Summary
Multiplex in situ Hybridisierung (ISH) wurde verwendet, um gleichzeitig die Transkripte für zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und einen Transkriptionsfaktor im gesamten vagalen ganglionären Komplex der erwachsenen Maus zu visualisieren. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um genaue Karten der Transkriptionsprofile von vagalen afferenten Neuronen zu erstellen.
Abstract
Diese Studie beschreibt ein Protokoll für die Multiplex-in-situ-Hybridisierung (ISH) der Maus-Jugular-Nodose-Ganglien, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Nachweis der Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Formalin-fixierte Jugular-Nodose-Ganglien wurden mit der RNAscope-Technologie verarbeitet, um gleichzeitig die Expression von zwei repräsentativen GPCRs (Cholecystokinin- und Ghrelin-Rezeptoren) in Kombination mit einem Markergen entweder der Nodose (paarartige Homöobox 2b, Phox2b) oder jugularen afferenten Neuronen (PR-Domäne Zinkfingerprotein 12, Prdm12) nachzuweisen. Markierte Ganglien wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Verteilungs- und Expressionsmuster der oben genannten Transkripte zu bestimmen. Kurz gesagt, phox2b afferente Neuronen wurden gefunden, um reichlich den Cholecystokinin-Rezeptor (Cck1r) zu exprimieren, aber nicht den Ghrelin-Rezeptor (Ghsr). Es wurde auch festgestellt, dass eine kleine Untergruppe von Prdm12-afferenten Neuronen Ghsr und / oder Cck1r exprimiert. Der in diesem Artikel beschriebene Ansatz kann Wissenschaftlern helfen, genaue Karten der Transkriptionsprofile vagaler afferenter Neuronen zu erstellen.
Introduction
Die Zellkörper der vagalen Afferenzen sind in den Jugular-, Petrosal- und Nodose-Ganglien1,2,3enthalten. Ihre Axone wandern zusammen über mehrere Äste des Vagusnervs zu den kraniozervikalen, thorakalen und abdominalen Territorien4,5,6,7. Von ihren viszeralen Enden aus können vagale Afferenzen auf eine Breite von physiologischen und schädlichen Reizen reagieren8,9,10. Die Verteilung von Signalmolekülen und Rezeptoren, die an der Vaguserfassung beteiligt sind, ist jedoch nach wie vor schlecht charakterisiert. Dies liegt zum Teil daran, dass die Vagusganglien trotz ihrer geringen Größe ein breites Spektrum von Rezeptoren exprimieren, darunter eine große Anzahl von GPCRs8,11,12,13. Darüber hinaus sind vagale afferente Neuronen von Natur aus heterogen und weisen unterschiedliche molekulare Profile auf14. Um die Sache zu komplizieren, sind die Jugular-, Petrosal- und Nodose-Ganglien in der Maus befestigt und bilden dadurch eine einzige ganglionäre Masse. Schließlich ist bei einer Untergruppe von Tieren das Knotenganglion an das sympathische Ganglion cervicalis superior15gebunden.
In der Vergangenheit haben sich die Forscher der Immunhistochemie zugewandt, um die neurochemische Zusammensetzung der vagalen afferenten Neuronen zu untersuchen16,17,18. Während die Immunhistochemie mit validierten Antikörpern nützlich ist, müssen die Ergebnisse immunhistochemischer Studien mit Vorsicht interpretiert werden. Zum Beispiel sind zahlreiche Bemühungen, spezifische Antikörper gegen GPCRs zuidentifizieren,gescheitert 19,20,21,22,23,24,25, was die Forscher zu dem Schluss führte, dass die Mehrheit der Antikörper gegen GPCRs unzuverlässig ist. Um diese Probleme zu umgehen, wurde die quantitative PCR (qPCR) weit verbreitet zur Beurteilung der Genexpression in der vagalen Ganglionmasse des Nagetiers26,27,28,29. Die Untersuchung der Genexpression mittels qPCR erfolgt jedoch auf Kosten eines Verlusts räumlicher Informationen. Insbesondere kann nicht vorhergesagt werden, wie viele Zellen oder welche Zelltypen ein bestimmtes Gen von Interesse exprimieren (z. B. Schlinge vs. Jugularzellen). Zu den wiederkehrenden Problemen gehören auch die Kontamination mit benachbarten Geweben und die Einbeziehung variabler Längen des Vagusnervs, des oberen Gebärmutterhalses und der Jugularganglien während der Dissektion15. Infolge der oben genannten Schwierigkeiten gibt es Kontroversen um die Expression und Verteilung mehrerer GPCRs in vagalen afferenten Neuronen. Ein besonders rätselhaftes Beispiel betrifft den Ghrelin-Rezeptor (Ghsr). Während einige Studien eine weit verbreitete Expression dieses Rezeptors in vagalen afferenten Neuronen30,31,32gefunden haben, haben andere festgestellt, dass Ghsr mRNA im Nodose Ganglion11,14fast nicht nachweisbar ist . Eine detaillierte Kartierung der Ghsr-mRNA in der vagalen ganglionären Masse ist daher gerechtfertigt.
