Summary
DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.
Abstract
후성유전학적 유전자 조절의 한 형태인 DNA 메틸화는 정상적인 세포 기능에 중요합니다. 세포에서 DNA 메틸 전이 효소 (DNMT)라고하는 단백질은 DNA 메틸화 패턴을 설정하고 유지합니다. 정상적인 DNA 메틸화 패턴의 변화는 암 발생 및 진행과 관련이 있어 DNMT를 잠재적인 항암제 표적으로 만듭니다. 따라서 이러한 효소의 새로운 소분자 억제제를 식별하고 특성화하는 것이 매우 중요합니다. 이 논문은 DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제제를 스크리닝하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 연속 결합 동역학 분석은 잠재적인 소분자 억제제의 존재 및 부재 하에서 DNA 메틸화의 초기 속도를 결정할 수 있도록 합니다. 이 분석은 메틸 민감성 엔도 뉴 클레아 제 Gla I을 사용하여 헤미 메틸화 된 DNA 기질의 메틸화를 형광 생성에 결합시킵니다.
이 연속 분석을 통해 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 마이크로타이터 플레이트에서 소량으로 분석을 수행하면 시약 비용이 절감됩니다. 이 분석을 사용하여 인간에서 가장 풍부한 DNMT 동종 효소 인 DNMT1의 억제제에 대한 작은 예제 스크린이 수행되었습니다. 고도로 치환 된 안트라 퀴논 천연 제품 인 락카산 A는 DNMT1의 강력한 DNA 경쟁 억제제입니다. 여기에서는 분석 프로토콜을 설명하기 위해 세 가지 잠재적 소분자 억제제(안트라퀴논 또는 1-3개의 치환기가 있는 안트라퀴논 유사 분자)를 두 가지 농도로 검사합니다. 초기 속도는 각 분자의 존재에서 관찰되는 백분율 활성을 계산하는 데 사용됩니다. 조사된 세 가지 화합물 중 하나는 DNMT1 활성의 농도 의존적 억제를 나타내며, 이는 DNMT1의 잠재적 억제제임을 나타냅니다.
Introduction
DNA 메틸화는 유전자 발현과 염색질 구조를 조절하는 중요한 후성유전학적 표시입니다. 메틸화는 주로 CpG 디 뉴클레오티드에서 발생합니다 - 시토신 다음에 구아노 신; 메틸기는 시토신의 5 위치에 추가됩니다. 올바른 DNA 메틸화 패턴, 따라서 적절한 유전자 발현은 적절한 세포 발달 및 기능에 필요합니다. 많은 질병 상태는 정상적인 메틸화 패턴 1,2,3의 변화와 관련이 있습니다. 예를 들어, 암 시작과 진행 및 DNA 메틸화 패턴의 변경 사이에는 연관성이 있습니다. 일반적으로 암세포는 메틸시토신의 전반적인 수치가 낮아 게놈 불안정성에 기여합니다. 동시에, 게놈에 존재하는 메틸 시토신은 종양 억제 유전자의 프로모터 영역에 집중되어 이러한 중요한 단백질의 유전자 침묵을 유도합니다. 특히, 후성유전학적 변화는 종양 발생과 관련된 DNA 돌연변이와 달리 역동적이고 가역적입니다. 이것은 후성 유전 학적 유전자 조절에 관여하는 단백질을 흥미로운 약물 표적 2,4로 만들었습니다.
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)는 DNA 메틸화 패턴을 생성하고 유지하는 역할을 하는 단백질입니다. 세 가지 촉매 활성 동종 효소 인 DNMT1, DNMT3a 및 DNMT3b가 인간에게 존재합니다. 개발 및 분화 과정에서 드 노보 메틸 트랜스퍼 라제 인 DNMT3a 및 DNMT3b는 메틸화 패턴을 설정합니다. 두 효소 모두 촉매 적으로 비활성 인 DNMT3L 단백질과 결합하여 증가 된 활성 1,5를 나타내는 복합체를 형성 할 수 있습니다. 세포 분열 후 딸 세포는 새로 합성된 DNA에 메틸화 표시가 없기 때문에 헤미메틸화된 DNA(듀플렉스의 한 가닥에만 메틸시토신을 포함하는 DNA)를 포함합니다. DNMT1의 주요 기능은 이 헤미메틸화 DNA를 메틸화하여 전체 메틸화 패턴 1,5를 재설정하는 것입니다.
DNMT 활동과 암 사이의 연관성은 잘 확립되어 있습니다. 전사 또는 번역 후 메커니즘에 의한 DNMT1의 과발현은 몇 가지 일반적인 발암 경로 6,7,8,9의 결과입니다. 하이포모픽 대립유전자를 사용하여 DNMT1 활성을 낮추기 위한 유전학적 접근은 Apc(Min)마우스10에서 종양 형성을 감소시킵니다. DNMT1을 녹다운시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 배양 및 마우스 종양 모델11,12에서 신생물을 억제합니다. 따라서 DNMT1 활성을 억제하는 것은 유망한 암 치료 접근법처럼 보입니다. 그러나 DNMT3 동종 효소가하는 역할은 그렇게 간단하지 않습니다. DNMT3a 돌연변이는 급성 골수성 백혈병13 및 골수이형성 증후군14에서 발견됩니다. 확인된 돌연변이 중 적어도 하나는 효소15의 DNA 메틸화 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 DNMT3b는 유방암16 및 대장 암17에서 과발현됩니다. 다양한 DNMT 동종 효소가 발암에서 서로 다른 역할을하기 때문에 동종 효소 특이 적 억제제를 식별하는 것이 중요합니다. 이러한 화합물은 치료제 개발에 유용할 뿐만 아니라 동종효소 특이적 억제제는 암 병인학에서 각 DNMT 동종효소의 역할을 해부하는 귀중한 도구가 될 것입니다.
