें। प्रत्येक चरण के बीच वॉश बफर में कुल्ला।
  12. प्रत्येक ओपल डाई(सामग्री की तालिका)को डाइमेथिल सल्फॉक्साइड में भंग करें और आवश्यकता होने तक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  13. चैनल 1 के लिए, एचआरपी-सी1 (40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट) और ओपल 520 (हरा रंग; पतला 1/1,500; 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें। प्रत्येक चरण के बीच वॉश बफर में कुल्ला।
  14. चैनल 2 के लिए, एचआरपी-सी2 (40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट) और ओपल 570 (पीला रंग; कमजोर पड़ने 1/1,500; 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए) के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें। प्रत्येक चरण के बीच वॉश बफर में कुल्ला।
  15. चैनल 3 के लिए, एचआरपी-सी 3 (40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट) और ओपल 690 (सुदूर लाल रंग; कमजोर पड़ने 1/1,500; 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए) के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें। प्रत्येक चरण के बीच वॉश बफर में कुल्ला।
  16. स्लाइड्स को धोएं और उन्हें 30 एस के लिए 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के लिए बेनकाब करें ।
  17. प्रत्येक स्लाइड पर तुरंत बढ़ते माध्यम को लागू करें और ऊतक अनुभाग के ऊपर एक कवरलिप रखें।
  18. इमेजिंग तक ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड होल्डर में क्षैतिज रखें।

3. माइक्रोस्कोपी और डेटा विश्लेषण

नोट: मल्टीप्लेक्स ईश डेटा को उपयुक्त फ़िल्टर के साथ उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, एक पसंदीदा इमेजिंग विधि 20x और 63x (तेल) उद्देश्यों के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी है; कारणों के लिए चर्चा का उल्लेख है । इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के निर्धारण के लिए चित्रा 2 को देखें।

  1. 488, 561, और 633 एनएम लेजर लाइनों से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। निम्नलिखित अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग करें (तालिका 1देखें): ओपल 690 (हेने 633 एनएम, डिटेक्शन रेंज 668-696 एनएम, पावर 2.0, लाभ 724); ओपल 570 (डीपीएसएस लेजर 561 एनएम, डिटेक्शन रेंज 579-627 एनएम, <पावर 15.0, <गेन 450); ओपल 520 (आर्गन लेजर 488 एनएम, डिटेक्शन रेंज 499-535 एनएम, <पावर 6.0, <गेन 830); DAPI (डायोड लेजर 405, डिटेक्शन रेंज 415-502 एनएम, <पावर 12.0, <गेन 532)।
  2. छवियों की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, 4 के औसत लाइन और कम से कम 1024 x 1024 के पिक्सेल आकार के साथ प्राप्त करें।
    नोट: उपरोक्त पैरामीटर केवल एक उदाहरण के रूप में प्रदान किए जाते हैं, और किसी भी ऊतक के लिए फ्लोरेसेंस के एक उपकरण, आवर्धन (20x या 63x), अभिव्यक्ति के स्तर और अंतर्जात स्तर के आधार पर संशोधनों की सिफारिश की जाती है।
  3. एक बार अधिग्रहण मापदंडों से संतुष्ट होने के बाद, एक ही सेटिंग्स का उपयोग करके छवियों को एकत्र करें। दृश्य की सुविधा के लिए प्रत्येक चैनल के लिए झूठे रंगों का श्रेय दें।
    नोट: उदाहरण के लिए, लाल (Phox2b या Prdm12), सियान (Cck1r), पीला (Ghsr), और ग्रे (DAPI) ।
  4. डीएपीआई के साथ हल्के से दाग एक नाभिक के साथ RNAscope-सकारात्मक प्रोफाइल की रूपरेखा की पहचान करके डिजिटल छवियों का उपयोग कर सेल गिनती करें। प्रत्येक ट्रांसक्रिप्ट[चित्र 3ए-सी]व्यक्त करते हुए आरएनएस्कोप-पॉजिटिव प्रोफाइल के प्रतिशत की गणना करें।
  5. अनुमानों की कठोरता और सटीकता में सुधार करने के लिए, कम से कम 4 विभिन्न जानवरों से कम से कम 2,000 न्यूरोनल प्रोफाइल की गणना करें। बाएं और दाएं गैंगलिया से अलग-अलग मतगणना करें।
  6. गिना प्रोफाइल की कुल संख्या के साथ एक पाई चार्ट में डेटा इनपुट।
  7. छवियों को प्राप्त करने और 20x छवियों को एक साथ सिलाई करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। अंतिम प्लेटें उत्पन्न करने के लिए इमेजजे-फिजी और एक अन्य फोटो और डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। सभी छवियों के विपरीत और हल्कापन समान रूप से समायोजन लागू करें।