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) wurde auch verwendet, um Genexpressionsmuster in der vagalen ganglionären Masse7,11,12,33,34,35zubewerten. Da RNA-basierte Techniken unter den meisten Umständen zuverlässiger und spezifischer bleiben als Antikörper-basierte Techniken36,37, ISH-Studien haben sich als wertvoll für ein besseres Verständnis der neurochemischen Kodierung von vagalen afferenten Neuronen erwiesen. Nichtsdestotrotz sind traditionelle ISH-Techniken selbst nicht ohne Vorbehalte. Radioaktives ISH ist empfindlich, erzeugt aber Hintergrund und bleibt umständlich38. Nicht-radioaktive ISH ist weniger kompliziert, aber auch weniger empfindlich38. Im Gegensatz dazu ist die kürzlich entwickelte RNAscope ISH-Methode hochempfindlich und erzeugt minimalen Hintergrund39. Die aktuelle Studie wandte multiplex fluoreszierendes RNAscope zum Nachweis von GPCRs in vagalen afferenten Neuronen der Maus an. Wir konzentrierten uns auf die Kartierung der Verteilung von Ghsr und verglichen seine Verteilung mit der des Cholecystokinin-Rezeptors (Cck1r), einer anderen GPCR, von der bekannt ist, dass sie im Knotenganglion34exprimiert wird. Schließlich wurden die beiden Transkriptionsfaktoren, die paarartige Homöobox 2b (Phox2b) und das PR-Domänen-Zinkfingerprotein 12 (Prdm12), als selektive Marker für nodose und jugular afferente Neuronen verwendet14. Ohne die Visualisierung von Phox2b oder Prdm12 wäre es schwierig, Jugular vs. Nodose Afferents mit Sicherheit zu identifizieren. Mögliche technische Fallstricke werden ebenfalls im gesamten Artikel diskutiert.
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Protocol
HINWEIS: Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, waren Wildtyp-Männchen auf einem reinen C57BL / 6J-Hintergrund. Insgesamt wurden 4 Mäuse für Multiplex-ISH verwendet. Alle Mäuse waren zum Zeitpunkt des Opfers etwa 8 Wochen alt. Eine männliche Maus (etwa ein Jahr alt) wurde auch verwendet, um endogene Fluoreszenz im Zusammenhang mit dem Altern nachzuweisen. Die Tiere wurden in belüfteten Käfigen in einer Barriereeinrichtung mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Das UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee überprüfte und genehmigte die unten beschriebenen Verfahren. Details zu Reagenzien und Werkzeugen finden Sie in der Materialtabelle.
1. Probenentnahme
- Am Tag des Opfers eine Überdosis Chloralhydrat (500 mg/kg, i.p.) an die Mäuse verabreichen. Perfundieren Sie die tief betäubten Mäuse transkardiell mit einer peristaltischen Pumpe mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 50 ml 10% Formalin bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Dies geschieht in einem Abzug, um das Einatmen von Formalin zu verhindern. - Da die Knoten-, Petrosal- und Jugularganglien in der Maus15zu einer einzigen ganglionischen Masse verschmolzen sind, sammeln Sie vorsichtig die gesamte vagale ganglionäre Masse von jeder Seite (links und rechts) mit Hilfe eines Sezierfernrohrs und einer feinen Federschere und Pinzette (siehe Materialtabelle).
- Wenn Sie die Maus mit einer großen Schere enthaupten (siehe Materialtabelle),vermeiden Sie es, den Hirnstamm zu zerquetschen.
- Nach einem zuvor bei der Ratte40beschriebenen Dissektionsansatz werden die sternohyoiden und omohyoiden Muskeln lateral zur Luftröhre mit einer kleinen Pinzette (Materialtabelle) entfernt, um den Hinterhauptbein freizulegen. Reinigen Sie die gesamte Region von Muskeln, Fettgewebe und Bindegewebe, bis die Halsschlagader, der Vagusnerv, der Hypoglossusnerv und das Foramen magnum sichtbar sind. Schneiden Sie den gesamten Hypoglossusnerv mit einer kleinen Federschere ab (Materialtabelle).
- Suchen Sie nach dem Schnatterganglion als durchscheinende Masse in der Nähe des Foramen magnum15. Mit einer kleinen Schere(Tabelle der Materialien)wird der Hinterhauptbein vorsichtig gebrochen, um das Halsganglion weiter freizulegen. Suchen Sie nach schwarzen Melanozyten an der Oberfläche des Jugulars als visuelle Landmarke.
- Schneiden Sie Nervenanhänge zwischen der vagalen ganglionären Masse ab und extrahieren Sie die gesamte ganglionäre Masse, indem Sie sanft am peripheren Ende des Vagusnervs ziehen, während Sie gleichzeitig das Jugularganglion mit einer kleinen Federschere in Richtung Hirnstamm schneiden (Materialtabelle).
- Entfernen Sie das Bindegewebe und das Fett, das am Vagusnerv und der ganglionären Masse haftet, so weit wie möglich.
- Da es leicht ist, ein Ganglion während des Transfers von einem Schlauch zum anderen zu verlieren, halten Sie ~ 0,5 cm des Vagusnervs, um die Handhabung und Lokalisierung von Proben zu erleichtern.
- Ganglien mit Hilfe einer feinen Pinzette in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 4 °C 24 h in Formalin und weitere 24 h mit 30% Saccharose inkubieren.
- Positionieren Sie Ganglien in einem kleinen Tropfen (~ 4 mm Ø) des Mediums mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) auf einem Stück Aluminiumfolie. Als nächstes frieren Sie die Probe auf einem Trockeneisbett ein.
- Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostaten bei -20 °C in Abschnitte von 14 μm Dicke und sammeln Sie sie auf Glasmikroskopobjektträgern im Abstand von 3 Serien 42 μm.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, Abschnitte nahe an den Rändern der Folie zu platzieren. Um Reagenzien zu sparen, halten Sie die Gewebeabschnitte so dicht wie möglich, aber ohne Überlappung. - Lagern Sie die Proben in einem -80 °C Gefrierschrank, bis sie für ISH benötigt werden, für mindestens 6 Monate.
HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie Informationen zur Fehlerbehebung bei endogener Fluoreszenz.
2. Vorbehandlung und ISH
- Vor dem Tag der Experimente Autoklav-Laborgläser für ISH, einschließlich Färbegeschirr und Waschen von Puffergläsern.
HINWEIS: Während das Arbeiten unter RNase-freien Bedingungen nicht kritisch ist, tragen Sie immer Handschuhe. Halten Sie RNase Dekontaminationslösungsflaschen (Tabelle der Materialien) in Reichweite, falls eine Kontamination vermutet wird. - Bringen Sie die Folien am ersten Tag auf einer speziell für die ISH gewidmeten Bank auf Raumtemperatur. Spülen Sie die Objektträger in 1x PBS und backen Sie sie 30 Minuten bei 60 °C im Backofen (Table of Materials).
- Fixieren Sie die Folien in 4% Formalin für 15 min bei 4 °C.
- Bringen Sie die Reagenzien im Multiplex-Kit (Table of Materials) auf Raumtemperatur.
- Dehydrieren Sie die Objektträger in 50%, 70% und 100% Ethanol für jeweils 5 min. H2O2-Lösung für 10 min auf die Proben auftragen und dann in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O)abspülen.
- Behandeln Sie die Proben mit dem Zielentnahmereagenz für 5 min, spülen Sie sie in ddH2O gefolgt von 100% Ethanol und trocknen Sie sie an der Luft. Erzeugen Sie mit einem hydrophoben Pen eine Barriere um die Proben.
HINWEIS: Wenden Sie die hydrophobe Barriere nicht zu nahe an den Gewebeabschnitten an. - Protease 30 min bei 40 °C in einemHybridisierungsofen auftragen( Materialtabelle ).
- In der Zwischenzeit die Sonden bei 40 °C vorwärmen und vor Gebrauch bei Raumtemperatur abkühlen. Inkubieren Sie die Objektträger mit der gewünschten Kombination von Zielsonden (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; oder Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) für 2 h bei 40 °C in einem Hybridisierungsofen.
- Negativkontrollgewebe mit der Dihydrodipicolinatreduktase (DapB) Ziel-C1-Sonde für 2 h bei 40 °C in einem Hybridisierungsofen inkubieren.
- Spülen Sie die Objektträger in Waschpuffer und lagern Sie sie über Nacht in 5x salzhaltigem Natriumcitrat (SSC) bei Raumtemperatur. Teilen Sie das Experiment der Einfachheit halber in zwei Tage auf. Spülen Sie am nächsten Tag die Objektträger mit Waschpuffer ab und inkubieren Sie sie mit den unten aufgeführten Amplifikationsreagenzien (siehe Benutzerhandbuch in der Materialtabelle).
- Amp1 (30 min bei 40 °C), AMP2 (30 min bei 40 °C) und AMP 3 (15 min bei 40 °C) auftragen. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
- Lösen Sie jeden Opalfarbstoff (Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid auf und lagern Sie die Lösungen bei 4 °C, bis sie benötigt werden.
- Für Kanal 1 die Objektträger mit HRP-C1 (15 min bei 40 °C) und Opal 520 (grüne Farbe; Verdünnung 1/1.500; 30 min bei 40°C) inkubieren. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
- Für Kanal 2 werden die Objektträger mit HRP-C2 (15 min bei 40 °C) und Opal 570 (gelbe Farbe; Verdünnung 1/1.500; für 30 min bei 40 °C) inkubiert. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
- Für Kanal 3 werden die Objektträger mit HRP-C3 (15 min bei 40 °C) und Opal 690 (fernrote Farbe; Verdünnung 1/1.500; für 30 min bei 40 °C) inkubiert. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
- Die Objektträger waschen und 30 s lang 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) aussetzen.
- Tragen Sie sofort das Befestigungsmedium auf jeden Objektträger auf und legen Sie einen Deckglas über den Gewebeabschnitt.
- Halten Sie das Gewebe horizontal in einem Objektträgerhalter bei 4 °C bis zur Bildgebung.
3. Mikroskopie und Datenanalyse
HINWEIS: Multiplex-ISH-Daten können mit einer Vielzahl von Instrumenten mit den entsprechenden Filtern abgebildet werden. Ein bevorzugtes bildgebendes Verfahren ist jedoch die konfokale Mikroskopie mit 20-fachen und 63-fachen (Öl-)Objektiven; beziehen Sie sich auf die Diskussion für die Gründe. Die Bestimmung des optimalen Signal-Rausch-Verhältnisses ist Abbildung 2 zu entnehmen.
- Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, das mit 488,561 und 633 nm Laserlinien ausgestattet ist. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter (siehe Tabelle 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, Erfassungsbereich 668-696 nm, Leistung 2.0, Verstärkung 724); Opal 570 (DPSS-Laser 561 nm, Erfassungsbereich 579-627 nm,
- Um die Qualität der Bilder zu verbessern, erfassen Sie mit einer Linienmittelung von 4 und einer Pixelgröße von mindestens 1024 x 1024.
HINWEIS: Die oben genannten Parameter werden nur als Beispiel angegeben, und Modifikationen werden in Abhängigkeit von einem Instrument, Vergrößerung (20x oder 63x), Expressionsniveaus und endogenen Fluoreszenzwerten für ein bestimmtes Gewebe empfohlen.- Sobald Sie mit den Aufnahmeparametern zufrieden sind, sammeln Sie Bilder mit den gleichen Einstellungen. Weisen Sie jedem Kanal falsche Farben zu, um die Visualisierung zu erleichtern.