여러 DNMT 억제제가 문헌에보고되었습니다. 공지된 DNMT 억제제는 뉴클레오시드 및 비뉴클레오사이드의 두 가지 부류로 나눌 수 있다. 뉴클레오시드 억제제는 전형적으로 시티딘 유사체이다. 이 화합물은 DNA에 통합되어 DNMT를 공유 결합적으로 포획합니다. 5- 아자 시티 딘 및 5- 아자 -2'- 데 옥시 시티 딘은 골수이 형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 4,18의 치료를 위해 승인되었습니다. 이들 화합물의 높은 독성, 낮은 생체이용률 및 화학적 불안정성은 문제점을 제시한다. 진행중인 연구는 차세대 뉴 클레오 시드 억제제의 효능을 조사하고 있습니다. 5-아자-2'-데옥시시티딘으로부터 유도된 SGI-110은하나의 예 19,20이다. 뉴 클레오 시드 억제제는 동종 효소 특이 적이 지 않으며 발생하는 DNMT 동종 효소를 비활성화합니다. 따라서, 뉴클레오시드-탈메틸화제로 처리하면 모든 DNMT 동종효소 4,18이 고갈된다. 비-뉴클레오시드 억제제는 억제 효과를 발휘하기 위해 DNA에 혼입될 필요가 없다. 대신, 이러한 분자는 DNMT에 직접 결합하여 동종 효소 특이 적 억제 가능성을 도입합니다. 현재까지 SGI-1027 21, 히드랄라진22, 프로카인아미드 23, RG108 및 유도체 24, 천연물 (-)-에피갈로카테킨 3-갈레이트(EGCG)25 및 락카산 A 26,27을 포함한 여러 비뉴클레오시드 억제제가 발견되었습니다. 현재까지 발견 된 대부분의 비 뉴 클레오 시드 억제제는 동종 효소 선택적이지 않거나 하나의 DNMT 동종 효소에 대해 약한 선호도를 나타냅니다. 또한, 이들 분자의 효능은 특히 세포 4,18에서 개선되어야합니다. 따라서, 보다 강력한 동종효소 선택적 DNMT 억제제를 발견하거나 개발할 필요가 있다.
DNMT의 새로운 소분자 억제제를 발견하는 데 장애물은 전통적으로 DNMT 활성28을 검사하는 데 사용되는 힘든 분석입니다. 분석은 일반적으로 여러 단계로 불연속적입니다. DNMT의 효소 활성은 여전히 방사성 S- 아데노 실 메티오닌 (SAM) 29,30,31,32,33,34를 사용하여 일상적으로 분석됩니다. DNA 메틸화에 대한 비방사성 분석법도 개발되었습니다. 예를 들어, 소화 생성물을 분리하기 위해 메틸 민감성 제한 엔도뉴클레아제 및 전기영동을 활용하는 분석이35,36에 기재되어 있다. 이러한 유형의 불연속, 다단계 분석은 약물 발견에 쉽게 적응할 수 없습니다. 2000년대 중반 이후, 더 높은 처리량을 갖는 여러 DNA 메틸화 분석법이 개발되었다28. 섬광 근접 분석을 사용하여 DNMT1 억제제37을 스크리닝하였다. 메틸 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 활용하는 또 다른 분석을 사용하여 DNMT3a 억제제25,38을 스크리닝했습니다. 두 분석 모두 기존 DNA 메틸화 분석보다 더 높은 처리량을 허용하지만 분석에는 여러 단계가 필요하며 메틸화 활성을 실시간으로 관찰할 수 없습니다. 보다 최근에, 메틸화 반응의 한 생성물 인 S- 아데노 실 호모시스테인 (SAH)의 형성을 NADPH 산화와 관련된 340 nm에서의 분광 변화에 결합하는 연속 동역학 분석이 설명되었다39. 이 분석은 분광 신호를 생성하기 위해 세 가지 결합 효소를 사용합니다.
우리는 상업적으로 이용 가능한 단일 결합 효소를 활용하고 실시간으로 데이터를 생성할 수 있는 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석을 개발했습니다(그림 1). 3개의 메틸시토신을 함유하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 기질로서 사용된다. 기질 DNA는 5' 말단에 형광단을 포함하고 3' 말단에 소광제를 포함합니다. 헤미메틸화된 CpG 부위의 메틸화는 엔도뉴클레아제 Gla I에 대한 절단 부위를 생성한다 - 완전히 메틸화된 GCGC. 생성물의 GlaI 절단은 소광제로부터 형광단을 방출하고 실시간으로 형광을 발생시킨다. 분석은 DNMT의 모든 이소형의 활성을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DNMT1에서는 이 동종효소가 헤미메틸화된 DNA 1,5를 우선적으로 메틸화하기 때문에 더 높은 활성이 관찰됩니다. 자가 억제 복제 초점 표적화 서열 (RFTS) 도메인이 DNMT1에서 제거되면 더욱 강력한 활성이 관찰됩니다. N- 말단 조절 영역에서 발견되는이 도메인은 촉매 부위에 결합하여 DNA 결합을 방지합니다. 처음 ~600개의 아미노산을 제거하면 전장 효소보다 훨씬 더 활성이 높은 잘린 효소가 생성됩니다(kcat/Kam에서 ~640배 증가)40. RFTS가 결여된 DNMT1(아미노산 621-1616)이라고 하는 이 활성화된 형태의 효소는 증가된 촉매력으로 인해 억제제를 더 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 논문은 잠재적인 소분자 억제제를 스크리닝하기 위해 분석에서 RFTS가 부족한 DNMT1을 활용하는 프로토콜을 제시합니다. 엔도뉴클레아제-결합 연속 분석을 사용하여, 초기 속도는 몇 개의 작은 분자의 존재 및 부재 하에서 결정된다. 각 잠재적 억제제는 농도 의존적 DNMT1 억제를 찾기 위해 두 가지 농도에서 검사됩니다. 소분자의 존재 하에 관찰된 활성 퍼센트를 각각의 경우에 계산하였다.
