Summary
Multiplex in situ hybridization (ISH) användes för att samtidigt visualisera transkriptioner för två G protein-kopplade receptorer och en transkription faktor i hela vagal ganglionic komplex av den vuxna musen. Detta protokoll kan användas för att generera exakta kartor över transkriptionsprofilerna för vagal afferenta nervceller.
Abstract
Denna studie beskriver ett protokoll för multiplex in situ hybridisering (ISH) av mus halspulsåder-snara ganglier, med särskild tonvikt på att upptäcka uttrycket av G protein-kopplade receptorer (GPCRs). Formalin-fasta halspulsåder-snara ganglier bearbetades med RNAscope teknik för att samtidigt upptäcka uttrycket av två representativa GPCRs (cholecystokinin och ghrelin receptorer) i kombination med en markör gen av antingen snara (parad-liknande homeobox 2b, Phox2b) eller jugular afferent nervceller (PR domän zink finger protein 12, Prdm12). Märkta ganglier avbildades med hjälp av konfokal mikroskopi för att bestämma distributions- och uttrycksmönstren för de ovannämnda transkriptionerna. Kortfattat, Phox2b afferent nervceller konstaterades rikligt uttrycka kolecystokinin receptorn (Cck1r) men inte ghrelin receptorn (Ghsr). En liten delmängd av Prdm12 afferent nervceller konstaterades också att uttrycka Ghsr och/eller Cck1r. Potentiella tekniska varningar i design, bearbetning och tolkning av multiplex ISH diskuteras. Tillvägagångssättet som beskrivs i denna artikel kan hjälpa forskare att generera exakta kartor över transkriptionsprofilerna för vagal afferenta nervceller.
Introduction
Cellkropparna av vagala afferenter finns i halspulsåder, petrosal och snar ganglier1,2,3. Deras axoner reser tillsammans via flera grenar av vagusnerven till craniocervical, thorax och bukterritorier4,5,6,7. Från deras viscerala ändelser kan vagala afferenter svara på ett brett spektrum av fysiologiska och skadliga stimuli8,9,10. Distributionen av signalmolekyler och receptorer som är involverade i vagalavkänning är dock fortfarande dåligt karakteriserad. Detta beror delvis på att vagala ganglier, trots sin lilla storlek, uttrycker ett brett spektrum av receptorer, inklusive ett stort antal GPCRs8,11,12,13. Dessutom är vagal afferenta nervceller i sig heterogena och visar distinkta molekylära profiler14. För att komplicera saken är halspulsåder, petrosala och snar ganglier fästa i musen och bildar därmed en enda ganglionic massa. Slutligen, i en delmängd av djur, är snar ganglion fäst vid den sympatiska överlägsna livmoderhalsenganglion 15.
Tidigare har forskare vänt sig till immunohistokemi för att studera den neurokemiska maket av vagal afferenta nervceller16,17,18. Medan immunohistokemi med validerade antikroppar är användbart, måste resultaten av immunohistokemiska studier tolkas med försiktighet. Till exempel har många ansträngningar för att identifiera specifika antikroppar mot GPCR misslyckatsmed 19,20,21,22,23,24,25, vilket har lett till att utredarna drar slutsatsen att majoriteten av antikropparna mot GPCR är otillförlitliga. För att kringgå dessa problem har kvantitativ PCR (qPCR) använts i stor utsträckning för att bedöma genuttryck i gnagare vagal ganglionic massa26,27,28,29. Att undersöka genuttryck med hjälp av qPCR sker dock på bekostnad av en förlust av rumslig information. I synnerhet kan det inte förutsägas hur många celler eller vilken celltyp som uttrycker en viss gen av intresse (t.ex. snara kontra halsceller). Återkommande problem inkluderar också förorening med intilliggande vävnader och införandet av varierande längder av vagusnerven, överlägsen livmoderhalscancer och halspulsåder under dissekering15. Som ett resultat av ovanstående svårigheter omger kontroverser uttrycket och distributionen av flera GPCR i vagal afferenta nervceller. Ett särskilt förbryllande exempel gäller ghrelinreceptorn (Ghsr). Medan vissa studier har funnit utbredda uttryck för denna receptor i vagal afferenta nervceller30,31,32, andra har funnit Ghsr mRNA vara nästan oidentifierbar i snar ganglion11,14. Detaljerad kartläggning av Ghsr mRNA i vagal ganglionic massa är därför berättigad.
