Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de transplantatie van aortaklepblaadjes onder de niercapsule om de studie van alloreactiviteit van hartkleppen mogelijk te maken.
Abstract
Er is een dringende klinische behoefte aan hartklepvervangingen die bij kinderen kunnen groeien. Hartkleptransplantatie wordt voorgesteld als een nieuw type transplantatie met het potentieel om duurzame hartkleppen te leveren die in staat zijn tot somatische groei zonder dat antistolling nodig is. De immunobiologie van hartkleptransplantaties blijft echter onontgonnen, wat de noodzaak benadrukt voor diermodellen om dit nieuwe type transplantatie te bestuderen. Eerdere rattenmodellen voor heterotopische aortakleptransplantatie in de abdominale aorta zijn beschreven, hoewel ze technisch uitdagend en duur zijn. Om deze uitdaging aan te gaan, werd een niersubcapsulair transplantatiemodel ontwikkeld bij knaagdieren als een praktische en meer eenvoudige methode voor het bestuderen van de immunobiologie van hartkleptransplantatie. In dit model wordt een enkele aortaklepfolder geoogst en in de renale subcapsulaire ruimte ingebracht. De nier is gemakkelijk toegankelijk en het getransplanteerde weefsel is veilig opgenomen in een subcapsulaire ruimte die goed gevasculariseerd is en geschikt is voor verschillende weefselgroottes. Bovendien, omdat een enkele rat drie donoraortablaadjes kan leveren en een enkele nier meerdere plaatsen voor getransplanteerd weefsel kan bieden, zijn er minder ratten nodig voor een bepaald onderzoek. Hier wordt de transplantatietechniek beschreven, die een belangrijke stap voorwaarts biedt in het bestuderen van de transplantatieimmunologie van hartkleptransplantatie.
Introduction
Aangeboren hartafwijkingen zijn de meest voorkomende aangeboren handicap bij mensen en treffen elk jaar 7 op de 1.000 levend geboren kinderen1. In tegenstelling tot volwassen patiënten waarbij verschillende mechanische en bioprothesekleppen routinematig worden geïmplanteerd, hebben pediatrische patiënten momenteel geen goede opties voor klepvervanging. Deze conventionele implantaten hebben niet het potentieel om te groeien bij ontvangende kinderen. Als gevolg hiervan zijn morbide heroperaties nodig om de hartklepimplantaten te vervangen voor achtereenvolgens grotere versies naarmate de kinderen groeien, waarbij getroffen kinderen vaak tot vijf of meer openhartoperaties in hun leven nodig hebben 2,3. Studies hebben aangetoond dat de vrijheid van interventie of overlijden significant slecht is voor zuigelingen dan oudere kinderen, waarbij 60% van de baby's met prothetische hartkleppen binnen 3 jaar na hun eerste operatie opnieuw wordt geopereerd of sterft4. Daarom is er een dringende behoefte aan het leveren van een hartklep die kan groeien en de functie bij pediatrische patiënten kan behouden.
Decennialang zijn pogingen om groeiende hartklepvervangingen te leveren gericht op tissue engineering en stamcellen. Pogingen om deze kleppen naar de kliniek te vertalen zijn tot nu toe echter mislukt 5,6,7,8. Om dit aan te pakken, wordt een hartkleptransplantatie voorgesteld als een meer creatieve operatie voor het leveren van groeiende hartklepvervangingen met het vermogen om zichzelf te herstellen en trombogenese te voorkomen. In plaats van het hele hart te transplanteren, wordt alleen de hartklep getransplanteerd en zal dan met het ontvangende kind meegroeien, vergelijkbaar met conventionele harttransplantaties of een Ross pulmonale handtekening 9,10,11. Postoperatief zullen ontvangende kinderen immunosuppressie krijgen totdat de getransplanteerde klep kan worden vervangen door een mechanische prothese van volwassen formaat wanneer de groei van de klep niet langer nodig is. De transplantatiebiologie van hartkleptransplantatietransplantaten blijft echter onontgonnen. Daarom zijn diermodellen nodig om dit nieuwe type transplantatie te bestuderen.
