Summary
DNA甲基转移酶是潜在的癌症药物靶标。在这里，提出了一个协议来评估DNA甲基转移酶抑制的小分子。该测定利用核酸内切酶将DNA甲基化与荧光生成偶联，并允许实时监测酶活性。
Abstract
DNA甲基化是表观遗传基因调控的一种形式，对正常的细胞功能很重要。在细胞中，称为DNA甲基转移酶（DNMT）的蛋白质建立并维持DNA甲基化模式。正常DNA甲基化模式的变化与癌症的发展和进展有关，使DNMT成为潜在的癌症药物靶标。因此，鉴定和表征这些酶的新型小分子抑制剂非常重要。本文提出了一种可用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂的方案。连续偶联动力学测定允许在存在和不存在潜在小分子抑制剂的情况下确定DNA甲基化的初始速度。该测定使用甲基敏感的核酸内切酶Gla I将半甲基化DNA底物的甲基化偶联到荧光生成。
这种连续测定允许实时监测酶活性。在微量滴定板中进行小体积测定可降低试剂成本。使用该测定方法，对DNMT1抑制剂进行了小型示例筛选，DNMT1是人类中最丰富的DNMT同工酶。高度取代的蒽醌天然产物乳酸A是一种有效的DNA竞争性DNMT1抑制剂。在这里，我们检查三种潜在的小分子抑制剂 - 蒽醌或具有一到三个取代基的蒽醌样分子 - 在两种浓度下描述测定方案。初始速度用于计算在每个分子存在下观察到的活性百分比。检查的三种化合物中的一种表现出DNMT1活性的浓度依赖性抑制，表明它是DNMT1的潜在抑制剂。
Introduction
DNA甲基化是调节基因表达和染色质结构的重要表观遗传标记。甲基化主要发生在 CpG 二核苷酸中——胞嘧啶，然后是鸟苷;将甲基加入到胞嘧啶的5位。正确的DNA甲基化模式，从而正确的基因表达，对于适当的细胞发育和功能是必需的。许多疾病状态与正常甲基化模式的改变有关1，2，3。例如，癌症的发生和进展以及DNA甲基化模式的改变之间存在联系。通常，癌细胞表现出较低的甲基胞嘧啶总体水平，这会导致基因组不稳定。同时，存在于基因组中的甲基胞嘧啶集中在肿瘤抑制基因的启动子区域，这导致这些重要蛋白质的基因沉默。值得注意的是，表观遗传变化是动态和可逆的，这与与肿瘤发生相关的DNA突变不同。这使得参与表观遗传基因调控的蛋白质成为有趣的药物靶点2，4。
DNA甲基转移酶（DNMT）是负责产生和维持DNA甲基化模式的蛋白质。三种催化活性同工酶DNMT1，DNMT3a和DNMT3b存在于人类中。在发育和分化过程中， 从头 甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b建立甲基化模式。两种酶都可以结合催化无活性的DNMT3L蛋白，形成活性增加的复合物1，5。细胞分裂后，子细胞含有半甲基化的DNA——仅在双链的一条链中含有甲基胞嘧啶的DNA——因为新合成的DNA没有甲基化标记。DNMT1的主要功能是甲基化这种半甲基化的DNA，从而重建完整的甲基化模式1，5。
DNMT活动与癌症之间的联系已经确立。DNMT1的过表达，无论是通过转录还是翻译后机制，都是几种常见致癌途径的结果6，7，8，9。使用亚态性等位基因降低DNMT1活性的遗传方法导致Apc（Min）小鼠10的肿瘤形成减少。敲低DNMT1的反义寡核苷酸抑制细胞培养和小鼠肿瘤模型中的肿瘤形成11，12。因此，抑制DNMT1活性似乎是一种有前途的癌症治疗方法。然而，DNMT3同工酶所扮演的角色并不是那么简单。DNMT3a 突变见于急性髓系白血病13 和骨髓增生异常综合征14。已鉴定的突变中至少有一个已被证明会降低酶15的DNA甲基化活性。然而，DNMT3b在乳腺癌16和结直肠癌17中过表达。由于各种DNMT同工酶在致癌作用中发挥不同的作用，因此鉴定同工酶特异性抑制剂至关重要。这些化合物不仅可用于治疗药物的开发，而且同工酶特异性抑制剂也将成为剖析每种DNMT同工酶在癌症病因学中的作用的宝贵工具。