HINWEIS: Zum Beispiel Rot (Phox2b oder Prdm12), Cyan (Cck1r), Gelb (Ghsr) und Grau (DAPI).- Führen Sie die Zellzählung anhand der digitalen Bilder durch, indem Sie die Umrisse von RNAscope-positiven Profilen mit einem Kern identifizieren, der leicht mit DAPI gefärbt ist. Berechnen Sie den Prozentsatz der RNAscope-positiven Profile, die jedes Transkript ausdrücken [Abbildung 3A-C].
- Um die Genauigkeit und Genauigkeit der Schätzungen zu verbessern, zählen Sie mindestens 2.000 neuronale Profile von mindestens 4 verschiedenen Tieren. Führen Sie die Zählung von linken und rechten Ganglien getrennt durch.
- Geben Sie die Daten in ein Kreisdiagramm mit der Gesamtzahl der gezählten Profile ein.
- Verwenden Sie Imaging-Software, um Bilder zu erfassen und 20-fache Bilder zusammenzusetzen. Verwenden Sie ImageJ-Fiji und eine andere Foto- und Designsoftware, um die endgültigen Platten zu generieren. Wenden Sie Anpassungen an Kontrast und Helligkeit gleichmäßig auf alle Bilder an.
- Um die Qualität der Bilder zu verbessern, erfassen Sie mit einer Linienmittelung von 4 und einer Pixelgröße von mindestens 1024 x 1024.
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Representative Results
Während RNAScope bei Tieren jeden Alters, Geschlechts oder genetischen Hintergrunds angewendet werden kann, ist es ratsam, mit jungen Erwachsenen (<3 Monate alt) zu arbeiten. Dies liegt daran, dass fluoreszierende Artefakte (z. B. Lipofuscin) häufige Befunde in Neuronen älterer Tiere sind41. Die formalinfixierten Ganglien älterer Mäuse enthalten oft eine überraschend intensive endogene Fluoreszenz, die leicht mit einer echten Färbung verwechselt werden kann (Abbildung 1A, B). In jedem Fall ist es ratsam, die Endogenfluoreszenz im Gewebe vor der Verarbeitung zu überprüfen.
Es ist wichtig, die optimalen Erfassungsparameter und das Signal-Rausch-Verhältnis für jeden Laser und jede Vergrößerung anhand von Abschnitten aus einem negativ kontrollierten Gewebe zu bestimmen, das mit der DapB-Negativsonde inkubiert wurde, wie in Abbildung 2A,Bgezeigt. Da DapB ein prokaryotisches Gen ist, sollten RNAscope-Signale im Negativkontrollgewebe vollständig fehlen. Abgesehen von gelegentlichen Ablagerungen und Kristallen ist in Bildern von Negativkontrollgeweben eine vernachlässigbare Fluoreszenz zu sehen, sofern die Aufnahmeparameter angemessen sind. Oberhalb einer bestimmten Laserleistung und -verstärkung treten jedoch unerwünschte Hintergrund- und zufällige fluoreszierende Punkte auf (Abbildung 2C). Ein weiterer Zweck der Minimierung der Laserleistung besteht darin, Pixelsättigung und Photobleichen zu vermeiden. Bei der Arbeit mit den oben genannten Parametern wurden keine größeren Probleme der Fluoreszenzbleiche beobachtet. Sollte ein solches Problem auftreten, ist es ratsam, das Gewebe mit einem Montagemedium für fluoreszenzmarkierte Zellen (Materialtabelle) abzudecken und die Laserleistung so weit wie möglich zu senken (siehe die empfohlenen Parameter in Tabelle 1).
Die RNAscope-Technik wurde für den Nachweis von 3 Genen in Gewebeschnitten der vagalen ganglionären Masse der Maus angewendet (Abbildung 3 und Abbildung 4). Ein Profil wurde als positiv für Ghsr und/oder Cck1r angesehen, wenn gelbe bzw. cyanfarbene Punkte ein mit roten Punkten gefülltes Profil überlagerten (Abbildung 3A-C). Das Beispiel in Abbildung 3 zeigt viele Profile, die sowohl Phox2b- als auch Cck1r-Transkripte enthalten (Abbildung 3D). Phox2b wurde verwendet, um nodose afferente Neuronen zu identifizieren. Reichliche Phox2b-Signale, die sich in den Neuronen des Nodose Ganglion angesammelt haben (Abbildung 4A,B). Cck1r-Signale wurden in etwa 52% der Phox2b-Zellen nachgewiesen (Abbildung 4C). Bemerkenswert ist, dass die Expressionsniveaus für Cck1r zwischen den Zellen stark variierten und von moderat (~ 20 Punkte pro Profil) bis hin zu intensiver Markierung (zytoplasmafüllt) reichten. Im Gegensatz dazu waren die Signale für Ghsr im Nodose Ganglion extrem spärlich (Abbildung 4A, B). Nur schätzungsweise 0,65% der Phox2b-positiven Zellen waren auch positiv für Ghsr-Transkripte (Abbildung 4C). Ghsr-exprimierende Zellen co-exprimieren Cck1r. Eine visuelle Untersuchung der Gewebe ergab keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den linken und rechten Ganglien. ISH-Signale fehlten praktisch in Bereichen ohne Neuronen (z. B. Epineurium und Fasertrakt).