Verschillende rattenmodellen zijn eerder beschreven voor heterotopische transplantatie van de aortaklep in de abdominale aorta 12,13,14,15,16,17,18. Deze modellen zijn echter onbetaalbaar lastig en vereisen vaak getrainde chirurgen om succesvol te opereren. Bovendien zijn ze duur en tijdrovend19. Een nieuw rattenmodel werd ontwikkeld om een eenvoudiger diermodel te creëren voor het bestuderen van de immunobiologie van hartkleptransplantaties. Enkele aortaklepblaadjes worden weggesneden en in de renale subcapsulaire ruimte ingebracht. De nier is bijzonder geschikt om transplantaatafstoting te bestuderen, omdat deze sterk gevasculariseerd is met toegang tot circulerende immuuncellen20,21. Terwijl verschillende anderen een niersubcapsulair model hebben gebruikt om de transplantatiebiologie van andere allografttransplantaties zoals pancreas, lever, nieren en hoornvlies 22,23,24,25,26,27 te bestuderen, is dit de eerste beschrijving van transplantatie van hartweefsel in deze positie. Hier wordt de transplantatietechniek beschreven, die een belangrijke stap voorwaarts biedt in het bestuderen van de transplantatieimmunologie van hartkleptransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door het Committee of Animal Research volgens de National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
1. Informatie over het diermodel (ratten)
- Gebruik een operatiemicroscoop (zie Materiaaltabel) met een vergroting tot 20x voor alle chirurgische ingrepen.
- Gebruik syngene (zoals Lewis-Lewis) of allogene (zoals Lewis-Brown Norway) stammen voor de transplantaties als dat nodig is voor het experiment.
- Gebruik ratten van leeftijd tussen 5-7 weken en lichaamsgewicht van 100-200 g die geschikt zijn voor de experimentele vraag.
2. Verwijdering van bont, voorbereiding van de huid en anesthesie
- Voer alle bewerkingen uit onder steriele omstandigheden.
OPMERKING: De stap wordt uitgevoerd in een speciale chirurgische ruimte en onder steriele omstandigheden. - Plaats de ratten in een inductiekamer voor verdoving en induceer anesthesie met 5% isofluraan in zuurstof. Onderhoud anesthesie met 3,5% isofluraan in zuurstof gedurende de hele procedure.
- Verwijder voor de donoroperatie de vacht van de rat van de navelstreng naar de sternale inkeping met behulp van bontknippers. Voor de ontvangende operatie, knip het haar over het chirurgische veld aan de achterste oksellijn van de ribben naar het bekken. Bereid vervolgens de huid voor met een chirurgisch ontsmettingsmiddel.
- Verkrijg een chirurgisch niveau van anesthesie voordat u de procedure start. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door de tenen van de rat stevig samen te drukken met een tang. Als de rat zich terugtrekt voor pijn, titreer dan het verdovingsmiddel indien nodig.
- Controleer de ademhalingsfrequentie en de diepte van de anesthesie klinisch gedurende de hele procedure; het niveau van isofluraan wordt zo nodig aangepast om een ademhalingsfrequentie van 55-65 ademhalingen /min te handhaven.
3. Donoroperatie
- Bereid en verdoof de rat zoals vermeld in stap 2. Snijd de huid van de xiphoid tot de sternale inkeping met behulp van een ontleedschaar. Voer een sternectomie uit door de ribben aan elke kant lateraal naar het borstbeen te snijden totdat optimale toegang tot het hart is bereikt.
- Hepariniseer de rat met een injectie van 100 U/100 g in het linkeratrium.
- Offer de donor op via exsanguinatie.
- Snijd de thymus weg om de visualisatie van de grote vaten te verbeteren. Verwijder vervolgens het hart en bloc met de opgaande aorta tot het niveau van de onnoemelijke slagader.
4. Bereiding van aortaklepblaadjes
- Plaats het donorhart in een steriele petrischaal onmiddellijk na de cardiectomie. Ontleed het donorhart in een ijskoude koelcelbuffer (zie Materiaalopgave).
- Gebruik een tang en Vannas-veerschaar om het donorhart te ontleden totdat alleen de aortawortel overblijft met een ventriculaire manchet van 1 mm proximaal aan de aortaklep.
- Open de aortaklep door een longitudinale snede te maken om de sinus van Valsalva tussen de linker en niet-coronaire sinussen te openen om alle drie de blaadjes te visualiseren.
