Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62945

Summary

Multipleks in situ hibridizasyon (ISH), yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki G protein bağlantılı reseptör ve bir transkripsiyon faktörü için transkriptleri aynı anda görselleştirmek için kullanıldı. Bu protokol, vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.

Abstract

Bu çalışmada, fare juguler-nodose gangliyonunun multipleks in situ hibridizasyonu (ISH) için bir protokol açıklanmaktadır ve özellikle G protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) ekspresyonunu tespit etmeye vurgulanmaktadır. Formalin-sabit juguler-nodose gangliyonları, iki temsili GPCR'nin (kolesistokin ve ghrelin reseptörleri) ifadesini nodose (eşleştirilmiş homeobox 2b, Phox2b) veya juguler afferent nöronların (PR etki alanı çinko parmak proteini 12, Prdm12) bir işaret geni ile birlikte aynı anda tespit etmek için RNAscope teknolojisi ile işlendi. Etiketli gangliyonlar, yukarıda belirtilen transkriptlerin dağılım ve ifade kalıplarını belirlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Kısaca, Phox2b afferent nöronların kolesistokinin reseptörü (Cck1r) bolca ifade edildiği, ancak ghrelin reseptörü (Ghsr) ifade etmediği bulunmuştur. Prdm12 afferent nöronlarının küçük bir alt kümesinin de Ghsr ve/veya Cck1r'i ifade ettiği bulunmuştur. Bu makalede açıklanan yaklaşım, bilim adamlarının vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmalarına yardımcı olabilir.

Introduction

Vagal afferentlerin hücre gövdeleri juguler, petrosal ve nodose gangliyon1,2,3'te bulunur. Aksonları vagus sinirinin birkaç dalı aracılığıyla kraniyoserikal, torasik ve abdominal bölgelere birlikte seyahat eder4,5,6,7. İçsel uçlarından, vagal afferentler çok çeşitli fizyolojik ve zararlı uyaranlara yanıt verebilir8,9,10. Bununla birlikte, vagal algılamada yer alan sinyal moleküllerinin ve reseptörlerin dağılımı kötü karakterize olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni kısmen vagal gangliyonların, küçük boyutlarına rağmen, çok sayıda GPCR 8 , 11 , 12,13dahil olmak üzere geniş bir reseptör spektrumunu ifade etmeleridir. Ayrıca, vagal afferent nöronlar doğası gereği heterojendir ve farklı moleküler profiller görüntüler14. Konuyu karmaşıklaştırmak için, juguler, petrosal ve nodose gangliyonları fareye bağlanır ve böylece tek bir gangliyonik kütle oluşturur. Son olarak, hayvanların bir alt kümesinde, nodose ganglionu sempatik üstün servikal ganglion15'e bağlanır.

Geçmişte, araştırmacılar vagal afferent nöronların nörokimyasal makyajını incelemek için immünhistokimyaya başvurdular16,17,18. Doğrulanmış antikorların kullanılması immünostokimya yararlı olmakla birlikte, immünohistokimyasal çalışmaların sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. Örneğin, GPCR'lere karşı spesifik antikorları tanımlamaya yönelik çok sayıda çaba başarısız oldu19,20,21 , 22,23,24,25, araştırmacıların GPCR'lere karşı antikorların çoğunluğunun güvenilmez olduğu sonucuna varmasına yol açtı. Bu sorunları atlatmak için, kemirgen vagal gangliyonik kütle26 , 27 , 28,29gen ekspresyonini değerlendirmek için nicel PCR (qPCR) yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, qPCR kullanılarak gen ekspresyonunun incelenmesi, mekansal bilgi kaybı pahasına gerçekleşir. Özellikle, kaç hücrenin veya hangi hücre tiplerinin belirli bir ilgi genini (örneğin, nodose ve juguler hücreler) ifade ettiği tahmin edilemez. Tekrarlayan sorunlar ayrıca bitişik dokularla kontaminasyon ve diseksiyon sırasında vagus sinirinin değişken uzunluklarının, üstün servikal ve juguler gangliyonların dahil edilmesini içerir15. Yukarıdaki zorlukların bir sonucu olarak, tartışmalar vagal afferent nöronlarda birkaç GPCR'nin ekspresyon ve dağılımını çevreler. Özellikle şaşırtıcı bir örnek ghrelin reseptörü (Ghsr) ile ilgilidir. Bazı çalışmalar vagal afferent nöronlarda bu reseptörün yaygın ekspresyonunun30,31,32, diğerleri Ghsr mRNA'nın nodose ganglion 11,14'teneredeyse tespit edilemediğini bulmuşlardır. Bu nedenle vagal gangliyonik kütlede Ghsr mRNA'nın ayrıntılı haritalandırılması garanti edilir.