In situ hybridisering (ISH) har också använts för att bedöma genuttryck mönster i vagal ganglionic massa7,11,12,33,34,35. Eftersom RNA-baserade tekniker förblir mer tillförlitliga och specifika än antikroppsbaserade tekniker under de flesta omständigheter36,37, har ISH-studier visat sig värdefulla för bättre förståelse av den neurokemiska kodningen av vagala afferenta nervceller. Ändå är traditionella ISH-tekniker i sig inte utan varningar. Radioaktiv ISH är känslig men genererar bakgrund och förblir besvärlig38. Icke-radioaktiv ISH är mindre komplicerat men också mindre känsligt38. Däremot är den nyligen utvecklade RNAscope ISH-metoden mycket känslig och genererar minimal bakgrund39. Den aktuella studien tillämpade multiplex fluorescerande RNAscope till detektion av GPCRs i vagal afferent nervceller i musen. Vi fokuserade på att kartlägga fördelningen av Ghsr och jämförde dess fördelning med cholecystokininreceptorn (Cck1r), en annan GPCR välkänd för att uttryckas i snar ganglion34. Slutligen användes de två transkriptionsfaktorerna, parad-liknande homeobox 2b (Phox2b) och PR-domän zinkfingerprotein 12 (Prdm12), som selektiva markörer för snara och jugulära afferenta nervceller, respektive14. Utan att visualisera Phox2b eller Prdm12 skulle det vara utmanande att identifiera halspulsåder kontra snara afferenter med säkerhet. Potentiella tekniska fallgropar diskuteras också i hela artikeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Möss som användes i denna studie var vilda män på en ren C57BL/6J bakgrund. Totalt 4 möss användes för multiplex ISH. Alla möss var ungefär 8 veckor gamla vid tidpunkten för offret. En manlig mus (ungefär ett år gammal) användes också för att visa endogen fluorescens associeras med åldrande. Djur hölls i ventilerade burar i en barriäranläggning med ad libitum tillgång till mat och vatten. UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee granskade och godkände de förfaranden som beskrivs nedan. Information om reagenser och verktyg finns i tabellen över material.
1. Provsamling
- På offerdagen, administrera en överdos av klorhydrat (500 mg/kg, dvs. till mössen. Perfusera de djupt sövda mössen transkartiellt med hjälp av en peristaltisk pump med 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 50 ml 10% formalin vid rumstemperatur.
OBS: Detta görs i en rökhuv för att förhindra inandning av formalin. - Eftersom snaran, petrosal och hals ganglilierna smälts samman för att bilda en enda ganglionic massa i musen15, samla försiktigt hela vagal ganglionic massa från varje sida (vänster och höger) med hjälp av en dissekerande omfattning och fina vårsaxar och tångar (se tabellen över material).
- När du halshugger musen med en stor sax (se tabellen över material), undvik att krossa hjärnstammen.
- Efter en dissekeringsmetod som beskrivits tidigare i råtta40, ta bort sternohyoid och omohyoid muskler lateralt till luftstrupen med små tångar(Tabell av material) för att exponera occipital ben. Rensa hela regionen av muskler, fettvävnad och konjunktiv vävnad tills halsartären, vagusnerven, hypoglossala nerven och foramen magnum är synliga. Skär hela hypoglossala nerven med små vårsaxar (Materialtabell).
- Leta efter snar ganglion som en genomskinlig massa nära foramen magnum15. Använd en liten sax (Materialtabell), bryt försiktigt occipitalbenet för att ytterligare exponera halsgängan. Leta efter svarta melanocyter vid halspulsåder som ett visuellt landmärke.
- Skär nervtillbehör mellan den vagala ganglionic massan och extrahera hela ganglionic massan genom att försiktigt dra på den perifera änden av vagusnerven samtidigt som man skär halsgängan mot hjärnstammen med små vårsaxar(Materialtabell).
- Ta bort den konjunktiva vävnaden och fettet som fastnar på vagusnerven och ganglionic massan så mycket som möjligt.
- Eftersom det är lätt att förlora en ganglion under överföringen från ett rör till ett annat, håll ~ 0,5 cm av vagusnerven för att underlätta hantering och lokalisering av prover.
- Placera ganglier med hjälp av fina tångar i 1,5 ml mikrocentrifugerör och inkubera vid 4 °C i formalin i 24 timmar och med 30% sackaros i ytterligare 24 timmar.
- Placera ganglier inuti ett litet fall (~4 mm Ø) av optimal skärtemperaturmedium (OCT) på en bit aluminiumfolie. Frys sedan provet på en bädd av torr is.
- Skär proverna med en kryostat vid -20 °C i sektioner med 14 μm tjocklek och samla på glasmikroskopbilder som 3 serie 42 μm ifrån varandra.