OPMERKING: De snede moet de volledige lengte van de sinus van Valsalva zijn. De werkelijke afmetingen zijn afhankelijk van de grootte van de rat. - Snijd elke aortaklepblaadje afzonderlijk weg. Gebruik in het bijzonder een stompe tang om de rand van de folder vast te pakken en gebruik vannas-veerschaar om de folder weg te snijden door van de ene commissure naar de annulus te snijden en vervolgens naar de volgende commissure.
OPMERKING: Wees er speciaal op dat u alleen de rand van de bijsluiter vastgrijpt om verstoring van de valvulaire endotheelcellen te minimaliseren. - Bewaar de monsters na excisie van de bijsluiter in een ijskoude opslagbufferoplossing totdat ze klaar zijn om in de ontvangende rat te worden geïmplanteerd. Implanteer alle bijsluiters binnen 4 uur na koude opslag.
5. Werking van de ontvanger
- Bereid en verdoof de rat zoals vermeld in stap 2. Gebruik een verwarmingskussen dat op 36-38 °C wordt gehouden om de operatie uit te voeren.
- Dien buprenorfine (0,03 mg/kg subcutaan) toe aan alle ontvangende ratten vóór de operatie en elke 6-12 uur postoperatief indien nodig om de pijn te verlichten.
- Plaats de rat in een rechter laterale lighouding om toegang te krijgen tot de linker nier.
OPMERKING: De linker nier heeft de voorkeur vanwege de meer caudale positie ten opzichte van de rechter nier. - Snijd de huid over de flank in de lengterichting over 1-inch met behulp van een schaar.
OPMERKING: De incisie moet kleiner blijven dan de grootte van de nier om voldoende spanning te bieden om te voorkomen dat de nier zich tijdens de procedure terugtrekt in de buikholte. - Snijd op dezelfde manier de onderliggende buikwand in.
- Externaliseer de nier
- Gebruik de duim en wijsvinger om dorsaal en ventraal lichte druk uit te oefenen terwijl u een gebogen tang gebruikt om de caudale pool van de nier door de buik- en huidincisie te tillen. Externaliseer het schedeluiteinde van de nier op dezelfde manier.
- Als alternatief kan de nier worden geëxternaliseerd door het perirenale vet te grijpen en met lichte spanning omhoog te trekken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de nier of de niervaten niet rechtstreeks vastpakt. - Zodra de nier is geëxternaliseerd, houd deze vochtig met een warme zoutoplossing die op de nier wordt gesijpeld.
- Maak een subcapsulair vak.
- Oefen lichtjes druk uit op de niercapsule met behulp van één set stompe tangen, zodat de niercapsule duidelijk kan worden onderscheiden van het onderliggende parenchym. Gebruik tegelijkertijd een andere set stompe tangen, pak de capsule voorzichtig vast en trek voorzichtig omhoog om een gat in de capsule te maken.
OPMERKING: Vanwege de delicate aard van de capsule is minimale kracht vereist om deze incisie tot stand te brengen. - Blijf een stompe tang gebruiken om de incisie uit te breiden totdat er een ruimte van ~ 2 mm is gecreëerd om de aortaklepfolder te huisvesten.
- Ontwikkel een ondiepe subcapsulaire zak die iets groter is dan de klepfolder, terwijl u de rand van de incisie met één tang optilt en een stompe sonde onder de niercapsule voortbeweegt.
- Oefen lichtjes druk uit op de niercapsule met behulp van één set stompe tangen, zodat de niercapsule duidelijk kan worden onderscheiden van het onderliggende parenchym. Gebruik tegelijkertijd een andere set stompe tangen, pak de capsule voorzichtig vast en trek voorzichtig omhoog om een gat in de capsule te maken.
- Transplanteer de aortaklep in de subcapsulaire zak.
- Haal de aortablaadje uit de koelcel en plaats deze in het chirurgische veld.
- Terwijl u de rand van de vezelige capsule optilt, plaatst u de aortablaadje in de subcapsulaire zak met een stompe tang.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel ver genoeg van de incisie verwijderd is, zodat het stevig onder de capsule is bevestigd. Er moet voor worden gezorgd dat schade aan het onderliggende parenchym of verder scheuren van de vezelige capsule wordt voorkomen. - De incisie in het nierkapsel kan open worden gelaten.
- Duw de nier voorzichtig terug naar zijn anatomische positie met behulp van tegentractie aangebracht op de incisieranden.
- Sluit de abdominale incisie met een lopende steriele chirurgische hechting. Sluit de schil met nietjes.