In situ hibridizasyon (ISH) vagal gangliyonik kütle7, 11 ,12,33,34,35gen ekspresyon kalıplarını değerlendirmek için de kullanılmıştır. RNA tabanlı teknikler çoğu durumda antikor bazlı tekniklerden daha güvenilir ve spesifik kaldığından36,37, ISH çalışmaları vagal afferent nöronların nörokimyasal kodlamasının daha iyi anlaşılması için değerli olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, geleneksel ISH tekniklerinin kendileri uyarı olmadan değildir. Radyoaktif ISH hassastır, ancak arka plan oluşturur ve hantalkalır 38. Radyoaktif olmayan ISH daha az karmaşık ama aynı zamanda daha az hassas38. Buna karşılık, son zamanlarda geliştirilen RNAscope ISH yöntemi son derece hassastır ve en az arka planoluşturur 39. Mevcut çalışma, farenin vagal afferent nöronlarında GPCR'lerin tespitine multipleks floresan RNAscope uyguladı. Ghsr'nin dağılımını haritalamaya odaklandık ve dağıtımını nodose ganglion34'teifade edildiği bilinen başka bir GPCR olan kolesistokinin reseptörü (Cck1r) ile karşılaştırdık. Son olarak, eşleştirilmiş homeobox 2b (Phox2b) ve PR etki alanı çinko parmak proteini 12 (Prdm12) olmak üzere iki transkripsiyon faktörü, nodose ve juguler afferent nöronlar için seçici belirteçler olarak kullanılmıştır, sırasıyla14. Phox2b veya Prdm12'yi görselleştirmeden, jugular vs. nodose afferentlerini kesin olarak tanımlamak zor olacaktır. Makale boyunca potansiyel teknik tuzaklar da tartışılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu çalışmada kullanılan fareler saf C57BL/6J arka plan üzerinde vahşi tip erkeklerdi. Multipleks ISH için toplam 4 fare kullanıldı. Tüm fareler kurban sırasında yaklaşık 8 haftalıktı. Yaşlanma ile ilişkili endojen floresan göstermek için bir erkek fare (yaklaşık bir yaşında) da kullanılmıştır. Hayvanlar, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan bir bariyer tesisi içinde havalandırmalı kafeslerde barındırıldı. UT Southwestern Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi aşağıda açıklanan prosedürleri gözden geçirdi ve onayladı. Reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosu 'ndabulunabilir.

1. Örnek toplama

  1. Kurban gününde, farelere aşırı dozda kloral hidrat (500 mg / kg, yani) sürün. Derin uyuşturulmuş fareleri, 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından oda sıcaklığında% 10 formalin 50 mL ile peristaltik bir pompa kullanarak transkardiyöz olarak perfüzyona maruz kalın.
    NOT: Bu, formalinin solunmasını önlemek için duman kaputunda yapılır.
  2. Nodose, petrosal ve juguler gangliyonlar farede tek bir gangliyonik kütle oluşturmak için kaynaştıkça15, tüm vagal gangliyonik kütleyi bir diseksiyon kapsamı ve ince yay makası ve forseps yardımıyla her iki taraftan (sol ve sağ) dikkatlice toplayın (Bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Farenin kafasını bir çift büyük makasla kıtırken (Malzeme Tablosunabakın), beyin sapının ezilmemesi gerekir.
  4. Sıçanda daha önce açıklanan bir diseksiyon yaklaşımını takiben40, oksipital kemiği ortaya çıkarmak için sternohyoid ve omohyoid kasları küçük önpslerle(Malzeme Masası)nefes borusuna yanal olarak çıkarın. Şahdamar, vagus siniri, hipoglossal sinir ve foramen magnum görünene kadar tüm bölgeyi kas, yağ dokusu ve konjonktif dokudan temizleyin. Tüm hipoglossal siniri küçük yay makası(Malzeme Masası)ile kesin.
  5. Nodose ganglion'un foramen magnum15'eyakın yarı saydam bir kütle olarak arayın. Küçük makas kullanarak (Malzeme Masası), juguler ganglionu daha fazla ortaya çıkarmak için oksipital kemiği dikkatlice kırın. Görsel bir dönüm noktası olarak şahdamarının yüzeyinde siyah melanositler arayın.
  6. Vagal gangliyonik kütle arasındaki sinir bağlantılarını kesin ve küçük yay makası(Malzeme Masası)ile beyin sapına doğru şahdamarını keserken vagus sinirinin periferik ucunun üzerine hafifçe çekerek tüm gangliyonik kütleyi çıkarın.
  7. Vagus sinirine ve gangliyonik kütleye yapışan konjonktürel dokuyu ve yağı mümkün olduğunca çıkarın.
  8. Bir tüpten diğerine transfer sırasında bir ganglionu kaybetmek kolay olduğundan, numunelerin işlenmesini ve lokalizasyonunu kolaylaştırmak için vagus sinirinin ~ 0,5 cm'ini saklayın.
  9. Gangliyonları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ince forseps yardımıyla yerleştirin ve formalin içinde 4 °C'de 24 saat ve 24 saat boyunca% 30 sakkarozla kuluçkaya yatırın.
  10. Gangliyumu bir parça alüminyum folyo üzerine optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamının küçük bir damlasının (~4 mm Ø) içine yerleştirin. Ardından, numuneyi kuru buz yatağında dondurun.
  11. Örnekleri -20 °C'de kriyostatla 14 μm kalınlığında bölümlere kesin ve cam mikroskop slaytlarında 3 seri 42 μm aralıklarla toplayın.
    NOT: Bölümleri slaydın kenarlarına yakın yerleştirmekten kaçının. Reaktifleri kaydetmek için, doku bölümlerini mümkün olduğunca sıkı bir şekilde paketlenin, ancak üst üste binmeden tutun.
  12. Numuneleri -80 °C dondurucuda en az 6 ay boyunca ISH için gerekli olana kadar saklayın.
    NOT: Endojen floresan sorunlarını gidermek için Şekil 1'e bakın.