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Representative Results

जबकि आरएनएस्कोप को किसी भी उम्र, लिंग या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जानवरों पर लागू किया जा सकता है, युवा वयस्कों (<3 महीने पुराने) के साथ काम करने की सलाह दी जाती है। इसका कारण यह है कि फ्लोरोसेंट कलाकृतियों (जैसे, लिपोफसिन) पुराने जानवरों के न्यूरॉन्स में आम निष्कर्ष हैं41। पुराने चूहों से फॉर्मेलिन-फिक्स्ड गैंगलिया में अक्सर आश्चर्यजनक रूप से तीव्र अंतर्जात फ्लोरेसेंस होता है जिसे आसानी से वास्तविक धुंधला(चित्रा 1A,बी)के लिए गलत किया जा सकता है। किसी भी मामले में, प्रसंस्करण से पहले ऊतक में अंतर्जात फ्लोरेसेंस के स्तर को सत्यापित करने की सलाह दी जाती है।

यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक लेजर और आवर्धन के लिए इष्टतम अधिग्रहण मापदंडों और सिग्नल-टू-शोर अनुपात का निर्धारण किया जाए, जो डीएपीबी नकारात्मक जांच के साथ इनक्यूबेटेड नकारात्मक ऊतक से अनुभागों का उपयोग करके चित्र 2 ए,बीमें दिखाया गया है। क्योंकि डीएपीबी एक प्रोकैरियोटिक जीन है, आरएनएस्कोप सिग्नल नकारात्मक नियंत्रण ऊतक से पूरी तरह से अनुपस्थित होना चाहिए। कभी-कभी मलबे और क्रिस्टल के अलावा, नकारात्मक नियंत्रण ऊतकों से छवियों में नगण्य फ्लोरेसेंस देखा जाता है, बशर्ते अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग उपयुक्त हो। हालांकि, एक निश्चित लेजर शक्ति और लाभ के ऊपर, अवांछित पृष्ठभूमि और यादृच्छिक फ्लोरोसेंट डॉट्स दिखाई देने लगते हैं(चित्रा 2C)। लेजर पावर को कम करने का एक और उद्देश्य पिक्सेल संतृप्ति और फोटोब्लैचिंग से बचना है। उपरोक्त मापदंडों के साथ काम करते समय फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग के कोई प्रमुख मुद्दे नहीं देखे गए। यदि ऐसा कोई मुद्दा उत्पन्न हो सकता है, तो लेजर पावर को जितना संभव हो उतना कम करने के अलावा फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं(सामग्री की तालिका) केलिए एक बढ़ते माध्यम के साथ ऊतक को कवर करने की सलाह दी जाती है (तालिका 1में अनुशंसित मापदंडों को देखें)।

आरएनएस्कोप तकनीक माउस के वागल गैंगलियोनिक द्रव्यमान (चित्र 3 और चित्रा 4)के ऊतक वर्गों में3 जीन का पता लगाने के लिए लागू किया गया था। एक प्रोफ़ाइल Ghsr और/या Cck1r के लिए सकारात्मक माना जाता था जब पीले और/या सियान डॉट्स, क्रमशः, लाल डॉट्स(चित्रा 3A-सी)से भरा एक प्रोफ़ाइल ओवरलेटिंग देखा गया । चित्रा 3 में दिए गए उदाहरण में कई प्रोफाइल दिखाई देते हैं जिनमें फोक्स2बी और सीके1आर ट्रांसक्रिप्ट(चित्रा 3 डी)दोनों होते हैं। Phox2b का उपयोग नोडोज अफ़ेषी न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए किया गया था। नोडोज गैंगलियन(चित्रा 4A,बी)के न्यूरॉन्स में प्रचुर मात्रा में Phox2b संकेतों। Cck1r संकेतों Phox2b कोशिकाओं(चित्रा 4C)के लगभग ५२% में पाया गया । ध्यान दें, Cck1r के लिए अभिव्यक्ति का स्तर कोशिकाओं के बीच बहुत भिन्न होता है, जिसमें मध्यम (~ 20 डॉट्स प्रति प्रोफाइल) से लेकर तीव्र लेबलिंग (साइटोप्लाज्म भरा जाता है)। इसके विपरीत, जीएचएसआर के लिए संकेत नोडोज गैंगलियन(चित्रा 4A,बी)में बेहद विरल थे। केवल एक अनुमान के अनुसार 0.65% Phox2b-सकारात्मक कोशिकाएं भी जीएचएसआर ट्रांसक्रिप्ट(चित्रा 4C)के लिए सकारात्मक थीं। Ghsr-व्यक्त कोशिकाओं अक्सर सह Cck1r व्यक्त किया। ऊतकों के एक दृश्य सर्वेक्षण में बाएं और दाएं गैंगलिया के बीच स्पष्ट मतभेदों का पता नहीं चला । ISH सिग्नल न्यूरॉन्स (जैसे, एपिनेयूरियम और फाइबर ट्रैक्ट) से रहित क्षेत्रों से लगभग अनुपस्थित थे।