Prdm12 wurde verwendet, um juguläre afferente Neuronen zu identifizieren. Wie erwartet, war die Prdm12-Expression in den Neuronen des Jugularganglions und einigen Neuronen, die den rostralen Teil des Nodose Ganglion infiltrierten, stark angereichert (Abbildung 5A-C). Interessanterweise wurden Cck1r-Signale in einer Untergruppe von Prdm12-Zellen nachgewiesen(Abbildung 5B,C). Etwas weniger als 9% der Prdm12-positiven Neuronen exprimierten auch Cck1r (Abbildung 5D). Das Jugularganglion enthält jedoch nur Zellen mit moderaten Cck1r-Spiegeln (<20 Punkte pro Zelle) und nicht die stark markierten Cck1r-positiven Zellen, die üblicherweise im Nodose-Ganglion vorkommen. Ghsr-positive Zellen waren im Jugular signifikant häufiger als in der Schlinge (Abbildung 5C). Etwa 3% der Prdm12-Zellen waren auch Ghsr-positiv (Abbildung 5D). Interessanterweise koexprimierte 1% aller Prdm12 sowohl Ghsr als auch Cck1r. Die Expressionsniveaus für Ghsr waren immer moderat (<20 Punkte pro Zelle). In Gebieten ohne Neuronen konnten keine ISH-Signale gesehen werden.
Abbildung 1:Fehlerbehebung bei der endogenen Fluoreszenz. (A, B) Endogene Fluoreszenz in der Knoten-/Jugularganglion einer alternden Maus (~1 Jahr alt). Digitale Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie unter Verwendung der Laserlinien aufgenommen, die in Farben und Erfassungsparametern angezeigt wurden, die mit denen identisch sind, die für Multiplex-ISH mit jüngeren Mäusen verwendet wurden (siehe später). Wichtig ist, dass das fixierte Gewebe in keiner anderen Weise verarbeitet wurde, als bei -80 °C gelagert und DAPI ausgesetzt zu werden. Wie in Agezeigt, wird ein signifikantes Maß an unerwünschter Fluoreszenz in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen beobachtet, insbesondere wenn sie dem 488-nm-Laser (grün) ausgesetzt sind. Dies ist ein häufiger Befund in der Histologie, der es rechtfertigt, die endogene Fluoreszenz vor der histologischen Analyse zu beurteilen. (B) Bei höherer Vergrößerung ähnelte die Fluoreszenz Lipofuszinpigmenten, die sich oft in alternden Zellen ansammeln und leicht mit echter Immunreaktivität und/oder RNAScope-Signalen verwechselt werden könnten. Maßstabsbalken = 158 μm (A) und 15 μm (B). (B). Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; NG = Knotenganglion; ISH = in situ Hybridisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestimmung des optimalen Signal-Rausch-Verhältnisses. (A, B) Negativkontrolle bestehend aus RNAScope-Detektion für das prokaryotische Gen DapB. Beachten Sie, dass die endogene Fluoreszenz im Knotenganglion einer jungen erwachsenen Maus minimal ist und dass die Inkubation mit der DapB-Sonde nicht zu Signalen führte. Die Erfassungsparameter waren identisch mit denen für Multiplex-ISH. Dies zeigt, dass das RNAScope-Verfahren selbst keinen signifikanten Hintergrund liefert, wenn die Erfassungsparameter sorgfältig ausgewählt werden. (C) Digitale Bilder desselben Gewebes, die mit zunehmender Leistung Laser und Verstärkung mit dem 488-nm-Laser aufgenommen wurden. Beachten Sie, wie ein unscharfer grüner Hintergrund und gelegentliche Punkte über einer bestimmten Laserleistung und -verstärkung entstehen. Daher ist es wichtig, die Erfassungsparameter für jeden Laser sorgfältig auszuwählen, basierend auf der Menge an unspezifischer Fluoreszenz, die im Negativkontrollgewebe erhalten wird. Maßstabsbalken = 158 μm (A) und 15 μm (B, C). Abkürzungen: DapB = Dihydrodipicolinatreduktase; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; NG = Knotenganglion; ISH = in situ Hybridisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Identifizierung und Zählung positiver Profile. (A) Repräsentatives digitales Bild von Phox2b-markierten Profilen (rot) im rostralen Teil des Knotenganglions. In diesem Beispiel wurden insgesamt 18 Zellprofile (gekennzeichnet als 1 bis 18) identifiziert. Beachten Sie, dass die DAPI-Färbung weiter bei der Lokalisierung von Neuronen hilft, die typischerweise einen großen und runden Kern mit leichter DAPI-Färbung aufweisen. Im Gegensatz dazu sind die Kerne nicht-neuronaler Zellen hell markiert, länglich und kleiner. Insgesamt entsprachen die RNAScope-Signale der Verteilung und Form neuronaler und nicht-neuronaler Zellen. (B) Es werden zwei markierte Ghsr-positive Neuronen (gelb) gezeigt (Profile 19 und 20). Ghsr-Signale waren spärlich und schwer zu erkennen. Daher wurden die Helligkeit und Sättigung der gelben Signale in der Fotosoftware selektiv und gleichmäßig verbessert. (C) Insgesamt werden neun Cck1r-markierte Profile (cyan) identifiziert (gekennzeichnet als 2, 5, 8, 11, 14, 17, 18 und 19). Beachten Sie, wie die Intensität der Cck1r-Signale zwischen den Zellen stark variierte. Beispielsweise enthält Profil 11 nur wenige positive Signale, während Profil 7 fast mit Cck1r-Signalen gefüllt ist. (D) Eine zusammengeführte Ansicht aller Kanäle ermöglichte die Identifizierung von Kolokalisierungsmustern. Viele Phox2b-positive Profile exprimieren auch Cck1r (z. B. die Profile 2, 8 und 14), was durch rote und cyanfarbene RNAScope-Punkte innerhalb desselben Zellprofils belegt wird. Im Gegensatz dazu exprimierten Phox2b-positive Profile keine Ghsr-Transkripte (Profile 19 und 20). Eine Ghsr-positive Zelle exprimierte jedoch auch niedrige Cck1r-Spiegel (Profil 19). Die beiden großen DAPI-gefärbten Kerne, die mit einem weißen Sternchen gekennzeichnet sind, entsprechen vermutlich der Lage von Phox2b-negativen afferenten Neuronen ohne RNAScope-Signale. In den unten beschriebenen repräsentativen Ergebnissen wurden mindestens 2.000 neuronale Profile aus linken und rechten ganglionären Massen von 4 verschiedenen Tieren gezählt. Maßstabsbalken = 24 μm. Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; Phox2b = paarartige Homöobox 2b; Ghsr = Ghrelin-Rezeptor; Cck1r = Cholecystokinin-Rezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Multiplex-ISH in nodose afferenten Neuronen. Digitale Bilder einer repräsentativen vagalen ganglionären Masse, die mit einem Multiplex-RNAscope für Phox2b, Cck1r und Ghsr markiert wurde. Die Bilder wurden mit den 20x (A) und 63x (B, C) Objektiven eines konfokalen Mikroskops (Zeiss LSM880) aufgenommen. In A,20× wurden mehrere Bilder mit der Zen-Software zusammengefügt und entweder als ungemischte Kanäle dargestellt oder zusammengeführt. Phox2b-Signale (rot), die sich spezifisch in afferenten Neuronen im Knotenganglion angesammelt haben. Wie erwartet, markierten Cck1r-Signale (Cyan) intensiv viele, aber nicht alle Neuronen im Knotenganglion. Bei geringer Vergrößerung konnten Zellen, die niedrige Cck1r-Spiegel exprimierten, oder Zellen mit Ghsr-Signalen (gelb) nicht leicht beobachtet werden. DAPI (grau) half, das Gewebe zu visualisieren und vagale afferente Neuronen mit einem großen und leicht gefärbten Kern zu identifizieren. Der weiße Einschub im zusammengeführten Bild entspricht den Positionen des unten enthaltenen Bildes. (B) Bei hoher Vergrößerung sind Phox2b-positive Profile (rot) erkennbar. Viele Zellen exprimierten auch Cck1r, aber in unterschiedlichen Konzentrationen, die von moderat bis sehr hoch reichten. Das Profil "1" ist ein Beispiel für ein Phox2b-Zellnegativ für Cck1r und Ghsr. Die Profile "2" und "3" sind Phox2b-Zellen mit hohen bzw. moderaten Cck1r-Signalen. Moderate Signale für Ghsr (gelb) wurden gelegentlich im Rostralknotenganglion gesehen, aber fast immer in Zellen, die für Phox2b negativ waren, wie das Profil "4" zeigt. Interessanterweise drückte das Profil "4" sowohl Ghsr als auch Cck1r aus. Wie in der nächsten Abbildung gezeigt, war Ghsr in Prdm12-Zellen häufiger. (C) Kreisdiagramm, das die Schätzungen des Prozentsatzes der Phox2b-Zellen (rot) zusammenfasst, die entweder Ghsr (gelb), Cck1r (cyan) oder beide (grau) koexprimieren. Die Gesamtzahl der gezählten Profile wird neben dem Diagramm angezeigt (n=4 verschiedene Ganglien, links und rechts kombiniert). Die Ergebnisse beider Seiten wurden gepoolt, da keine Unterschiede festgestellt wurden. Maßstabsbalken = 158 μm (A) und 15 μm (B). Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; NG = Knotenganglion; JG = Jugularganglion; ISH = in situ Hybridisierung; Phox2b = paarartige Homöobox 2b; Ghsr = Ghrelin-Rezeptor; Cck1r = Cholecystokinin-Rezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse jugulärer afferenter Neuronen multiplex ISH. Digitale Bilder einer repräsentativen vagalen ganglionären Masse, die mit multiplex RNAscope Prdm12, Cck1r und Ghsr markiert ist. Die Bilder wurden mit den 20x (A) und 63x (B, C) Objektiven eines konfokalen Mikroskops (Zeiss LSM880) aufgenommen. In A,20× wurden mehrere Bilder mit der Zen-Software zusammengefügt und entweder als ungemischte Kanäle dargestellt oder zusammengeführt. Prdm12-Transkript (rot) akkumulierte sich spezifisch in afferenten Neuronen im Jugularganglion und nur wenigen Neuronen, die den rostralen Teil des Knotenganglions infiltrieren. Cck1r-Signale (Cyan) wurden intensiv als Nodose-Ganglion bezeichnet. Bei geringer Vergrößerung konnten Zellen, die niedrige Cck1r-Spiegel exprimierten, oder Zellen mit Ghsr-Signalen (gelb) nicht leicht gesehen werden. DAPI (grau) half, das Gewebe zu visualisieren und vagale afferente Neuronen mit einem großen und leicht gefärbten Kern zu identifizieren. Die beiden weißen Einschübe im zusammengeführten Bild entsprechen den Positionen der unten enthaltenen Bilder. (B, C) Bei hoher Vergrößerung können Prdm12-positive Zellprofile (rot) abgegrenzt werden. Moderate Signale für Cck1r wurden auch in den Profilen "1" und "2" erkannt. Profil "3" ist repräsentativ für Prdm12-Zellen, die negativ für Cck1r oder Ghsr sind. In Csind Ghsr-Signale (gelb) im repräsentativen Profil "4" zu sehen, aber nicht in "5". (D) Kreisdiagramm, das die Schätzungen des Prozentsatzes der Prdm12-Zellen (rot) zusammenfasst, die entweder Ghsr (gelb), Cck1r (Cyan) oder beide (grau) koexprimieren. Die Gesamtzahl der gezählten Profile wird neben dem Diagramm angezeigt (n=4 verschiedene Ganglien, links und rechts kombiniert). Die Ergebnisse beider Seiten wurden gepoolt, da keine Unterschiede festgestellt wurden. Maßstabsbalken = 158 μm (A) und 15 μm (B, C). Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; NG = Knotenganglion; JG = Jugularganglion; ISH = in situ Hybridisierung; Prdm12 = PR-Domäne Zinkfingerprotein 12; Phox2b = paarartige Homöobox 2b; Ghsr = Ghrelin-Rezeptor; Cck1r = Cholecystokinin-Rezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Opal | Laserlinie | Erfassungsbereich | Macht | gewinnen | Zeilendurchschnitt | Pixelgröße |
| Opal 690 | HeNe 633 nm | 668-696 nm | 2 | 724 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opal 570 | DPSS Laser 561 nm | 579-627 nm | 15 | 450 | 4 | 1024 x 1024 |
| Opal 520 | Argonlaser 488 nm | 499-535 nm | 6 | 830 | 4 | 1024 x 1024 |
| DAPI | Diodenlaser 405 | 415-502 nm | 12 | 532 | 4 | 1024 x 1024 |
Tabelle 1: Erfassungsparameter. Abkürzung: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol.
