Summary
DNA-methyltransferaser er potentielle kræftlægemiddelmål. Her præsenteres en protokol til vurdering af små molekyler til DNA-methyltransferasehæmning. Dette assay anvender en endonuklease til at koble DNA-methylering til fluorescensgenerering og gør det muligt at overvåge enzymaktivitet i realtid.
Abstract
DNA-methylering, en form for epigenetisk genregulering, er vigtig for normal cellulær funktion. I celler etablerer og opretholder proteiner kaldet DNA-methyltransferaser (DNMT'er) DNA-methyleringsmønsteret. Ændringer i det normale DNA-methyleringsmønster er forbundet med kræftudvikling og progression, hvilket gør DNMT'er potentielle kræftlægemiddelmål. Således er identifikation og karakterisering af nye små molekylehæmmere af disse enzymer af stor betydning. Dette papir præsenterer en protokol, der kan bruges til at screene for DNA-methyltransferasehæmmere. Det kontinuerlige koblede kinetikassay gør det muligt at bestemme initialhastigheder af DNA-methylering i nærvær og fravær af potentielle små molekylehæmmere. Analysen bruger den methylfølsomme endonuklease Gla I til at koble methylering af et hemimethyleret DNA-substrat til fluorescensgenerering.
Dette kontinuerlige assay gør det muligt at overvåge enzymaktivitet i realtid. Gennemførelse af analysen i små mængder i mikrotiterplader reducerer omkostningerne ved reagenser. Ved hjælp af dette assay blev der udført en lille eksempelskærm for hæmmere af DNMT1, det mest rigelige DNMT-isozym hos mennesker. Det stærkt substituerede anthraquinon naturlige produkt, laccainsyre A, er en potent, DNA-konkurrencedygtig hæmmer af DNMT1. Her undersøger vi tre potentielle små molekylehæmmere - anthraquinoner eller anthraquinonlignende molekyler med en til tre substituenter - i to koncentrationer for at beskrive analyseprotokollen. Indledende hastigheder bruges til at beregne den procentvise aktivitet, der observeres i nærværelse af hvert molekyle. En af tre undersøgte forbindelser udviser koncentrationsafhængig hæmning af DNMT1-aktivitet, hvilket indikerer, at det er en potentiel hæmmer af DNMT1.
Introduction
DNA-methylering er et vigtigt epigenetisk mærke, der regulerer genekspression og kromatinstruktur. Methylering forekommer overvejende i CpG-dinukleotider - cytosin efterfulgt af guanosin; methylgruppen tilsættes til 5-positionen af cytosin. Korrekte DNA-methyleringsmønstre og dermed korrekt genekspression er nødvendige for passende cellulær udvikling og funktion. Mange sygdomstilstande har været forbundet med ændringer i det normale methyleringsmønster 1,2,3. For eksempel er der en sammenhæng mellem kræftinitiering og progression og ændringer i DNA-methyleringsmønsteret. Typisk udviser kræftceller lavere samlede niveauer af methylcytosin, hvilket bidrager til genom ustabilitet. Samtidig er methylcytosinet, der er til stede i genomet, koncentreret i promotorregionerne af tumorundertrykkende gener, hvilket fører til genhæmning af disse vigtige proteiner. Især er epigenetiske ændringer dynamiske og reversible, i modsætning til DNA-mutationerne forbundet med tumorigenese. Dette har gjort proteinerne involveret i epigenetisk genregulering interessante lægemiddelmål 2,4.
DNA-methyltransferaser (DNMT'er) er de proteiner, der er ansvarlige for at generere og opretholde DNA-methyleringsmønstre. Tre katalytisk aktive isozymer, DNMT1, DNMT3a og DNMT3b, findes hos mennesker. Under udvikling og differentiering etablerer de novo methyltransferaserne, DNMT3a og DNMT3b, methyleringsmønstre. Begge enzymer kan binde det katalytisk inaktive DNMT3L-protein til dannelse af komplekser, der udviser øget aktivitet 1,5. Efter celledeling indeholder datterceller hemimethyleret DNA - DNA indeholdende methylcytosin i kun en streng af duplexet - fordi det nyligt syntetiserede DNA er blottet for methyleringsmærker. DNMT1's vigtigste funktion er at methylere dette hemimethylerede DNA og dermed genetablere det fulde methyleringsmønster 1,5.
Forbindelser mellem DNMT-aktivitet og kræft er veletablerede. Overekspression af DNMT1, enten ved transkriptionelle eller posttranslationelle mekanismer, er en konsekvens af flere almindelige onkogene veje 6,7,8,9. Genetiske tilgange til lavere DNMT1-aktivitet ved hjælp af hypomorfe alleler resulterer i nedsat tumordannelse i Apc (Min) mus10. Antisense oligonukleotider, der knockdown DNMT1 hæmmer neoplasi i cellekultur og musetumormodeller11,12. Således virker hæmning af DNMT1-aktivitet som en lovende tilgang til kræftbehandling. De roller, som DNMT3 isozymer spiller, er dog ikke så ligetil. DNMT3a mutationer findes i akut myeloid leukæmi13 og myelodysplastisk syndrom14. Mindst en af de identificerede mutationer har vist sig at mindske DNA-methyleringsaktiviteten af enzymet15. DNMT3b er imidlertid overudtrykt i brystkræft16 og kolorektal cancer17. Da de forskellige DNMT-isozymer spiller forskellige roller i carcinogenese, vil identifikation af isozymespecifikke hæmmere være kritisk. Ikke alene vil disse forbindelser være nyttige til udvikling af terapi, men isozymspecifikke hæmmere ville også være et uvurderligt redskab til at dissekere hver DNMT-isozyms rolle i kræftetiologi.