Prdm12 जुगुलर afferent न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, Prdm12 अभिव्यक्ति जुगलबंदी गैंगलियन के न्यूरॉन्स में अत्यधिक समृद्ध थी और नोडोज गैंगलियन(चित्रा 5 ए-सी)के रोस्ट्रल हिस्से में घुसपैठ करने वाले कुछ न्यूरॉन्स। दिलचस्प बात यह है कि Prdm12 कोशिकाओं(चित्रा 5B,C)के सबसेट में Cck1r संकेतों का पता चला । Prdm12-सकारात्मक न्यूरॉन्स के 9% से थोड़ा कम भी Cck1r(चित्रा 5D)व्यक्त की । हालांकि, जुगलबंदी गैंगलियन में केवल Cck1r (<20 डॉट्स प्रति कोशिकाओं) के मध्यम स्तर वाली कोशिकाएं होती हैं, न कि आमतौर पर नोडोज गैंगलियन में पाए जाने वाले दृढ़ता से लेबल वाले Cck1r-सकारात्मक कोशिकाओं के बजाय। जीएचएसआर-पॉजिटिव कोशिकाएं नोडोज(चित्रा 5C)की तुलना में जुगलबंदी में काफी अधिक प्रचलित थीं। Prdm12 कोशिकाओं के लगभग 3% भी Ghsr सकारात्मक(चित्रा 5D)थे । दिलचस्प बात यह है कि सभी Prdm12 का 1% Ghsr और Cck1r दोनों को सह-व्यक्त किया गया था। Ghsr के लिए अभिव्यक्ति का स्तर हमेशा मध्यम (<20 डॉट्स प्रति सेल) था। न्यूरॉन्स से रहित क्षेत्रों में कोई ISH संकेत नहीं देखा जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1:अंतर्जात फ्लोरेसेंस के समस्या निवारण मुद्दे। (ए, बी)एक एजिंग माउस (~ 1 वर्ष पुराना) के नोडोज/जुगुलर गैंगलियन में अंतर्जात फ्लोरेसेंस । डिजिटल छवियों को रंगों और अधिग्रहण मापदंडों में इंगित लेजर लाइनों का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत किया गया था जो छोटे चूहों के साथ मल्टीप्लेक्स ISH के लिए उपयोग किए जाने वाले समान थे (बाद में देखें)। महत्वपूर्ण बात यह है कि फिक्स्ड टिश्यू को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने और DAPI के संपर्क में आने के अलावा किसी भी तरह से संसाधित नहीं किया गया था। जैसा कि एमें दिखाया गया है, न्यूरोनल और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं में अवांछित फ्लोरेसेंस का एक महत्वपूर्ण स्तर देखा जाता है, खासकर जब 488 एनएम लेजर (हरा) के संपर्क में आता है। यह हिस्टोरोलॉजी में एक आम निष्कर्ष है, जो हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पहले अंतर्जात फ्लोरेसेंस का आकलन करने की वारंट है। (ख)उच्च आवर्धन पर, फ्लोरेसेंस लिपोफुसिन पिगमेंट जैसा दिखता है जो अक्सर उम्र बढ़ने वाली कोशिकाओं में जमा होता है और वास्तविक इम्यूनोरेएक्टिविटी और/या आरएनएस्कोप संकेतों के लिए आसानी से गलत हो सकता है । स्केल बार = 158 माइक्रोन(ए)और 15 माइक्रोन(बी)। (ख)संक्षिप्त: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल; एनजी = नोडोज गैंगलियन; ISH = सीटू संकरण में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2-इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात का निर्धारण करना। (ए, बी)नकारात्मक नियंत्रण जिसमें प्रोकैरियोटिक जीन डीएपीबीके लिए आरएनएस्कोप डिटेक्शन शामिल है । ध्यान दें कि एक युवा वयस्क माउस के नोडोज गैंगलियन में अंतर्जात फ्लोरेसेंस कम है, और डीएपीबी जांच के साथ इनक्यूबेशन के संकेत नहीं मिले। अधिग्रहण पैरामीटर मल्टीप्लेक्स ईश के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान थे। इससे पता चलता है कि यदि अधिग्रहण मापदंडों को ध्यान से चुना जाता है तो आरएनएस्कोप प्रक्रिया स्वयं किसी महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि का उत्पादन नहीं करती है। (ग)एक ही ऊतक की डिजिटल छवियां 488 एनएम लेजर के साथ शक्ति लेजर और लाभ बढ़ाने में अधिग्रहीत की गई। ध्यान दें कि कैसे कुछ फजी हरे रंग की पृष्ठभूमि और सामयिक डॉट्स एक निश्चित लेजर शक्ति और लाभ से ऊपर उठते हैं। इस प्रकार, नकारात्मक नियंत्रण ऊतक में प्राप्त अविशिष्ट फ्लोरेसेंस की मात्रा के आधार पर प्रत्येक लेजर के लिए अधिग्रहण मापदंडों को सावधानीपूर्वक चुनना महत्वपूर्ण है। स्केल बार = 158 माइक्रोन(ए)और 15 माइक्रोन(बी, सी)। संक्षिप्त: डीएपीबी = डियड्रोडिपिकोलिनेट रिक्टेस; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; एनजी = नोडोज गैंगलियन; ISH = सीटू संकरण में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:सकारात्मक प्रोफाइल की पहचान और गिनती। (A)नोडोज गैंगलियन के रॉक्रल पार्ट में फोक्स2बी लेबल वाली प्रोफाइल (लाल) की रिप्रेजेंटेटिव डिजिटल इमेज । इस उदाहरण में, कुल 18 सेलुलर प्रोफाइल (1 से 18 के रूप में लेबल) की पहचान की गई थी। ध्यान दें कि दापी धुंधला आगे न्यूरॉन्स, जो आम तौर पर प्रकाश DAPI दाग के साथ एक बड़े और गोल नाभिक प्रदर्शित स्थानीयकरण में मदद करता है । इसके विपरीत, गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के नाभिक को चमकीले लेबल, लम्बी और आकार में छोटा किया जाता है। कुल मिलाकर, आरएनएस्कोप संकेत गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के बजाय न्यूरोनल के वितरण और आकार के अनुरूप थे। (ख)दो लेबल Ghsr-सकारात्मक न्यूरॉन्स (पीला) दिखाया गया है (प्रोफाइल 19 और 20) । जीएचएसआर के संकेत विरल थे और देखना मुश्किल था । इसलिए, हल्केपन और पीले संकेतों की संतृप्ति को चुनिंदा और समान रूप से फोटो सॉफ्टवेयर में बढ़ाया गया था। (ग)कुल नौ Cck1r-लेबल प्रोफाइल (सियान) की पहचान की जाती है (2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 और 19 के रूप में लेबल) । ध्यान दें कि कैसे Cck1r संकेतों की तीव्रता कोशिकाओं के बीच बहुत विविध । उदाहरण के लिए, प्रोफ़ाइल 11 में केवल कुछ सकारात्मक संकेत होते हैं, जबकि प्रोफ़ाइल 7 लगभग Cck1r संकेतों से भरा हुआ है। (घ)सभी चैनलों के एक विलय दृश्य कोलोकैलाइजेशन पैटर्न की पहचान की अनुमति दी । कई Phox2b-सकारात्मक प्रोफाइल भी सह-व्यक्त Cck1r (उदाहरण के लिए, प्रोफाइल 2, 8, और 14), के रूप में एक ही सेलुलर प्रोफ़ाइल के भीतर लाल और सियान RNAScope डॉट्स द्वारा सबूत । इसके विपरीत, Phox2b-सकारात्मक प्रोफाइल ने Ghsr टेप (प्रोफाइल 19 और 20) व्यक्त नहीं किया। हालांकि, एक Ghsr-positive सेल भी Cck1r (प्रोफ़ाइल 19) के निम्न स्तर व्यक्त किया । एक सफेद तारक के साथ लेबल दो बड़े DAPI दाग नाभिक संभवतः RNAScope संकेतों से रहित Phox2b-नकारात्मक afferent न्यूरॉन्स के स्थान के अनुरूप है । नीचे वर्णित प्रतिनिधि परिणामों में, 4 विभिन्न जानवरों से बाएं और दाएं गैंगलोनिक जनता से कम से कम 2,000 न्यूरोनल प्रोफाइल गिने गए थे। स्केल बार = 24 माइक्रोन। संक्षिप्त: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; Phox2b = बनती-जैसे होमोबॉक्स 2b; Ghsr = ghrelin रिसेप्टर; Cck1r = कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:नोडोज एफेरेंट न्यूरॉन्स में मल्टीप्लेक्स ईश के प्रतिनिधि परिणाम। फोक्स2बी, सीके1आर और जीएचएसआर के लिए मल्टीप्लेक्स आरएनएस्कोप के साथ लेबल किए गए प्रतिनिधि वैगल गैंगलियोनिक मास की डिजिटल छवियां एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (Zeiss LSM880) के 20x(ए)और 63x(बी, सी)उद्देश्यों के साथ अधिग्रहीत की गई थीं। एमें, 20× कई छवियों को ज़ेन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक साथ सिले गए थे और या तो अनमिक्स चैनलों के रूप में प्रस्तुत किया गया था या विलय कर दिया गया था। फोक्स2बी सिग्नल (लाल) विशेष रूप से नोडोज गैंगलियन में स्थित अफरेंट न्यूरॉन्स में जमा होते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, Cck1r संकेतों (सियान) ने तीव्रता से कई लेबल किए, लेकिन सभी नहीं, नोडोज गैंगलियन में न्यूरॉन्स। कम आवर्धन पर, Cck1r के निम्न स्तर या Ghsr संकेतों (पीले) के साथ किसी भी कोशिकाओं को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को आसानी से नहीं देखा जा सकता था। DAPI (ग्रे) ने ऊतक की कल्पना करने और एक बड़े और हल्के से दाग वाले नाभिक के साथ वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स की पहचान करने में मदद की। विलय छवि