그림 1: DNA 메틸화 분석. 5' 말단에 형광단이 있고 3' 말단에 소광제가 있는 헤미메틸화 헤어핀 DNA가 기질로 사용됩니다. DNMT1은 S- 아데노 실 메티오닌에서 비 메틸화 된 CpG 부위로 메틸기의 전달을 촉매하여 S- 아데노 실 호모시스테인과 완전히 메틸화 된 DNA를 생성합니다. DNA 생성물은 완전히 메틸화 된 GCGC 부위를 절단하는 엔도 뉴 클레아 제 Gla I의 절단 부위를 포함합니다. 생성물 DNA의 절단은 3' 소광기로부터 5' 형광단을 방출하여 형광을 생성한다. 약어: Fl = 형광단; Q = 소멸제; DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; SAM = S- 아데노 실 메티오닌; SAH = S- 아데노 실 호모시스테인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 스크린용 분석 용액 준비
참고: 이 분석에 사용된 기질의 농도는 조정할 수 있습니다. RFTS가 결여된 DNMT1의 경우, 헤어핀 DNA 기질 및 SAM에 대해 실험적으로 결정된Km 값은 각각 1-2nM 및 2μM,26,40이다.
- 얼음 위의 미세 원심분리 튜브에서 테스트 중인 각 분석 조건 600μL를 준비합니다.
참고: 필요한 분석 용액의 총 부피는 수행되는 반복의 수에 따라 다릅니다. 각각의 분석 조건은 이 프로토콜에 대해 삼중으로 실행되었다.- ddH2O및 5x 메틸화 완충액(250mM 트리스 pH 7.5, 5mMMgCl2, 500mM 칼륨 글루타메이트, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 25% 글리세롤)을 각 튜브에 첨가하여 1x 완충액의 최종 농도를 달성합니다. 20 μM 화합물을 함유하는 분석의 경우, 472 μL의 ddH2O 및120μL 5x 완충액을 첨가한다. 50 μM 화합물을 함유하는 분석의 경우, 470 μL의 ddH2O 및120μL의 5x 완충액을 첨가한다.
- 각 샘플에 20mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 3.15μL를 추가합니다.
- 2μL의 3.15μM 헤어핀 DNA 기질과 1.33μL의 4.75mM SAM을 각 샘플에 추가합니다.
참고: 분석 용액 혼합물의 기질 농도는 원하는 최종 농도의 1.05배입니다. - 적절한 샘플에 21 μM (10 mM의 1.26 μL) 또는 52.5 μM (10 mM의 3.15 μL)의 최종 농도로 억제제를 첨가하십시오. 동등한 양의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 대조군 샘플에 추가합니다.
알림: 화면에 사용되는 억제제의 농도는 다를 수 있습니다. 최대 최종 DMSO 농도는 ≤5%(v/v)여야 합니다. 최대 5%(v/v)의 DMSO 농도는 분석26에서 관찰된 활성에 영향을 미치지 않습니다.
- 3 초 동안 볼텍싱 (3,000 rpm)하여 용액을 혼합하십시오. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.
- 각 분석 용액 95μL를 검은색 반쪽 영역 96웰 플레이트의 6개의 연속 웰에 분취합니다(그림 2).
참고: 이러한 스크리닝 분석은 두 배치로 수행되었습니다. 먼저, 20 μM 억제제 샘플 (총 4 개 조건)을 조사한 다음, 50 μM 억제제 샘플 (총 4 개 조건)을 조사했다.
그림 2: 분석 플레이트 설정. 각 분석 용액은 검은색 96웰 플레이트의 6개 웰(DMSO 대조군(파란색), 화합물 1(녹색), 화합물 2(빨간색) 및 화합물 3(노란색)으로 분취됩니다. RFTS가 부족한 DNMT1과 Gla I은 모두 3 개의 웰에 추가 될 것입니다. 대조군으로 Gla I 단독으로 다른 세 개의 우물에 추가됩니다. 약어: RFTS = 복제 초점 표적화 서열; DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; DMSO = 디메틸 술폭 시드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 스크린을 위한 효소 해결책 준비
참고: RFTS가 결여된 DNMT1은 대장균에서 발현되고 균 질성으로 정제될 수 있습니다. RFTS-결여된 DNMT1에 대한 발현 및 정제 절차는 이전에 설명되었다41. 필요한 효소의 양은 수행되는 분석의 수에 따라 다릅니다. 여기에서 각 세트에서 4 가지 다른 분석이 수행됩니다. 각 분석은 3 배로 완료됩니다.
- 얼음 위의 미세 원심분리 튜브에 각 효소 용액 75μL를 준비합니다.
참고: 두 가지 효소 용액이 필요합니다. 하나의 솔루션에는 DNMT1 및 Gla I이 포함됩니다. 다른 하나는 Gla I 만 포함합니다.- ddH2O및 5x 메틸화 완충액(250mM 트리스 pH 7.5, 5mMMgCl2, 500mM 글루타민산 칼륨, 5mM DTT, 25% 글리세롤)을 각 튜브에 첨가하여 1x 완충액의 최종 농도를 달성합니다. Gla I 효소 용액의 경우 15μL의 5x 완충액과 58.8μL ddH2O를 추가합니다. DNMT1+Gla I 효소 용액의 경우 15μL의 5x 버퍼와 58.2μLddH2O를 추가합니다.
- 0.16 U/μL의 최종 농도에 대해 각 용액에 10 μL의 10 U/μL Gla I를 추가합니다.
- 최종 농도 40nM에 대해 5μM RFTS 결여 DNMT1 0.6μL를 DNMT1+Gla I 용액에 추가합니다.
- 부드럽게 두드려 용액을 혼합합니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.
- 각 효소 용액 12μL를 원뿔형 바닥의 96웰 플레이트에 6개의 웰에 분취합니다(그림 3).
그림 3: 효소판 설정. Gla I (회색) 및 DNMT1 + Gla I (파란색) 용액은 각각 96 웰 플레이트의 6 개 웰로 분취됩니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 효소를 일련의 분석 용액에 동시에 추가할 수 있습니다. 각 분석 조건 (6 웰)에 대해 3 개의 웰은 DNMT1 + Gla I을 수신하고 3 개의 웰은 Gla I 단독을받습니다. 약어 : DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 분석을 실행하고 데이터를 분석합니다.