2. Ön işlem ve ISH

  1. Deneyler gününden önce, bulaşıkları boyamak ve tampon kavanozları yıkamak da dahil olmak üzere ISH için kullanılacak laboratuvar camlarını otoklavlayın.
    NOT: RNase içermeyen koşullar altında çalışmak kritik olmasa da, her zaman eldiven giyin. Kontaminasyondan şüphelenilme durumunda RNase dekontaminasyon çözelti şişelerini(Malzeme Masası)ulaşılabilecek bir yerde tutun.
  2. İlk gün, slaytları özellikle ISH'ye adanmış bir bankta oda sıcaklığına getirin. Slaytları 1x PBS'de durulayın ve bir fırın fırınında(Malzeme Masası)60 °C'de 30 dakika pişirin.
  3. Slaytları 4 °C'de 15 dakika boyunca % 4 formalin olarak sabitleyin.
  4. Multipleks kitteki reaktifleri(Malzeme Masası)oda sıcaklığına getirin.
  5. Slaytları her biri 5 dakika boyunca% 50, % 70 ve% 100 etanolde susuz bırakır. Numunelere10dakika boyunca H 2 O2 çözeltisi uygulayın ve ardından çift damıtılmış suda durulayın (ddH2O).
  6. Numuneleri hedef alma reaktifi ile 5 dakika boyunca tedavi edin, ddH2O'da durulayın ve ardından% 100 etanol ve hava kuru. Hidrofobik bir kalem kullanarak, numunelerin etrafında bir bariyer oluşturun.
    NOT: Hidrofobik bariyeri doku bölümlerine çok yakın uygulamayın.
  7. Bir hibridizasyon fırınına(Malzeme Masası)40 °C'de 30 dakika proteaz uygulayın.
  8. Bu arada, probları 40 °C'de önceden ısıtın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Bir hibridizasyon fırınında 40 °C'de 2 saat boyunca hedef probların (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; veya Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) istenen kombinasyonuyla slaytları kuluçkaya yatırın.
  9. Hibridizasyon fırınında 40 °C'de 2 saat boyunca dihidrodipikolinat redüktaz (DapB) hedef C1 probu ile negatif kontrol dokusunu kuluçkaya yatırın.
  10. Slaytları yıkama tamponunda durulayın ve oda sıcaklığında 5x salin sodyum sitrat (SSC) içinde gece boyunca saklayın. Kolaylık sağlamak için deneyi iki güne bölün. Ertesi gün, slaytları yıkama tamponu ile durulayın ve aşağıda listelenen amplifikasyon reaktifleriyle kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosu'ndakikullanım kılavuzuna bakın).
  11. AMP1 (40 °C'de 30 dk), AMP2 (40 °C'de 30 dk) ve AMP 3 (40 °C'de 15 dk) uygulayın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  12. Her Opalboyasını( Malzeme Masası ) dimetil süloksit içinde çözün ve çözeltileri ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
  13. Kanal 1 için, slaytları HRP-C1 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 520 (yeşil renk; seyreltme 1/1.500; 40°C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  14. Kanal 2 için, slaytları HRP-C2 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 570 (sarı renk; seyreltme 1/1.500; 40 °C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  15. Kanal 3 için, slaytları HRP-C3 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 690 (uzak kırmızı renk; seyreltme 1/1.500; 40 °C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.
  16. Slaytları yıkayın ve 30 s için 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) maruz.
  17. Her kaydırağa hemen montaj ortamı uygulayın ve doku bölümünün üzerine bir kapak kılıfı yerleştirin.
  18. Görüntülemeye kadar dokuları 4 °C'de bir slayt tutucuda yatay tutun.

3. Mikroskopi ve veri analizi

NOT: Multipleks ISH verileri, uygun filtrelere sahip çok çeşitli araçlarla görüntülenebilir. Bununla birlikte, tercih edilen bir görüntüleme yöntemi 20x ve 63x (yağ) hedeflerine sahip konfokal mikroskopidir; nedenlerle tartışmaya bakın. En uygun sinyal-gürültü oranının belirlenmesi için Şekil 2'ye bakın.

  1. 488, 561 ve 633 nm lazer hatları ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın. Aşağıdaki alma parametrelerini kullanın (bkz: Tablo 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, algılama aralığı 668-696 nm, güç 2.0, kazanç 724); Opal 570 (DPSS lazer 561 nm, algılama aralığı 579-627 nm, < güç 15.0,
  2. Görüntülerin kalitesini artırmak için, ortalama 4 çizgi ve en az 1024 x 1024 piksel boyutu elde edin.
    NOT: Yukarıdaki parametreler sadece örnek olarak sağlanmıştır ve değişiklikler bir alete, büyütmeye (20x veya 63x), ifade seviyelerine ve herhangi bir doku için endojen floresan seviyelerine bağlı olarak önerilir.
  3. Edinme parametrelerinden memnun olduktan sonra, aynı ayarları kullanarak görüntüleri toplayın. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için her kanala yanlış renkler atfin.
    NOT: Örneğin, kırmızı (Phox2b veya Prdm12), siyan (Cck1r), sarı (Ghsr) ve gri (DAPI).
  4. Dapi ile hafifçe boyanmış bir çekirdekle RNAscope pozitif profillerin ana hatlarını tanımlayarak dijital görüntüleri kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. Her transkripti ifade eden RNAscope pozitif profillerin yüzdesini hesaplayın [Şekil 3A-C].
  5. Tahminlerin titizliğini ve doğruluğunu artırmak için, en az 4 farklı hayvandan en az 2.000 nöronal profil sayın. Sayım işlemi soldan ve sağdan gangliyonlardan ayrı ayrı gerçekleştirin.
  6. Verileri, toplam sayılan profil sayısıyla bir pasta grafiğe girin.
  7. Görüntüleri elde etmek ve 20x görüntüleri bir araya getirmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Son plakaları oluşturmak için ImageJ-Fiji ve başka bir fotoğraf ve tasarım yazılımı kullanın. Kontrast ve hafiflik ayarlamalarını tüm görüntülere eşit şekilde uygulayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNAScope herhangi bir yaştan, cinsiyette veya genetik kökenden hayvanlara uygulanabilirken, genç yetişkinlerle (<3 aylık) çalışmanız önerilir. Bunun nedeni, floresan eserlerin (örneğin lipofuscin) yaşlı hayvanların nöronlarında yaygın bulgular olmasıdır41. Yaşlı farelerden formalin-sabit gangliyon genellikle kolayca gerçek boyama ile karıştırılabilecek şaşırtıcı derecede yoğun endojen floresan içerir (Şekil 1A,B). Her durumda, işlemden önce dokudaki endojen floresan seviyelerinin doğrulanması tavsiye edilir.