में सफेद इनसेट नीचे शामिल छवि के स्थानों से मेल खाती है। (ख)उच्च आवर्धन पर, Phox2b-सकारात्मक प्रोफाइल (लाल) स्पष्ट हैं । कई कोशिकाओं ने भी Cck1r व्यक्त किया, लेकिन अलग-अलग स्तरों पर, मध्यम से लेकर बहुत अधिक। प्रोफाइल "1" Cck1r और Ghsr के लिए एक Phox2b सेल नकारात्मक का एक उदाहरण है प्रोफाइल "2" और "3" क्रमशः उच्च और मध्यम Cck1r संकेतों के साथ Phox2b कोशिकाएं हैं । Ghsr (पीला) के लिए मध्यम संकेतों को कभी-कभी रॉक्रल नोडोज गैंगलियन में देखा जाता था, लेकिन लगभग हमेशा फोक्स 2बी के लिए नकारात्मक कोशिकाओं में, जैसा कि प्रोफ़ाइल "4" के साथ दिखाया गया है। दिलचस्प बात यह है कि प्रोफाइल "4" ने जीएचएसआर और सीके1आर दोनों व्यक्त किए। जैसा कि अगले आंकड़े में दिखाया गया है, Ghsr Prdm12 कोशिकाओं में अधिक प्रचुर मात्रा में था। (ग)पाई चार्ट Phox2b कोशिकाओं (लाल) के प्रतिशत के अनुमानों का सारांश या तो Ghsr (पीला), Cck1r (सियान), या दोनों (ग्रे) व्यक्त । गणना प्रोफाइल की कुल संख्या चार्ट के बगल में इंगित की गई है (n = 4 अलग-अलग गैंगलिया, बाएं और दाएं संयुक्त)। प्रत्येक पक्ष से परिणाम जमा किए गए क्योंकि कोई मतभेद नहीं देखा गया । स्केल बार = 158 माइक्रोन(ए)और 15 माइक्रोन(बी)। संक्षिप्त: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; एनजी = नोडोज गैंगलियन; JG = जुगलबंदी गैंगलियन; ISH = सीटू संकरण में; Phox2b = बनती-जैसे होमोबॉक्स 2b; Ghsr = ghrelin रिसेप्टर; Cck1r = कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स मल्टीप्लेक्स ISH के प्रतिनिधि परिणाम । मल्टीप्लेक्स आरएनएस्कोप पीआरडीएम12, सीके1आर और जीएचएसआर के साथ लेबल वाले प्रतिनिधि वैगल गैंगलियोनिक मास की डिजिटल छवियां एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (Zeiss LSM880) के 20x(ए)और 63x(बी, सी)उद्देश्यों के साथ प्राप्त की गई थीं। एमें, 20× कई छवियों को ज़ेन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक साथ सिले गए थे और या तो अनमिक्स चैनलों के रूप में प्रस्तुत किया गया था या विलय कर दिया गया था। Prdm12 प्रतिलिपि (लाल) विशेष रूप से जुगलबंदी गैंगलियन में स्थित अफरेंट न्यूरॉन्स में संचित और केवल कुछ न्यूरॉन्स नाडोज गैंगलियन के रोस्ट्रल भाग में घुसपैठ करते हैं। Cck1r संकेतों (सियान) तीव्रता से nodose ganglion लेबल । कम आवर्धन पर, Cck1r या Ghsr संकेतों (पीला) के साथ किसी भी कोशिकाओं के कम स्तर को व्यक्त कोशिकाओं को आसानी से नहीं देखा जा सकता है । DAPI (ग्रे) ने ऊतक की कल्पना करने और एक बड़े और हल्के से दाग वाले नाभिक के साथ वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स की पहचान करने में मदद की। विलय छवि में दो सफेद इनसेट नीचे शामिल छवियों के स्थानों के अनुरूप हैं । (B, C) उच्च आवर्धन पर, Prdm12-सकारात्मक सेल प्रोफाइल (लाल) चित्रित किया जा सकता है। Cck1r के लिए मध्यम संकेतों को प्रोफाइल "1" और "2" में भी पाया गया। प्रोफाइल "3" Cck1r या Ghsr के लिए नकारात्मक Prdm12 कोशिकाओं का प्रतिनिधि है। सीमें, Ghsr संकेत (पीला) प्रतिनिधि प्रोफ़ाइल "4" में देखा जाता है, लेकिन "5" में नहीं । (घ)पाई चार्ट Prdm12 कोशिकाओं (लाल) सह या तो Ghsr (पीला), Cck1r (सियान), या दोनों (ग्रे) व्यक्त के प्रतिशत के अनुमानों का सारांश । गणना प्रोफाइल की कुल संख्या चार्ट के बगल में इंगित की गई है (n = 4 अलग-अलग गैंगलिया, बाएं और दाएं संयुक्त)। प्रत्येक पक्ष से परिणाम जमा किए गए क्योंकि कोई मतभेद नहीं देखा गया । स्केल बार = 158 माइक्रोन(ए)और 15 माइक्रोन(बी, सी)। संक्षिप्त: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; एनजी = नोडोज गैंगलियन; JG = जुगलबंदी गैंगलियन; ISH = सीटू संकरण में; Prdm12 = पीआर डोमेन जिंक फिंगर प्रोटीन 12; Phox2b = बनती-जैसे होमोबॉक्स 2b; Ghsr = ghrelin रिसेप्टर; Cck1r = कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