- 플레이트 리더를 37°C로 예열합니다. 분석 용액이 들어 있는 검은색 플레이트를 삽입합니다. 플레이트를 흔들고(425cpm에서 5초 동안 이중 궤도) 여기 파장 485nm, 방출 파장 528nm의 형광을 읽습니다. 플레이트를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
알림: 또는 적절한 파장 차단이 있는 필터를 형광 판독값에 사용할 수 있습니다. - 분석 플레이트를 제거합니다. 각 웰에 5μL의 효소 용액을 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
참고: 샘플 행을 동시에 시작할 수 있도록 다중 채널 피펫을 사용합니다. - 플레이트를 플레이트 리더에 삽입합니다. 30분 동안 53초마다 형광을 기록합니다. 각 판독 전에 플레이트(425cpm에서 4초 동안 이중 궤도)를 흔듭니다.
- 각 조건에 대한 평균 삼중 Gla I 제어 분석. RFTS가 결여된 DNMT1의 존재 하에 수득된 삼중 트레이스로부터 평균 Gla I-함유 대조군 반응 트레이스를 뺀다. 수정된 반복실험에 대한 평균의 평균 및 표준 오차를 확인합니다.
- 보정된 평균 반응 트레이스를 플로팅하고 초기 선형 부분을 선에 피팅하여 초기 속도를 결정합니다.
- 화합물이 있을 때 관찰된 속도를 DMSO 함유 제어 반응에서 관찰된 속도로 나누고 100을 곱하여 활성 백분율을 결정합니다.
4. 추가 분석 제어 — 효소의 순차적 첨가
- 얼음 위의 미세 원심분리 튜브에 550μL의 분석 용액을 준비합니다. 110μL의 5x 메틸화 완충액, 3.88μL의 3.15μM 헤어핀 DNA 기질, 6.43μL의 47.5mM SAM, 3.06μL의 20mg/mL BSA 및 426.6μL의ddH2O를 추가합니다.
- 3 초 동안 볼텍싱 (3,000 rpm)하여 용액을 혼합합니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.
- 90 μL의 분석 용액을 검정색 반면적 96-웰 플레이트에서 6개의 연속적인 웰로 분취한다.
- 얼음 위에 DNMT1 효소 용액을 준비합니다. 4μL의 5x 메틸화 완충액, 0.76μL의 5μM RFTS 결핍 DNMT1 및 15.24μL의ddH2O를 하나의 튜브에 추가합니다. 4 μL의 5x 메틸화 완충액 및 16 μL의 ddH2O를 다른 튜브에 첨가한다.
- 부드럽게 두드려 용액을 혼합합니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.
- 5μL의 DNMT1 함유 용액을 검은색 반면적 96웰 플레이트의 3웰에 추가합니다. 5μL의 완충액 대조액을 다른 3개의 웰에 추가합니다.
- 마이크로타이터 플레이트를 37°C로 예열된 플레이트 리더에 넣습니다. 플레이트를 흔들고(425cpm에서 3초 동안 이중 궤도) 여기 파장 485nm, 방출 파장 528nm의 형광을 읽습니다. 흔들기를 반복하고 60 분 동안 30 초마다 읽습니다.
- 분석 플레이트가 플레이트 리더에있는 동안 얼음 위에 Gla I 용액을 준비하십시오. 8μL의 5x 메틸화 완충액, 0.64μL의 10U/μL Gla I 및 31.4μL의ddH2O를 미세 원심분리 튜브에 추가합니다. 부드럽게 두드려 용액을 섞습니다. 탁상용 미니 원심분리기(1,200× g)에서 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.
- 6 μL의 Gla I 용액을 원뿔형 바닥의 96 웰 플레이트에서 6 개의 웰로 분취한다.
- 처음 30분 동안 읽은 후 플레이트 리더에서 검은색 플레이트를 제거합니다. 5μL의 Gla I 용액을 6개의 웰 모두에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
알림: 모든 웰을 동시에 시작할 수 있도록 다중 채널 피펫을 사용하십시오. - 검은색 플레이트를 플레이트 리더에 다시 놓습니다. 35분 동안 35초마다 형광을 기록합니다. 각 판독 전에 플레이트(425cpm에서 3초 동안 이중 궤도)를 흔듭니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
활성 DNMT1은 이 분석의 전제 조건입니다. RFTS-결여된 DNMT1을 대장균에서 발현시키고, 이전에 공개된 절차41에 따라 균질성으로 정제하였다. 정제된 효소가 활성인지 확인하기 위해, 불연속 엔도뉴클레아제-결합 분석을 사용하여 DNA 메틸화 활성을 조사하였다36. 이 분석은 Sau3A1 절단 부위에 위치한 단일 반메틸화 CpG를 갖는 32 염기쌍 이중 DNA를 활용합니다. Sau3A1은 헤미 메틸화 된 기질 DNA를 절단 할 수 있습니다. 그러나 DNA가 완전히 메틸화되면 절단이 차단됩니다. RFTS-결여된 DNMT1을 1 μM DNA 및 0.5 mM SAM을 함유하는 분석에 첨가하고, 분취량을 제거하고, 30분에 걸쳐 급속 냉동하였다. 샘플을 이어서부터 Sau3A1로 분해하고, 생성물을 겔 전기영동으로 분리하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, DNA는 반응 시간이 증가함에 따라 절단으로부터 보호되며, 이는 RFTS-결핍 DNMT1이 헤미메틸화된 DNA를 메틸화하고 있음을 나타낸다. 원래 분석에 존재하는 대부분의 1μM 기질 DNA는 30분 시간 과정에 걸쳐 생성물로 전환되었습니다.
이 논문에 설명된 엔도뉴클레아제 결합 분석은 형광의 증가로서 DNA 메틸화 활성을 실시간으로 관찰할 수 있게 해준다. 이 분석의 성공의 핵심은 엔도뉴클레아제 Gla I의 메틸 민감도입니다. Gla I은 헤미메틸화된 기질 DNA를 효율적으로 절단하지 않지만 완전히 메틸화된 생성물 DNA를 절단합니다(그림 1). 헤어핀 DNA의 절단은 소광제로부터 형광단을 방출하고 형광의 증가를 생성하는 데 필요합니다. 효소가 예상대로 작동하고 있음을 입증하기 위해 RFTS가 부족한 DNMT1 및 Gla I이라는 효소를 동시가 아닌 순차적으로 첨가하는 대조 반응을 수행했습니다. 결합 분석이 올바르게 작동하는 경우 DNA 기질의 메틸화가 내부적으로 담금질된 헤어핀 DNA의 배경 형광에 영향을 미치지 않을 것으로 예상되므로 DNMT1의 추가가 형광에 영향을 미치지 않아야 합니다. 그러나, 메틸 트랜스퍼 라제를 함유하는 분석에 Gla I의 후속 첨가는 완전히 메틸화 된 헤어핀 DNA의 절단으로 인한 형광 생성을 초래해야한다. 헤미메틸화된 헤어핀 DNA 기질 자체에는 배경 형광이 있습니다(그림 5). 이들 분석에는 20 nM 헤어핀 DNA 및 500 μM SAM이 포함되어 있었다. RFTS-결여된 DNMT1 또는 완충액을 분석에 첨가하고, 형광을 30분 동안 추적하였다.