Şekil 2A,B'de gösterildiği gibi DapB negatif prob ile inkübe edilmiş negatif kontrol dokusundan bölümler kullanılarak her lazer ve büyütme için en uygun alım parametrelerini ve sinyal-gürültü oranını belirlemekönemlidir. DapB prokaryotik bir gen olduğu için negatif kontrol dokusunda RNAscope sinyalleri tamamen bulunmamalıdır. Ara sıra döküntü ve kristallerin yanı sıra, elde alma parametrelerinin uygun olması koşuluyla, negatif kontrol dokularından gelen görüntülerde ihmal edilebilir floresan görülür. Bununla birlikte, belirli bir lazer gücünün ve kazancının üzerinde, istenmeyen arka plan ve rastgele floresan noktalar görünmeye başlar (Şekil 2C). Lazer gücünü en aza indirmenin bir başka amacı da piksel doygunluğundan ve fotobleaching'den kaçınmaktır. Yukarıdaki parametrelerle çalışırken floresan ağartma ile ilgili önemli bir sorun gözlenmedi. Böyle bir sorun ortaya çıkabilirse, lazer gücünü mümkün olduğunca düşürmenin yanı sıra floresan etiketli hücreler (Malzeme Tablosu) için bir montaj ortamı ile dokuyu örtmeniz önerilir (Tablo 1'dekiönerilen parametrelere bakın).

Farenin vagal gangliyonik kütlesinin doku bölümlerinde 3 genin tespiti için RNAscope tekniği uygulanmıştır (Şekil 3 ve Şekil 4). Bir profil Ghsr ve/veya Cck1r için pozitif olarak kabul edildi, sırasıyla sarı ve/veya siyan noktalar, kırmızı noktalarla dolu bir profilin üzerine bindirildi (Şekil 3A-C). Şekil 3'te verilen örnek, hem Phox2b hem de Cck1r transkriptlerini içeren birçok profili gösterir (Şekil 3D). Phox2b nodose afferent nöronları tanımlamak için kullanıldı. Nodose ganglion nöronlarında biriken bol miktarda Phox2b sinyalleri (Şekil 4A, B). Phox2b hücrelerinin yaklaşık %52'sinde Cck1r sinyalleri saptanmıştır(Şekil 4C). Not olarak, Cck1r için ifade düzeyleri hücreler arasında orta (profil başına ~ 20 nokta) yoğun etiketlemeye (sitoplazma dolgulu) kadar büyük ölçüde değişmektedir. Buna karşılık, Ghsr sinyalleri nodose ganglionunda son derece seyrekti (Şekil 4A, B). Phox2b pozitif hücrelerin sadece tahmini % 0.65'i de Ghsr transkriptleri için pozitifti (Şekil 4C). Ghsr ekspresyör hücreleri genellikle Cck1r'i birlikte ifade eder. Dokularda yapılan görsel bir araştırmada sol ve sağ gangliyonlar arasında belirgin farklılıklar olmadığı ortaya kondu. ISH sinyalleri nöronlardan yoksun bölgelerde (örneğin epineüryum ve fiber sistem) neredeyse yoktu.

Prdm12 juguler afferent nöronları tanımlamak için kullanıldı. Beklendiği gibi, Prdm12 ekspresyonu juguler ganglionun nöronlarında ve nodoe ganglionun rostral kısmına sızan birkaç nöronda oldukça zenginleştirilmiştir (Şekil 5A-C). İlginçtir ki, Prdm12 hücrelerinin bir alt kümesinde Cck1r sinyalleri tespit edildi (Şekil 5B, C). Prdm12 pozitif nöronların% 9'undan biraz daha azı da Cck1r 'i ifade etti (Şekil 5D). Bununla birlikte, juguler ganglion, nodoe ganglionunda yaygın olarak bulunan güçlü etiketli Cck1r pozitif hücreler yerine sadece orta düzeyde Cck1r (hücre başına <20 nokta) olan hücreler içerir. Ghsr-pozitif hücreler şahdamarında nodose'a göre önemli ölçüde daha yaygındı (Şekil 5C). Prdm12 hücrelerinin yaklaşık %3'ü de Ghsr pozitifti (Şekil 5D). İlginçtir ki, Ghsr için tüm Prdm12'nin hem Ghsr hem de Cck1r. İfade seviyelerinin% 1'i her zaman ılımlıydı (hücre başına <20 nokta). Nöronlardan yoksun bölgelerde ISH sinyali görülemedi.