- Postoperatieve zorg
- Plaats de rat na de operatie in een schone kooi op een verwarmingskussen met toegang tot voedsel en water.
- Controleer het dier dagelijks om te beoordelen op routinematige wondgenezing en tekenen van pijn of angst. Verwijder de nietjes na 7-10 dagen.
6. Verzameling van weefsel voor analyse
- Op geselecteerde eindpunten na transplantatie, euthanaseer het dier door exsanguinatie. Voer specifiek een mediane laparotomie uit en transect de abdominale aorta onder 5% isofluraan in zuurstof.
- Mobiliseer de nier en snijd deze weg door de nierslagader, ader en urineleider met een schaar door te snijden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het gebied met de getransplanteerde bijsluiter niet begrijpt. - Plaats de nier 's nachts in formaline, integreer deze in paraffine en sectie het voor de gewenste kleuring. Oriënteer het monster met de niercapsule naar voren gericht en het nierparenchym naar achteren gericht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een grafische weergave van het experimentele ontwerp is voorzien voor het rattenmodel (figuur 1). Daarnaast is een aortawortel ontleed uit het hart van de donor en een individuele aortaklepfolder die is voorbereid voor implantatie ook weergegeven in figuur 2. Vervolgens wordt een representatief beeld getoond van de positie van de aortaklepfolder onder de niercapsule voor implantatie in figuur 3A en na 3, 7 en 28 dagen bij de ontvangende rat (figuren 3B-D), waaruit het gemak van het lokaliseren en herstellen van het getransplanteerde weefsel blijkt.
De aortaklepblaadjes behouden hun oorspronkelijke architectuur na heterotopische transplantatie bij syngene dieren, wat het nut van dit model als basislijn aantoont om de immuunrespons bij allogene transplantaties te vergelijken. Specifiek onthulde histologie met hematoxyline en eosine (H &E) kleuring dat klepblaadjes bij syngenetische transplantaties na 7 dagen structureel intact waren zonder tekenen van oedemateuze zwelling (figuur 4A). De structurele integriteit van de klepfolder werd verder bevestigd door immunohistochemie voor Alpha Smooth Muscle Actin (aSMA) en CD31 (figuur 4B).
Figuur 1: Experimenteel ontwerp van de heterotope transplantatie van de aortaklep onder het nierkapsel bij ratten. Het hart wordt verzameld van de donorrat (A). De aortaklepblaadjes worden ontleed en bewaard in koude opslag (B) tot het implantatieproces onder het nierkapsel bij de ontvangende rat (C). De folders worden vervolgens op vaste tijdstippen geëxplanteerd en microscopisch (D) geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbereiding van de aortaklepbrochure voor implantatie. Voorbeeld van een aortawortel ontleed uit het donorhart (A) en verdere dissectie van een aortaklepfolder voor implantatie (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van de aortaklepblaadje onder het nierkapsel. De aortaklepfolder wordt gevisualiseerd onder de niercapsule bij implantatie (A), na 3 (B), 7 (C) en 28 dagen (D) bij syngene dieren en na 3 (E), 7 (F) en 28 dagen (G) bij allogene dieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Aortaklepblaadjes blijven structureel intact na transplantatie onder de niercapsule gedurende 7 dagen bij syngene dieren. De bovenste rij toont H &E-kleuring en immunostaining voor DAPI, aSMA en CD31 voor controlehartkleppen die werden verkregen maar niet getransplanteerd. De onderste rij toont H &E-kleuring en immunostaining voor DAPI, aSMA en CD31 in een syngenetische klepfolder die na 7 dagen wordt gexplant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belang en potentiële toepassingen
Hoewel mechanische en bioprothese hartkleppen routinematig worden gebruikt bij volwassen patiënten die klepvervanging nodig hebben, missen deze kleppen het potentieel om te groeien en zijn daarom suboptimaal voor pediatrische patiënten. Hartkleptransplantatie is een experimentele operatie die is ontworpen om groeiende hartklepvervangingen te leveren voor pasgeborenen en baby's met een aangeboren hartaandoening. In tegenstelling tot de transplantatie-immunobiologie van conventionele harttransplantaties, blijft de transplantatie-immunobiologie van dit nieuwe type transplantatie echter slecht onderzocht. Hier wordt een uniek rattenmodel voor subcapsulaire niertransplantatie van aortaklepblaadjes beschreven, wat een belangrijke stap voorwaarts biedt in het bestuderen van de transplantatie-immunobiologie van hartkleptransplantatie.