그림 5에서 볼 수 있듯이 형광은 결합 효소가 없는 경우 RFTS 결핍 DNMT1에 의해 영향을 받지 않습니다(파란색 음영에는 10nM RFTS가 결여된 DNMT1이 포함된 반면 빨간색 음영은 완충액 대조군임). 따라서, DNMT1에 의한 헤미메틸화된 CpG 부위의 메틸화는 형광 신호를 현저하게 변화시키지 않는다. 그러나 Gla I을 모든 웰에 첨가했을 때 RFTS가 결여된 DNMT1을 포함하는 분석에서만 강력한 형광 생성이 관찰되었습니다(그림 5). 이것은 DNMT1에 의한 헤미 메틸화 기질 DNA의 메틸화가 Gla I 절단 및 형광 생성에 필요하다는 것을 보여준다. 이 대조 분석에서 관찰 된 형광의 증가는 효소가 순차적으로 첨가됨에 따라 Gla I의 활성을 반영한다는 점에 유의해야한다. 대안적으로, 이러한 반응 혼합물은 Gla I로 분해될 수 있고, 생성된 올리고뉴클레오티드는 전기영동에 의해 분리되어 절단을 시각화하고 효소가 예상대로 작동하는지 확인할 수 있습니다.
이 결합 분석을 사용하여 DNMT1의 초기 속도를 직접 결정하려면 RFTS가 부족한 DNMT1과 Gla I의 두 효소를 동시에 추가해야 합니다. 생성물 DNA의 Gla I 절단 속도가 DNMT1에 의한 DNA 메틸화 속도보다 빠른 한, 생성 된 형광 신호는 DNA 메틸화 활성을 반영합니다. DNMT1 활성이 속도 제한임을 보장하기 위해 DNMT1의 농도는 다른 모든 분석 조건을 일정하게 유지하면서 다양할 수 있습니다. 형광 생성 속도는 DNMT1의 농도에 비례해야합니다. 이것은 이전에 여기40에서 사용된 조건에서 RFTS가 결여된 DNMT1에 대해 보여졌다. DNMT 활성을 검사하기 위해 이 결합 분석을 활용하는 경우, DNMT1 및 Gla I을 모두 포함하는 반응 이외에 Gla I 함유 제어 반응이 수행됩니다(그림 6A). Gla I 컨트롤에는 여러 기능이 있습니다. DNMT 함유 반응 트레이스에서 Gla I 제어 반응 트레이스를 빼면 헤미메틸화된 DNA 기질의 느린 절단과 배경 형광을 모두 계산할 수 있습니다. 생성 된 수정 된 반응 트레이스는 DNMT1의 DNA 메틸화 활성을 반영합니다. 보정된 반응 트레이스의 초기 선형 부분을 피팅하면 초기 속도를 결정할 수 있습니다(그림 6B). 10 nM 헤어핀 DNA 기질 및 10 μM SAM을 사용하여, 113 ± 2 RFU/min의 초기 속도를 얻었다.
치환된 안트라퀴논은 이전에 DNMT1의 활성을 억제하는 것으로 나타났습니다. 천연물인 락카산 A는 치환도가 높은 안트라퀴논으로 DNMT127의 강력한 DNA 경쟁 억제제입니다. 더 단순한 구조를 가진 몇 가지 화합물, 안트라 퀴논 코어상의 하나 또는 두 개의 치환기, 하나는 부피가 큰 방향족 치환체이며, DNA 경쟁 방식으로 DNMT1을 억제하는 것으로 나타났습니다41. 여기서, Gla I 결합 분석에서 RFTS가 결여된 DNMT1 활성을 억제하는 3개의 치환된 안트라퀴논 또는 안트라퀴논-유사 분자의 능력이 이들 스크리닝 분석을 수행하는 방법의 예로서 조사되었다. 이들 화합물은 1 내지 3개의 치환기를 함유하였으며, 모두 안트라퀴논 코어의 한쪽 면에 있었다(표 1). 이러한 분석에 사용되는 기질 농도(10nM DNA 및 10μM SAM)는 각기질에 대한 KM보다 ~5배 더 높습니다. 분석에서 생성된 신호는 기질 DNA에서 직접 나옵니다. 이 때문에 Km에 가깝거나 낮은 농도에서 분석하기가 어렵습니다. 감지할 신호가 충분하지 않습니다. 이러한 기질 농도는 억제제가없는 상태에서 이러한 조건에서 강력한 활성이 보이기 때문에 선택되었습니다 (그림 6B). 다른 기질 농도가 스크리닝 분석에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 포화 SAM 농도에서 스크리닝을 수행하는 것은 SAM 경쟁 억제제에 대한 검색을 편향시키는 전략으로 사용될 수 있습니다.
각각의 분석은 헤어핀 DNA 기질, 메틸-공여 보조인자 SAM, 및 스크린을 위한 대조군으로서 잠재적 억제제 또는 DMSO를 함유하였다. 당사는 분석에 사용하기 위해 DMSO에서 스크리닝 화합물의 10mM 용액을 일상적으로 생성합니다. 여기에서 조사한 것과 같은 안트라퀴논은 수용액에서 열악한 용해도를 나타냅니다. 따라서 농축 된 주식을 생성하기 위해 DMSO가 용매로 사용됩니다. 최종 농도까지 5%(v/v)의 DMSO를 첨가하는 것은 분석26에서의 활성에 영향을 미치지 않는다. 그러나 수용액에서 용해도가 낮은 화합물을 취급할 때는 화합물이 선택한 최종 스크리닝 농도에서 용해되도록 주의해야 합니다.