文献中报道了几种DNMT抑制剂。已知的DNMT抑制剂可分为两类：核苷和非核苷。核苷抑制剂通常是胞苷类似物。这些化合物被掺入DNA中并共价捕获DNMT。 5-氮杂胞苷和5-氮杂-2'-脱氧胞苷已被批准用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病4，18。这些化合物的高毒性、低生物利用度和化学不稳定性存在问题。正在进行的工作正在研究下一代核苷抑制剂的功效;SGI-110来源于5-氮杂-2'-脱氧胞苷，就是一个例子19，20。核苷抑制剂不是同工酶特异性的，会使遇到的任何DNMT同工酶失活。因此，用核苷去甲基化剂处理会导致所有DNMT同工酶4，18的耗竭。非核苷抑制剂不需要掺入DNA中即可发挥其抑制作用。相反，这些分子直接与DNMT结合，引入了同工酶特异性抑制的可能性。迄今为止，已经发现了几种非核苷抑制剂，包括SGI-102721，肼屈嗪22，普鲁卡因酰胺23，RG108及其衍生物24，以及天然产物（−）-表没食子儿茶素3-没食子酸酯（EGCG）25和乳酸A26，27。迄今为止发现的大多数非核苷抑制剂不是同工酶选择性的，或者对一种DNMT同工酶表现出弱的偏好。此外，这些分子的效力需要提高，特别是在细胞4，18中。因此，需要发现或开发更有效的同工酶选择性DNMT抑制剂。
发现新的DNMT小分子抑制剂的一个障碍是传统上用于检查DNMT活性的费力测定28。检测通常是不连续的，有多个步骤。DNMT的酶活性仍然常规使用放射性S-腺苷甲硫氨酸（SAM）29，30，31，32，33，34进行测定。DNA甲基化的非放射性测定也已经开发出来。例如，利用甲基敏感限制性核酸内切酶和电泳分离消化产物的测定已经描述35，36。这些类型的不连续、多步骤测定不容易用于药物发现。自 2000 年代中期以来，已经开发了几种具有更高通量的 DNA 甲基化测定28。闪烁邻近测定用于筛选DNMT1抑制剂37。另一种利用甲基敏感限制性核酸内切酶的测定用于筛选DNMT3a抑制剂25，38。虽然这两种检测方法都比传统的DNA甲基化测定具有更高的通量，但这些测定需要多个步骤，并且不允许实时观察甲基化活性。最近，已经描述了一种连续的动力学测定，该测定将甲基化反应的一种产物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的形成与NADPH氧化39相关的340nm处的光谱变化耦合。该测定利用三种偶联酶产生光谱信号。
我们开发了一种基于荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化测定，该测定利用了单一的市售偶联酶，可以实时生成数据（图1）。含有三个甲基胞嘧啶的发夹寡核苷酸用作底物。底物DNA在5'端包含一个荧光团，在3'端包含一个淬灭剂。半甲基化CpG位点的甲基化产生核酸内切酶Gla I的切割位点 - 完全甲基化的GCGC。产物寡核苷酸的Gla I裂解从淬灭剂中释放荧光团并实时产生荧光。该测定可用于检查DNMT任何亚型的活性;然而，DNMT1观察到更高的活性，因为该同工酶优先甲基化半甲基化的DNA1，5。如果从DNMT1中删除自动抑制性复制病灶靶向序列（RFTS）结构域，则可以观察到更强大的活性。该结构域位于N末端调控区，与催化位点结合并阻止DNA结合。去除前 ~600 个氨基酸会导致截短酶比全长酶更活跃（kcat/Km 增加 ~640 倍）40。这种酶的活化形式，称为缺乏RFTS的DNMT1（氨基酸621-1616），由于其增加的催化能力，可以更容易地鉴定抑制剂。本文提出了一种在测定中利用缺乏RFTS的DNMT1来筛选潜在小分子抑制剂的方案。使用核酸内切酶偶联连续测定，在存在和不存在几个小分子的情况下确定初始速度。在两种浓度下检查每种潜在抑制剂，以寻找浓度依赖性DNMT1抑制。计算在每种情况下在存在小分子的情况下观察到的活性百分比。
图1：DNA甲基化测定。 使用半甲基化的发夹DNA，5'端有荧光团，3'端有淬灭剂作为底物。DNMT1催化甲基从 S-腺苷甲硫氨酸转移到非甲基化的CpG位点，产生 S-腺苷同型半胱氨酸和完全甲基化的DNA。DNA产物含有核酸内切酶Gla I的切割位点，该位点可切割完全甲基化的GCGC位点。产物DNA的切割从3'淬灭剂中释放5'荧光团，产生荧光。缩写：Fl = 荧光团;Q =淬火;DNMT1 = DNA甲基转移酶1;SAM = S-腺苷蛋氨酸;SAH = S-腺苷同型半胱氨酸。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
1. 为屏幕准备检测解决方案