De renale subcapsulaire ruimte biedt een optimale omgeving om transplantatie-immunobiologie van hartkleppen te bestuderen. Het getransplanteerde weefsel is veilig opgesloten in een goed gevasculariseerde locatie met toegang tot circulerende immuuncellen20. Bovendien zijn subcapsulaire modellen eerder met succes gebruikt om allograftafstoting te testen in veel weefsels zoals de alvleesklier, lever, nieren en de andere celtypen 22,23,24,25,26,27, wat aangeeft dat dit model gerechtvaardigd is om de immunogeniciteit van aortaklepblaadjes te bestuderen.
Dit model heeft verschillende protentionale toepassingen voor het bestuderen van de transplantatie immunologie van aortakleppen. Ten eerste kan het model worden gebruikt om het niveau van systemische immuunsuppressie te bepalen dat nodig is voor hartkleptransplantatie om transplantaatafstoting te voorkomen, zoals tacrolimus, mycofenolaat en steroïden. Bovendien hebben verschillende studies aangetoond dat klepweefsel immunologisch kan verschillen van ander hartweefsel, omdat de kleppen relatief worden gespaard tijdens fulminante afstoting van conventionele harttransplantaties 28,29,30. Dit model maakt verkenning van dit concept mogelijk, omdat de subcapsulaire ruimte verschillende weefseltypen kan huisvesten, zoals klepbrochure en myocardium, om de immunogeniciteit van deze weefsels te vergelijken.
Dit model is voordelig omdat het technisch eenvoudig en snel is en een hoge overlevingskans heeft met een laag risico op complicaties. Omdat elke donor drie aortaklepblaadjes kan leveren, kan één rat als donor dienen voor drie verschillende ontvangers. Gemiddeld was de duur van de donoroperatie 27,2 min (n = 12) en de duur van de ontvangende operatie was 29,7 min (n = 36). De overlevingskans van de ontvangende operatie was 97,2% (n = 35/36), met één intraoperatieve sterfte als gevolg van respiratoire depressie. Minimale bloeding als gevolg van trauma aan het nierparenchym tijdens het creëren van de subcapsulaire pocket werd opgemerkt in 11,1% van de ontvangende operaties. Het bloeden was echter in alle gevallen gemakkelijk onder controle te houden met compressie van een katoenen tip applicator. Eén monster werd losgemaakt van de subcapsulaire ruimte en niet hersteld na uitleg, zelfs niet na 7 dagen.
Voorheen werden de klepblaadjes geëxplanteerd door ze uit de subcapsulaire ruimte te verwijderen en ingebed, gesneden en gekleurd zonder bevestigd aortaweefsel. Deze methode is echter suboptimaal omdat de folders zelf extreem klein, dun en transparant zijn, wat resulteert in het verlies van verschillende monsters bij de verwerking. In plaats daarvan wordt aanbevolen om de nier en bloc te verwijderen en het weefsel in te bedden en te snijden terwijl het nog steeds onder de niercapsule is bevestigd om ervoor te zorgen dat er geen monsters verloren gaan. Bovendien minimaliseert deze aanpak het trauma en de manipulatie van de folder.
Kritieke stappen
De kritieke stappen van de procedure zijn het vaststellen van een chirurgisch vlak van anesthesie, het insnijden van de buikwand over de nieren, het verwijderen van de nier, het verhogen van de subcapsulaire flap, het inbrengen van het heterotope transplantatieweefsel, het verkrijgen van hemostase, het terugbrengen van de nier naar de anatomische positie en het sluiten van de huid.
Wijzigingen en probleemoplossing
Hoewel dit de eerste beschrijving is van transplantatie van hartweefsel onder de niercapsule, hebben verschillende anderen transplantatie van andere weefseltypen in de renale subcapsulaire ruimte 20,22,23,24,25,26,27 beschreven. In dit protocol werden kleine aanpassingen aangebracht aan eerdere subcapsulaire modellen om de techniek te optimaliseren en complicaties te minimaliseren. In het bijzonder, terwijl anderen hebben aanbevolen om Vannas-lentescharen te gebruiken om de initiële incisie in de niercapsule20,26 te maken, is deze methode waarschijnlijker om trauma aan het onderliggende parenchym te veroorzaken en te resulteren in subcapsulaire hematoomvorming. Te veel bloedingen zullen resulteren in uitzetting van de capsule en de veiligheid van de getransplanteerde26 in gevaar brengen. Daarom moet een stompe tang worden gebruikt om de capsule te openen. Bovendien, terwijl sommige protocollen pleiten voor de plaatsing van commerciële producten met homostatische eigenschap over de kapselincisie26,31, is deze stap onnodig zolang het weefsel ver genoeg in de subcapsulaire zak wordt geschoven.