스크린에서 검사된 각각의 조건에 대해, GlaI-함유 대조 분석이 수행된다. 배경 형광 및 기질 헤어핀 DNA의 느린 절단을 설명하는 것 외에도, 이 제어는 전위 억제제가 분광 신호(예를 들어, 형광등)를 방해하는지 여부를 결정할 수 있게 한다. 효소를 첨가하여 반응을 시작한 후, 스크리닝 데이터에서 53초의 시간 간격으로 30분 동안 형광을 측정하였다. 이것은 전체 96웰 플레이트를 판독할 때 이 실험실의 플레이트 리더에서 사용할 수 있는 가장 빠른 시간 간격입니다. 다른 시간 간격을 사용하여 반응 트레이스를 생성할 수 있습니다. 적절한 시간 간격은 사용되는 기기와 읽는 우물의 수에 따라 다릅니다. 재현성을 보장하기 위해 각 분석은 3 배로 수행됩니다. 평균 Gla I 함유 대조군 트레이스는 RFTS-결여된 DNMT1의 존재 하에서 관찰된 반응 트레이스로부터 차감된다. 반응의 초기 속도는 보정된 반응 트레이스의 초기 선형 부분을 피팅하여 결정할 수 있습니다.
처음에, 형광 생성에 대한 3개의 잠재적 억제제의 영향을 20 μM의 최종 농도에서 조사하였다. 잠재적 억제제의 더 높은 농도는 두 가지 이유로 스크리닝을 위해 선택되었다. 먼저, 분석에서 기질 농도는 모두 각각의Km값 보다 높다. 이것은 특히 억제제가 경쟁력이 있는 경우 동역학 분석에서 억제를 검출하는 것을 더 어렵게 만들 수 있습니다. 둘째, 이 스크린에 사용된 안트라퀴논 유사 화합물은 공지된 억제제인 락카산 A보다 구조가 훨씬 간단하다. 이 분자는 코어 구조 주위에 몇 개의 치환기 만 포함하기 때문에 약한 상호 작용을 예상했습니다. DMSO 함유 대조 분석에서 111 ± 5 RFU/min의 초기 속도가 얻어졌습니다(그림 7A). 이것은 DMSO가 없을 때 이전에보고 된 비율과 매우 유사하며 적은 양의 DMSO를 추가해도 관찰 된 활동에 영향을 미치지 않음을 확인합니다. 두 화합물의 첨가는 관찰된 초기 속도를 감소시켰고, 세 번째 화합물의 첨가는 활성에 영향을 미치지 않았다. 초기 속도는 각 화합물의 존재 하에서 관찰된 퍼센트 활성을 결정하기 위해 사용되었다. 20 μM에서, 화합물 1 및 2의 첨가는 ~80%의 퍼센트 활성을 초래한 반면, 화합물 3의 존재 하에서 100% 퍼센트 활성이 관찰되었으며, 이는 이 분자가 효소를 억제하지 않음을 나타낸다(표 1).
억제제는 농도 의존적 억제를 나타낼 것으로 예상된다. 다음으로, 이들 분자는 50 μM의 훨씬 더 높은 농도로 재조사되었다. 이 분석 세트의 경우, DMSO 함유 제어 분석은 125 ± 7 RFU/분의 초기 속도를 가졌다(도 7B). 이 속도는 이전에 결정된 속도보다 약간 높습니다. 그러나 이러한 속도는 모두 Error 내에서 비교적 가깝습니다. 다시, 화합물 3은 초기 속도에 거의 영향을 미치지 않은 반면, 화합물 1 및 2의 첨가는 관찰된 초기 속도를 감소시켰다. 예상된 바와 같이, 더 높은 농도에서, 화합물 1은 활성에 더 큰 영향을 미쳤다. 50 μM에서, 화합물 1의 첨가는 ~60%의 퍼센트 활성을 초래하였다 (표 1). 그러나, 더 높은 농도의 화합물 2의 첨가는 더 강력한 억제를 초래하지 않았다. 화합물 2의 50 μM의 존재 하에서 관찰된 활성 백분율은 다시 80%에 가까웠다.
제시된 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 엔도뉴클레아제-결합된 형광-기반 DNA 메틸화 분석은 잠재적인 DNMT 억제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 데이터는 화합물 1 및 화합물 2가 잠재적 억제제인 반면, 화합물 3은 그렇지 않음을 나타낸다. 잠재적 억제제가 진정한 DNMT1 억제제임을 검증하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
그림 4: DNMT1 활동 제어. 헤미메틸화 이중 DNA 메틸화는 Sau3A1 절단으로부터 보호합니다. RFTS-결여된 DNMT1을 1 μM DNA 및 500 μM SAM을 함유하는 분석 혼합물에 첨가하였다. 샘플을 37°C에서 30분 인큐베이션 동안 지시된 시점에 수집하고, Sau3A1로 분해하고, 18% PAGE 상의 겔 전기영동에 의해 분해하였다. 여기에는 5분, 10분, 15분 및 30분 샘플이 표시됩니다. 첫 번째 차선은 DNMT1이 없는 컨트롤입니다. 약어 : DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; RFTS = 복제 초점 표적화 서열. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 형광 기반 분석 제어. RFTS-결여된 DNMT1 (10 nM 최종 농도) 및 Gla I (0.8 U)을 20 nM 헤어핀 DNA 기질 및 500 μM SAM을 함유하는 삼중 분석에 순차적으로 첨가하였다. DNMT1(파란색 원) 또는 완충액(빨간색 원)의 추가만으로는 배경 형광에 영향을 미치지 않았습니다. 모든 분석에 Gla I을 추가하면 DNMT1을 포함하는 분석에서 형광이 생성되지만 그렇지 않은 분석에서는 형광이 생성되지 않습니다. 약어 : DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; RFTS = 복제 초점 표적화 서열; RFU = 상대 형광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 형광 반응 추적. 삼중 분석에는 10nM 헤어핀 DNA 기질과 10μM SAM이 포함되었습니다. (A) RFTS가 결여된 DNMT1 (2 nM) 및 Gla I (0.8 U)을 3개의 분석(청색)에 첨가하고, Gla I(0.8 U) 단독을 3개의 분석(적색)에 첨가하였다. 