OBS: Undvik att placera sektioner nära bildens kanter. För att spara reagenser, håll vävnadssektionerna så tätt packade som möjligt men utan överlappning. - Förvara proverna i en frys på -80 °C tills det behövs för ISH i minst 6 månader.
OBS: Se figur 1 för felsökning för endogen fluorescens.
2. Förbehandling och ISH
- Före experimentdagen ska autoklavlaboratorieglas användas för ISH, inklusive färgningsfat och tvättbuffertburkar.
OBS: När du arbetar under RNase-fria förhållanden är det inte kritiskt, använd alltid handskar. Håll RNase dekontamineringslösningsflaskor(Materialtabell)inom räckhåll om kontaminering misstänks. - På den första dagen, ta rutschkanorna till rumstemperatur på en bänk speciellt tillägnad ISH. Skölj rutschkanorna i 1x PBS och grädda dem i 30 minuter vid 60 °C i en bakugn(Materialbord).
- Efterfixa bilderna i 4% formalin i 15 min vid 4 °C.
- Ta reagenserna i multiplexsatsen(Materialtabellen)till rumstemperatur.
- Dehydrera rutschkanorna i 50%, 70% och 100% etanol i 5 min vardera. Applicera H2O2-lösningen på proverna i 10 minuter och skölj sedan i dubbeldestillerat vatten (ddH2O).
- Behandla proverna med målåtervinningsreagenset i 5 minuter, skölj i ddH2O följt av 100% etanol och lufttorr. Använd en hydrofobisk penna och skapa en barriär runt proverna.
OBS: Applicera inte den hydrofoba barriären för nära vävnadssektionerna. - Applicera proteas i 30 min vid 40 °C i en hybridiseringsugn(Materialbord).
- Under tiden, förkriga sonder vid 40 °C och kyla dem vid rumstemperatur före användning. Inkubera bilderna med önskad kombination av målsonder (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; eller Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) i 2 timmar vid 40 °C2 i en hybridiseringsugn.
- Inkubera negativ kontrollvävnad med dihydrodipicolinatreduktas (DapB) mål C1 sond för 2 h vid 40 °C i en hybridiseringsugn.
- Skölj rutschkanorna i tvättbuffert och förvara över natten i 5x saltlösningsnatriumcitrat (SSC) vid rumstemperatur. För enkelhetens skull, dela experimentet i två dagar. Skölj på följande dag bilderna med tvättbuffert och inkubera dem med förstärkningsreagenser som anges nedan (se användarhandboken i Tabell över material).
- Applicera AMP1 (30 min vid 40 °C), AMP2 (30 min vid 40 °C) och AMP 3 (15 min vid 40 °C). Skölj i tvättbuffert mellan varje steg.
- Lös upp varje Opalfärg(Materialtabell)i dimetylsulfoxid och förvara lösningarna vid 4 °C tills det behövs.
- För kanal 1, inkubera bilderna med HRP-C1 (15 min vid 40 °C) och Opal 520 (grön färg; utspädning 1/1 500; 30 minuter vid 40°C). Skölj i tvättbuffert mellan varje steg.
- För kanal 2, inkubera bilderna med HRP-C2 (15 min vid 40 °C) och Opal 570 (gul färg; utspädning 1/1 500; i 30 min vid 40 °C). Skölj i tvättbuffert mellan varje steg.
- För kanal 3, inkubera bilderna med HRP-C3 (15 min vid 40 °C) och Opal 690 (långt röd färg; utspädning 1/1 500; i 30 min vid 40 °C). Skölj i tvättbuffert mellan varje steg.
- Tvätta rutschkanorna och exponera dem för 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) i 30 s.
- Applicera omedelbart monteringsmediet på varje bild och placera ett täckslip över vävnadssektionen.
- Håll vävnaderna horisontella i en glidhållare vid 4 °C tills avbildningen.
3. Mikroskopi och dataanalys
OBS: Multiplex ISH-data kan avbildas med ett brett utbud av instrument med lämpliga filter. En föredragen avbildningsmetod är dock konfokal mikroskopi med 20x och 63x (olja) mål; hänvisa till diskussionen av skälen. Se figur 2 för bestämning av det optimala signal-till-brusförhållandet.
- Använd ett konfokalt mikroskop utrustat med laserlinjer på 488, 561 och 633 nm. Använd följande anskaffningsparametrar (se tabell 1): Opal 690 (HeNe 633 nm, detektionsområde 668-696 nm, effekt 2,0, förstärkning 724); Opal 570 (DPSS laser 561 nm, detektionsområde 579-627 nm,
- För att förbättra kvaliteten på bilderna, skaffa med en linje i genomsnitt 4 och en pixelstorlek på minst 1024 x 1024.