Bij grotere ratten kan de nier bedekt zijn met perirenaal vet en het externaliseren van de nier via lifting met een gebogen tang is mogelijk niet haalbaar. In deze gevallen is het het beste om de nier te externaliseren door voorzichtig het perirenale vet met een tang te trekken en de nier uit de buikholte te trekken zonder schade of bloeding te veroorzaken.
Vergelijking met bestaande heterotope transplantatiemodellen
Terwijl verschillende andere diermodellen voor heterotopische aortakleptransplantatie eerder zijn beschreven 12,13,14,15,16,17,18, biedt het huidige protocol een eenvoudig en praktischer alternatief dat eerdere modellen op verschillende manieren verbetert. Ten eerste is er vanwege de technisch eenvoudige aard van de procedure zeer weinig training vereist om succesvol te werken. Dit staat in schril contrast met eerder beschreven heterotope aortakleptransplantaties in de abdominale aorta. Daarom biedt dit model een praktischer en kosteneffectiever alternatief om aortakleptransplantatie te bestuderen en tegelijkertijd de morbiditeit, pijn en mortaliteit van de ratten te minimaliseren. Bovendien, omdat er slechts één aortaklepfolder nodig is voor de ontvangeroperatie en elke donorrat drie folders levert, zijn er minder donorratten nodig voor een bepaald experiment. Bovendien kan het implanteren van weefsel in de contralaterale nier of een afzonderlijke subcapsulaire pocket interne controle of vergelijking van immuunresponsen op verschillende weefsels binnen een enkele rat mogelijk maken. In dit geval is de beste aanpak via een midline laparotomie-incisie.
Naast de diermodellen die heterotopische aortakleptransplantatie in de abdominale aorta beschrijven, hebben andere studies een subcutaan model gebruikt om de immunogeniciteit van aortakleppen te bestuderen32. Hoewel deze aanpak ongetwijfeld eenvoudiger is dan transplantatie in de abdominale aorta, suggereert bestaand bewijs dat subcutane implantatie een minder effectieve methode is voor de presentatie van antigeen33,34. Het geïmplanteerde monster is ook een uitdaging om te vinden en te analyseren. Daarom wordt de renale subcapsulaire ruimte voorgesteld als een plaats van implantatie die zowel vereenvoudigd als optimaal is voor het bestuderen van de biologie van aortakleptransplantatie.
Kortom, het nieuw voorgestelde model dient als een aanvulling op het armamentarium van wetenschappers om hartkleptransplantatie te bestuderen en vult de eerder beschreven modellen aan.
Beperkingen
Hoewel de transplantatie van aortaklepblaadjes onder de niercapsule een efficiënte methode is voor het bestuderen van alloimmuniteit in vivo, bestaan er enkele beperkingen van dit model. Hoewel de subcapsulaire ruimte goed gevasculariseerd is, biedt deze niet dezelfde hemodynamische omgeving als de sub-coronaire positie. Dit kan de immuunrespons op getransplanteerd weefsel beïnvloeden. Sommigen hebben verondersteld dat de verschillende immuuneigenschappen die in klepweefsel worden waargenomen, het gevolg kunnen zijn van de hogedrukbloedstroom over de aortaklep in de sub-coronaire positie, waardoor de chemotactische respons28,35 teniet wordt gedaan. Bovendien is dit model onvoldoende om het effect van alloreactiviteit op de klepfunctie te bestuderen, omdat de folders hun fysiologische functie onder de niercapsule niet uitvoeren. Er bestaan echter vergelijkbare beperkingen voor de heterotopische abdominale aortatransplantatiemodellen, aangezien het succes van deze modellen afhangt van het incompetent maken van de klepblaadjes om graftrombose te voorkomen15,36.
Beperkingen van het protocol zijn onder meer de mogelijkheid dat weefsel losraakt van de renale subcapsulaire ruimte en niet herstelbaar is (1 op de 36 dieren). Een andere beperking is de dood van het dier tijdens de operatie (1 op de 36 dieren); de dood werd echter veroorzaakt door de overdosis buprenorfine en andere methoden voor het doseren van analgesie kunnen worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Figuur 1 is gemaakt met biorender.com. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het AATS Foundation Surgical Investigator Program aan TKR, het Children's Excellence Fund van het Department of Pediatrics aan de Medical University of South Carolina aan TKR, een Emerson Rose Heart Foundation-subsidie aan TKR, filantropie door senator Paul Campbell aan TKR, NIH-NHLBI Institutional Postdoctoral Training Grants (T32 HL-007260) aan JHK en BG, en de Medical University of South Carolina College of Medicine Pre-clerkship FLEX Research Fund naar MAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chlordie, USP | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4-0 Polyglactin 910 | Ethicon | J415H | |
| 7.5% Povidone-Iodine | CareFusion | 29904-004 | |
| 70% ETOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Harvard Apparatus | 75-2030 | Air-tight inducton chamber for rats |
| Anesthesia machine | Harvard Apparatus | 75-0238 | Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging |
| Anesthesia Mask | Harvard Apparatus | 59-8255 | Rat anesthesia mask |
| Brown Norway Rats (BN/Crl) | Charles River | Strain Code 091 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | 0.03 mg/kg, administered subcutaneously |
| Electric hair clippers | WAHL | 79434 | |
| Electric Heating Pad | Harvard Apparatus | 72-0492 | Maintained at 36-38 °C |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | 100U/100g injection into the left atrium |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Iris forceps curved | World Precision Instruments | 15917 | |
| Iris forceps straight | World Precision Instruments | 15916 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen |
| Lewis Rats (LEW/ Crl) | Charles River | Strain Code 004 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Micro forceps | World Precision Instruments | 500233 | Dumont #5 |
| Micro scissors | World Precision Instruments | 501930 | Spring-loaded Vannas Scissors |
| Needle Driver | World Precision Instruments | 500226 | Ryder Needle Driver |
| Operating microscope | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x - 90x Stereo Microscope |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Skin staples | Ethicon | PXR35 | Proximate 35 |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 1WC | |
| Sterile gauze sponges | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 1962C | Metzenbaum Scissors |
| University of Wisconsin Buffer (Servator B) | S.A.L.F S.p.A. | 6484A1 | Stored at 4 °C |
References
- Van Der Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: A systematic review and meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Jacobs, J. P., et al. Reoperations for pediatric and congenital heart disease: An analysis of the Society of Thoracic Surgeons (STS) congenital heart surgery database. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 17 (1), 2-8 (2014).
- Syedain, Z. H., et al. Pediatric tri-tube valved conduits made from fibroblast-produced extracellular matrix evaluated over 52 weeks in growing lambs. Science Translational Medicine. 13 (585), 1-16 (2021).
- Khan, M. S., Samayoa, A. X., Chen, D. W., Petit, C. J., Fraser, C. D. Contemporary experience with surgical treatment of aortic valve disease in children. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 146 (3), 512-521 (2013).
- Boyd, R., Parisi, F., Kalfa, D. State of the art: Tissue engineering in congenital heart surgery. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31 (4), 807-817 (2019).
- Feins, E. N., Emani, S. M. Expandable valves, annuloplasty rings, shunts, and bands for growing children. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 23, 17-23 (2020).
- Lintas, V., et al. TCT-795 Human cell derived off-the-shelf tissue engineered heart valves for next generation transcatheter aortic valve replacement: a proof-of-concept study in adult sheep. Journal of the American College of Cardiology. 70 (18), 271 (2017).
- Blum, K. M., Drews, J. D., Breuer, C. K. Tissue-engineered heart valves: A call for mechanistic studies. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (3), 240-253 (2018).
- Bernstein, D., et al. Cardiac growth after pediatric heart transplantation. Circulation. 85 (4), 1433-1439 (1992).
- Delmo Walter, E. M., et al. Adaptive growth and remodeling of transplanted hearts in children. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 40 (6), 1374-1383 (2011).
- Simon, P., et al. Growth of the pulmonary autograft after the Ross operation in childhood. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 19 (2), 118-121 (2001).
- Oei, F. B. S., et al. A size-matching heterotopic aortic valve implantation model in the rat. Journal of Surgical Research. 87 (2), 239-244 (1999).
- Oei, F. B. S., et al. Heart valve dysfunction resulting from cellular rejection in a novel heterotopic transplantation rat model. Transplant International. 13, SUPPL. 1 (2000).
- El Khatib, H., Lupinetti, F. M. Antigenicity of fresh and cryopreserved rat valve allografts. Transplantation. 49 (4), 765-767 (1990).
- Yankah, A. C., Wottge, H. U. Allograft conduit wall calcification in a model of chronic arterial graft rejection. Journal of Cardiac Surgery. 12 (2), 86-92 (1997).
- Moustapha, A., et al. Aortic valve grafts in the rat: Evidence for rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 114 (6), 891-902 (1997).
- Légaré, J. F., et al. Prevention of allograft heart valve failure in a rat model. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 122 (2), 310-317 (2001).
- Legare, J. F., Lee, T. D. G., Creaser, K., Ross, D. B., Green, M. T lymphocytes mediate leaflet destruction and allograft aortic valve failure in rats. The Annals of Thoracic Surgery. 70 (4), 1238-1245 (2000).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Burgin, M., et al. Kidney Subcapsular Allograft Transplants as a Model to Test Virus-Derived Chemokine-Modulating Proteins as Therapeutics. Methods in molecular biology. 2225, Clifton, N.J. 257-273 (2021).
- Foglia, R. P., DiPreta, J., Donahoe, P. K., Statter, M. B. Fetal allograft survival in immunocompetent recipients is age dependent and organ specific. Annals of Surgery. 204 (4), 402-410 (1986).
- Cunha, G. R., Baskin, L. Use of sub-renal capsule transplantation in developmental biology. Differentiation. 91 (4-5), 4-9 (2016).
- Hori, J., Joyce, N., Streilein, J. W. Epithelium-deficient corneal allografts display immune privilege beneath the kidney capsule. Investigative Opthalmology & Visual Science. 41 (2), 443-452 (2000).
- Mandel, T., et al. transplantation of organ cultured fetal pig pancreas in non-obese diabetic (NOD) mice and primates (Macaca fascicularis). Xenotransplantation. 2 (3), 128-132 (1995).
- Ricordi, C., Flye, M. W., Lacy, P. E. Renal subcapsular transplantation of clusters of hepatocytes in conjunction with pancreatic islets. Transplantation. 45 (6), 1148-1150 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Subcapsular transplantation of tissue in the kidney. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 737-740 (2014).
- Vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Mitchell, R. N., Jonas, R. A., Schoen, F. J. Pathology of explanted cryopreserved allograft heart valves: Comparison with aortic valves from orthotopic heart transplants. Journal of Thoracic and Cardiovasular Surgery. 115 (1), 118-127 (1998).
- Valante, M., et al. The aortic valve after heart transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 60, SUPPL. 2 (1995).
- O'Brien, M. F., Stafford, E. G., Gardner, M. A. H., Pohlner, P. G., McGiffin, D. C. A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 94 (6), 812-823 (1987).
- Ng, T. F., Osawa, H., Hori, J., Young, M. J., Streilein, J. W. Allogeneic neonatal neuronal retina grafts display partial immune privilege in the subcapsular space of the kidney. The Journal of Immunology. 169 (10), 5601-5606 (2002).
- Heslop, B. F., Wilson, S. E., Hardy, B. E. Antigenicity of aortic valve allografts. Annals of Surgery. 177 (3), 301-306 (1973).
- Steinmuller, D., Weiner, L. J. Evocation and persistence of transplantation immunity in rats. Transplantation. 1 (1), 97-106 (1963).
- Billingham, R. E., Brent, L., Brown, J. B., Medawar, P. B. Time of onset and duration of transplantation immunity. Plastic and Reconstructive Surgery. 24 (1), 410-413 (1959).
- Tector, A. J., Boyd, W. C., Korns, M. E. Aortic valve allograft rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 62 (4), 592-601 (1971).
- Sugimura, Y., Schmidt, A. K., Lichtenberg, A., Akhyari, P., Assmann, A. A rat model for the in vivo assessment of biological and tissue-engineered valvular and vascular grafts. Tissue Engineering Methods (Part C). 23 (12), 982-994 (2017).