강력한 형광 생성은 두 효소를 모두 포함하는 분석에서만 관찰됩니다. (B) 평균 Gla I 반응 트레이스를 DNMT에서 뺍니다.1+Gla I 반응 트레이스. 삼중 데이터 평균의 평균 및 표준 오차가 표시됩니다. 트레이스의 선형 부분을 피팅하면 113 ± 2 RFU/min의 초기 속도가 제공됩니다. 약어 : DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; RFTS = 복제 초점 표적화 서열; RFU = 상대 형광 단위; SAM = S- 아데노 실 메티오닌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 잠재적 억제제의 존재 하에 DNA 메틸화 활성. RFTS가 결여된 DNMT1의 DNA 메틸화 활성을 DMSO (흑색), 화합물 1 (적색), 화합물 2 (청색), 또는 화합물 3 (녹색)의 존재하에 조사하였다. 20 μM 화합물 (A) 및 50 μM 화합물 (B)에서 보정된 반응 트레이스를 적합시켜 초기 속도를 결정하였다. 화합물 1 및 2의 첨가는 관찰 속도를 감소시킨 반면, 화합물 3은 활성에 거의 영향을 미치지 않았다. 삼중 분석에 대한 평균의 평균 및 표준 오차가 도시되어 있다. 약어 : DNMT1 = DNA 메틸 트랜스퍼 라제 1; RFTS = 복제 초점 표적화 서열; RFU = 상대 형광 단위; DMSO = 디메틸 술폭 시드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 잠재적인 소분자 억제제의 존재 하에서 관찰된 초기 속도 및 백분율 활성. 초기 속도는 보정된 반응 트레이스의 초기 선형 부분을 라인에 피팅하여 결정되었습니다. 피팅과 연관된 오류가 보고됩니다. 활성 백분율은 화합물의 존재 하에서 결정된 속도를 DMSO 대조 반응에서 결정된 속도로 나누고 100을 곱하여 결정하였다; 관련 오류가 전파되었습니다. 약어 : Cmpd = 화합물; DMSO = 디메틸술폭시드; RFU = 상대 형광 단위. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA 메틸 트랜스퍼 라제의 억제제를 확인하고 특성화하려면 효소의 활성을 측정해야합니다. DNA 메틸 트랜스퍼 라제 활성을 검사하기위한 몇 가지 방법이 존재합니다. 활동은 일반적으로 방사능을 사용하여 모니터링됩니다. SAM의 표지된 메틸기의 전사는 29,30,31,32,33,34로 정량화될 수 있다. 메틸-민감성 엔도뉴클레아제를 이용하는 겔-기반 분석이 또한 기술되었다35,36. 이러한 분석은 일반적으로 불연속적이며 활성을 검사하기 위해 여러 단계가 필요합니다. 여기서, 잠재적인 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위해 엔도뉴클레아제-결합된 DNA 메틸화 분석이 기술된다. 이 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다. 분석은 비교적 간단합니다. 신호를 얻기 위해 분리 기술(예를 들어, 전기영동, 필터 결합)을 필요로 하지 않는다. 또한 분석은 연속적이므로 실시간으로 데이터를 수집 할 수 있습니다. 메틸화 활성에 대한 상이한 연속 동역학 분석이 최근에 기술되었다39. 그러나 이 분석은 분광 신호를 생성하기 위해 세 가지 결합 효소가 필요합니다. 여기에 설명된 분석에는 단일 커플링 효소가 필요합니다.
이러한 DNMT 활성 분석은 먼저 효소를 제외한 모든 분석 성분을 포함하는 분석 용액을 생성하여 수행됩니다. 분석 용액에는 기질, 헤어핀 DNA 및 SAM이 포함되어 있습니다. 0.1 mg/mL BSA도 분석에 일상적으로 포함됩니다. 분석에 사용된 DNA 및 DNMT1의 농도(나노몰 범위)가 매우 낮기 때문에 BSA는 일반적인 단백질 농도를 증가시켜 피펫 팁, 튜브 및 마이크로타이터 플레이트에 대한 부착과 효소 활성에 영향을 미칠 수 있는 환경적 모욕을 방지합니다. 그런 다음 분석은 분석 용액에 효소를 첨가하여 시작됩니다. 이러한 희석은 모든 분석 성분의 최종 농도를 결정할 때 고려되어야 합니다. 반응은 95μL의 분석 용액에 5μL의 효소 용액을 첨가함으로써 개시된다. 따라서 분석 용액 내의 DNA, SAM 및 BSA 농도는 원하는 최종 농도의 1.05x입니다. 예를 들어, 10 nM DNA가 요구되는 경우, 10.5 nM DNA로 분석 용액이 생성된다. 효소 용액에서 RFTS가 결여된 DNMT1의 농도는 원하는 최종 농도의 20배입니다. 여기서, 40 nM RFTS-결여된 DNMT1을 효소 용액에 사용하였으며, 각 분석에서 DNMT1의 최종 농도는 2 nM이 되도록 하였다.
Gla I은 상업적으로 이용 가능한 효소이기 때문에 그 양은 제조업체가 제공 한대로 단위 (U)로 제공됩니다. 생성 된 효소 용액에는 0.16U / μL Gla I이 포함되어있어 총 0.8U의 Gla I이 각 웰에 첨가됩니다. 시약 비용을 절감하기 위해 소량의 적절한 효소 용액을 준비한 다음 이러한 용액을 원뿔형 바닥의 96웰 플레이트에 분취합니다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 5μL의 효소 용액을 원뿔형 바닥 플레이트에서 검은색 96웰 반쪽 영역 플레이트의 분석 용액으로 옮깁니다. 이 프로세스를 통해 일련의 분석을 동시에 시작할 수 있습니다. 또는 다른 분석 플레이트 설정을 사용하여 효소 용액을 시약 저장소에 넣은 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 분석 용액에 효소를 추가할 수 있습니다. 그러나 이 접근법은 저장소의 액체 회수 폐기물로 인해 더 많은 양의 효소 용액이 필요합니다. 우리는 96 웰 반 면적 플레이트에서 분석을 수행합니다. 이 플레이트의 웰 크기가 작기 때문에 기존 96웰 플레이트보다 총 분석 부피(100μL)가 작아 시약 비용을 절감할 수 있습니다.