OBS: Ovanstående parametrar tillhandahålls endast som ett exempel, och modifieringar rekommenderas beroende på ett instrument, förstoring (20x eller 63x), uttrycksnivåer och endogena nivåer av fluorescens för en viss vävnad.- När du är nöjd med förvärvsparametrarna samlar du in bilder med samma inställningar. Tillskriva falska färger till varje kanal för att underlätta visualisering.
OBS: Till exempel röd (Phox2b eller Prdm12), cyan (Cck1r), gul (Ghsr) och grå (DAPI).- Utför cellräkning med hjälp av de digitala bilderna genom att identifiera konturen av RNAscope-positiva profiler med en kärna lätt fläckad med DAPI. Beräkna procentandelen RNAscope-positiva profiler som uttrycker varje transkription [figur 3A-C].
- För att förbättra noggrannheten och noggrannheten i uppskattningarna, räkna minst 2 000 neuronala profiler från minst 4 olika djur. Utför räkning från vänster och höger ganglier separat.
- Mata in data i ett cirkeldiagram med det totala antalet räknade profiler.
- Använd bildbehandlingsprogram för att skaffa bilder och sy ihop 20x bilder. Använd ImageJ-Fiji och en annan foto- och designprogramvara för att generera de slutliga plattorna. Gör justeringar för kontrast och lätthet på alla bilder.
- För att förbättra kvaliteten på bilderna, skaffa med en linje i genomsnitt 4 och en pixelstorlek på minst 1024 x 1024.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medan RNAScope kan appliceras på djur i alla åldrar, kön eller genetisk bakgrund, är det lämpligt att arbeta med unga vuxna (<3 månader gamla). Detta beror på att fluorescerande artefakter (t.ex. lipofuscin) är vanliga fynd i nervceller hos äldre djur41. De formalin-fasta ganglierna från äldre möss innehåller ofta förvånansvärt intensiv endogen fluorescens som lätt kan misstas för äkta färgning (figur 1A, B). Under alla omständigheter är det lämpligt att kontrollera nivåerna av endogen fluorescens i vävnaden före bearbetning.
Det är viktigt att bestämma optimala förvärvsparametrar och signal-till-brus-förhållande för varje laser och förstoring med hjälp av sektioner från en negativ kontrollvävnad inkuberad med DapB-negativ sond som visas i figur 2A,B. Eftersom DapB är en prokaryota gen bör RNAscope-signaler vara helt frånvarande från den negativa kontrollvävnaden. Bortsett från enstaka skräp och kristaller ses försumbar fluorescens i bilder från negativa kontrollvävnader, förutsatt att förvärvsparametrarna används är lämpliga. Men ovanför en viss laserkraft och förstärkning börjar oönskad bakgrund och slumpmässiga fluorescerande prickar dyka upp (figur 2C). Ett annat syfte med att minimera laserkraften är att undvika pixelmättnad och fotoblekning. Inga större problem med fluorescensblekning observerades vid arbete med ovanstående parametrar. Om ett sådant problem kan uppstå är det lämpligt att täcka vävnaden med ett monteringsmedium för fluorescerande märkta celler(Tabell av material) förutom att sänka lasereffekten så mycket som möjligt (se de rekommenderade parametrarna i tabell 1).
RNAscope-tekniken tillämpades för detektion av 3 gener i vävnadsdelar av musens vagala ganglionic massa(figur 3 och figur 4). En profil ansågs positiv för Ghsr och/eller Cck1r när gula respektive/eller cyan prickar sågs överlägga en profil fylld med röda prickar (figur 3A-C). Exemplet i figur 3 visar många profiler som innehåller både Phox2b- och Cck1r-transkriptioner (figur 3D). Phox2b användes för att identifiera snara afferenta nervceller. Rikliga Phox2b-signaler ackumulerade i nodose ganglion nervceller (Figur 4A, B). Cck1r-signaler upptäcktes i cirka 52% av Phox2b-cellerna (figur 4C). Observera att uttrycksnivåerna för Cck1r varierade kraftigt mellan celler, allt från måttliga (~ 20 prickar per profil) till intensiv märkning (cytoplasma fylld). Däremot var signalerna för Ghsr extremt glesa i snarliga ganglion (figur 4A, B). Endast uppskattningsvis 0,65% av Phox2b-positiva celler var också positiva för Ghsr-transkriptioner (figur 4C). Ghsr-uttrycka celler ofta co-expressed Cck1r. En visuell undersökning av vävnaderna visade inte uppenbara skillnader mellan vänster och höger ganglier. ISH-signaler var praktiskt taget frånvarande från områden utan nervceller (t.ex. epineurium och fiberkanalen).