दूधिया पत्थर लेजर लाइन डिटेक्शन रेंज शक्ति लाभ लाइन औसत पिक्सेल आकार
ओपल 690 हेने 633 एनएम 668-696 एनएम 2 724 4 1024 x 1024
ओपल 570 डीपीएसएस लेजर 561 एनएम 579-627 एनएम 15 450 4 1024 x 1024
ओपल 520 आर्गन लेजर 488 एनएम 499-535 एनएम 6 830 4 1024 x 1024
दापी डायोड लेजर 405 415-502 एनएम 12 532 4 1024 x 1024

तालिका 1: अधिग्रहण पैरामीटर। संक्षिप्त नाम: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल।

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Discussion

ईश की तकनीक का आविष्कार 1960 के दशक के अंत में42के दशक में किया गया था । हालांकि, 1 9 80 के दशक के मध्य तक यह नहीं है कि इसे केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र43,44में एमआरएएनए का पता लगाने के लिए लागू किया गया था। तंत्रिका तंत्र की विषमता और एंटीबॉडी के साथ आवर्ती मुद्दों को ध्यान में रखते हुए, सेलुलर स्तर पर एक विशेष प्रतिलिपि का स्थानीयकरण एक अमूल्य उपकरण बना हुआ है। फिर भी, पारंपरिक ISH तरीके श्रमसाध्य और निरपवाद रूप से संवेदनशील बने हुए हैं । सौभाग्य से, इस अध्ययन में आरएनएस्कोप नामक एक अत्यधिक संवेदनशील ईश प्रक्रिया कार्यरत है, जो आमतौर पर कोई पृष्ठभूमि उत्पन्न नहीं करती है और निम्न स्तर45,46पर व्यक्त कई प्रतिलिपियों का पता लगाने की अनुमति देती है। विशेष रूप से, जीएचएसआर और सीके1आर ट्रांसक्रिप्ट का एक साथ पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आरएनओस्कोप लागू किया गया था। प्रतिलेखन कारकों, Phox2b और Prdm12, आगे क्रमशः nodose और जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स अंतर करने के लिए चयनात्मक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया । Phox2b और Prdm12 की कल्पना किए बिना, निश्चितता के साथ जुगुलर बनाम नोडोज अफरेंट न्यूरॉन्स की पहचान करना चुनौतीपूर्ण होगा। जैसा कि ऊपर बताया गया है, एक महत्वपूर्ण कदम में एक सुसंगत और उचित विच्छेदन तकनीक शामिल है। इसके अलावा, अंतर्जात फ्लोरेसेंस का सत्यापन भी एक महत्वपूर्ण कारक है क्योंकि यह आरएनएस्कोप संकेतों के लिए आसानी से गलत हो सकता है। इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण ऊतक के आधार पर उचित अधिग्रहण मापदंडों का चुनाव दृढ़ता से सलाह दी जाती है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 20x और 63x (तेल) उद्देश्यों के साथ पसंदीदा इमेजिंग विधि है क्योंकि 1) कम स्तर पर व्यक्त किए गए टेप और/या विरल कोशिकाओं में केवल उच्च आवर्धन पर ध्यान देने योग्य हो सकता है । 2) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी एक फोकल प्लेन के संग्रह की अनुमति देता है, जो यह देखते हुए महत्वपूर्ण है कि एक दूसरे के शीर्ष पर दो कोशिकाएं गलत तरीके से एक सेल के रूप में दिखाई दे सकती हैं जब epifluorescence द्वारा छवि की जाती है। 3) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी भी अधिक चयनात्मक और लचीला अधिग्रहण मापदंडों की अनुमति देता है। उपरोक्त अधिग्रहण पैरामीटर केवल एक उदाहरण के रूप में प्रदान किए जाते हैं, और किसी भी ऊतक के लिए फ्लोरेसेंस के एक उपकरण, आवर्धन (20x या 63x), अभिव्यक्ति के स्तर और अंतर्जात स्तर के आधार पर संशोधनों की सिफारिश की जाती है। धुंधला प्रक्रिया ही केवल मामूली समायोजन के साथ अनुशंसित प्रोटोकॉल के बहुत करीब रही। जाहिर है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी टेप का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है, न सिर्फ GPCRs । यहां वर्णित प्रक्रिया फिर भी विशेष रूप से जीपीसीआर24के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ आवर्ती मुद्दों पर विचार करने के लिए उपयोगी है ।