注意：可以调整该测定中使用的底物浓度。对于缺乏RFTS的DNMT1，实验确定的发夹DNA底物和SAM的Km 值分别为1-2 nM和2μM，分别为26，40。
- 准备 600 μL 在冰上的微量离心管中测试的每个测定条件。
注意：所需的测定溶液总量取决于正在进行的重复次数。对于该协议，每个测定条件一式三份运行。- 向每个试管中加入ddH2O和5x甲基化缓冲液（250 mM Tris pH 7.5，5 mM MgCl2，500 mM谷氨酸钾，5 mM二硫苏糖醇（DTT），25%甘油），以达到1x缓冲液的终浓度。对于含有 20 μM 化合物的测定，加入 472 μL ddH2O 和 120 μL 5x 缓冲液。对于含有 50 μM 化合物的测定，加入 470 μL ddH2O 和 120 μL 5x 缓冲液。
- 向每个样品中加入 3.15 μL 20 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA）。
- 向每个样品中加入 2 μL 3.15 μM 发夹 DNA 底物和 1.33 μL 4.75 mM SAM。
注意：测定溶液混合物中底物的浓度是所需最终浓度的1.05倍。 - 向适当的样品中加入终浓度为 21 μM（1.26 μL 的 10 mM）或 52.5 μM（3.15 μL 的 10 mM）的抑制剂。向对照样品中加入等量的二甲基亚砜（DMSO）。
注意：筛网中使用的抑制剂浓度可以变化。最终DMSO的最大浓度应为≤5%（v / v）。高达5%（v / v）的DMSO浓度对测定26中观察到的活性没有影响。
- 通过涡旋（3，000 rpm）混合溶液3秒。在台式微型离心机（1，200 × g）中旋转样品几秒钟，以确保溶液收集在管底部。
- 将 95 μL 每种测定溶液等分到黑色半区 96 孔板中的 6 个连续孔中（图 2）。
注意：这些筛选测定分两批进行。首先，检查20μM抑制剂样品（总共4个条件），然后检查50μM抑制剂样品（总共4个条件）。
图2：检测板设置。 将每种测定溶液等分到黑色96孔板中的六个孔中：DMSO对照（蓝色），化合物1（绿色），化合物2（红色）和化合物3（黄色）。缺乏RFTS的DNMT1和Gla I都将添加到三个井中。作为对照，Gla I将被单独添加到其他三个井中。缩写：RFTS = 复制焦点靶向序列;DNMT1 = DNA甲基转移酶1;DMSO = 二甲基亚砜。 请点击此处查看此图的大图。
2.制备用于筛选的酶溶液
注意：缺乏RFTS的DNMT1可以在 大肠杆菌 中表达并纯化至均匀。缺乏RFTS的DNMT1的表达和纯化程序已在前面描述过41。所需的酶体积取决于正在进行的测定次数。在这里，每组进行四种不同的测定;每次测定一式三份完成。
- 在冰上的微量离心管中制备 75 μL 每种酶溶液。
注意：需要两种酶溶液。一个解决方案将包含 DNMT1 和 Gla I;另一个将仅包含 Gla I。- 向每个试管中加入ddH2O和5x甲基化缓冲液（250 mM Tris pH 7.5，5 mM MgCl2，500 mM谷氨酸钾，5 mM DTT，25%甘油），以达到1x缓冲液的终浓度。对于 Gla I 酶溶液，加入 15 μL 5x 缓冲液和 58.8 μL ddH2O。对于 DNMT1+Gla I 酶溶液，加入 15 μL 5x 缓冲液和 58.2 μL ddH2O。
- 向每种溶液中加入 1.2 μL 10 U/μL Gla I，最终浓度为 0.16 U/μL。
- 向 DNMT1+Gla I 溶液中加入 0.6 μL 5 μM 不含 RFTS 的 DNMT1，使最终浓度为 40 nM。
- 轻轻敲击以混合溶液。在台式微型离心机（1，200 × g）中旋转样品几秒钟，以确保将溶液收集在管底部。
- 将 12 μL 每种酶溶液等分到锥形底部 96 孔板中的 6 个孔中（图 3）。
图 3：酶板设置。 将Gla I（灰色）和DNMT1 + Gla I（蓝色）溶液分别等分到96孔板中的六个孔中。使用多通道移液管，可以将酶同时添加到一排测定溶液中。对于每个测定条件（六个孔），三个孔将接受DNMT1 + Gla I，三个孔将单独接受Gla I。缩写：DNMT1 = DNA 甲基转移酶 1。 请点击此处查看此图的大图。
3.运行测定并分析数据。