Figure 1
Şekil 1: Endojen floresan sorunlarının giderilmesi. (A, B) Yaşlanan bir farenin nodoz/juguler ganglionunda endojen floresan (~1 yaşında). Dijital görüntüler, genç farelerle multipleks ISH için kullanılanlarla aynı renklerde ve edinme parametrelerinde belirtilen lazer çizgileri kullanılarak konfokal mikroskopi ile elde edilmiştir (daha sonra bakınız). Daha da önemlisi, sabit doku -80 °C'de saklanmak ve DAPI'ya maruz kalmak dışında hiçbir şekilde işlenmedi. A'da gösterildiği gibi, nöronal ve nöronal olmayan hücrelerde, özellikle 488 nm lazere (yeşil) maruz kaldığında önemli düzeyde istenmeyen floresan görülür. Bu, histolojik analizden önce endojen floresan değerlendirmeyi garanti eden histolojide yaygın bir bulgudur. (B) Daha yüksek büyütmede, floresan genellikle yaşlanan hücrelerde biriken ve kolayca gerçek immünoreaktivite ve / veya RNAScope sinyalleri ile karıştırılabilen lipofuscin pigmentlerine benziyordu. Ölçek çubukları = 158 μm (A) ve 15 μm (B). (B). Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindole; NG = nodose ganglion; ISH = yerinde hibridizasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Optimum sinyal-gürültü oranının belirlenmesi. (A, B) Prokaryotik gen DapBiçin RNAScope tespitinin oluşturduği negatif kontrol. Genç bir yetişkin farenin nodose ganglionunda endojen floresan minimal olduğunu ve DapB probu ile inkübasyonun sinyallerle sonuç vermediğini unutmayın. Alma parametreleri multipleks ISH için kullanılanlarla aynıydı. Bu, edinme parametreleri dikkatlice seçilirse RNAScope yordamın kendisinin önemli bir arka plan üretmediğini gösterir. (C) 488 nm lazer ile güç lazer ve kazanç artırmada elde edilen aynı dokunun dijital görüntüleri. Bazı bulanık yeşil arka plan ve zaman zaman noktalar belirli bir lazer gücü ve kazanç üzerinde ortaya nasıl dikkat edin. Bu nedenle, negatif kontrol dokusunda elde edilen spesifik olmayan floresan miktarına göre her lazer için alım parametrelerini dikkatlice seçmek önemlidir. Ölçek çubukları = 158 μm (A) ve 15 μm (B, C). Kısaltmalar: DapB = dihidrodipikolinat redüktaz; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; NG = nodose ganglion; ISH = yerinde hibridizasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Pozitif profillerin tanımlanması ve sayımı. (A) Nodose ganglionunun rostral kısmında Phox2b etiketli profillerin (kırmızı) temsili dijital görüntüsü. Bu örnekte, toplam 18 hücresel profil (1 ile 18 arasında etiketlenmiştir) tanımlanmıştır. DAPI lekelemenin, tipik olarak hafif DAPI lekesi ile büyük ve yuvarlak bir çekirdek gösteren nöronların lokalizasyonunda daha fazla yardımcı olduğunu unutmayın. Buna karşılık, nöronal olmayan hücrelerin çekirdekleri parlak bir şekilde etiketlenir, uzatılır ve boyutu daha küçüktür. Genel olarak, RNAScope sinyalleri nöronal olmayan hücreler yerine nöronal dağılımına ve şekline uygundur. (B) İki etiketli Ghsr pozitif nöron (sarı) gösterilmiştir (profiller 19 ve 20). Ghsr sinyalleri seyrekti ve görülmesi zordu. Bu nedenle, sarı sinyallerin hafifliği ve doygunluğu fotoğraf yazılımında seçici ve eşit olarak geliştirilmiştir. (C) Toplam dokuz Cck1r etiketli profil (siyan) tanımlanır (2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 ve 19 olarak etiketlenir). Cck1r sinyallerinin yoğunluğunun hücreler arasında nasıl büyük ölçüde değiştiğini unutmayın. Örneğin, profil 11 yalnızca birkaç pozitif sinyal içerirken, profil 7 neredeyse Cck1r sinyalleriyle doludur. (D) Tüm kanalların birleştirilmiş görünümü, kolokalizasyon desenlerinin tanımlanmasına izin verdi. Birçok Phox2b pozitif profil, aynı hücresel profil içindeki kırmızı ve siyan RNAScope noktaları tarafından kanıtlanan Cck1r'ı (örneğin, profil 2, 8 ve 14) birlikte ifade etti. Buna karşılık, Phox2b pozitif profiller Ghsr transkriptlerini ifade etmedi (profiller 19 ve 20). Bununla birlikte, bir Ghsr pozitif hücre de düşük Cck1r seviyelerini ifade etti (profil 19). Beyaz yıldız işareti ile etiketlenmiş iki büyük DAPI lekeli çekirdek, muhtemelen RNAScope sinyallerinden yoksun Phox2b negatif afferent nöronların konumuna karşılık gelir. Aşağıda açıklanan temsili sonuçlarda, 4 farklı hayvandan sol ve sağ gangliyonik kitlelerden en az 2.000 nöronal profil sayılmıştır. Ölçek çubukları = 24 μm. Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindole; Phox2b = eşleştirilmiş homeobox 2b; Ghsr = ghrelin reseptörü; Cck1r = kolesistokinin reseptörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Nodose afferent nöronlarda multipleks ISH'nin temsili sonuçları. Phox2b, Cck1r ve Ghsr için multipleks RNAscope ile etiketlenmiş temsili bir vagal gangliyonik kütlenin dijital görüntüleri, konfokal mikroskobun (Zeiss LSM880) 20x (A) ve 63x (B, C) hedefleri ile elde edildi. A, 20×'da zen yazılımı kullanılarak birkaç görüntü birbirine dikildi ve karıştırılmamış kanallar olarak sunuldu veya birleştirildi. Phox2b sinyalleri (kırmızı) özellikle nodose ganglionunda bulunan afferent nöronlarda birikir. Beklendiği gibi, Cck1r sinyalleri (siyan) nodose ganglionunda birçok nöron, ancak hepsi değil, yoğun bir şekilde etiketlendi. Düşük büyütmede, düşük Cck1r seviyelerini ifade eden hücreler veya Ghsr sinyalli (sarı) herhangi bir hücre kolayca gözlemlenemedi. DAPI (gri), dokunun görselleştirilmesine ve büyük ve hafif lekeli bir çekirdeğe sahip vagal afferent nöronların tanımlanmasına yardımcı oldu. Birleştirilen görüntüdeki beyaz içe, aşağıda bulunan görüntünün konumlarına karşılık gelir. (B) Yüksek büyütmede Phox2b pozitif profiller (kırmızı) belirgindir. Birçok hücre de Cck1r'i ifade etti, ancak orta ila çok yüksek arasında değişen seviyelerde. "1" profili, Cck1r ve Ghsr için negatif bir Phox2b hücresi örneğidir. Ghsr (sarı) için ılımlı sinyaller zaman zaman rostral nodose ganglionunda, ancak "4" profilinde gösterildiği gibi Phox2b için negatif hücrelerde görüldü. İlginçtir ki, profil "4" hem Ghsr hem de Cck1r'i ifade etti. Bir sonraki şekilde gösterildiği gibi, Ghsr Prdm12 hücrelerinde daha boldu. (C) Phox2b hücrelerinin (kırmızı) Ghsr (sarı), Cck1r (siyan) veya her ikisinin (gri) birlikte ifade etme yüzdesinin tahminlerini özetleyen pasta grafik. Toplam sayılan profil sayısı grafiğin yanında belirtilir (n=4 farklı gangliyon, sol ve sağ birleştirilmiş). Her iki taraftan sonuçlar, hiçbir fark fark edilmedikleri için birikti. Ölçek çubukları = 158 μm (A) ve 15 μm (B). Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindole; NG = nodose ganglion; JG = şahdamar ganglionu; ISH = yerinde hibridizasyon; Phox2b = eşleştirilmiş homeobox 2b; Ghsr = ghrelin reseptörü; Cck1r = kolesistokinin reseptörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Juguler afferent nöronların multiplks ISH'nin temsili sonuçları. Multipleks RNAscope Prdm12, Cck1r ve Ghsr. Images ile etiketlenmiş temsili bir vagal gangliyonik kütlenin dijital görüntüleri, konfokal mikroskobun (Zeiss LSM880) 20x (A) ve 63x (B, C) hedefleri ile elde edildi. A, 20×'da zen yazılımı kullanılarak birkaç görüntü birbirine dikildi ve karıştırılmamış kanallar olarak sunuldu veya birleştirildi. Prdm12 transkript (kırmızı) özellikle juguler ganglion bulunan afferent nöronlarda ve nodose ganglion rostral kısmına sızan sadece birkaç nöronda birikir. Cck1r sinyalleri (siyan) nodose ganglion'u yoğun bir şekilde etiketledi. Düşük büyütmede, düşük Cck1r seviyelerini ifade eden hücreler veya Ghsr sinyalli (sarı) herhangi bir hücre kolayca görülemedi. DAPI (gri), dokunun görselleştirilmesine ve büyük ve hafif lekeli bir çekirdeğe sahip vagal afferent nöronların tanımlanmasına yardımcı oldu. Birleştirilen görüntüdeki iki beyaz içe geçenler, aşağıda yer alan görüntülerin konumlarına karşılık gelir. (B, C) Yüksek büyütmede Prdm12 pozitif hücre profilleri (kırmızı) tanımlama yapılabilir. "1" ve "2" profillerinde de Cck1r için ılımlı sinyaller tespit edildi. Profil "3", Prdm12 hücrelerinin Cck1r veya Ghsr için negatif olduğunu temsil eder. C'de, Ghsr sinyalleri (sarı) "4" temsili profilde görülür, ancak "5" de görülmez. (D) Prdm12 hücrelerinin (kırmızı) Ghsr (sarı), Cck1r (siyan) veya her ikisinin (gri) birlikte ifade etme yüzdesinin tahminlerini özetleyen pasta grafik. Toplam sayılan profil sayısı grafiğin yanında belirtilir (n=4 farklı gangliyon, sol ve sağ birleştirilmiş). Her iki taraftan sonuçlar, hiçbir fark fark edilmedikleri için birikti. Ölçek çubukları = 158 μm (A) ve 15 μm (B, C). Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindole; NG = nodose ganglion; JG = şahdamar ganglionu; ISH = yerinde hibridizasyon; Prdm12 = PR etki alanı çinko parmak proteini 12; Phox2b = eşleştirilmiş homeobox 2b; Ghsr = ghrelin reseptörü; Cck1r = kolesistokinin reseptörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Opal Lazer hattı Algılama aralığı güç kazanç Satır ortalaması Piksel boyutu
Opal 690 HeNe 633 nm 668-696 nm 2 724 4 1024 x 1024
Opal 570 DPSS lazer 561 nm 579-627 nm 15 450 4 1024 x 1024
Opal 520 argon lazer 488 nm 499-535 nm 6 830 4 1024 x 1024
DAPI diyot lazer 405 415-502 nm 12 532 4 1024 x 1024