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Discussion
Die Technik der ISH wurde in den späten 1960er Jahren erfunden42. Erst Mitte der 1980er Jahre wurde es jedoch zum Nachweis von mRNAs im zentralen und peripheren Nervensystem eingesetzt43,44. In Anbetracht der Heterogenität des Nervensystems und wiederkehrender Probleme mit Antikörpern bleibt die Lokalisierung eines bestimmten Transkripts auf zellulärer Ebene ein unschätzbares Werkzeug. Dennoch sind die traditionellen ISH-Methoden mühsam und variabel sensibel geblieben. Glücklicherweise verwendete diese Studie ein hochempfindliches ISH-Verfahren namens RNAscope, das normalerweise keinen Hintergrund erzeugt und die Erkennung mehrerer Transkripte ermöglicht, die auf niedrigen Ebenen ausgedrückt werden45,46. Insbesondere wurde das Multiplex-Fluoreszenz-RNAScope für den gleichzeitigen Nachweis der Ghsr- und Cck1r-Transkripte eingesetzt. Die Transkriptionsfaktoren Phox2b und Prdm12 wurden weiterhin als selektive Marker verwendet, um Knoten- bzw. juguläre afferente Neuronen zu unterscheiden. Ohne die Visualisierung von Phox2b und Prdm12 wäre es schwierig, juguläre vs. nodose-afferente Neuronen mit Sicherheit zu identifizieren. Wie oben erläutert, beinhaltet ein kritischer Schritt eine konsistente und korrekte Dissektionstechnik. Darüber hinaus ist auch die Verifizierung der endogenen Fluoreszenz ein wichtiger Faktor, da sie leicht mit RNAScope-Signalen verwechselt werden könnte. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, geeignete Erfassungsparameter auf der Grundlage von Negativkontrollgewebe zu wählen. Wie bereits erwähnt, ist die konfokale Mikroskopie die bevorzugte bildgebungsweise Methode mit 20-fachen und 63-fachen (Öl-)Objektiven, da 1) Transkripte, die in niedrigen Konzentrationen und/oder in spärlichen Zellen exprimiert werden, nur bei hoher Vergrößerung wahrnehmbar sein können. 2) Die konfokale Mikroskopie ermöglicht die Erfassung einer einzigen Fokusebene, was wichtig ist, wenn man bedenkt, dass zwei Zellen übereinander fälschlicherweise als eine Zelle erscheinen können, wenn sie durch Epifluoreszenz abgebildet werden. 3) Die konfokale Mikroskopie ermöglicht auch selektivere und flexiblere Erfassungsparameter. Die oben genannten Erfassungsparameter werden nur als Beispiel angegeben, und Modifikationen werden in Abhängigkeit von einem Instrument, Vergrößerung (20x oder 63x), Expressionsniveaus und endogenen Fluoreszenzwerten für ein bestimmtes Gewebe empfohlen. Das Färbeverfahren selbst blieb mit nur geringen Anpassungen sehr nahe an dem des empfohlenen Protokolls. Offensichtlich kann das hier beschriebene Protokoll auf die Erkennung von Transkripten angewendet werden, nicht nur auf GPCRs. Das hier beschriebene Verfahren ist jedoch besonders nützlich angesichts der wiederkehrenden Probleme mit Antikörpern, die gegen GPCRs24erhoben werden.
Wie bereits erwähnt15, ist das Mausknotenganglion manchmal durch eine Zellbrücke am oberen zervikalen Ganglion befestigt. Die Einbeziehung dieser Zellbrücke kann zu verwirrenden Ergebnissen führen, z. B. wenn nicht-vagale Marker im Knotenganglion nachgewiesen werden. Der Prüfer möchte möglicherweise systematisch überprüfen, ob das Knotenganglion während der Dissektion am oberen Zervixganglion befestigt ist. Andernfalls führen inkonsistente Dissektionsfähigkeiten zwischen Ganglien zu experimenteller Variabilität. Es ist auch wichtig zu beachten, dass sowohl petrosale als auch nodose-afferente Neuronen Phox2b47exprimieren. Was wir also als nodose afferente Neuronen bezeichneten, umfasste sowohl petrosale als auch Nodose-Neuronen. Schließlich sollte man beim Vergleich verschiedener Studien bedenken, dass verschiedene Methoden der Euthanasie Veränderungen in der Genexpression verursachen können48.