- 将读板器预热至37°C。 插入含有测定溶液的黑板。摇动板（双轨道以425 cppm持续5秒），并以485nm的激发波长和528nm的发射波长读取荧光。将板在37°C孵育5分钟。
注意：或者，可以使用具有适当波长截止的滤光片进行荧光读数。 - 取出检测板。向每个孔中加入 5 μL 酶溶液，并通过上下移液混合。
注意：使用多通道移液器，以便可以同时启动一排样品。 - 将板插入读板器。每53秒记录一次荧光，持续30分钟。在每次读数之前摇动板（双轨道以 425 cpm 持续 4 秒）。
- 每种情况的平均三次重复 Gla I 对照测定。从在缺乏RFTS的DNMT1存在下获得的三次重复迹线中减去平均含Gla I的对照反应迹线。确定校正重复的平均值和标准误差。
- 绘制平均校正反应迹线并将初始线性部分拟合到一条线上以确定初始速度。
- 通过将在化合物存在下观察到的速度除以在含DMSO的对照反应中观察到的速度并乘以100来确定活性百分比。
4. 额外的检测控制 — 酶的顺序添加
- 在冰上的微量离心管中制备 550 μL 测定溶液。加入 110 μL 5x 甲基化缓冲液、3.88 μL 3.15 μM 发夹 DNA 底物、6.43 μL 47.5 mM SAM、3.06 μL 20 mg/mL BSA 和 426.6 μL ddH2O。
- 通过涡旋（3，000rpm）混合溶液3秒。在台式小型离心机（1，200 × g）中旋转样品几秒钟，以确保将溶液收集在管底部。
- 将 90 μL 测定溶液等分到黑色半区 96 孔板中的 6 个连续孔中。
- 在冰上制备DNMT1酶溶液。向一个试管中加入 4 μL 5x 甲基化缓冲液、0.76 μL 缺乏 5 μM RFTS 的 DNMT1 和 15.24 μL ddH2O。向另一管中加入 4 μL 5x 甲基化缓冲液和 16 μL ddH2O。
- 轻轻敲击以混合溶液。在台式微型离心机（1，200 × g）中旋转样品几秒钟，以确保溶液收集在管底部。
- 将 5 μL 含 DNMT1 的溶液加入黑色半区 96 孔板中的三个孔中。向其他三个孔中加入 5 μL 缓冲液对照溶液。
- 将微量滴定板放入预热至37°C的读板器中。 摇动板（双轨道以425 cpm持续3秒），并以485nm的激发波长和528nm的发射波长读取荧光。重复摇晃，每60秒读取一次，持续30分钟。
- 当检测板在酶标仪中时，在冰上制备Gla I溶液。向微量离心管中加入 8 μL 5x 甲基化缓冲液、0.64 μL 10 U/μL Gla I 和 31.4 μL ddH2O。轻轻敲击以混合溶液。在台式微型离心机（1，200 × g）中旋转样品几秒钟，以确保溶液收集在管底部。
- 将 6 μL Gla I 溶液等分到锥形底部 96 孔板中的 6 个孔中。
- 在最初的30分钟读数后，从读板器中取出黑色板。向所有 6 孔中加入 5 μL Gla I 溶液，并通过上下移液混合。
注意：使用多通道移液器，以便可以同时启动所有孔。 - 将黑色板放回读板器中。每35秒记录一次荧光，持续35分钟。在每次读数之前摇动板（双轨道以425 cppm持续3秒）。
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Representative Results
活动 DNMT1 是此分析的先决条件。缺乏RFTS的DNMT1在 大肠杆菌 中表达，并按照先前发表的程序纯化至均一性41。为了确保纯化的酶具有活性，使用不连续的核酸内切酶偶联测定来检查DNA甲基化活性36。该测定利用位于Sau3A1切割位点的32个碱基对双链DNA和单个半甲基化CpG。Sau3A1可以切割半甲基化的底物DNA;然而，当DNA完全甲基化时，切割被阻断。将缺乏RFTS的DNMT1加入到含有1μM DNA和0.5mM SAM的测定中，取出等分试样并在30分钟内快速冷冻。随后用Sau3A1消化样品，并通过凝胶电泳分离产物。 如图4所示，随着反应时间的增加，DNA被保护免受切割，这表明缺乏RFTS的DNMT1正在甲基化半甲基化的DNA。最初存在于测定中的大多数 1 μM 底物 DNA 已在 30 分钟时间过程中转化为产物。