Tablo 1: Edinme parametreleri. Kısaltma: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ISH tekniği 1960'ların sonunda icat edildi42. Ancak, 1980'lerin ortalarına kadar merkezi ve periferik sinir sistemlerinde mRNA'ların tespiti için uygulanmadı43,44. Sinir sisteminin heterojenliği ve antikorlarla ilgili tekrarlayan sorunlar göz önüne alındığında, belirli bir transkriptin hücresel düzeyde lokalize edilmesi paha biçilmez bir araç olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, geleneksel ISH yöntemleri zahmetli ve değişken derecede hassas kalmıştır. Neyse ki, bu çalışma genellikle arka plan oluşturmayan ve düşük seviyelerde ifade edilen birkaç transkriptin tespit edilmesine izin veren RNAscope adlı son derece hassas bir ISH prosedürü uyguladı45,46. Özellikle, Ghsr ve Cck1r transkriptlerinin eşzamanlı tespiti için multipleks floresan RNAScope uygulandı. Transkripsiyon faktörleri, Phox2b ve Prdm12, sırasıyla nodoe ve juguler afferent nöronları ayırt etmek için seçici belirteçler olarak kullanılmıştır. Phox2b ve Prdm12'yi görselleştirmeden, juguler ve nodose afferent nöronları kesin olarak tanımlamak zor olacaktır. Yukarıda açıklandığı gibi, kritik bir adım tutarlı ve uygun bir diseksiyon tekniği içerir. Ek olarak, endojen floresan doğrulaması da RNAScope sinyalleri ile kolayca karıştırılabileceği için önemli bir faktördür. Ayrıca, negatif kontrol dokusuna dayalı uygun alım parametrelerinin seçimi şiddetle tavsiye edilir. Daha önce de belirtildiği gibi, konfokal mikroskopi 20x ve 63x (yağ) hedefleri ile tercih edilen görüntüleme yöntemidir, çünkü düşük seviyelerde ve/veya seyrek hücrelerde ifade edilen 1) transkriptler sadece yüksek büyütmede fark edilebilir. 2) Konfokal mikroskopi, epifluoresans ile görüntülendiğinde üst üste iki hücrenin yanlış bir şekilde tek hücre olarak görünebileceği düşünüldüğünde önemli olan tek bir odak düzleminin toplanmasına izin verir. 3) Konfokal mikroskopi daha seçici ve esnek alım parametrelerine de olanak tanır. Yukarıdaki alma parametreleri sadece bir örnek olarak sağlanır ve değişiklikler bir alete, büyütmeye (20x veya 63x), ekspresyon seviyelerine ve herhangi bir doku için endojen floresan seviyelerine bağlı olarak önerilir. Boyama prosedürünün kendisi, sadece hafif ayarlamalarla önerilen protokolünkine çok yakın kaldı. Açıkçası, burada açıklanan protokol sadece GPCR'lerin değil, herhangi bir transkriptin tespitine uygulanabilir. Burada açıklanan prosedür yine de GPCRs24'ekarşı yükseltilen antikorlarla ilgili tekrarlayan sorunlar göz önüne alındığında özellikle yararlıdır.