जैसा कि पहले15पर चर्चा की गई थी, माउस नोडोज गैंगलियन कभी-कभी सेल ब्रिज द्वारा बेहतर सर्वाइकल गैंगलियन से जुड़ा होता है। इस सेल ब्रिज को शामिल करने से भ्रामक परिणाम हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, नॉन-वागल मार्कर नोज गैंगलियन में पाए जा रहे हैं। जांचकर्ता व्यवस्थित रूप से सत्यापित करना चाहते हैं कि क्या विच्छेदन के दौरान नोडोज गैंगलियन बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलियन से जुड़ा हुआ है। अन्यथा, गैंगलिया के बीच असंगत विच्छेदन कौशल प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता का परिचय देगा। यह भी ध्यान रखना जरूरी है कि पेट्रोसल और नोडोज दोनों ही एफेरेंट न्यूरॉन्स एक्सप्रेस फोक्स2बी47। इस प्रकार, जिसे हमने नोडोज अफरेंडेंट न्यूरॉन्स के रूप में संदर्भित किया, उसमें पेट्रोसल और नोडोज न्यूरॉन्स दोनों शामिल थे। अंत में, जब विभिन्न अध्ययनों की तुलना की जाती है, तो किसी को ध्यान में रखना चाहिए कि इच्छामृत्यु के विभिन्न तरीकों से जीन अभिव्यक्ति48में परिवर्तन हो सकता है।

सिद्धांत रूप में, पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस को किसी भी चैनल के लिए एक दूसरे के रूप में जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हालांकि, ओपल 690 को हरे रंग की फ्लोरेसेंस का निम्न स्तर उत्सर्जित करने के लिए पाया गया। ज्यादातर परिस्थितियों में, अत्यधिक व्यक्त किए गए टेप (जैसे, Prdm12) के मामले में, यदि लेजर तीव्रता बहुत अधिक थी तो अवांछित हरे रंग की फ्लोरेसेंस देखी गई। इसलिए मॉडरेट/लो एक्सप्रेशन वाले जीन्स के लिए ओपल ६९० की सिफारिश की जाती है । यदि केवल अत्यधिक व्यक्त जीन के साथ काम करना है, तो ओपल 690 को और अधिक पतला करने (यानी, 1/3,000) की सिफारिश की जाती है और छवि अधिग्रहण के दौरान अविशिष्ट हरे रंग की फ्लोरेसेंस पर कब्जा नहीं किया जाता है। आरएनएस्कोप सिग्नल अलग-अलग रंगों के अलग-अलग बिंदु होते हैं, भले ही ट्रांसक्रिप्ट एक ही सेल प्रोफाइल के भीतर व्यक्त किए जाते हों। हालांकि, अत्यधिक व्यक्त किए गए टेपों के लिए, व्यक्तिगत डॉट्स को देखना संभव नहीं हो सकता है बल्कि साइटोप्लाज्म को भरने में फ्लोरेसेंस हो सकता है। जब डॉट्स विभिन्न रंगों के फ्लोरेसेंस का उत्सर्जन करते हैं, तो कोई भी अन्य उदाहरणों के अलावा, अपर्याप्त अधिग्रहण मापदंडों और/या अंतर्जात वर्णक के कारण अविशिष्ट फ्लोरेसेंस की समस्या पर विचार कर सकता है । अंत में, ओपल 570 और 620 का उपयोग एक साथ नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि उनका उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप होता है।

यदि ब्याज के ऊतकों में व्यक्त किए जाने वाले जीन के लिए कोई आरएनएस्कोप संकेत नहीं देखे जाते हैं, तो यह सलाह दी जाती है कि उपलब्ध सकारात्मक जांच (यानी पेप्टिडिल-प्रोलिल सीआईएस-ट्रांस आइसोमेरास बी हाउसकीपिंग जीन) चलाकर ऊतक की अखंडता को सत्यापित करें। दापी काउंटरस्टेनिंग ऊतक की गुणवत्ता निर्धारित करने में भी सहायक है। डीएपीआई-लेबल वाले नाभिक जो कटा हुआ दिखाई देते हैं, अत्यधिक पाचन या अनुचित रूप से तय ऊतक का संकेत दे सकते हैं।

नतीजतन, Ghsr Prdm12-सकारात्मक जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स के एक छोटे से सबसेट में व्यक्त किया गया था । इसके विपरीत, और पिछले एक अध्ययन11के साथ समझौते में, Ghsr mRNA नडोज अफरेंट न्यूरॉन्स से लगभग अनुपस्थित था। यह अनुमान लगाया गया है कि क्यूपीसीआर और ईश द्वारा पहले पाए गए जीएचएसआर एमआरएनए के निम्न स्तर की संभावना जुगुलर एफेरेंट न्यूरॉन्स30, 31,32के कारण थी । एक पूर्व कैल्शियम सिग्नलिंग अध्ययन से पता चला है कि 3% सुसंस्कृत वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स ghrelin49का जवाब देते हैं, एक संख्या जो उल्लेखनीय रूप से Ghsr-एक्सप्रेस जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स के प्रतिशत के समान है। Cck1r कई Phox2b-सकारात्मक nodose afferent न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था और, अधिक आश्चर्य की बात है, Prdm12 के एक सबसेट में-सकारात्मक जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स । संक्षेप में, यह पेपर मौजूदा ईश तकनीकों के सफल अनुकूलन को दर्शाता है ताकि जुगुलर-नोडोज गैंगलियोनिक द्रव्यमान में चुनिंदा जीपीसीआर के सेलुलर वितरण का आकलन किया जा सके।

अंत में, मल्टीप्लेक्स ISH को वयस्क माउस के पूरे वागल गैंगलियोनिक परिसर में दो जीपीसीआर (सीके1आर और जीएचएसआर) और एक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (फोक्स2बी या पीआरडीएम12) के लिए टेप का पता लगाने और एक साथ कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए-अनुक्रमण, क्यूपीसीआर और पारंपरिक हिस्टरोलॉजी के लिए एक पूरक उपकरण हो सकता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल समान आकार के अन्य गैंगलिया पर लागू किया जा सकता है। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, अधिग्रहण पैरामीटर, जानवरों की आयु और विच्छेदन की निरंतरता प्रयोगात्मक डिजाइन के दौरान विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। इसलिए, यह एक अत्यधिक विषम और छोटे गैंगलियन में स्थलाकृतिक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के बारे में अद्वितीय जानकारी प्रदान कर सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न शारीरिक और रोगविज्ञानी स्थितियों के संदर्भ में जुगुलर बनाम नोडोज एफ्फेरेंट न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें फीडिंग स्थिति में परिवर्तन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। इसका उपयोग पशु प्रजातियों में वैगल एफेरेंट न्यूरॉन्स के न्यूरोकेमिकल मेकअप की तुलना करने के लिए भी किया जा सकता है, जो आमतौर पर प्रीक्लिनिकल अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, जिसमें वानरों औरसूअरों 50,51शामिल हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस कार्य को एनआईएच ग्रांट #5P01DK119130-02 द्वारा वित्तपोषित न्यूरोएनाटॉमी/हिस्टोलॉजी/ब्रेन इंजेक्शन कोर द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक यूटी पश्चिमी लाइव सेल इमेजिंग सुविधा (डॉ फेल्प्स की अध्यक्षता में) और उसके कर्मचारियों (अभिजीत बुगडे और मार्सेल मेटलेन) की सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं, जो एनआईएच ग्रांट #1S10OD021684-01 द्वारा भाग में समर्थित है, जो एक एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट द्वारा भाग में समर्थित है, P30 CA142543।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
20x SSC Invitrogen AM9763
-80°C freezer PHCBI MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021 Adobe photo and design software
Baking oven Thermo Scientific Model:658
Confocal microscope Zeiss LSM880 Airyscan
Cover glass Brain Research Laboratories 2460-1.5D
Cryostat Leica CM 3050 S
Dumont #5 Forceps F.S.T. 11252-20
Ecomount Biocare Medical EM 897L mounting medium
HybEZ oven hybridization oven
Hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
ImageJ-Fiji NIH
Large scissors Henry Schein 100-7561
Micro centrifuge tubes VWR 20170-333
Minipump variable flow Fisher Scientific 13-876-1
Opal 520 Akoya biosciences FP1 1487001KT Fluorescent biomarker
Opal 570 Akoya biosciences FP1 1488001KT Fluorescent biomarker
Opal 690 Akoya biosciences FP1 1497001KT Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACD /Bio-Techne 323100 multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 ACD /Bio-Techne 313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB ACD /Bio-Techne 310043
RNAscope probe Mouse Ghsr ACD /Bio-Techne 426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 ACD /Bio-Techne 407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 ACD /Bio-Techne 524371-C2
RnaseZap Sigma R2020 Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors Millipore Sigma Z265977
Superfrost Plus slides Fisherbrand 1255015
Tissue Tek OCT medium Sakura 4583
User manual ACD 323100 USM
Vannas Spring Scissors Roboz RS 5620
ZEN Imaging Software Zeiss

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Bob-Manuel, J., Gautron, L.… More

Bob-Manuel, J., Gautron, L. Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (175), e62945, doi:10.3791/62945 (2021).

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