Prdm12 användes för att identifiera jugular afferent nervceller. Som förväntat var Prdm12-uttrycket mycket berikat i nervcellerna i halskomanen och några neuroner som infiltrerade den rostala delen av snar ganglion (Figur 5A-C). Intressant nog upptäcktes Cck1r-signaler i en delmängd av Prdm12-celler (figur 5B, C). Något mindre än 9% av Prdm12-positiva nervceller uttryckte också Cck1r (Figur 5D). Hals ganglion innehåller dock endast celler med måttliga nivåer av Cck1r (<20 prickar per celler) snarare än de starkt märkta Cck1r-positiva cellerna som vanligtvis finns i snar ganglion. Ghsr-positiva celler var betydligt vanligare i halspulsåder än i snaran (figur 5C). Cirka 3% av Prdm12-cellerna var också Ghsr-positiva (figur 5D). Intressant nog var 1% av alla Prdm12 co-uttryckt både Ghsr och Cck1r. Uttrycksnivåer för Ghsr var alltid måttliga (<20 prickar per cell). Inga ISH-signaler kunde ses i områden utan nervceller.
Figur 1: Felsökning av endogen fluorescens ( A, B) Endogen fluorescens i snaran/halsgängan hos en åldrande mus (~1 år gammal). Digitala bilder förvärvades genom konfokal mikroskopi med hjälp av laserlinjerna som anges i färger och förvärvsparametrar som är identiska med de som används för multiplex ISH med yngre möss (se senare). Viktigt är att den fasta vävnaden inte bearbetades på något annat sätt än att lagras vid -80 °C och exponerades för DAPI. Som visas i Aobserveras en betydande nivå av oönskad fluorescens i neuronala och icke-neuronala celler, särskilt när de utsätts för 488 nm laser (grön). Detta är ett vanligt fynd i histologi, som motiverar bedömning endogen fluorescence före histologiska analys. (B) Vid högre förstoring liknade fluorescens lipofuscinpigment som ofta ackumuleras i åldrande celler och lätt kan misstas för äkta immunoreaktivitet och/eller RNAScope-signaler. Skalstänger = 158 μm (A) och 15 μm (B). (B). Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = snar ganglion; ISH = in situ hybridisering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Bestämning av optimalt signal-till-brus-förhållande. (A, B) Negativ kontroll bestående av RNAScope-detektion för den prokaryotiska genen DapB. Observera att endogen fluorescens i snar ganglion av en ung vuxen mus är minimal, och att inkubation med DapB-sonden inte resulterade i signaler. Förvärvsparametrarna var identiska med dem som användes för multiplex ISH. Detta visar att själva RNAScope-förfarandet inte ger någon betydande bakgrund om förvärvsparametrar väljs noggrant. (C) Digitala bilder av samma vävnad förvärvas vid ökande effektlaser och vinst med 488 nm laser. Observera hur en del suddig grön bakgrund och enstaka prickar uppstår över en viss laserkraft och vinst. Därför är det viktigt att noggrant välja förvärvsparametrar för varje laser baserat på mängden ospecificerad fluorescens som erhålls i den negativa kontrollvävnaden. Skalstänger = 158 μm (A) och 15 μm (B, C). Förkortningar: DapB = dihydrodipicolinat reduktas; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = snar ganglion; ISH = in situ hybridisering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Identifiering och räkning av positiva profiler. ( A) Representativ digital bild av Phox2b-märkta profiler (röda) i den rostala delen av snar ganglion. I det här exemplet identifierades totalt 18 cellulära profiler (märkta som 1 till 18). Observera att DAPI-färgning ytterligare hjälper till att lokalisera nervceller, som vanligtvis visade en stor och rund kärna med lätt DAPI-fläck. Däremot är kärnorna i icke-neuronala celler ljust märkta, långsträckta och mindre i storlek. Sammantaget överensstämde RNAScope-signalerna till fördelningen och formen av neuronala snarare än icke-neuronala celler. (B) Två märkta Ghsr-positiva nervceller (gula) visas (profilerna 19 och 20). Ghsr-signalerna var glesa och svåra att se. Därför förbättrades ljusheten och mättnaden av de gula signalerna selektivt och enhetligt i fotoprogramvara. c)Totalt nio Cck1r-märkta profiler (cyan) identifieras (märkta som 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 och 19). Observera hur intensiteten hos Cck1r-signaler varierade kraftigt mellan cellerna. Till exempel innehåller profil 11 bara några positiva signaler, medan profil 7 nästan är fylld med Cck1r-signaler. ( D) En sammanslagen vy över alla kanaler gjorde det möjligt att identifiera colocaliseringsmönster. Många Phox2b-positiva profiler uttryckte också Cck1r (t.ex. profilerna 2, 8 och 14), vilket framgår av röda och cyan RNAScope prickar inom samma cellulära profil. Däremot uttryckte Phox2b-positiva profiler inte Ghsr-transkriptioner (profilerna 19 och 20). Emellertid uttryckte en Ghsr-realitetcell också låga jämnar av Cck1r (profilera 19). De två stora DAPI-färgade atomkärnorna märkta med en vit asterisk motsvarar förmodligen platsen för Phox2b-negativa afferenta nervceller utan RNAScope-signaler. I de representativa resultaten som beskrivs nedan räknades minst 2 000 neuronala profiler från vänster och höger ganglionic massorna från 4 olika djur. Skalstänger = 24 μm. Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; Phox2b = parad hemobox 2b; Ghsr = ghrelinreceptor; Cck1r = cholecystokininreceptor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa resultat av multiplex ISH i snara afferenta nervceller. Digitala bilder av en representativ vagal ganglionic massa märkt med multiplex RNAscope för Phox2b, Cck1r och Ghsr. Bilder förvärvades med målen 20x (A) och 63x (B, C) mål för ett konfokalt mikroskop (Zeiss LSM880). I A, 20× flera bilder syddes ihop med Zen-programvaran och presenterades som antingen omixade kanaler eller sammanfogade. Phox2b signaler (röd) specifikt ackumuleras i afferenta nervceller som ligger i snar ganglion. Som förväntat, Cck1r signaler (cyan) intensivt märkt många, men inte alla, nervceller i snar ganglion. Vid låg förstoring kunde celler som uttrycker låga nivåer av Cck1r eller några celler med Ghsr-signaler (gul) inte observeras lätt. DAPI (grå) hjälpte till att visualisera vävnaden och identifiera vagal afferent nervceller med en stor och lätt färgade kärnan. Den vita infällningen i den sammanfogade bilden motsvarar platserna för bilden som ingår nedan. (B) Vid hög förstoring är Phox2b-positiva profiler (röda) uppenbara. Många celler uttryckte också Cck1r men på olika nivåer, allt från måttlig till mycket hög. Profilen "1" är ett exempel på en Phox2b-cellnegativ för Cck1r och Ghsr. Profiler "2" och "3" är Phox2b-celler med höga respektive måttliga Cck1r-signaler. Måttliga signaler för Ghsr (gul) sågs ibland i rostral snar ganglion men nästan alltid i celler negativa för Phox2b, som visas med profil "4". Intressant nog uttryckte profilen "4" både Ghsr och Cck1r. Som framgår av nästa figur var Ghsr mer riklig i Prdm12-celler. C)Cirkeldiagram som sammanfattar uppskattningarna av andelen Phox2b-celler (röda) som uttrycker antingen Ghsr (gul), Cck1r (cyan) eller båda (grå). Det totala antalet räknade profiler anges bredvid diagrammet (n=4 olika ganglier, vänster och höger kombinerat). Resultaten från varje sida poolades eftersom inga skillnader märktes. Skalstänger = 158 μm (A) och 15 μm (B). Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = snar ganglion; JG = halsringning ganglion; ISH = in situ hybridisering; Phox2b = parad hemobox 2b; Ghsr = ghrelinreceptor; Cck1r = cholecystokininreceptor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativa resultat av jugulära afferenta nervceller multiplex ISH. Digitala bilder av en representativ vagal ganglionic massa märkt med multiplex RNAscope Prdm12, Cck1r och Ghsr. Bilder förvärvades med målen 20x (A) och 63x (B, C) för ett konfokalmikroskop (Zeiss LSM880). I A, 20× flera bilder syddes ihop med Zen-programvaran och presenterades som antingen omixade kanaler eller sammanfogade. Prdm12 transkription (röd) specifikt ackumuleras i afferenta nervceller ligger i hals halsbrand ganglion och endast några nervceller infiltrerar den rostrala delen av snar ganglion. Cck1r signaler (cyan) intensivt märkt snar ganglion. Vid låg förstoring kunde celler som uttrycker låga nivåer av Cck1r eller några celler med Ghsr-signaler (gul) inte ses lätt. DAPI (grå) hjälpte till att visualisera vävnaden och identifiera vagal afferent nervceller med en stor och lätt färgade kärnan. De två vita inslagen i den sammanfogade bilden motsvarar platserna för bilderna som ingår nedan. (B, C) Vid hög förstoring kan Prdm12-positiva cellprofiler (röda) avgränsas. Måttliga signaler för Cck1r upptäcktes också i profilerna "1" och "2". Profil "3" är representativ för Prdm12 celler negativa för Cck1r eller Ghsr. I Cses Ghsr-signaler (gula) i representativ profil "4" men inte i "5". (D) Cirkeldiagram som sammanfattar uppskattningarna av andelen Prdm12-celler (röda) som uttrycker antingen Ghsr (gul), Cck1r (cyan) eller båda (grå). Det totala antalet räknade profiler anges bredvid diagrammet (n=4 olika ganglier, vänster och höger kombinerat). Resultaten från varje sida poolades eftersom inga skillnader märktes. Skalstänger = 158 μm (A) och 15 μm (B, C). Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = snar ganglion; JG = halsringning ganglion; ISH = in situ hybridisering; Prdm12 = PR-domän zinkfingerprotein 12; Phox2b = parad hemobox 2b; Ghsr = ghrelinreceptor; Cck1r = cholecystokininreceptor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Opal | Laserlinje | Detektionsområde | kraft | vinst | Linjegenomsnitt | Pixelstorlek |
| Opal 690 | HeNe 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 × 1024 |
| Opal 570 | DPSS-laser 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 × 1024 |
| Opal 520 | argonlaser 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 × 1024 |
| DAPI | diodlaser 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 × 1024 |
Tabell 1: Parametrar för förvärv. Förkortning: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniken för ISH uppfanns i slutet av 1960-talet42. Det är dock inte förrän i mitten av 1980-talet som det tillämpades för detektion av mRNAs i centrala och perifera nervsystemet43,44. Med tanke på nervsystemets heterogenitet och återkommande problem med antikroppar, är lokalisering av en viss transkription på cellnivå fortfarande ett ovärderligt verktyg. Icke desto mindre har traditionella ISH-metoder förblivit mödosamma och variably känsliga. Lyckligtvis använde denna studie ett mycket känsligt ISH-förfarande som kallas RNAscope, som vanligtvis inte genererar någon bakgrund och tillåter upptäckt av flera transkriptioner uttryckta på låga nivåer45,46. Specifikt tillämpades multiplex fluorescerande RNAScope för samtidig detektion av Ghsr och Cck1r transkriptioner. Transkriptionsfaktorerna, Phox2b och Prdm12, användes vidare som selektiva markörer för att skilja snara respektive jugulära afferenta nervceller. Utan att visualisera Phox2b och Prdm12 skulle det vara utmanande att identifiera jugulära kontra snara afferenta nervceller med säkerhet. Som förklarats ovan innehåller ett kritiskt steg en konsekvent och korrekt dissekeringsteknik. Dessutom är verifieringen av endogen fluorescens också en viktig faktor eftersom det lätt kan misstas för RNAScope-signaler. Dessutom rekommenderas valet av lämpliga förvärvsparametrar baserade på negativ kontrollvävnad starkt. Som nämnts tidigare är konfokal mikroskopi den föredragna avbildningsmetoden med 20x och 63x (olja) mål eftersom 1) transkriptioner uttryckta på låga nivåer och/eller i glesa celler endast kan märkas vid hög förstoring. 2) Konfokal mikroskopi gör det möjligt att samla in ett enda fokalplan, vilket är viktigt med tanke på att två celler ovanpå varandra felaktigt kan visas som en cell när de avbildas av epifluorescens. 3) Konfokal mikroskopi möjliggör också mer selektiva och flexibla förvärvsparametrar. Ovanstående förvärvsparametrar tillhandahålls endast som ett exempel, och modifieringar rekommenderas beroende på ett instrument, förstoring (20x eller 63x), uttrycksnivåer och endogena nivåer av fluorescens för en viss vävnad. Själva färgningsförfarandet förblev mycket nära det rekommenderade protokollet med endast små justeringar. Uppenbarligen kan protokollet som beskrivs här tillämpas på att upptäcka eventuella transkriptioner, inte bara GPCR. Det förfarande som beskrivs här är dock särskilt användbart med tanke på de återkommande problem med antikroppar som tas upp mot GPCR24.
Som tidigare diskuterats15, musen snar ganglion är ibland fäst vid överlägsen livmoderhalscancer ganglion av en cell bro. Införandet av denna cellbrygga kan leda till förvirrande resultat, t.ex. icke-vagala markörer som detekteras i snar ganglion. Utredaren kanske systematiskt vill kontrollera om snar ganglion är kopplad till den överlägsna livmoderhalsen ganglion under dissekering. Annars kommer inkonsekvent dissekeringsförmåga mellan ganglier att införa experimentell variabilitet. Det är också viktigt att notera att både petrosala och snara afferenta nervceller uttrycker Phox2b47. Således, vad vi kallade snara afferent nervceller ingår både petrosal och snara nervceller. Slutligen, när man jämför olika studier, bör man komma ihåg att olika metoder för dödshjälp kan orsaka förändringar i genuttryck48.