Flere DNMT-hæmmere er blevet rapporteret i litteraturen. Kendte DNMT-hæmmere kan opdeles i to klasser: nukleosid og ikke-nukleosid. Nukleosidhæmmere er typisk cytidinanaloger. Disse forbindelser er inkorporeret i DNA og kovalent fælde DNMT'er. 5-azacytidin og 5-aza-2'-deoxycytidin er blevet godkendt til behandling af myelodysplastisk syndrom og akut myeloid leukæmi 4,18. Den høje toksicitet, lave biotilgængelighed og kemisk ustabilitet af disse forbindelser udgør problemer. Igangværende arbejde undersøger effektiviteten af den næste generation af nukleosidhæmmere; SGI-110, afledt af 5-aza-2'-deoxycytidin, er et eksempel 19,20. Nukleosidhæmmere er ikke isozymespecifikke og vil inaktivere ethvert DNMT-isozym, der opstår. Derfor resulterer behandling med et nukleosid-demethyleringsmiddel i udtømning af alle DNMT-isozymer 4,18. Ikke-nukleosidhæmmere behøver ikke at blive inkorporeret i DNA for at udøve deres hæmmende virkninger. I stedet binder disse molekyler direkte til DNMT'er, hvilket introducerer muligheden for isozymspecifik hæmning. Flere ikke-nukleosidhæmmere er blevet opdaget til dato, herunder SGI-102721, hydralazin 22, procainamid 23, RG108 og derivater 24 og naturlige produkter, (-)-epigallocatechin 3-gallat (EGCG)25 og laccainsyre A 26,27. De fleste af de ikke-nukleosidhæmmere, der er opdaget til dato, er ikke isozymeselektive eller viser svage præferencer for et DNMT-isozym. Derudover skal styrken af disse molekyler forbedres, især i celler 4,18. Der er således behov for at opdage eller udvikle mere potente, isozymeselektive DNMT-hæmmere.
En hindring for at opdage nye små molekylehæmmere af DNMT'er er de besværlige assays, der traditionelt bruges til at undersøge DNMT-aktivitet28. Assays er normalt diskontinuerlige med flere trin. Den enzymatiske aktivitet af DNMT'er analyseres stadig rutinemæssigt ved anvendelse af radioaktivt S-adenosylmethionin (SAM)29,30,31,32,33,34. Ikke-radioaktive assays til DNA-methylering er også blevet udviklet. For eksempel er assays, der anvender methylfølsomme begrænsningsendonukleaser og elektroforese til at adskille fordøjelsesprodukterne, blevet beskrevet35,36. Disse typer diskontinuerlige, multistep assays er ikke let modtagelige for lægemiddelopdagelse. Siden midten af 2000'erne er der udviklet flere DNA-methyleringsassays med en højere gennemstrømning28. Et scintillationsnærhedsassay blev brugt til at screene for DNMT1-hæmmere37. Et andet assay ved hjælp af en methylfølsom restriktionsendonuklease blev brugt til at screene for DNMT3a-hæmmere25,38. Mens begge assays tillod højere gennemstrømning end traditionelle DNA-methyleringsassays, kræver assays flere trin og tillader ikke observation af methyleringsaktivitet i realtid. For nylig er der beskrevet et kontinuerligt kinetikassay, der kobler dannelsen af S-adenosylhomocystein (SAH), et produkt af methyleringsreaktionen, til den spektroskopiske ændring ved 340 nm forbundet med NADPH-oxidation39. Dette assay bruger tre koblingsenzymer til at generere et spektroskopisk signal.
Vi udviklede et fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay, der anvender et enkelt kommercielt tilgængeligt koblingsenzym og kan generere data i realtid (figur 1). Et hårnål oligonukleotid indeholdende tre methylcytosiner anvendes som substrat. Substrat-DNA'et indeholder en fluorophore i 5'-enden og en slukker i 3'-enden. Methylering af det hemimethylerede CpG-sted genererer spaltningsstedet for endonuklease Gla I - fuldt methyleret GCGC. Gla I-spaltning af produktet oligonukleotid frigiver fluoroforen fra slukningsenheden og genererer fluorescens i realtid. Analysen kan bruges til at undersøge aktiviteten af enhver isoform af DNMT; der observeres dog højere aktivitet med DNMT1, da dette isozyme fortrinsvis methylerer hemimethyleret DNA 1,5. Endnu mere robust aktivitet observeres, hvis det autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) domæne fjernes fra DNMT1. Dette domæne, der findes i den N-terminale regulatoriske region, binder til det katalytiske sted og forhindrer DNA-binding. Fjernelse af de første ~600 aminosyrer resulterer i et afkortet enzym, der er signifikant mere aktivt end enzymet i fuld længde (~640 gange stigning i kkat/Km)40. Denne aktiverede form af enzymet, kaldet RFTS-manglende DNMT1 (aminosyrer 621–1616), giver mulighed for lettere identifikation af hæmmere på grund af dets øgede katalytiske kraft. Dette papir præsenterer en protokol til at bruge RFTS-manglende DNMT1 i assays til at screene for potentielle små molekylehæmmere. Ved anvendelse af det endonukleasekoblede kontinuerlige assay bestemmes starthastigheden i nærvær og fravær af nogle få små molekyler. Hver potentiel hæmmer undersøges ved to koncentrationer for at se efter koncentrationsafhængig DNMT1-hæmning. Den procentvise aktivitet, der blev observeret i nærværelse af de små molekyler, blev beregnet i hvert enkelt tilfælde.