Daha önce tartışıldığı gibi15Fare nodose ganglionu bazen bir hücre köprüsü tarafından üstün servikal ganglion'a bağlanır. Bu hücre köprüsünün dahil edilmesi kafa karıştırıcı sonuçlara yol açabilir, örneğin nodose ganglionunda vagal olmayan belirteçler tespit edilir. Araştırmacı, nodose ganglionun diseksiyon sırasında üst servikal gangliona bağlı olup olmadığını sistematik olarak doğrulamak isteyebilir. Aksi takdirde, gangliyonlar arasındaki tutarsız diseksiyon becerileri deneysel değişkenliği getirecektir. Hem petrosal hem de nodose afferent nöronların Phox2b47'yi ifade ettiğini de belirtmek önemlidir. Bu nedenle, nodose afferent nöronlar olarak adlandırdığımız şey hem petrosal hem de nodose nöronlarını içeriyordu. Son olarak, farklı çalışmaları karşılaştırırken, farklı ötanazi yöntemlerinin gen ifadesinde değişikliklere neden olabileceğini akılda tutmak gerekir48.

Teorik olarak, algılama için kullanılan floroforlar herhangi bir kanala birbirinin yerine atfedilebilir. Bununla birlikte, Opal 690'ın düşük düzeyde yeşil floresan yay olduğu bulunmuştur. Çoğu durumda, yüksek oranda ifade edilen transkriptlerde (örneğin Prdm12), lazer yoğunluğu çok yüksekse istenmeyen yeşil floresan görüldü. Bu nedenle Opal 690 orta/düşük ekspresyonlu genler için önerilir. Sadece yüksek oranda ifade edilen genlerle çalışıyorsanız, Opal 690'ı daha fazla seyreltmeniz (yani 1/3.000) ve görüntü alımı sırasında spesifik olmayan yeşil floresan yakalamamanız önerilir. RNAscope sinyalleri, transkriptler aynı hücre profili içinde ifade edildiğinde bile farklı renklerde ayrı noktalardır. Bununla birlikte, yüksek oranda ifade edilen transkriptler için, tek tek noktaları değil, sitoplazmayı dolduran floresanları görmek mümkün olabilir. Noktalar farklı renklerde floresan yaydığında, diğer örneklerin yanı sıra, yetersiz alım parametreleri ve / veya endojen pigmentler nedeniyle spesifik olmayan floresan sorunu düşünülebilir. Son olarak, emisyon spektrumları çakıştığı için Opal 570 ve 620 aynı anda kullanılmamalıdır.