Theoretisch können die für den Nachweis verwendeten Fluorophore austauschbar jedem Kanal zugeordnet werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass Opal 690 eine geringe grüne Fluoreszenz emittiert. In den meisten Fällen wurde bei hochexprimierten Transkripten (z. B. Prdm12) unerwünschte grüne Fluoreszenz beobachtet, wenn die Laserintensität zu hoch war. Opal 690 wird daher für Gene mit moderater/niedriger Expression empfohlen. Wenn sie nur mit hochexprimierten Genen arbeiten, wird empfohlen, Opal 690 weiter zu verdünnen (d.h. 1/3.000) und keine unspezifische grüne Fluoreszenz während der Bildaufnahme einzufangen. RNAscope-Signale sind separate Punkte unterschiedlicher Farben, selbst wenn Transkripte innerhalb desselben Zellprofils ausgedrückt werden. Bei hochexprimierten Transkripten ist es jedoch möglicherweise nicht möglich, einzelne Punkte zu sehen, sondern fluoreszenz, die das Zytoplasma füllt. Wenn Punkte Fluoreszenz in verschiedenen Farben emittieren, könnte man ein Problem der unspezifischen Fluoreszenz in Betracht ziehen, das unter anderem auf unzureichende Erfassungsparameter und / oder endogene Pigmente zurückzuführen ist. Schließlich dürfen Opal 570 und 620 nicht gleichzeitig verwendet werden, da sich ihre Emissionsspektren überlappen.
Wenn für ein Gen, von dem bekannt ist, dass es im interessierenden Gewebe exprimiert wird, keine RNAscope-Signale beobachtet werden, wird empfohlen, die Integrität des Gewebes zu überprüfen, indem eine positive Sonde zur Verfügung steht (d. H. Peptidyl-Prolyl-cis-Trans-Isomerase-B-Housekeeping-Gen). DAPI Counterstaining ist auch hilfreich bei der Bestimmung der Gewebequalität. DAPI-markierte Kerne, die zerkleinert erscheinen, können auf eine übermäßige Verdauung oder falsch fixiertes Gewebe hinweisen.
Infolgedessen wurde Ghsr in einer kleinen Untergruppe von Prdm12-positiven jugulären afferenten Neuronen exprimiert. Im Gegensatz dazu und in Übereinstimmung mit einer früheren Studie11war Ghsr-mRNA in nodose afferenten Neuronen praktisch nicht vorhanden. Es wird abgeleitet, dass niedrige Ghsr-mRNA-Spiegel, die zuvor durch qPCR und ISH nachgewiesen wurden, wahrscheinlich auf juguläre afferente Neuronen zurückzuführen waren30,31,32. Eine frühere Kalzium-Signalstudie zeigte, dass 3% der kultivierten vagalen afferenten Neuronen auf Ghrelin49reagieren, eine Zahl, die dem Prozentsatz der Ghsr-exprimierenden jugulären afferenten Neuronen bemerkenswert ähnlich ist. Cck1r wurde in vielen Phox2b-positiven Nodose-afferenten Neuronen und, noch überraschender, in einer Untergruppe von Prdm12-positiven jugularen afferenten Neuronen exprimiert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die erfolgreiche Anpassung bestehender ISH-Techniken zur Beurteilung der zellulären Verteilung ausgewählter GPCRs in der jugular-nodose Ganglion-Masse in ihrer Gesamtheit.
Zusammenfassend wurde Multiplex-ISH verwendet, um die Transkripte für zwei GPCRs (Cck1r und Ghsr) und einen Transkriptionsfaktor (Phox2b oder Prdm12) im gesamten vagalen ganglionären Komplex der erwachsenen Maus zu erkennen und gleichzeitig zu visualisieren. Das hier beschriebene Protokoll kann ein ergänzendes Werkzeug zu RNA-Sequenzierung, qPCR und traditioneller Histologie sein. Dieses Protokoll kann jedoch auf andere Ganglien ähnlicher Größe angewendet werden. Wie bereits erwähnt, sind Akquisitionsparameter, Alter der Tiere und Konsistenz der Dissektion wichtige Faktoren, die beim Versuchsdesign zu berücksichtigen sind. Daher kann es einzigartige Informationen über die topographischen Genexpressionsmuster in einem sehr heterogenen und kleinen Ganglion liefern. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um Veränderungen in den Transkriptionsprofilen von jugulären vs. nodose-afferenten Neuronen im Zusammenhang mit verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu bestimmen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Veränderungen des Fütterungsstatus. Es kann auch verwendet werden, um die neurochemische Zusammensetzung von vagalen afferenten Neuronen in Tierarten zu vergleichen, die üblicherweise in der präklinischen Forschung verwendet werden, einschließlich Primaten undSchweinen 50,51.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core unterstützt, der durch den NIH-Zuschuss #5P01DK119130-02 finanziert wurde. Die Autoren möchten die Unterstützung der UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (unter der Leitung von Dr. Phelps) und ihrer Mitarbeiter (Abhijit Bugde und Marcel Mettlen) würdigen, die zum Teil durch den NIH Grant #1S10OD021684-01, eine gemeinsame Ressource des Harold C. Simmons Cancer Center, unterstützt zum Teil durch einen NCI Cancer Center Support Grant, unterstützt wird. P30 CA142543.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
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