I teorin kan fluoroforerna som används för detektion omväxlande hänföras till vilken kanal som helst. Emellertid, Opal 690 konstaterades att avge en låg nivå av grön fluorescens. Under de flesta omständigheter, när det gäller högt uttryckta transkriptioner (t.ex. Prdm12), sågs oönskad grön fluorescens om laserintensiteten var för hög. Opal 690 rekommenderas därför för gener med måttligt/lågt uttryck. Om endast arbeta med starkt uttryckta gener, Det rekommenderas att späda Opal 690 ytterligare (dvs. 1/3,000) och inte fånga ospecificerad grön fluorescens under bildförvärv. RNAscope-signaler är separata prickar av olika färger, även när transkriptioner uttrycks inom samma cellprofil. Men för högt uttryckta transkriptioner kanske det inte är möjligt att se enskilda prickar utan snarare fluorescens fylla upp cytoplasma. När prickar avger fluorescens av olika färger kan man överväga ett problem med ospecificerad fluorescens på grund av bland annat otillräckliga förvärvsparametrar och/eller endogena pigment. Slutligen får Opal 570 och 620 inte användas samtidigt eftersom deras utsläppsspektra överlappar varandra.
Om inga RNAscope-signaler observeras för en gen som är känd för att uttryckas i vävnaden av intresse, rekommenderas det att verifiera vävnadens integritet genom att köra en positiv sond tillgänglig (dvs. peptidyl-prolyl cis-trans isomerasE B hushållningsgen). DAPI-mottaining är också till hjälp för att bestämma vävnadskvaliteten. DAPI-märkta kärnor som verkar strimlade kan tyda på överdriven matsmältning eller felaktigt fast vävnad.
Som ett resultat uttrycktes Ghsr i en liten delmängd av Prdm12-positiva jugulära afferenta nervceller. Däremot, och i samförstånd med en tidigare studie11, var Ghsr mRNA praktiskt taget frånvarande från snara afferenta nervceller. Det är härlett att låga nivåer av Ghsr mRNA tidigare upptäckt av qPCR och ISH sannolikt berodde på jugulära afferenta nervceller30,31,32. En tidigare kalciumsignaleringsstudie visade att 3% av odlade vagala afferenta nervceller svarar på ghrelin49, ett tal som är anmärkningsvärt likt andelen Ghsr-uttryckande jugulära afferenta nervceller. Cck1r uttrycktes i många Phox2b-positiva snara afferenta nervceller och, mer överraskande, i en delmängd av Prdm12-positiva jugular afferenta nervceller. Sammanfattningsvis visar detta dokument framgångsrik anpassning av befintliga ISH-tekniker för att bedöma cellulär distribution av utvalda GPCR i halspulsåder-snara ganglionic massa i sin helhet.
Sammanfattningsvis användes multiplex ISH för att upptäcka och samtidigt visualisera transkriptionerna för två GPCR (Cck1r och Ghsr) och en transkriptionsfaktor (Phox2b eller Prdm12) i hela vagal ganglionic komplexet av den vuxna musen. Protokollet som beskrivs här kan vara ett kompletterande verktyg till RNA-Sequencing, qPCR och traditionell histologi. Detta protokoll kan dock tillämpas på andra ganglier av liknande storlek. Som diskuterats ovan är förvärvsparametrar, djurens ålder och konsekvens av dissekering viktiga faktorer att tänka på under experimentell design. Därför kan det erbjuda unik information om topografiska genuttryck mönster i en mycket heterogen och liten ganglion. Detta protokoll kan användas för att fastställa förändringar i transkriptionsprofilerna för halspulsåder kontra snara afferenta nervceller i samband med olika fysiologiska och patofysiologiska förhållanden, inklusive, men inte begränsat till, förändringar i utfodringsstatus. Det kan också användas för att jämföra den neurokemiska halten av vagala afferenta nervceller hos djurarter som vanligen används i preklinisk forskning, inklusive primater och grisar50,51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Neuroanatomy / Histology / Brain Injection Core finansierat av NIH grant #5P01DK119130-02. Författarna vill erkänna hjälpen från UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (ledd av Dr. Phelps) och dess personal (Abhijit Bugde och Marcel Mettlen), delvis med stöd av NIH Grant #1S10OD021684-01, en delad resurs för Harold C. Simmons Cancer Center, delvis med stöd av ett NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