Figur 1: DNA-methyleringsassay. Et hemimethyleret hårnål-DNA med en fluorophore i 5'-enden og en quencher i 3'-enden bruges som substrat. DNMT1 katalyserer overførslen af methylgruppen fra S-adenosylmethionin til det ikke-methylerede CpG-sted og genererer S-adenosylhomocystein og fuldt methyleret DNA. DNA-produktet indeholder spaltningsstedet for endonuklease Gla I, som spalter fuldt methylerede GCGC-steder. Spaltning af produkt-DNA'et frigiver 5'-fluoroforen fra 3'-slukningsenheden og genererer fluorescens. Forkortelser: Fl = fluorophore; Q = quencher; DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionin; SAH = S-adenosylhomocystein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered analyseløsninger til skærmen
BEMÆRK: Koncentrationerne af substrater, der anvendes i dette assay, kan tilpasses. For RFTS-manglende DNMT1 er de eksperimentelt bestemte Km-værdier for hårnålens DNA-substrat og SAM 1-2 nM og 2 μM, henholdsvis26,40.
- Der fremstilles 600 μL af hver analysetilstand, der testes i mikrocentrifugerør på is.
BEMÆRK: Den samlede mængde analyseopløsning, der kræves, afhænger af antallet af replikater, der udføres. Hver analysebetingelse blev kørt i tre eksemplarer for denne protokol.- Tilsæt ddH2O og 5x methyleringsbuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamat, 5 mM dithiothreitol (DTT), 25% glycerol) til hvert rør for at opnå en endelig koncentration på 1x buffer. For assays indeholdende 20 μM forbindelse tilsættes 472 μL ddH2O og 120 μL 5x buffer. For assays indeholdende 50 μM forbindelse tilsættes 470 μL ddH2O og 120 μL 5x buffer.
- Der tilsættes 3,15 μL 20 mg/ml bovin serumalbumin (BSA) til hver prøve.
- Der tilsættes 2 μL 3,15 μM hårnåls-DNA-substrat og 1,33 μL 4,75 mM SAM til hver prøve.
BEMÆRK: Koncentrationen af substrater i assayopløsningsblandingen er 1,05x de ønskede slutkoncentrationer. - Der tilsættes inhibitor til en slutkoncentration på 21 μM (1,26 μL af 10 mM) eller 52,5 μM (3,15 μL af 10 mM) til de relevante prøver. Der tilsættes en tilsvarende mængde dimethylsulfoxid (DMSO) til en kontrolprøve.
BEMÆRK: Koncentrationen af inhibitor, der anvendes i skærmen, kan varieres. Den maksimale endelige DMSO-koncentration bør være ≤5% (v/v). DMSO-koncentrationer på op til 5 % (v/v) har ingen effekt på den aktivitet, der er observeret i assay26.
- Bland opløsningerne ved hvirvlning (3.000 o / min) i 3 s. Prøverne omdannes i et par sekunder i en minicentrifuge på bordpladen (1.200 × g) for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret.
- Aliquot 95 μL af hver analyseopløsning i 6 på hinanden følgende brønde i en sort halvområde 96-brøndplade (figur 2).
BEMÆRK: Disse screeningsanalyser blev udført i to batcher. Først blev 20 μM hæmmerprøver (4 betingelser i alt) undersøgt, efterfulgt af 50 μM hæmmerprøver (4 betingelser i alt).
Figur 2: Opsætning af analyseplade. Hver analyseopløsning aliciteres i seks brønde i den sorte 96-brøndsplade: DMSO-kontrol (blå), forbindelse 1 (grøn), forbindelse 2 (rød) og forbindelse 3 (gul). Både RFTS-manglende DNMT1 og Gla I vil blive tilføjet til tre brønde. Som en kontrol vil Gla I alene blive tilføjet til de tre andre brønde. Forkortelser: RFTS = replikation foci målretningssekvens; DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Forbered enzymopløsninger til skærmen
BEMÆRK: RFTS-manglende DNMT1 kan udtrykkes i E. coli og renses til homogenitet. Ekspressions- og rensningsprocedurer for RFTS-manglende DNMT1 er beskrevet tidligere41. Den nødvendige mængde enzym afhænger af antallet af analyser, der udføres. Her udføres fire forskellige analyser i hvert sæt; Hvert assay er afsluttet i tre eksemplarer.
- Der fremstilles 75 μL af hver enzymopløsning i mikrocentrifugerør på is.
BEMÆRK: Der er behov for to enzymopløsninger. En løsning vil indeholde DNMT1 og Gla I; den anden vil kun indeholde Gla I.- Tilsæt ddH2 O og 5x methyleringsbuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamat, 5 mM DTT, 25% glycerol) til hvert rør for at opnå en endelig koncentration på 1x buffer. Til Gla I-enzymopløsningen tilsættes 15 μL 5x buffer og 58,8 μL ddH2O. Til DNMT1+Gla I-enzymopløsningen tilsættes 15 μL 5x buffer og 58,2 μL ddH2O.
- Der tilsættes 1,2 μL 10 U/μL Gla I til hver opløsning for en slutkoncentration på 0,16 E/μL.
- Der tilsættes 0,6 μL 5 μM RFTS-manglende DNMT1 for en endelig koncentration på 40 nM til DNMT1+Gla I-opløsningen.
- Tryk forsigtigt for at blande opløsningerne. Prøverne omdannes i et par sekunder i en minicentrifuge på bordpladen (1.200 × g) for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret.
- Aliquot 12 μL af hver enzymopløsning i 6 brønde i en koniskbundet 96-brøndplade (figur 3).
Figur 3: Opsætning af enzymplade. Gla I (grå) og DNMT1+Gla I (blå) opløsningerne er hver især aliquoted i seks brønde i 96-brøndspladen. Ved hjælp af en flerkanalspipet kan enzymet tilsættes til en række analyseopløsninger samtidigt. For hver analysetilstand (seks brønde) modtager tre brønde DNMT1 + Gla I, og tre brønde modtager Gla I alene. Forkortelse: DNMT1 = DNA-methyltransferase 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Kør analysen og analyser dataene.
- Forvarm pladelæseren til 37 °C. Indsæt den sorte plade, der indeholder analyseopløsningerne. Ryst pladen (dobbelt orbital ved 425 cpm i 5 s) og læs fluorescensen med en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 528 nm. Pladen inkuberes ved 37 °C i 5 min.
BEMÆRK: Alternativt kan filtre med korrekte bølgelængdeafskæringer bruges til fluorescensaflæsningerne. - Fjern analysepladen. Der tilsættes 5 μL enzymopløsning til hver brønd og blandes ved pipettering op og ned.
BEMÆRK: Brug multikanalpipetter, så en række prøver kan startes samtidigt. - Indsæt pladen i pladelæseren. Optag fluorescens hver 53 s i 30 min. Ryst pladen (dobbelt orbital ved 425 cpm i 4 s) før hver aflæsning.
- Gennemsnitlig tredobbelt Gla I kontrol assays for hver tilstand. Træk det gennemsnitlige Gla I-holdige kontrolreaktionsspor fra de tredobbelte spor opnået i nærværelse af RFTS-manglende DNMT1. Bestem gennemsnits- og standardfejlen for middelværdien for de korrigerede replikater.
- Afbild det gennemsnitlige korrigerede reaktionsspor, og tilpas den indledende lineære del til en linje for at bestemme starthastigheden.
- Den procentvise aktivitet bestemmes ved at dividere den observerede hastighed i nærværelse af en forbindelse med hastigheden observeret i den DMSO-holdige kontrolreaktion og multiplicere med 100.
4. Yderligere analysekontrol — sekventiel tilsætning af enzymer
- Der fremstilles 550 μL analyseopløsning i et mikrocentrifugerør på is. Der tilsættes 110 μL 5x methyleringsbuffer, 3,88 μL 3,15 μM hårnåls-DNA-substrat, 6,43 μL 47,5 mM SAM, 3,06 μL 20 mg/ml BSA og 426,6 μL ddH2O.
- Opløsningen blandes ved hvirveldannelse (3.000 omdr./min.) i 3 s. Centrifugering af prøverne i et par sekunder i en minicentrifuge på bordpladen (1.200 × g) for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret.
- Aliquot 90 μL af analyseopløsningen i 6 på hinanden følgende brønde i en sort halvområde 96-brøndplade.
- Forbered DNMT1-enzymopløsningerne på is. Der tilsættes 4 μL 5x methyleringsbuffer, 0,76 μL 5 μM RFTS-manglende DNMT1 og 15,24 μL ddH2Otil et rør. Der tilsættes 4 μL 5x methyleringsbuffer og 16 μL ddH2O, til etandet rør.
- Tryk forsigtigt for at blande opløsningerne. Centrifugering af prøverne i et par sekunder i en minicentrifuge på bordpladen (1.200 × g) for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret.
- Der tilsættes 5 μL af den DNMT1-holdige opløsning til tre brønde i den sorte halvområde 96-brøndplade. Der tilsættes 5 μL bufferkontrolopløsning til de tre andre brønde.
- Mikrotiterpladen anbringes i pladelæseren, der er forvarmet til 37 °C. Ryst pladen (dobbelt orbital ved 425 cpm i 3 s) og læs fluorescensen med en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 528 nm. Gentag rystelserne og læs hver 60 sek. i 30 min.
- Mens analysepladen er i pladelæseren, skal du forberede Gla I-opløsningen på is. Der tilsættes 8 μL 5x methyleringsbuffer, 0,64 μL 10 U/μL Gla I og 31,4 μL ddH2Otil et mikrocentrifugerør. Tryk forsigtigt for at blande opløsningen. Prøven omdannes i et par sekunder i en minicentrifuge på bordpladen (1.200 × g) for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret.
- Aliquot 6 μL af Gla I-opløsningen i 6 brønde i en koniskbundet 96-brøndplade.
- Efter den første 30 minutters læsning skal du fjerne den sorte plade fra pladelæseren. Der tilsættes 5 μL Gla I-opløsning til alle 6 boringer og blandes ved at pipettere op og ned.
BEMÆRK: Brug en multikanals pipet, så alle brønde kan startes samtidigt. - Placer den sorte plade tilbage i pladelæseren. Optag fluorescens hver 35. sek. i 35 min. Ryst pladen (dobbelt orbital ved 425 cpm i 3 s) før hver aflæsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aktiv DNMT1 er en forudsætning for denne analyse. RFTS-manglende DNMT1 blev udtrykt i E.coli og oprenset til homogenitet efter tidligere offentliggjorte procedurer41. For at sikre, at det oprensede enzym var aktivt, blev et diskontinuerligt endonukleasekoblet assay brugt til at undersøge DNA-methyleringsaktivitet36. Dette assay anvender et 32 basepar duplex DNA med en enkelt hemimethyleret CpG placeret i et Sau3A1 spaltningssted. Sau3A1 kan spalte det hemimethylerede substrat-DNA; spaltning blokeres dog, når DNA'et er fuldt methyleret. RFTS-manglende DNMT1 blev tilsat til assays indeholdende 1 μM DNA og 0,5 mM SAM, og aliquoter blev fjernet og flash-frosset over 30 min. Prøver blev efterfølgende fordøjet med Sau3A1, og produkterne blev adskilt ved gelelektroforese. Som vist i figur 4 er DNA'et beskyttet mod spaltning, når reaktionstiden øges, hvilket indikerer, at RFTS-manglende DNMT1 methylerer det hemimethylerede DNA. Det meste af det 1 μM substrat-DNA, der oprindeligt var til stede i analysen, er blevet omdannet til produkt i løbet af 30-minutters tidsforløbet.
Det endonukleasekoblede assay beskrevet i dette papir tillader observation af DNA-methyleringsaktivitet i realtid som en stigning i fluorescens. Nøglen til succesen med dette assay er methylfølsomheden af endonuklease Gla I. Gla I spalter ikke effektivt det hemimethylerede substrat-DNA, men spalter det fuldt methylerede produkt-DNA (figur 1). Spaltning af hårnålens DNA er nødvendig for at frigive fluoroforen fra slukningen og generere en stigning i fluorescens. For at demonstrere, at enzymerne virker som forventet, blev der udført en kontrolreaktion, hvor enzymerne, RFTS-manglende DNMT1 og Gla I, blev tilsat sekventielt snarere end samtidigt. Hvis det koblede assay fungerer korrekt, bør tilsætningen af DNMT1 ikke påvirke fluorescens, da methylering af DNA-substratet ikke forventes at påvirke baggrundsfluorescensen af det internt slukkede hårnål-DNA. Efterfølgende tilsætning af Gla I til assays, der indeholdt methyltransferasen, bør imidlertid resultere i fluorescensgenerering på grund af spaltning af det fuldt methylerede hårnål-DNA. Selve det hemimethylerede hårnål-DNA-substrat har baggrundsfluorescens (figur 5); disse assays indeholdt 20 nM hårnål DNA og 500 μM SAM. RFTS-manglende DNMT1 eller buffer blev tilsat til assays, og fluorescens blev fulgt i 30 min.
Som det ses i figur 5, er fluorescensen upåvirket af RFTS-manglende DNMT1 i fravær af koblingsenzymet (blå nuancer indeholdt 10 nM RFTS-manglende DNMT1, mens røde nuancer er bufferkontrollen). Således ændrer methylering af det hemimethylerede CpG-sted af DNMT1 ikke fluorescenssignalet væsentligt. Men da Gla I blev føjet til alle brønde, blev robust fluorescensgenerering kun observeret i de assays, der indeholdt RFTS-manglende DNMT1 (figur 5). Dette viser, at methylering af det hemimethylerede substrat-DNA ved DNMT1 er påkrævet for Gla I-spaltning og generering af fluorescens. Det skal bemærkes, at stigningen i fluorescens observeret i dette kontrolassay afspejler aktiviteten af Gla I, da enzymerne blev tilsat sekventielt. Alternativt kunne disse reaktionsblandinger fordøjes med Gla I, og de resulterende oligonukleotider kunne adskilles ved elektroforese for at visualisere spaltning og sikre, at enzymerne fungerer som forventet.
For at bruge dette koblede assay til direkte at bestemme de indledende hastigheder af DNMT1, skal begge enzymer, RFTS-manglende DNMT1 og Gla I, tilsættes samtidigt. Så længe hastigheden af Gla I-spaltning af produkt-DNA'et er hurtigere end hastigheden af DNA-methylering af DNMT1, vil det genererede fluorescenssignal afspejle DNA-methyleringsaktivitet. For at sikre, at DNMT1-aktiviteten er hastighedsbegrænsende, kan koncentrationen af DNMT1 varieres, mens alle andre analysebetingelser holdes konstante. Fluorescenshastigheden bør være proportional med koncentrationen af DNMT1. Dette er tidligere blevet vist for RFTS-manglende DNMT1 under de betingelser, der anvendes her40. Ved anvendelse af dette koblede assay til at undersøge DNMT-aktivitet udføres en Gla I-indeholdende kontrolreaktion ud over reaktionen, der indeholder både DNMT1 og Gla I (figur 6A). Gla I-kontrollen har flere funktioner. Fradrag af Gla I-kontrolreaktionssporet fra det DNMT-holdige reaktionsspor gør det muligt at beregne både langsom spaltning af det hemimethylerede DNA-substrat og baggrundsfluorescensen. De korrigerede reaktionsspor, der genereres, afspejler DNA-methyleringsaktiviteten af DNMT1. Montering af den indledende lineære del af det korrigerede reaktionsspor gør det muligt at bestemme starthastigheden (figur 6B). Med 10 nM hårnål DNA-substrat og 10 μM SAM blev der opnået en starthastighed på 113 ± 2 RFU / min.
Substituerede anthraquinoner har tidligere vist sig at hæmme aktiviteten af DNMT1. Det naturlige produkt, laccainsyre A, en stærkt substitueret anthraquinon, er en potent, DNA-konkurrencedygtig hæmmer af DNMT127. Et par forbindelser med enklere strukturer, en eller to substituenter på anthraquinonkernen, hvor den ene er en omfangsrig aromatisk substituent, har også vist sig at hæmme DNMT1 på en DNA-konkurrencedygtig måde41. Her blev tre substituerede anthraquinoner eller anthraquinonlignende molekylers evne til at hæmme RFTS-manglende DNMT1-aktivitet i Gla I-koblet assay undersøgt som et eksempel på, hvordan man udfører disse screeningsassays. Disse forbindelser indeholdt en til tre substituenter, alle på den ene side af anthraquinonkernen (tabel 1). Substratkoncentrationerne (10 nM DNA og 10 μM SAM), der anvendes til disse assays, er ~ 5x højere end Km for hvert substrat. Signalet, der genereres i analysen, kommer direkte fra substrat-DNA'et. På grund af dette er det vanskeligt at analysere ved koncentrationer nær eller under Km; der er simpelthen ikke nok signal til at opdage. Disse substratkoncentrationer blev valgt, fordi der under disse betingelser ses robust aktivitet uden hæmmere (figur 6B). Andre substratkoncentrationer kan anvendes i screeningsassays. For eksempel kan udførelse af en skærm ved mættende SAM-koncentrationer bruges som en strategi til at skævvride søgningen mod SAM-konkurrencedygtige hæmmere.
Hvert assay indeholdt hårnålens DNA-substrat, den methyldonerende co-faktor SAM og en potentiel hæmmer eller DMSO som en kontrol til skærmen. Vi genererer rutinemæssigt 10 mM opløsninger af screeningsforbindelser i DMSO til brug i assays. Antraquinoner som dem, der undersøges her, udviser dårlig opløselighed i vandige opløsninger. For at generere koncentrerede lagre anvendes DMSO således som opløsningsmiddel. Tilsætningen af DMSO op til 5% (v/v) endelig koncentration påvirker ikke aktiviteten i assay26. Når forbindelser med lav opløselighed i vandig opløsning behandles, skal det dog sikres, at forbindelsen er opløselig ved den eller de valgte endelige screeningskoncentrationer.
For hver tilstand, der undersøges på skærmen, udføres et Gla I-indeholdende kontrolassay. Ud over at tage højde for baggrundsfluorescens og langsom spaltning af substrathårnålens DNA tillader denne kontrol bestemmelse af, om den potentielle hæmmer interfererer med det spektroskopiske signal (f.eks. Er det fluorescerende). Efter initiering af reaktionen ved tilsætning af enzymer blev fluorescens målt i 30 minutter med et tidsinterval på 53 s i screeningsdataene. Dette er det hurtigste tidsinterval, der er tilgængeligt på pladelæseren i dette laboratorium, når du læser en hel 96-brøndplade. Andre tidsintervaller kan bruges til at generere reaktionssporene. Et passende tidsinterval afhænger af det instrument, der bruges, og antallet af brønde, der læses. For at sikre reproducerbarhed udføres hvert assay i tre eksemplarer. Det gennemsnitlige Gla I-holdige kontrolspor trækkes fra de reaktionsspor, der observeres i nærværelse af RFTS-manglende DNMT1. Reaktionens starthastighed kan bestemmes ved at montere den indledende lineære del af de korrigerede reaktionsspor.
Oprindeligt blev virkningen af tre potentielle hæmmere på fluorescensgenerering undersøgt ved en endelig koncentration på 20 μM. Højere koncentrationer af de potentielle hæmmere blev valgt til screening af to grunde. For det første er substratkoncentrationerne i analysen begge over deres respektive Km-værdier . Dette kan gøre det vanskeligere at opdage hæmning i kinetiske assays, især hvis hæmmerne er konkurrencedygtige. For det andet er de anthraquinonlignende forbindelser, der anvendes i denne skærm, signifikant enklere i struktur end den kendte hæmmer, laccainsyre A. Da disse molekyler kun indeholder nogle få substituenter omkring kernestrukturen, forventede vi svagere interaktioner. I det DMSO-holdige kontrolassay blev der opnået en starthastighed på 111 ± 5 RFU/min (figur 7A). Bemærk, at dette er meget lig den sats, der blev rapporteret tidligere i fravær af DMSO, og bekræfter, at tilføjelsen af lave mængder DMSO ikke påvirker den observerede aktivitet. Tilsætningen af to forbindelser reducerede den observerede starthastighed, mens tilsætningen af den tredje forbindelse ikke havde nogen effekt på aktiviteten. De indledende hastigheder blev brugt til at bestemme den procentvise aktivitet, der blev observeret i nærværelse af hver forbindelse. Ved 20 μM resulterede tilsætningen af forbindelser 1 og 2 i en procentvis aktivitet på ~ 80%, mens 100% procent aktivitet blev observeret i nærvær af forbindelse 3, hvilket indikerer, at dette molekyle ikke hæmmer enzymet (tabel 1).
Hæmmere forventes at udvise koncentrationsafhængig hæmning. Dernæst blev disse molekyler undersøgt igen i en endnu højere koncentration på 50 μM. For dette sæt assays havde det DMSO-holdige kontrolassay en starthastighed på 125 ± 7 RFU / min (figur 7B). Denne hastighed er lidt højere end de tidligere fastsatte satser; Disse hastigheder er dog alle relativt tæt på fejl. Igen havde forbindelse 3 ringe effekt på starthastigheden, mens tilsætningen af forbindelse 1 og 2 reducerede den observerede starthastighed. Som forventet havde forbindelse 1 ved den højere koncentration en større indvirkning på aktiviteten. Ved 50 μM resulterede tilsætningen af forbindelse 1 i en procentvis aktivitet på ~ 60% (tabel 1). Tilsætningen af en højere koncentration af forbindelse 2 resulterede imidlertid ikke i mere robust hæmning. Den procentvise aktivitet, der blev observeret i nærværelse af 50 μM forbindelse 2, var igen nær 80%.
Som det fremgår af de præsenterede data, kan det endonukleasekoblede fluorescensbaserede DNA-methyleringsassay bruges til at screene for potentielle DNMT-hæmmere. Dataene indikerer, at forbindelse 1 og forbindelse 2 er potentielle hæmmere, mens forbindelse 3 ikke er. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at validere de potentielle hæmmere som ægte DNMT1-hæmmere.
Figur 4: DNMT1 aktivitetskontrol. Hemimethyleret duplex-DNA-methylering beskytter mod Sau3A1-spaltning. RFTS-manglende DNMT1 blev tilsat til analyseblandinger indeholdende 1 μM DNA og 500 μM SAM. Prøver blev indsamlet på de angivne tidspunkter under en 30-minutters inkubation ved 37 ° C, fordøjet med Sau3A1 og løst ved gelelektroforese på 18% PAGE. Her vises 5, 10, 15 og 30 minutters prøver. Den første bane er en kontrol, der mangler DNMT1. Forkortelser: DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; RFTS = Replikering Foci målretningssekvens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fluorescensbaseret analysekontrol. RFTS-manglende DNMT1 (10 nM endelig koncentration) og Gla I (0,8 U) blev tilføjet sekventielt til tredobbelte assays indeholdende 20 nM hårnål DNA-substrat og 500 μM SAM. Tilsætning af DNMT1 (blå cirkler) eller buffer (røde cirkler) alene havde ingen effekt på baggrundsfluorescens. Tilsætning af Gla I til alle assays resulterer i fluorescensgenerering i assays, der indeholdt DNMT1, men ikke i assays, der ikke gør det. Forkortelser: DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; RFTS = replikering Foci målretning sekvens; RFU = relative fluorescensenheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Spor af fluorescensreaktion. Tredobbelte assays indeholdt 10 nM hårnål DNA-substrat og 10 μM SAM. (A) RFTS-manglende DNMT1 (2 nM) og Gla I (0,8 U) blev tilføjet til tre assays (blå), og Gla I (0,8 U) alene blev tilføjet til tre assays (rød). Robust fluorescensgenerering observeres kun i de assays, der indeholder begge enzymer. (B) Det gennemsnitlige Gla I-reaktionsspor blev trukket fra DNMT1+Gla I-reaktionssporene. Den gennemsnitlige fejl og standardfejlen for gennemsnittet af de tredobbelte data vises. Montering af den lineære del af sporet giver en starthastighed på 113 ± 2 RFU / min. Forkortelser: DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; RFTS = replikering Foci målretning sekvens; RFU = relative fluorescensenheder; SAM = S-adenosylmethionin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: DNA-methyleringsaktivitet i nærvær af potentielle hæmmere. DNA-methyleringsaktivitet af RFTS-manglende DNMT1 blev undersøgt i nærværelse af DMSO (sort), forbindelse 1 (rød), forbindelse 2 (blå) eller forbindelse 3 (grøn). Korrigerede reaktionsspor ved 20 μM forbindelse (A) og 50 μM forbindelse (B) var egnede til at bestemme starthastigheden. Tilsætning af forbindelse 1 og 2 reducerede den observerede hastighed, mens forbindelse 3 havde ringe indvirkning på aktiviteten. Gennemsnits- og standardfejl for middelværdien for de tredobbelte assays vises. Forkortelser: DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; RFTS = replikering Foci målretning sekvens; RFU = relative fluorescensenheder; DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Indledende hastigheder og procentvise aktiviteter observeret i nærvær af potentielle små molekylehæmmere. Initial hastighed blev bestemt ved at tilpasse den indledende lineære del af korrigerede reaktionsspor til en linje; Fejlen i forbindelse med tilpasningen rapporteres. Procentaktivitet blev bestemt ved at dividere hastigheden bestemt i nærvær af forbindelse med den hastighed, der blev bestemt i DMSO-kontrolreaktionen og multiplicere med 100; tilhørende fejl blev udbredt. Forkortelser: Cmpd = forbindelse; DMSO = dimethylsulfoxid; RFU = relative fluorescensenheder. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at identificere og karakterisere hæmmere af DNA-methyltransferaser skal enzymets aktivitet måles. Der findes flere metoder til undersøgelse af DNA-methyltransferaseaktivitet. Aktivitet overvåges almindeligvis ved hjælp af radioaktivitet; overførsel af den mærkede methylgruppe af SAM kan kvantificeres 29,30,31,32,33,34. Gelbaserede assays, der anvender methylfølsomme endonukleaser, er også beskrevet35,36. Disse assays er normalt diskontinuerlige og kræver flere trin for at undersøge aktiviteten. Her beskrives et endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay for at screene for potentielle DNA-methyltransferasehæmmere. Denne teknik har flere fordele. Analysen er relativt enkel. Det kræver ikke separationsteknikker (f.eks. elektroforese, filterbinding) for at opnå et signal. Derudover er analysen kontinuerlig, hvilket gør det muligt at indsamle data i realtid. Et andet kontinuerligt kinetikassay for methyleringsaktivitet blev for nylig beskrevet39. Dette assay kræver imidlertid tre koblingsenzymer for at generere et spektroskopisk signal. Det her beskrevne assay kræver et enkelt koblingsenzym.
Disse DNMT-aktivitetsassays udføres ved først at generere en analyseopløsning, der indeholder alle analysekomponenterne undtagen enzymerne. Analyseopløsningerne indeholder substraterne, hårnåle-DNA og SAM; 0,1 mg / ml BSA er også rutinemæssigt inkluderet i assays. Med de ekstremt lave koncentrationer (i nanomolært område) af DNA og DNMT1, der anvendes i analysen, øger BSA den generelle proteinkoncentration for at forhindre vedhæftning til pipetspidser, rør og mikrotiterplader og miljømæssige fornærmelser, der kan påvirke enzymaktiviteten. Reaktionen initieres derefter ved at tilsætte enzymer til analyseopløsningerne. Der skal tages hensyn til disse fortyndinger ved bestemmelse af de endelige koncentrationer af alle analysekomponenter. Reaktioner initieres ved at tilsætte 5 μL enzymopløsning til 95 μL analyseopløsning. Derfor er koncentrationerne af DNA, SAM og BSA i analyseopløsningerne 1,05x den ønskede endelige koncentration. For eksempel, hvis 10 nM DNA ønskes, genereres analyseopløsninger med 10, 5 nM DNA. Koncentrationen af RFTS-manglende DNMT1 i enzymopløsningen er 20x den ønskede endelige koncentration. Her blev 40 nM RFTS-manglende DNMT1 anvendt i enzymopløsningen, således at den endelige koncentration af DNMT1 i hvert assay var 2 nM.
Da Gla I er et kommercielt tilgængeligt enzym, er mængden angivet i enheder (U) som leveret af producenten. De genererede enzymopløsninger indeholder 0,16 U/μL Gla I, således at der tilsættes i alt 0,8 U Gla I til hver brønd. For at spare på reagensomkostningerne fremstilles små mængder af de passende enzymopløsninger, og disse opløsninger aliciteres derefter i koniskbundede 96-brøndsplader. Ved hjælp af flerkanalspipetter overføres 5 μL enzymopløsninger fra den koniskbundede plade til analyseopløsningerne i den sorte 96-brønds halvområdeplade. Denne proces gør det muligt at starte en række assays samtidigt. Alternativt kunne enzymopløsninger med en anden analysepladeopsætning placeres i reagensreservoirer, og derefter kunne multikanalpipetter bruges til at tilføje enzym til analyseopløsningerne. Denne tilgang vil imidlertid kræve større mængder enzymopløsning på grund af væskegenvindingsaffald i reservoirerne. Vi udfører analyserne i 96-brønd halvområdeplader; den mindre brøndstørrelse i disse plader giver mulighed for et mindre samlet analysevolumen (100 μL) end traditionelle 96-brøndsplader, hvilket igen sparer reagensomkostninger.
DNA-methyleringsassayet, der er beskrevet her, kræver et hemimethyleret substrat-DNA på grund af specificiteten af koblingsendonuklease Gla I. Dette gør analysen særlig god til at undersøge aktiviteten af DNMT1, da dette isozyme fortrinsvis methylerer hemimethyleret DNA1. DNMT3-isozymerne udviser ikke en præference mellem ikke-methyleret og hemimethyleret DNA1. Således kan dette assay også bruges til at undersøge aktiviteten af DNMT3-isozymerne. Faktisk er hæmning af DNMT3a af små molekyler blevet vurderet ved hjælp af dette assay26,27,41. Kravet om et hemimethyleret substrat-DNA betyder, at dette assay ikke kan bruges til at undersøge substratspecificitet eller præference mellem ikke-methylerede og hemimethylerede CpG-steder.
Denne analyse er afhængig af et spektroskopisk signal: stigningen i fluorescens, når fluoroforen og slukningen adskilles. Således kan små molekyler, der selv fluorescerer eller slukker fluorescens, forstyrre analysen. En grund til at udføre den Gla I-holdige kontrol for hver analysetilstand er at kontrollere for denne mulighed. Det lille molekyles spektroskopiske egenskaber kan forklares ved blot at bruge Gla I-kontroldataene (f.eks. Hvis molekylet har et svagt fluorescenssignal). Men hvis molekylet er stærkt fluorescerende eller en stærk slukker, kan dette assay ikke bruges til at detektere DNA-methyleringsaktivitet.
Skærmen beskrevet her er et indledende assay for at detektere potentielle DNMT-hæmmere. Forbindelser, der er "hits" i startskærmen, skal valideres i sekundære assays for at sikre, at de er ægte DNMT-hæmmere. Fordi dette assay er et koblet kinetikassay, betyder det ikke nødvendigvis, at forbindelsen hæmmer methyltransferasen ved blot at observere et fald i fluorescensgenerering i nærværelse af et bestemt lille molekyle. Et lille molekyle, der er i stand til at hæmme koblingsenzymet Gla I, ville også resultere i et observeret fald i fluorescensgenerering. En simpel sekundær skærm indebærer bestemmelse af aktiviteten af Gla I i nærvær og fravær af de potentielle hæmmere. Til dette assay anvendes det fuldt methylerede internt slukkede hårnål-DNA som substrat26,41. Yderligere assays designet til at undersøge aggregeringsafhængig hæmning og DNA-interkalation kan også bruges som sekundære assays til yderligere validering af potentielle hæmmere26,41. I de data, der præsenteres her, blev forbindelse 1 og forbindelse 2 identificeret som potentielle DNMT1-hæmmere. Ved hjælp af en række sekundære assays er forbindelse 1 blevet valideret som en direkte hæmmer af DNMT141. Dette tidligere offentliggjorte arbejde viste, at forbindelser indeholdende omfangsrige substituenter ved C2-positionen af anthraquinonkernen syntes at være mere effektive hæmmere af DNMT1. Der er dog behov for flere undersøgelser for fuldt ud at forstå de strukturelle determinanter for DNMT1-hæmning.
Det koblede assay, der er beskrevet her, har flere potentielle anvendelser. Analysen kan bruges til steady state kinetiske eksperimenter. Fordi analysen er kontinuerlig, er det ligetil at bestemme starthastigheder. Dette assay er tidligere blevet brugt til at undersøge makroskopiske kinetikparametre (dvs. Km, Vmax og kcat) af forskellige afkortede DNMT1-proteiner40. Analysen er blevet brugt til at undersøge et lille sæt molekyler til DNMT1-hæmning 41 og vurdere isozymspecificitet af identificerede hæmmere ved at undersøge deres indvirkning på DNMT3a-aktivitet26,27,41. Analysen er også blevet brugt til at karakterisere hæmmere. Mekanismen for hæmning og styrke (fx Ki, IC50) af både hæmmende proteindomæner36,40 og nye små molekyler 27,41 er blevet bestemt ved hjælp af dette koblede kinetikassay. Analysen er også blevet tilpasset til brug i en HTS-kampagne. I dette tilfælde blev analysen miniaturiseret yderligere til et 384-brøndformat og brugt som et slutpunktsassay til den indledende skærm26. Således er det fluorescensbaserede endonukleasekoblede DNA-methyleringsassay, der er beskrevet her, et alsidigt assay, der kan bruges til at undersøge aktiviteten af DNA-methyltransferaser og muliggør identifikation og karakterisering af små molekylehæmmere af disse vigtige epigenetiske modifikatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Bucknell University og Institut for Kemi for deres støtte til dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 3694 | |
| 96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates | ThermoFisher | 249570 | |
| Bovine Serum Albumin | NEB | B9000S | |
| compound 1 | ChemBridge | 5812086 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 2 | ChemBridge | 6722175 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 3 | ChemBridge | 5249376 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | methyl-sensitive endonuclease |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M0250 | |
| Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | custom synthesized | internally quenched hairpin DNA (substrate) |
| Potassium Glutamate | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | methyl-donating co-factor (substrate) |
| Tris Base | RPI | T60040 |
References
- Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
- Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
- Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
- Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
- Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
- Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
- Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
- MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
- Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
- Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
- MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
- Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
- Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
- Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
- Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
- Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
- Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
- Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
- Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
- Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
- Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
- Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
- Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
- Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
- Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
- Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
- Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
- Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
- Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
- Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
- Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
- Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
- Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
- Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
- Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
- Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
- Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
- Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
- Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
- Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
- Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).