본원에 기술된 DNA 메틸화 분석은 커플링 엔도뉴클레아제 GlaI의 특이성으로 인해 헤미메틸화 기질 DNA를 필요로 한다. 이것은 이 동종효소가 헤미메틸화된 DNA1을 우선적으로 메틸화하기 때문에 DNMT1의 활성을 검사하는 데 특히 유용합니다. DNMT3 동종 효소는 비 메틸화 및 헤미 메틸화 DNA1 사이에 선호도를 나타내지 않습니다. 따라서이 분석은 DNMT3 동종 효소의 활성을 검사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 실제로, 소분자에 의한 DNMT3a의 억제는 이 분석26,27,41을 사용하여 평가되었다. 헤미메틸화 기질 DNA의 요구 사항은 이 분석을 사용하여 비메틸화 및 반메틸화 CpG 부위 간의 기질 특이성 또는 선호도를 검사할 수 없음을 의미합니다.
이 분석은 분광 신호에 의존합니다 : 형광단과 소광제가 분리 될 때 형광이 증가합니다. 따라서, 스스로 형광을 발하거나 형광을 소멸시키는 작은 분자는 분석을 방해 할 수있다. 각 분석 조건에 대해 Gla I 함유 제어를 수행하는 한 가지 이유는 이러한 가능성을 확인하는 것입니다. 소분자의 분광학적 특성은 GlaI 대조군 데이터를 사용하여 간단히 설명할 수 있습니다(예를 들어, 분자가 약한 형광 신호를 갖는 경우). 그러나 분자가 강한 형광성 또는 강한 소광제인 경우 이 분석을 사용하여 DNA 메틸화 활성을 검출할 수 없습니다.
여기에 설명된 화면은 잠재적인 DNMT 억제제를 검출하기 위한 초기 분석입니다. 초기 스크린에서 "히트"인 화합물은 진정한 DNMT 억제제인지 확인하기 위해 2차 분석에서 검증되어야 합니다. 이 분석은 결합 동역학 분석이기 때문에, 단순히 특정 소분자의 존재 하에 형광 생성의 감소를 관찰하는 것이 반드시 화합물이 메틸트랜스퍼라제를 억제한다는 것을 의미하지는 않는다. 결합 효소 Gla I을 억제할 수 있는 작은 분자는 또한 형광 생성의 관찰된 감소를 초래할 것이다. 간단한 2 차 스크린은 잠재적 억제제의 존재 및 부재에서 Gla I의 활성을 결정하는 것을 포함한다. 이 분석을 위해, 완전히 메틸화된 내부적으로 퀀칭된 헤어핀 DNA가 기질(26, 41)로서 사용된다. 응집-의존적 억제 및 DNA 삽입을 검사하기 위해 고안된 추가의 분석은 또한 잠재적 억제제(26,41)를 추가로 검증하기 위한 2차 분석으로서 사용될 수 있다. 여기에 제시된 데이터에서 화합물 1과 화합물 2는 잠재적 인 DNMT1 억제제로 확인되었습니다. 다양한 2차 분석을 사용하여, 화합물 1은 DNMT141의 직접 억제제로서 검증되었다. 이전에 발표 된이 연구는 안트라 퀴논 코어의 C2 위치에 부피가 큰 치환기를 포함하는 화합물이 DNMT1의보다 효과적인 억제제 인 것으로 나타났습니다. 그러나 DNMT1 억제에 대한 구조적 결정 요인을 완전히 이해하려면 더 많은 연구가 필요합니다.
여기에 설명된 결합 분석에는 몇 가지 잠재적인 용도가 있습니다. 상기 분석은 정상 상태 동역학 실험에 활용될 수 있다. 분석이 연속적이기 때문에 초기 속도를 결정하는 것은 간단합니다. 이 분석은 이전에 다양한 절단된 DNMT1 단백질(40)의 거시적 동역학 파라미터 (즉, Km, Vmax 및 kcat)를 검사하는데 사용되었다. 이 분석은 DNMT1 억제 41에 대한 작은 분자 세트를 검사하고 DNMT3a 활성26,27,41에 미치는 영향을 조사하여 확인 된 억제제의 동종 효소 특이성을 평가하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 또한 억제제를 특성화하는 데 사용되었습니다. 억제 단백질 도메인36,40 및 신규한 소분자27,41 모두의 억제 및 효능 (예를 들어, Ki, IC50)의 메카니즘은 이 커플링된 동역학 분석을 사용하여 결정되었다. 이 분석은 HTS 캠페인에도 사용하도록 조정되었습니다. 이 경우, 분석은 384-웰 포맷으로 추가로 소형화되었고, 초기 스크린(26)에 대한 종말점 분석으로서 사용되었다. 따라서, 여기에 기술된 형광 기반 엔도뉴클레아제-결합 DNA 메틸화 분석은 DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 검사하는 데 사용할 수 있는 다목적 분석이며, 이러한 중요한 후성유전학적 변형인자의 소분자 억제제의 식별 및 특성화를 가능하게 한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는이 연구를 지원 한 Bucknell University와 화학과에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 3694 | |
| 96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates | ThermoFisher | 249570 | |
| Bovine Serum Albumin | NEB | B9000S | |
| compound 1 | ChemBridge | 5812086 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 2 | ChemBridge | 6722175 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 3 | ChemBridge | 5249376 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | methyl-sensitive endonuclease |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M0250 | |
| Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | custom synthesized | internally quenched hairpin DNA (substrate) |
| Potassium Glutamate | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | methyl-donating co-factor (substrate) |
| Tris Base | RPI | T60040 |
References
- Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
- Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
- Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
- Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
- Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
- Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
- Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
- MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
- Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
- Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
- MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
- Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
- Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
- Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
- Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
- Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
- Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
- Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
- Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
- Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
- Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
- Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
- Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
- Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
- Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
- Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
- Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
- Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
- Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
- Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
- Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
- Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
- Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
- Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
- Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
- Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
- Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
- Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
- Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
- Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
- Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).