本文中描述的核酸内切酶偶联测定允许实时观察DNA甲基化活性，因为荧光的增加。该测定成功的关键是核酸内切酶Gla I.的甲基敏感性，Gla I不能有效地切割半甲基化的底物DNA，但会切割完全甲基化的产物DNA（图1）。需要切割发夹DNA以从淬灭剂中释放荧光团并产生荧光增加。为了证明酶按预期工作，进行了对照反应，其中顺序而不是同时添加缺乏RFTS的DNMT1和Gla I的酶。如果偶联测定工作正常，则添加DNMT1不会影响荧光，因为DNA底物的甲基化预计不会影响内部淬灭的发夹DNA的背景荧光。然而，随后将Gla I添加到含有甲基转移酶的测定中，由于完全甲基化的发夹DNA的切割，应该会产生荧光。半甲基化的发夹DNA底物本身确实具有背景荧光（图5）;这些测定含有20nM发夹DNA和500μM SAM。将缺乏RFTS的DNMT1或缓冲液加入测定中，并跟踪荧光30分钟。
如图5所示，在没有偶联酶的情况下，荧光不受缺乏RFTS的DNMT1的影响（蓝色阴影含有10 nM RFTS缺乏DNMT1，而红色阴影是缓冲液对照）。因此，DNMT1对半甲基化CpG位点的甲基化不会明显改变荧光信号。然而，当将Gla I添加到所有孔中时，仅在含有缺乏RFTS的DNMT1的测定中观察到强大的荧光产生（图5）。这表明DNMT1对半甲基化底物DNA的甲基化是Gla I切割和荧光产生所必需的。应该注意的是，在该对照测定中观察到的荧光增加反映了Gla I的活性，因为酶是依次添加的。或者，这些反应混合物可以用Gla I消化，并且可以通过电泳分离所得寡核苷酸以可视化切割并确保酶按预期工作。
为了使用这种偶联测定直接确定DNMT1的初始速度，需要同时添加两种酶，即缺乏RFTS的DNMT1和Gla I。只要产物DNA的Gla I切割速率快于DNMT1的DNA甲基化速率，产生的荧光信号就会反映DNA甲基化活性。为了确保DNMT1活性是限速的，可以在保持所有其他测定条件不变的同时改变DNMT1的浓度。荧光产生速率应与DNMT1的浓度成正比。在缺乏RFTS的DNMT1中，这已经显示在这里使用的条件下40。当利用这种偶联测定来检查DNMT活性时，除了含有DNMT1和Gla I的反应外，还进行含Gla I的对照反应（图6A）。Gla I 控件具有多种功能。从含DNMT的反应迹图中减去Gla I对照反应迹线，可以同时考虑半甲基化DNA底物的缓慢切割和背景荧光。生成的校正反应迹线反映了DNMT1的DNA甲基化活性。拟合校正反应迹线的初始线性部分可以确定初始速度（图6B）。使用10 nM发夹DNA底物和10 μM SAM，获得113 ± 2 RFU/min的初始速度。
取代的蒽醌以前已被证明可以抑制DNMT1的活性。天然产物乳酸A是一种高度取代的蒽醌，是DNMT127的有效DNA竞争性抑制剂。一些结构更简单的化合物，蒽醌核心上的一个或两个取代基，其中一个是大块芳香族取代基，也被证明以DNA竞争的方式抑制DNMT141。在这里，研究了三种取代的蒽醌或蒽醌样分子在Gla I偶联测定中抑制缺乏RFTS的DNMT1活性的能力，作为如何进行这些筛选测定的一个例子。这些化合物含有一到三个取代基，全部位于蒽醌核心的一侧（表1）。用于这些测定的底物浓度（10 nM DNA 和 10 μM SAM）比每种底物的 Km 高 ~5 倍。测定中产生的信号直接来自底物DNA。因此，很难在接近或低于Km的浓度下进行测定;根本没有足够的信号来检测。之所以选择这些底物浓度，是因为在没有抑制剂的情况下，在这些条件下可以看到稳定的活性（图6B）。其他底物浓度可用于筛选测定。例如，在饱和的SAM浓度下进行筛选可以用作偏倚SAM竞争性抑制剂的策略。
每个测定都包含发夹DNA底物，甲基供体辅因子SAM和潜在的抑制剂或DMSO作为筛选的对照。我们通常在DMSO中生成10 mM筛选化合物溶液，用于测定。诸如此处检查的蒽醌在水溶液中的溶解度较差。因此，为了产生浓缩的原液，DMSO用作溶剂。添加高达5%（v / v）终浓度的DMSO不会影响测定中的活性26。但是，在处理在水溶液中溶解度低的化合物时，应注意确保化合物在所选的最终筛选浓度下可溶。
对于在屏幕中检查的每个条件，执行含Gla I的对照测定。除了考虑底物发夹DNA的背景荧光和缓慢切割外，该对照还可以确定潜在的抑制剂是否干扰光谱信号（例如，它是荧光的）。通过加入酶启动反应后，在筛选数据中以53 s的时间间隔测量荧光30分钟。这是该实验室中读板器读取整个 96 孔板时可用的最快时间间隔。其他时间间隔可用于生成反应迹线。适当的时间间隔将取决于所使用的仪器和读取的孔数。为确保可重复性，每次测定一式三份进行。从存在缺乏RFTS的DNMT1下观察到的反应迹线中减去平均含Gla I的对照迹线。反应的初始速度可以通过拟合校正反应迹线的初始线性部分来确定。
最初，在20μM的终浓度下检查三种潜在抑制剂对荧光产生的影响。 选择更高浓度的潜在抑制剂进行筛选有两个原因。首先，测定中的底物浓度均高于其各自的Km 值。这使得在动力学测定中检测抑制变得更加困难，特别是如果抑制剂具有竞争力。其次，该筛选中使用的蒽醌样化合物在结构上明显比已知的抑制剂乳酸A简单得多。由于这些分子在核心结构周围仅包含少数取代基，我们预计相互作用较弱。在含DMSO的对照测定中，获得的初始速度为111±5 RFU/min（图7A）。请注意，这与之前在没有DMSO的情况下报告的比率非常相似，并证实添加少量DMSO不会影响观察到的活动。添加两种化合物降低了观察到的初始速度，而添加第三种化合物对活性没有影响。初始速度用于确定在每种化合物存在下观察到的活性百分比。在20μM下，添加化合物1和2导致~80%的活性百分比，而在化合物3存在下观察到100%的活性，表明该分子不抑制酶（表1）。
抑制剂有望表现出浓度依赖性抑制。接下来，在更高的50μM浓度下重新检查这些分子。对于这组测定，含DMSO的对照测定的初始速度为125±7 RFU / min（图7B）。该速度略高于先前确定的速率;但是，这些速度都在误差范围内相对接近。同样，化合物3对初始速度几乎没有影响，而添加化合物1和2降低了观察到的初始速度。正如预期的那样，在较高浓度下，化合物1对活性的影响更大。在50μM时，添加化合物1导致~60%的活性百分比（表1）。然而，加入更高浓度的化合物2并没有导致更强大的抑制作用。在存在50μM化合物2的情况下观察到的活性百分比再次接近80%。
从所提供的数据中可以看出，基于核酸内切酶偶联荧光的DNA甲基化测定可用于筛选潜在的DNMT抑制剂。数据表明化合物1和化合物2是潜在的抑制剂，而化合物3不是。需要更多的研究来验证潜在的抑制剂是真正的DNMT1抑制剂。
图 4：DNMT1 活动控制。 半甲基化双链DNA甲基化可防止Sau3A1切割。将缺乏RFTS的DNMT1添加到含有1μM DNA和500μM SAM的测定混合物中。在37°C孵育30分钟期间，在指定的时间点收集样品，用Sau3A1消化，并通过18%PAGE上的凝胶电泳分离。这里显示了 5、10、15 和 30 分钟的样品。第一条车道是缺少 DNMT1 的控制装置。缩写：DNMT1 = DNA 甲基转移酶 1;RFTS = 复制焦点靶向序列。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：基于荧光的测定对照。 依次将缺乏RFTS的DNMT1（10nM终浓度）和Gla I（0.8U）加入含有20nM发夹DNA底物和500μM SAM的三次重复测定中。单独添加DNMT1（蓝色圆圈）或缓冲液（红色圆圈）对背景荧光没有影响。在所有测定中加入Gla I会导致含有DNMT1的测定产生荧光，但在不含DNMT1的测定中则不会产生荧光。缩写：DNMT1 = DNA 甲基转移酶 1;RFTS = 复制焦点靶向序列;RFU = 相对荧光单位。 请点击此处查看此图的大图。
图6：荧光反应曲线。 一式三份测定含有 10 nM 发夹 DNA 底物和 10 μM SAM。（A）将缺乏RFTS的DNMT1（2 nM）和Gla I（0.8 U）添加到三个测定（蓝色）中，并且单独将Gla I（0.8 U）添加到三个测定（红色）中。仅在含有两种酶的测定中观察到稳定的荧光产生。（B）从DNMT1+Gla I反应迹图中减去平均Gla I反应迹线。显示了一式三份数据平均值的平均值和标准误差。拟合迹线的线性部分，初始速度为 113 ± 2 RFU/min。缩写：DNMT1 = DNA 甲基转移酶 1;RFTS = 复制焦点靶向序列;RFU = 相对荧光单位;SAM = S-腺苷蛋氨酸。 请点击此处查看此图的大图。
图7：存在潜在抑制剂时的DNA甲基化活性。 在DMSO（黑色）、化合物1（红色）、化合物2（蓝色）或化合物3（绿色）存在下检查缺乏RFTS的DNMT1的DNA甲基化活性。拟合20 μM化合物（A）和50 μM化合物（B）的校正反应迹线以确定初始速度。添加化合物1和2降低了观察到的速度，而化合物3对活性几乎没有影响。显示了一式三份测定的平均值和标准误差。缩写：DNMT1 = DNA 甲基转移酶 1;RFTS = 复制焦点靶向序列;RFU = 相对荧光单位;DMSO = 二甲基亚砜。 请点击此处查看此图的大图。
表1：在存在潜在小分子抑制剂的情况下观察到的初始速度和活性百分比。 通过将校正反应迹线的初始线性部分拟合到一条线上来确定初始速度;报告与拟合相关的错误。通过将化合物存在下确定的速率除以DMSO对照反应中确定的速率并乘以100来确定活性百分比;传播了相关错误。缩写：Cmpd = 化合物;DMSO = 二甲基亚砜;RFU = 相对荧光单位。 请按此下载此表格。
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Discussion
为了鉴定和表征DNA甲基转移酶的抑制剂，必须测量酶的活性。存在几种检查DNA甲基转移酶活性的方法。通常使用放射性监测活动;SAM标记甲基的转移可以定量为29，30，31，32，33，34。利用甲基敏感核酸内切酶的基于凝胶的测定也已被描述为35，36。这些测定通常是不连续的，需要多个步骤来检查活性。本文描述了一种核酸内切酶偶联的DNA甲基化测定，以筛选潜在的DNA甲基转移酶抑制剂。这种技术有几个优点。测定相对简单。它不需要分离技术（例如，电泳，过滤器结合）来获得信号。此外，该测定是连续的，允许实时收集数据。最近描述了甲基化活性的不同连续动力学测定39。然而，该测定需要三种偶联酶来产生光谱信号。此处描述的测定需要单个偶联酶。
这些DNMT活性测定是通过首先生成包含除酶以外的所有测定组分的测定溶液来进行的。检测溶液包含底物、发夹 DNA 和 SAM;0.1 mg/mL BSA也常规包含在测定中。由于测定中使用的DNA和DNMT1浓度极低（在纳摩尔范围内），BSA增加了一般蛋白质浓度，以帮助防止粘附在移液器吸头、管和微量滴定板上以及可能影响酶活性的环境损害。然后通过向测定溶液中添加酶来启动反应。在确定所有测定组分的最终浓度时，必须考虑这些稀释度。通过将 5 μL 酶溶液加入 95 μL 测定溶液中来引发反应。因此，测定溶液中DNA、SAM和BSA的浓度是所需最终浓度的1.05倍。例如，如果需要 10 nM DNA，则用 10.5 nM DNA 生成测定溶液。酶溶液中缺乏RFTS的DNMT1的浓度是所需最终浓度的20倍。在这里，在酶溶液中使用40nM RFTS缺乏的DNMT1，使得每次测定中DNMT1的最终浓度为2nM。
由于Gla I是一种市售酶，其数量以制造商提供的单位（U）给出。生成的酶溶液含有 0.16 U/μL Gla I，因此每个孔中总共加入 0.8 U 的 Gla I。为了节省试剂成本，制备少量适当的酶溶液，然后将这些溶液等分到锥形底部的96孔板中。使用多通道移液管，将 5 μL 酶溶液从锥形底板转移到黑色 96 孔半区域板中的测定溶液中。该过程允许同时启动一行测定。或者，使用不同的测定板设置，可以将酶溶液放入试剂储液器中，然后可以使用多通道移液管将酶添加到测定溶液中。然而，由于储层中的液体回收废物，这种方法将需要更大量的酶溶液。我们在96孔半面积板中进行测定;与传统的 96 孔板相比，这些板的孔尺寸较小，总检测体积 （100 μL） 更小，再次节省了试剂成本。
由于偶联核酸内切酶Gla I的特异性，这里描述的DNA甲基化测定需要半甲基化底物DNA。这使得该测定特别适合检查DNMT1的活性，因为该同工酶优先甲基化半甲基化的DNA1。DNMT3同工酶在非甲基化和半甲基化DNA1之间没有偏好。因此，该测定也可用于检查DNMT3同工酶的活性。事实上，已经使用该测定法评估了小分子对DNMT3a的抑制26，27，41。半甲基化底物DNA的要求意味着该测定不能用于检查底物特异性或非甲基化和半甲基化CpG位点之间的偏好。
该测定依赖于光谱信号：荧光团和淬灭剂分离时荧光的增加。因此，本身发出荧光或淬灭荧光的小分子会干扰测定。对每种测定条件进行含Gla I的对照的一个原因是检查这种可能性。小分子的光谱特性可以简单地通过使用Gla I控制数据来解释（例如，如果分子具有微弱的荧光信号）。但是，如果分子是强荧光或强淬灭剂，则该测定不能用于检测DNA甲基化活性。
此处描述的筛选是检测潜在DNMT抑制剂的初始测定。在初始筛选中“命中”的化合物必须在二级测定中验证，以确保它们是真正的DNMT抑制剂。由于该测定是偶联动力学测定，因此仅观察在特定小分子存在下荧光生成的减少并不一定意味着该化合物抑制甲基转移酶。能够抑制偶联酶Gla I的小分子也会导致观察到的荧光产生减少。简单的二次筛查涉及在存在和不存在潜在抑制剂的情况下确定Gla I的活性。对于该测定，使用完全甲基化的内部淬灭发夹DNA作为底物26，41。设计用于检查聚集依赖性抑制和 DNA 插层的其他测定也可以用作辅助测定，以进一步验证潜在的抑制剂26，41。在此提供的数据中，化合物1和化合物2被确定为潜在的DNMT1抑制剂。使用各种二级测定，化合物1已被验证为DNMT141的直接抑制剂。这项先前发表的研究表明，在蒽醌核心的C2位置含有大块取代基的化合物似乎是DNMT1的更有效抑制剂。然而，需要更多的研究来充分了解DNMT1抑制的结构决定因素。
此处描述的偶联测定具有多种潜在用途。该测定可用于稳态动力学实验。由于测定是连续的，因此确定初始速度非常简单。该测定以前已用于检查各种截短DNMT1蛋白的宏观动力学参数（即Km，Vmax和kcat）40。该测定已用于检查一小组分子的DNMT1抑制41，并通过检查其对DNMT3a活性的影响来评估已鉴定抑制剂的同工酶特异性26，27，41。该测定也已用于表征抑制剂。抑制性蛋白质结构域36，40和新型小分子27，41的抑制和效力（例如，Ki，IC50）的抑制机制已使用这种耦合动力学测定法确定。该测定也已适应用于HTS活动。在这种情况下，该测定进一步小型化为384孔格式，并用作初始筛选26的终点测定。因此，这里描述的基于荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化测定是一种通用的测定，可用于检查DNA甲基转移酶的活性，并允许鉴定和表征这些重要表观遗传修饰剂的小分子抑制剂。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者感谢巴克内尔大学和化学系对这项工作的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 3694 | |
| 96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates | ThermoFisher | 249570 | |
| Bovine Serum Albumin | NEB | B9000S | |
| compound 1 | ChemBridge | 5812086 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 2 | ChemBridge | 6722175 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 3 | ChemBridge | 5249376 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | methyl-sensitive endonuclease |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M0250 | |
| Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | custom synthesized | internally quenched hairpin DNA (substrate) |
| Potassium Glutamate | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | methyl-donating co-factor (substrate) |
| Tris Base | RPI | T60040 |
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