İlgi dokusunda ifade edildiği bilinen bir gen için RNAscope sinyali gözlenmezse, mevcut pozitif bir prob (yani peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B kat tutma geni) çalıştırarak dokunun bütünlüğünü doğrulamaniz önerilir. DAPI karşı-lekeleme doku kalitesinin belirlenmesinde de faydalıdır. Parçalanmış gibi görünen DAPI etiketli çekirdekler aşırı sindirime veya yanlış sabitlenmiş dokuya işaret edebilir.

Sonuç olarak, Ghsr Prdm12 pozitif juguler afferent nöronların küçük bir alt kümesinde ifade edildi. Buna karşılık, ve önceki bir çalışma ile aynı fikirde11, Ghsr mRNA nodose afferent nöronlar neredeyse yoktu. Daha önce qPCR ve ISH tarafından tespit edilen düşük Ghsr mRNA seviyelerinin muhtemelen juguler afferent nöronlar30 , 31,32. Önceki bir kalsiyum sinyal çalışması, kültürlü vagal afferent nöronların% 3'ünün ghrelin49'a yanıt verdiğini göstermiştir Ghsr ifade eden juguler afferent nöronların yüzdesine oldukça benzer bir sayı. Cck1r birçok Phox2b-pozitif nodose afferent nöronlarında ve daha şaşırtıcı bir şekilde Prdm12-pozitif juguler afferent nöronların bir alt kümesinde ifade edildi. Özetle, bu makale, juguler-nodose gangliyonik kütledeki seçilmiş GPCR'lerin hücresel dağılımını bütünüyle değerlendirmek için mevcut ISH tekniklerinin başarılı adaptasyonunu göstermektedir.

Sonuç olarak, yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki GPCR (Cck1r ve Ghsr) ve bir transkripsiyon faktörü (Phox2b veya Prdm12) için transkriptleri tespit etmek ve aynı anda görselleştirmek için multipleks ISH kullanıldı. Burada açıklanan protokol RNA-Sıralama, qPCR ve geleneksel histoloji için tamamlayıcı bir araç olabilir. Ancak, bu protokol benzer boyuttaki diğer gangliyonlara uygulanabilir. Yukarıda tartışıldığı gibi, edinim parametreleri, hayvanların yaşı ve diseksiyon tutarlılığı deneysel tasarım sırasında göz önünde bulundurulması gereken önemli faktörlerdir. Bu nedenle, son derece heterojen ve küçük bir gangliondaki topografik gen ekspresyon kalıpları hakkında benzersiz bilgiler sunabilir. Bu protokol, juguler ve nodose afferent nöronların transkripsiyon profillerindeki değişiklikleri, beslenme durumundaki değişiklikler de dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik durumlar bağlamında belirlemek için kullanılabilir. Primatlar ve domuzlar da dahil olmak üzere preklinik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan hayvan türlerinde vagal afferent nöronların nörokimyasal makyajını karşılaştırmak için de kullanılabilir50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH grant #5P01DK119130-02 tarafından finanse edilen Nöroanatomi/Histoloji/Beyin Enjeksiyon Çekirdeği tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi tarafından desteklenen Harold C. Simmons Kanser Merkezi'nin Ortak Kaynağı olan NIH Grant #1S10OD021684-01 tarafından desteklenen UT Southwestern Canlı Hücre Görüntüleme Tesisi (Dr. Phelps başkanlığındaki) ve personelinin (Abhijit Bugde ve Marcel Mettlen) yardımını kabul etmek istiyor. P30 CA142543.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
20x SSC Invitrogen AM9763
-80°C freezer PHCBI MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021 Adobe photo and design software
Baking oven Thermo Scientific Model:658
Confocal microscope Zeiss LSM880 Airyscan
Cover glass Brain Research Laboratories 2460-1.5D
Cryostat Leica CM 3050 S
Dumont #5 Forceps F.S.T. 11252-20
Ecomount Biocare Medical EM 897L mounting medium
HybEZ oven hybridization oven
Hydrophobic pen Vector Laboratories H-4000
ImageJ-Fiji NIH
Large scissors Henry Schein 100-7561
Micro centrifuge tubes VWR 20170-333
Minipump variable flow Fisher Scientific 13-876-1
Opal 520 Akoya biosciences FP1 1487001KT Fluorescent biomarker
Opal 570 Akoya biosciences FP1 1488001KT Fluorescent biomarker
Opal 690 Akoya biosciences FP1 1497001KT Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACD /Bio-Techne 323100 multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 ACD /Bio-Techne 313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB ACD /Bio-Techne 310043
RNAscope probe Mouse Ghsr ACD /Bio-Techne 426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 ACD /Bio-Techne 407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 ACD /Bio-Techne 524371-C2
RnaseZap Sigma R2020 Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors Millipore Sigma Z265977
Superfrost Plus slides Fisherbrand 1255015
Tissue Tek OCT medium Sakura 4583
User manual ACD 323100 USM
Vannas Spring Scissors Roboz RS 5620
ZEN Imaging Software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).

Tags

Nörobilim Sayı 175 Nöroanatomi sinyalizasyon histoloji transkripsiyon transmembran reseptörleri periferik sinir sistemi diseksiyon konfokal mikroskopi floresan
Multipleks <em>In Situ</em> Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bob-Manuel, J., Gautron, L.More

Bob-Manuel, J., Gautron, L. Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (175), e62945, doi:10.3791/62945 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter