Summary
DNA-metyltransferaser är potentiella mål för cancerläkemedel. Här presenteras ett protokoll för att bedöma små molekyler för DNA-metyltransferashämning. Denna analys använder ett endonukleas för att koppla DNA-metylering till fluorescensgenerering och gör det möjligt att övervaka enzymaktivitet i realtid.
Abstract
DNA-metylering, en form av epigenetisk genreglering, är viktig för normal cellulär funktion. I celler etablerar och upprätthåller proteiner som kallas DNA-metyltransferaser (DNMT) DNA-metyleringsmönstret. Förändringar i det normala DNA-metyleringsmönstret är kopplade till cancerutveckling och progression, vilket gör DNMT till potentiella cancerläkemedelsmål. Således är det av stor betydelse att identifiera och karakterisera nya småmolekylära hämmare av dessa enzymer. Detta dokument presenterar ett protokoll som kan användas för att screena för DNA-metyltransferashämmare. Den kontinuerliga kopplade kinetikanalysen gör det möjligt att bestämma initiala hastigheter för DNA-metylering i närvaro och frånvaro av potentiella småmolekylära hämmare. Analysen använder det metylkänsliga endonukleaset Gla I för att koppla metylering av ett hemimetylerat DNA-substrat till fluorescensgenerering.
Denna kontinuerliga analys gör det möjligt att övervaka enzymaktiviteten i realtid. Genomförande av analysen i små volymer i mikrotiterplattor minskar kostnaden för reagenser. Med hjälp av denna analys utfördes en liten exempelskärm för hämmare av DNMT1, det vanligaste DNMT-isozymet hos människor. Den mycket substituerade naturprodukten antrakinon, lakcainsyra A, är en potent, DNA-konkurrenskraftig hämmare av DNMT1. Här undersöker vi tre potentiella småmolekylära hämmare - antrakinoner eller antrakinonliknande molekyler med en till tre substituenter - i två koncentrationer för att beskriva analysprotokollet. Initialhastigheter används för att beräkna den procentuella aktiviteten som observerats i närvaro av varje molekyl. En av tre undersökta föreningar uppvisar koncentrationsberoende hämning av DNMT1-aktivitet, vilket indikerar att det är en potentiell hämmare av DNMT1.
Introduction
DNA-metylering är ett viktigt epigenetiskt märke som reglerar genuttryck och kromatinstruktur. Metylering sker huvudsakligen i CpG-dinukleotider - cytosin följt av guanosin; Metylgruppen tillsätts till 5-positionen av cytosin. Korrekta DNA-metyleringsmönster, och därmed korrekt genuttryck, behövs för lämplig cellulär utveckling och funktion. Många sjukdomstillstånd har associerats med förändringar i det normala metyleringsmönstret 1,2,3. Till exempel finns det en koppling mellan cancerinitiering och progression och förändringar i DNA-metyleringsmönstret. Vanligtvis uppvisar cancerceller lägre totala nivåer av metylcytosin, vilket bidrar till genominstabilitet. Samtidigt koncentreras metylcytosinet som är närvarande i genomet i promotorregionerna av tumörsuppressorgener, vilket leder till gendämpning av dessa viktiga proteiner. I synnerhet är epigenetiska förändringar dynamiska och reversibla, till skillnad från DNA-mutationerna associerade med tumorigenes. Detta har gjort proteinerna som är involverade i epigenetisk genreglering intressanta läkemedelsmål 2,4.
DNA-metyltransferaser (DNMT) är de proteiner som är ansvariga för att generera och upprätthålla DNA-metyleringsmönster. Tre katalytiskt aktiva isozymer, DNMT1, DNMT3a och DNMT3b, finns hos människor. Under utveckling och differentiering etablerar de novo-metyltransferaserna, DNMT3a och DNMT3b, metyleringsmönster. Båda enzymerna kan binda det katalytiskt inaktiva DNMT3L-proteinet för att bilda komplex som uppvisar ökad aktivitet 1,5. Efter celldelning innehåller dotterceller hemimetylerat DNA - DNA som innehåller metylcytosin i endast en sträng av duplexen - eftersom det nyligen syntetiserade DNA saknar metyleringsmärken. Den huvudsakliga funktionen hos DNMT1 är att metylera detta hemimetylerade DNA och därmed återupprätta det fullständiga metyleringsmönstret 1,5.
Kopplingar mellan DNMT-aktivitet och cancer är väl etablerade. Överuttryck av DNMT1, antingen genom transkriptionella eller post-translationella mekanismer, är en följd av flera vanliga onkogena vägar 6,7,8,9. Genetiska tillvägagångssätt för att sänka DNMT1-aktivitet med hypomorfa alleler resulterar i minskad tumörbildning hos Apc (Min) möss10. Antisense oligonukleotider som slår ner DNMT1 hämmar neoplasi i cellodling och mustumörmodeller11,12. Således verkar hämmande DNMT1-aktivitet som en lovande cancerterapimetod. De roller som DNMT3-isozymerna spelar är dock inte så enkla. DNMT3a-mutationer finns i akut myeloisk leukemi13 och myelodysplastiskt syndrom14. Minst en av de identifierade mutationerna har visat sig minska DNA-metyleringsaktiviteten hos enzymet15. DNMT3b är dock överuttryckt i bröstcancer16 och kolorektal cancer17. Eftersom de olika DNMT-isozymerna spelar olika roller i cancerframkallande kommer det att vara avgörande att identifiera isozymspecifika hämmare. Dessa föreningar kommer inte bara att vara användbara för utveckling av terapier, utan isozymspecifika hämmare skulle också vara ett ovärderligt verktyg för att dissekera rollen för varje DNMT-isozym i canceretiologi.
Flera DNMT-hämmare har rapporterats i litteraturen. Kända DNMT-hämmare kan delas in i två klasser: nukleosid och icke-nukleosid. Nukleosidhämmare är vanligtvis cytidinanaloger. Dessa föreningar införlivas i DNA och kovalent fälla DNMTs. 5-azacytidin och 5-aza-2'-deoxycytidin har godkänts för behandling av myelodysplastiskt syndrom och akut myeloisk leukemi 4,18. Den höga toxiciteten, låg biotillgänglighet, och kemisk instabilitet av dessa föreningar ger problem. Pågående arbete undersöker effekten av nästa generations nukleosidhämmare; SGI-110, härledd från 5-aza-2'-deoxicytidin, är ett exempel19,20. Nukleosidhämmare är inte isozymspecifika och kommer att inaktivera alla DNMT-isozym som påträffas. Därför resulterar behandling med ett nukleosiddemetyleringsmedel i uttömning av alla DNMT-isozymer 4,18. Icke-nukleosidhämmare behöver inte införlivas i DNA för att utöva sina hämmande effekter. Istället binder dessa molekyler direkt till DNMT, vilket introducerar möjligheten till isozymspecifik hämning. Flera icke-nukleosidhämmare har hittills upptäckts, inklusive SGI-1027 21, hydralazin 22, prokainamid23, RG108 och derivat 24, och naturliga produkter, (−)-epigallocatechin 3-gallat (EGCG)25 och lakcainsyra A 26,27. De flesta av de icke-nukleosidhämmare som hittills upptäckts är inte isozymeselektiva eller visar svaga preferenser för ett DNMT-isozym. Dessutom måste styrkan hos dessa molekyler förbättras, särskilt i cellerna 4,18. Således finns det ett behov av att upptäcka eller utveckla mer potenta, isozymselektiva DNMT-hämmare.
Ett hinder för att upptäcka nya småmolekylära hämmare av DNMT är de mödosamma analyser som traditionellt används för att undersöka DNMT-aktivitet28. Analyser är vanligtvis diskontinuerliga med flera steg. Den enzymatiska aktiviteten hos DNMT analyseras fortfarande rutinmässigt med radioaktivt S-adenosylmetionin (SAM)29,30,31,32,33,34. Icke-radioaktiva analyser för DNA-metylering har också utvecklats. Till exempel har analyser som använder metylkänsliga restriktionsendonukleaser och elektrofores för att separera matsmältningsprodukterna beskrivits35,36. Dessa typer av diskontinuerliga, flerstegsanalyser är inte lätt mottagliga för läkemedelsupptäckt. Sedan mitten av 2000-talet har flera DNA-metyleringsanalyser med högre genomströmning utvecklats28. En scintillationsnärhetsanalys användes för att screena för DNMT1-hämmare37. En annan analys som använder ett metylkänsligt restriktionsendonukleas användes för att screena för DNMT3a-hämmare25,38. Medan båda analyserna möjliggjorde högre genomströmning än traditionella DNA-metyleringsanalyser, kräver analyserna flera steg och tillåter inte observation av metyleringsaktivitet i realtid. På senare tid har en kontinuerlig kinetikanalys beskrivits som kopplar bildningen av S-adenosylhomocystein (SAH), en produkt av metyleringsreaktionen, till den spektroskopiska förändringen vid 340 nm associerad med NADPH-oxidation39. Denna analys använder tre kopplingsenzymer för att generera en spektroskopisk signal.
Vi utvecklade en fluorescensbaserad endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys som använder ett enda kommersiellt tillgängligt kopplingsenzym och kan generera data i realtid (figur 1). En hårnåloligonukleotid innehållande tre metylcytosiner används som substrat. Substrat-DNA innehåller en fluorofor på 5'-änden och en släckare på 3'-änden. Metylering av det hemimetylerade CpG-stället genererar klyvningsstället för endonukleas Gla I - helt metylerad GCGC. Gla I-klyvning av produkten oligonukleotid frigör fluoroforen från släckaren och genererar fluorescens i realtid. Analysen kan användas för att undersöka aktiviteten hos vilken isoform av DNMT som helst; emellertid observeras högre aktivitet med DNMT1 eftersom detta isozym företrädesvis metylerar hemimetylerat DNA 1,5. Ännu mer robust aktivitet observeras om den autoinhibitoriska RFTS-domänen (Replication Foci Targeting Sequence) tas bort från DNMT1. Denna domän, som finns i N-terminalregleringsregionen, binder till den katalytiska platsen och förhindrar DNA-bindning. Avlägsnande av de första ~ 600 aminosyrorna resulterar i ett stympat enzym som är signifikant mer aktivt än fullängdsenzymet (~ 640-faldig ökning av kkatt / Km) 40. Denna aktiverade form av enzymet, kallad RFTS-saknad DNMT1 (aminosyror 621–1616), möjliggör enklare identifiering av hämmare på grund av dess ökade katalytiska kraft. Detta dokument presenterar ett protokoll för att använda RFTS-saknade DNMT1 i analyser för att screena för potentiella småmolekylära hämmare. Med hjälp av den endonukleaskopplade kontinuerliga analysen bestäms initialhastigheten i närvaro och frånvaro av några små molekyler. Varje potentiell hämmare undersöks vid två koncentrationer för att leta efter koncentrationsberoende DNMT1-hämning. Den procentuella aktiviteten som observerades i närvaro av de små molekylerna beräknades i varje enskilt fall.
Figur 1: DNA-metyleringsanalys. Ett hemimetylerat hårnåls-DNA med en fluorofor i 5'-änden och en släckare på 3'-änden används som substrat. DNMT1 katalyserar överföringen av metylgruppen från S-adenosylmetionin till det icke-metylerade CpG-stället, vilket genererar S-adenosylhomocystein och fullständigt metylerat DNA. DNA-produkten innehåller klyvningsstället för endonukleas Gla I, som klyver helt metylerade GCGC-platser. Klyvning av produkten DNA frigör 5'-fluoroforen från 3'-släckaren och genererar fluorescens. Förkortningar: Fl = fluorofor; Q =släckare; DNMT1 = DNA-metyltransferas 1; SAM = S-adenosylmetionin; SAH = S-adenosylhomocystein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered analyslösningar för skärmen
OBS: Koncentrationerna av substrat som används i denna analys kan anpassas. För RFTS-bristande DNMT1 är de experimentellt bestämda Km-värdena för hårnålens DNA-substrat och SAM 1–2 nM respektive 2 μM26,40.
- Bered 600 μl av varje analystillstånd som testas i mikrocentrifugrör på is.
Den totala volymen analyslösning som behövs beror på antalet replikat som utförs. Varje analysvillkor kördes i tre exemplar för det här protokollet.- Tillsätt ddH 2O och 5x metyleringsbuffert (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamat, 5 mM ditiotreitol (DTT), 25% glycerol) till varje rör för att uppnå en slutlig koncentration av 1x buffert. För analyser som innehåller 20 μM förening, tillsätt 472 μLddH2Ooch 120 μL 5x buffert. För analyser som innehåller 50 μM förening, tillsätt 470 μL ddH2O och 120 μL 5x buffert.
- Tillsätt 3,15 μl 20 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) till varje prov.
- Tillsätt 2 μL 3,15 μM hårnåls-DNA-substrat och 1,33 μL 4,75 mM SAM till varje prov.
OBS: Koncentrationen av substrat i analyslösningsblandningen är 1,05x de önskade slutliga koncentrationerna. - Tillsätt hämmare till en slutlig koncentration av 21 μM (1,26 μL av 10 mM) eller 52,5 μM (3,15 μL av 10 mM) till lämpliga prover. Tillsätt en motsvarande mängd dimetylsulfoxid (DMSO) till ett kontrollprov.
OBS: Koncentrationen av hämmare som används på skärmen kan varieras. Den maximala slutliga DMSO-koncentrationen bör vara ≤5 % (v/v). DMSO-koncentrationer upp till 5 % (v/v) har ingen effekt på den aktivitet som observerats i testet26.
- Blanda lösningarna genom att virvla (3 000 rpm) i 3 s. Snurra proverna i några sekunder i en minicentrifug på bordsskivan (1 200 × g) för att säkerställa att lösningen samlas upp i botten av röret.
- Alikvot 95 μL av varje analyslösning i 6 på varandra följande brunnar i en svart halvarea 96-brunnsplatta (figur 2).
OBS: Dessa screeninganalyser utfördes i två satser. Först undersöktes 20 μM-inhibitorprover (4 totala förhållanden), följt av 50 μM-inhibitorprover (4 totala förhållanden).
Bild 2: Inställning av analysplatta. Varje analyslösning alikvoteras i sex brunnar i den svarta 96-brunnsplattan: DMSO-kontroll (blå), förening 1 (grön), förening 2 (röd) och förening 3 (gul). Både RFTS-saknade DNMT1 och Gla I kommer att läggas till i tre brunnar. Som en kontroll kommer Gla I ensam att läggas till de andra tre brunnarna. Förkortningar: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA-metyltransferas 1; DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Förbered enzymlösningar för skärm
OBS: RFTS-saknas DNMT1 kan uttryckas i E. coli och renas till homogenitet. Uttrycks- och reningsprocedurer för RFTS-bristande DNMT1 har beskrivits tidigare41. Volymen enzym som behövs beror på antalet analyser som utförs. Här utförs fyra olika analyser i varje uppsättning; varje analys slutförs i tre exemplar.
- Bered 75 μl av varje enzymlösning i mikrocentrifugrör på is.
OBS: Två enzymlösningar kommer att behövas. En lösning kommer att innehålla DNMT1 och Gla I; den andra kommer bara att innehålla Gla I.- Tillsätt ddH 2O och 5x metyleringsbuffert (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamat, 5 mM DTT, 25% glycerol) till varje rör för att uppnå en slutlig koncentration av 1x buffert. För Gla I-enzymlösningen, tillsätt 15 μL 5x buffert och 58,8 μL ddH2O. För enzymlösningen DNMT1+Gla I, tillsätt 15 μL 5x buffert och 58,2 μLddH2O.
- Tillsätt 1,2 μl 10 U/μl Gla I till varje lösning för en slutlig koncentration på 0,16 U/μl.
- Tillsätt 0,6 μL 5 μM RFTS-saknas DNMT1 för en slutlig koncentration på 40 nM till DNMT1+Gla I-lösningen.
- Tryck försiktigt för att blanda lösningarna. Snurra proverna i några sekunder i en minicentrifug på bordsskivan (1 200 × g) för att säkerställa att lösningen samlas upp i botten av röret.
- Alikvot 12 μL av varje enzymlösning i 6 brunnar i en konisk bottenplatta med 96 brunnar (figur 3).
Figur 3: Inställning av enzymplatta. Lösningarna Gla I (grå) och DNMT1+Gla I (blå) alikvoteras var och en i sex brunnar i 96-brunnsplattan. Med hjälp av en flerkanalig pipett kan enzymet tillsättas till en rad analyslösningar samtidigt. För varje analystillstånd (sex brunnar) kommer tre brunnar att få DNMT1+Gla I och tre brunnar kommer att få Gla I ensam. Förkortning: DNMT1 = DNA-metyltransferas 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Kör analysen och analysera data.
- Förvärm plattläsaren till 37 °C. Sätt i den svarta plattan som innehåller analyslösningarna. Skaka plattan (dubbel orbital vid 425 cpm i 5 s) och läs fluorescensen med en excitationsvåglängd på 485 nm och en emissionsvåglängd på 528 nm. Inkubera plattan vid 37 °C i 5 minuter.
OBS: Alternativt kan filter med rätt våglängdsavgränsningar användas för fluorescensavläsningarna. - Ta bort analysplattan. Tillsätt 5 μl enzymlösning till varje brunn och blanda genom pipettering upp och ner.
OBS: Använd flerkanaliga pipetter så att en rad prover kan initieras samtidigt. - Sätt i plattan i plattläsaren. Spela in fluorescens var 53: e s i 30 minuter. Skaka plattan (dubbel orbital vid 425 cpm i 4 s) före varje avläsning.
- Genomsnittliga tredubbla Gla I-kontrollanalyser för varje tillstånd. Subtrahera det genomsnittliga Gla I-innehållande kontrollreaktionsspåret från de tredubbla spåren erhållna i närvaro av RFTS-saknad DNMT1. Bestäm medelvärdet och standardfelet för medelvärdet för de korrigerade replikaten.
- Plotta det genomsnittliga korrigerade reaktionsspåret och anpassa den ursprungliga linjära delen till en linje för att bestämma initialhastigheten.
- Bestäm procentaktiviteten genom att dividera hastigheten som observerats i närvaro av en förening med den hastighet som observerats i den DMSO-innehållande kontrollreaktionen och multiplicera med 100.
4. Ytterligare analyskontroll – sekventiell tillsats av enzymer
- Bered 550 μL analyslösning i ett mikrocentrifugrör på is. Tillsätt 110 μL 5x metyleringsbuffert, 3,88 μL 3,15 μM hårnåls-DNA-substrat, 6,43 μL 47,5 mM SAM, 3,06 μL 20 mg/ml BSA och 426,6 μLddH2O.
- Blanda lösningen genom virvel (3 000 rpm) i 3 s. Snurra proverna i några sekunder i en minicentrifug på bordsskivan (1 200 × g) för att säkerställa att lösningen samlas upp i botten av röret.
- Alikvot 90 μL av analyslösningen i 6 på varandra följande brunnar i en svart halvarea 96-brunnsplatta.
- Förbered DNMT1-enzymlösningarna på is. Tillsätt 4 μL 5x metyleringsbuffert, 0,76 μL 5 μM RFTS-saknas DNMT1 och 15,24 μL ddH2O till ett rör. Tillsätt 4 μl 5x metyleringsbuffert och 16 μl ddH2O-rör till ettannat rör.
- Tryck försiktigt för att blanda lösningarna. Snurra proverna i några sekunder i en minicentrifug på bordsskivan (1 200 × g) för att säkerställa att lösningen samlas upp i botten av röret.
- Tillsätt 5 μL av den DNMT1-innehållande lösningen till tre brunnar i den svarta halvarea 96-brunnsplattan. Tillsätt 5 μl av buffertkontrolllösningen till de andra tre brunnarna.
- Placera mikrotiterplattan i plattläsaren förvärmd till 37 °C. Skaka plattan (dubbel orbital vid 425 cpm i 3 s) och läs fluorescensen med en excitationsvåglängd på 485 nm och en emissionsvåglängd på 528 nm. Upprepa skakningen och läs var 60: e s i 30 minuter.
- Medan analysplattan finns i plattläsaren, förbered Gla I-lösningen på is. Tillsätt 8 μl 5x metyleringsbuffert, 0,64 μl 10 U/μL Gla I och 31,4 μlddH2OOtill ett mikrocentrifugrör. Tryck försiktigt för att blanda lösningen. Snurra provet i några sekunder i en minicentrifug på bordsskivan (1 200 × g) för att säkerställa att lösningen samlas upp i botten av röret.
- Alikvot 6 μL av Gla I-lösningen i 6 brunnar i en konisk bottenad 96-brunnsplatta.
- Efter den första 30 minuters läsningen, ta bort den svarta plattan från plattläsaren. Tillsätt 5 μL Gla I-lösning till alla 6 brunnar och blanda genom pipettering upp och ner.
OBS: Använd en flerkanalig pipett så att alla brunnar kan initieras samtidigt. - Sätt tillbaka den svarta plattan i plattläsaren. Spela in fluorescens var 35: e s i 35 min. Skaka plattan (dubbel orbital vid 425 cpm i 3 s) före varje avläsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aktiv DNMT1 är en förutsättning för denna analys. RFTS-bristande DNMT1 uttrycktes i E.coli och renades till homogenitet efter tidigare publicerade förfaranden41. För att säkerställa att det renade enzymet var aktivt användes en diskontinuerlig endonukleaskopplad analys för att undersöka DNA-metyleringsaktivitet36. Denna analys använder ett 32 baspar duplex-DNA med en enda hemimetylerad CpG placerad i en Sau3A1-klyvningsplats. Sau3A1 kan klyva det hemimetylerade substrat-DNA; klyvning blockeras emellertid när DNA är helt metylerat. RFTS-saknade DNMT1 tillsattes till analyser som innehöll 1 μM DNA och 0,5 mM SAM, och alikvoter avlägsnades och blixtfrystes över 30 minuter. Prover smältes därefter med Sau3A1, och produkterna separerades genom gelelektrofores. Som visas i figur 4 skyddas DNA från klyvning när reaktionstiden ökar, vilket indikerar att RFTS-saknad DNMT1 metylerar det hemimetylerade DNA. Det mesta av det 1 μM-substrat-DNA som ursprungligen fanns i analysen har omvandlats till produkt under 30-minuters tidsförloppet.
Den endonukleaskopplade analysen som beskrivs i detta dokument möjliggör observation av DNA-metyleringsaktivitet i realtid som en ökning av fluorescensen. Nyckeln till framgången för denna analys är metylkänsligheten hos endonukleaset Gla I. Gla I klyver inte effektivt det hemimetylerade substrat-DNA:t utan kommer att klyva det helt metylerade produkt-DNA:t (figur 1). Klyvning av hårnålens DNA krävs för att frigöra fluoroforen från släckaren och generera en ökning av fluorescensen. För att visa att enzymerna fungerar som förväntat genomfördes en kontrollreaktion där enzymerna, RFTS-saknade DNMT1 och Gla I, tillsattes sekventiellt snarare än samtidigt. Om den kopplade analysen fungerar korrekt bör tillsatsen av DNMT1 inte påverka fluorescensen, eftersom metylering av DNA-substratet inte förväntas påverka bakgrundsfluorescensen hos det internt släckta hårnåls-DNA: t. Efterföljande tillsats av Gla I till analyser som innehöll metyltransferaset bör dock resultera i fluorescensgenerering på grund av klyvning av det helt metylerade hårnåls-DNA: t. Det hemimetylerade hårnåls-DNA-substratet i sig har bakgrundsfluorescens (figur 5); dessa analyser innehöll 20 nM hårnåls-DNA och 500 μM SAM. RFTS-saknade DNMT1 eller buffert tillsattes till analyserna och fluorescens följdes i 30 minuter.
Som framgår av figur 5 påverkas fluorescensen inte av RFTS-bristande DNMT1 i frånvaro av kopplingsenzymet (blå nyanser innehöll 10 nM RFTS-saknas DNMT1 medan röda nyanser är buffertkontrollen). Således förändrar metylering av det hemimetylerade CpG-stället med DNMT1 inte märkbart fluorescenssignalen. Men när Gla I tillsattes i alla brunnar observerades robust fluorescensgenerering endast i de analyser som innehöll RFTS-saknad DNMT1 (figur 5). Detta visar att metylering av det hemimetylerade substrat-DNA med DNMT1 krävs för Gla I-klyvning och generering av fluorescens. Det bör noteras att ökningen av fluorescens som observerats i denna kontrollanalys återspeglar aktiviteten hos Gla I eftersom enzymerna tillsattes sekventiellt. Alternativt kan dessa reaktionsblandningar smältas med Gla I, och de resulterande oligonukleotiderna kan separeras genom elektrofores för att visualisera klyvning och säkerställa att enzymerna fungerar som förväntat.
För att använda denna kopplade analys för att direkt bestämma initialhastigheterna för DNMT1 måste båda enzymerna, RFTS-saknar DNMT1 och Gla I, läggas till samtidigt. Så länge hastigheten för Gla I-klyvning av produkt-DNA är snabbare än DNA-metyleringshastigheten med DNMT1, kommer den genererade fluorescenssignalen att återspegla DNA-metyleringsaktivitet. För att säkerställa att DNMT1-aktiviteten är hastighetsbegränsande kan koncentrationen av DNMT1 varieras samtidigt som alla andra analysförhållanden hålls konstanta. Hastigheten för fluorescensgenerering bör vara proportionell mot koncentrationen av DNMT1. Detta har tidigare visats för RFTS-bristande DNMT1 under de förhållanden som används här40. När denna kopplade analys används för att undersöka DNMT-aktivitet utförs en Gla I-innehållande kontrollreaktion utöver reaktionen som innehåller både DNMT1 och Gla I (figur 6A). Gla I-kontrollen har flera funktioner. Subtrahering av Gla I-kontrollreaktionsspåret från det DNMT-innehållande reaktionsspåret möjliggör redovisning av både långsam klyvning av det hemimetylerade DNA-substratet och bakgrundsfluorescensen. De korrigerade reaktionsspåren som genereras återspeglar DNA-metyleringsaktiviteten hos DNMT1. Anpassning av den ursprungliga linjära delen av det korrigerade reaktionsspåret möjliggör bestämning av initialhastigheten (figur 6B). Med 10 nM hårnåls-DNA-substrat och 10 μM SAM erhölls en initialhastighet på 113 ± 2 RFU/min.
Substituerade antrakinoner har tidigare visat sig hämma aktiviteten av DNMT1. Den naturliga produkten, lakkainsyra A, en mycket substituerad antrakinon, är en potent, DNA-konkurrenskraftig hämmare av DNMT127. Några föreningar med enklare strukturer, en eller två substituenter på antrakinonkärnan, där en är en skrymmande aromatisk substituent, har också visat sig hämma DNMT1 på ett DNA-konkurrenskraftigt sätt41. Här undersöktes förmågan hos tre substituerade antrakinoner eller antrakinonliknande molekyler att hämma RFTS-saknad DNMT1-aktivitet i den Gla I-kopplade analysen som ett exempel på hur man utför dessa screeninganalyser. Dessa föreningar innehöll en till tre substituenter, alla på ena sidan av antrakinonkärnan (tabell 1). Substratkoncentrationerna (10 nM DNA och 10 μM SAM) som används för dessa analyser är ~ 5x högre än Km för varje substrat. Signalen som genereras i analysen kommer direkt från substratets DNA. På grund av detta är det svårt att analysera vid koncentrationer nära eller under Km; det finns helt enkelt inte tillräckligt med signal för att upptäcka. Dessa substratkoncentrationer valdes eftersom robust aktivitet ses under dessa förhållanden i frånvaro av hämmare (figur 6B). Andra substratkoncentrationer kan användas vid screeninganalyser. Till exempel kan en skärm vid mättande SAM-koncentrationer användas som en strategi för att bias sökningen mot SAM-konkurrenskraftiga hämmare.
Varje analys innehöll hårnålens DNA-substrat, den metyldonerande samfaktorn SAM och en potentiell hämmare eller DMSO som kontroll för skärmen. Vi genererar rutinmässigt 10 mM-lösningar av screeningföreningar i DMSO för användning i analyser. Antrakinoner som de som undersöks här uppvisar dålig löslighet i vattenhaltiga lösningar. För att generera koncentrerade lager används DMSO som lösningsmedel. Tillsatsen av DMSO upp till 5 % (v/v) slutlig koncentration påverkar inte aktiviteten i testet26. Vid hantering av föreningar med låg löslighet i vattenlösning bör dock försiktighet iakttas för att säkerställa att föreningen är löslig vid den eller de valda slutliga screeningkoncentrationerna.
För varje tillstånd som undersöks på skärmen utförs en Gla I-innehållande kontrollanalys. Förutom att redovisa bakgrundsfluorescens och långsam klyvning av substratets hårnåls-DNA, möjliggör denna kontroll bestämning av om den potentiella hämmaren stör den spektroskopiska signalen (t.ex. den är fluorescerande). Efter att ha initierat reaktionen genom tillsats av enzymer mättes fluorescens i 30 minuter med ett tidsintervall på 53 s i screeningdata. Detta är det snabbaste tidsintervallet som finns tillgängligt på plattläsaren i detta laboratorium när du läser en hel 96-brunnsplatta. Andra tidsintervall kan användas för att generera reaktionsspåren. Ett lämpligt tidsintervall beror på vilket instrument som används och antalet brunnar som läses. För att säkerställa reproducerbarhet utförs varje analys i tre exemplar. Det genomsnittliga Gla I-innehållande kontrollspåret subtraheras från de reaktionsspår som observerats i närvaro av RFTS-saknad DNMT1. Reaktionens initialhastighet kan bestämmas genom att montera den initiala linjära delen av de korrigerade reaktionsspåren.
Inledningsvis undersöktes effekten av tre potentiella hämmare på fluorescensgenerering vid en slutlig koncentration på 20 μM. Högre koncentrationer av de potentiella hämmarna valdes för screening av två skäl. För det första ligger substratkoncentrationerna i analysen båda över sina respektive Km-värden . Detta kan göra det svårare att upptäcka hämning i kinetiska analyser, särskilt om hämmarna är konkurrenskraftiga. För det andra är de antrakinonliknande föreningarna som används i denna skärm betydligt enklare i struktur än den kända hämmaren, lakcainsyra A. Eftersom dessa molekyler bara innehåller några få substituenter runt kärnstrukturen, förväntade vi oss svagare interaktioner. I den DMSO-innehållande kontrollanalysen erhölls en initialhastighet på 111 ± 5 RFU/min (figur 7A). Observera att detta är mycket likt den frekvens som rapporterats tidigare i avsaknad av DMSO och bekräftar att tillsatsen av låga mängder DMSO inte påverkar den observerade aktiviteten. Tillsatsen av två föreningar minskade den observerade initialhastigheten, medan tillsatsen av den tredje föreningen inte hade någon effekt på aktiviteten. De initiala hastigheterna användes för att bestämma den procentuella aktiviteten som observerades i närvaro av varje förening. Vid 20 μM resulterade tillsatsen av föreningarna 1 och 2 i en procentaktivitet på ~ 80%, medan 100% procent aktivitet observerades i närvaro av förening 3, vilket indikerar att denna molekyl inte hämmar enzymet (tabell 1).
Hämmare förväntas uppvisa koncentrationsberoende hämning. Därefter undersöktes dessa molekyler på nytt i en ännu högre koncentration av 50 μM. För denna uppsättning analyser hade den DMSO-innehållande kontrollanalysen en initialhastighet på 125 ± 7 RFU/min (figur 7B). Denna hastighet är något högre än de tidigare bestämda hastigheterna; dessa hastigheter är dock alla relativt nära inom fel. Återigen hade förening 3 liten effekt på initialhastigheten, medan tillsatsen av föreningarna 1 och 2 minskade den observerade initialhastigheten. Som väntat hade förening 1 vid den högre koncentrationen en större inverkan på aktiviteten. Vid 50 μM resulterade tillsatsen av förening 1 i en procentuell aktivitet på ~ 60% (tabell 1). Tillsatsen av en högre koncentration av förening 2 resulterade emellertid inte i mer robust hämning. Den procentuella aktiviteten som observerades i närvaro av 50 μM förening 2 var återigen nära 80%.
Som framgår av de data som presenteras kan den endonukleaskopplade fluorescensbaserade DNA-metyleringsanalysen användas för att screena för potentiella DNMT-hämmare. Uppgifterna indikerar att förening 1 och förening 2 är potentiella hämmare, medan förening 3 inte är det. Ytterligare studier krävs för att validera de potentiella hämmarna som sanna DNMT1-hämmare.
Bild 4: DNMT1 aktivitetskontroll. Hemimetylerad duplex-DNA-metylering skyddar mot Sau3A1-klyvning. RFTS-saknad DNMT1 tillsattes till analysblandningar innehållande 1 μM DNA och 500 μM SAM. Proverna samlades in vid de angivna tidpunkterna under en 30-minuters inkubation vid 37 °C, rötades med Sau3A1 och löstes upp genom gelelektrofores på 18 % PAGE. Här visas 5, 10, 15 och 30 min prover. Den första körfältet är en kontroll som saknar DNMT1. Förkortningar: DNMT1 = DNA-metyltransferas 1; RFTS = Målsekvens för replikeringsfokus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fluorescensbaserad analyskontroll. RFTS-saknade DNMT1 (10 nM slutkoncentration) och Gla I (0,8 U) tillsattes sekventiellt till tredubbla analyser innehållande 20 nM hårnåls-DNA-substrat och 500 μM SAM. Tillsats av DNMT1 (blå cirklar) eller buffert (röda cirklar) ensam hade ingen effekt på bakgrundsfluorescens. Tillägg av Gla I till alla analyser resulterar i fluorescensgenerering i analyser som innehöll DNMT1, men inte i analyser som inte gör det. Förkortningar: DNMT1 = DNA-metyltransferas 1; RFTS = Replikeringsfokuseringsinriktningssekvens; RFU = relativa fluorescensenheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Spår av fluorescensreaktion. Tredubbla analyser innehöll 10 nM hårnåls-DNA-substrat och 10 μM SAM. (A) RFTS-saknade DNMT1 (2 nM) och Gla I (0,8 U) lades till i tre analyser (blå) och Gla I (0,8 U) ensam lades till i tre analyser (röd). Robust fluorescensgenerering observeras endast i analyserna som innehåller båda enzymerna. (B) Det genomsnittliga Gla I-reaktionsspåret subtraherades från DNMT1 + Gla I-reaktionspåren. Medelvärdet och standardfelet för medelvärdet av tredubbla data visas. Montering av den linjära delen av spåret ger en initialhastighet på 113 ± 2 RFU/min. Förkortningar: DNMT1 = DNA-metyltransferas 1; RFTS = Replikeringsfokuseringsinriktningssekvens; RFU = relativa fluorescensenheter; SAM = S-adenosylmetionin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: DNA-metyleringsaktivitet i närvaro av potentiella hämmare. DNA-metyleringsaktivitet av RFTS-saknad DNMT1 undersöktes i närvaro av DMSO (svart), förening 1 (röd), förening 2 (blå) eller förening 3 (grön). Korrigerade reaktionsspår vid 20 μM förening (A) och 50 μM förening (B) var lämpliga för att bestämma initialhastigheten. Tillsats av föreningarna 1 och 2 minskade den observerade hastigheten, medan förening 3 hade liten inverkan på aktiviteten. Medelvärdet och standardfelet för medelvärdet för tredubbla analyser visas. Förkortningar: DNMT1 = DNA-metyltransferas 1; RFTS = Replikeringsfokuseringsinriktningssekvens; RFU = relativa fluorescensenheter; DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Initiala hastigheter och procentaktiviteter observerade i närvaro av potentiella småmolekylära hämmare. Initialhastigheten bestämdes genom att anpassa den initiala linjära delen av korrigerade reaktionsspår till en linje; felet i samband med passformen rapporteras. Procentaktivitet bestämdes genom att dividera hastigheten bestämd i närvaro av förening med den hastighet som bestämdes i DMSO-kontrollreaktionen och multiplicera med 100; associerat fel spreds. Förkortningar: Cmpd = förening; DMSO = dimetylsulfoxid; RFU = relativa fluorescensenheter. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att identifiera och karakterisera hämmare av DNA-metyltransferaser måste enzymets aktivitet mätas. Det finns flera metoder för att undersöka DNA-metyltransferasaktivitet. Aktiviteten övervakas vanligtvis med hjälp av radioaktivitet; överföring av den märkta metylgruppen av SAM kan kvantifieras 29,30,31,32,33,34. Gelbaserade analyser som använder metylkänsliga endonukleaser har också beskrivits35,36. Dessa analyser är vanligtvis diskontinuerliga och kräver flera steg för att undersöka aktiviteten. Här beskrivs en endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys för att screena för potentiella DNA-metyltransferashämmare. Denna teknik har flera fördelar. Analysen är relativt enkel. Det kräver inte separationstekniker (t.ex. elektrofores, filterbindning) för att erhålla en signal. Dessutom är analysen kontinuerlig, vilket möjliggör insamling av data i realtid. En annan kontinuerlig kinetikanalys för metyleringsaktivitet beskrevs nyligen39. Denna analys kräver emellertid tre kopplingsenzymer för att generera en spektroskopisk signal. Analysen som beskrivs här kräver ett enda kopplingsenzym.
Dessa DNMT-aktivitetsanalyser utförs genom att först generera en analyslösning som innehåller alla analyskomponenter utom enzymerna. Analyslösningarna innehåller substraten, hårnåls-DNA och SAM; 0,1 mg/ml BSA ingår också rutinmässigt i analyserna. Med de extremt låga koncentrationerna (i det nanomolära intervallet) av DNA och DNMT1 som används i analysen ökar BSA den allmänna proteinkoncentrationen för att förhindra vidhäftning till pipettspetsar, rör och mikrotiterplattor och miljöförolämpningar som kan påverka enzymaktiviteten. Reaktionen initieras sedan genom att tillsätta enzymer till analyslösningarna. Dessa utspädningar måste beaktas vid bestämningen av de slutliga koncentrationerna av alla analyskomponenter. Reaktioner initieras genom tillsats av 5 μL enzymlösning till 95 μL analyslösning. Därför är koncentrationerna av DNA, SAM och BSA i analyslösningarna 1,05x den önskade slutliga koncentrationen. Till exempel, om 10 nM DNA önskas, genereras analyslösningar med 10, 5 nM DNA. Koncentrationen av RFTS-saknad DNMT1 i enzymlösningen är 20x den önskade slutliga koncentrationen. Här användes 40 nM RFTS-saknad DNMT1 i enzymlösningen så att den slutliga koncentrationen av DNMT1 i varje analys var 2 nM.
Eftersom Gla I är ett kommersiellt tillgängligt enzym anges dess kvantitet i enheter (U) enligt tillverkarens uppgifter. Enzymlösningarna som genereras innehåller 0,16 U / μL Gla I så att totalt 0,8 U Gla I tillsätts till varje brunn. För att spara på reagenskostnader framställs små volymer av lämpliga enzymlösningar, och dessa lösningar alikvoteras sedan i koniska bottenplattor med 96 brunnar. Med hjälp av flerkanaliga pipetter överförs 5 μL enzymlösningar från den koniska bottenplattan till analyslösningarna i den svarta 96-brunnshalvareaplattan. Denna process gör det möjligt att initiera en rad analyser samtidigt. Alternativt, med en annan analysplattinställning, kan enzymlösningar placeras i reagensreservoarer, och sedan kan flerkanaliga pipetter användas för att tillsätta enzym till analyslösningarna. Detta tillvägagångssätt kommer emellertid att kräva högre volymer enzymlösning på grund av flytande återvinningsavfall i behållarna. Vi utför analyserna i 96-brunnar halvområdesplattor; den mindre brunnsstorleken i dessa plattor möjliggör en mindre total analysvolym (100 μl) än traditionella 96-brunnsplattor, vilket återigen sparar reagenskostnader.
DNA-metyleringsanalysen som beskrivs här kräver ett hemimetylerat substrat-DNA på grund av specificiteten hos kopplingsendonukleaset Gla I. Detta gör analysen särskilt bra för att undersöka aktiviteten hos DNMT1, eftersom detta isozym företrädesvis metylerar hemimetylerat DNA1. DNMT3-isozymerna uppvisar ingen preferens mellan icke-metylerat och hemimetylerat DNA1. Således kan denna analys också användas för att undersöka aktiviteten hos DNMT3-isozymerna. Faktum är att hämning av DNMT3a av små molekyler har bedömts med hjälp av denna analys26,27,41. Kravet på ett hemimetylerat substrat-DNA innebär att denna analys inte kan användas för att undersöka substratspecificitet eller preferens mellan icke-metylerade och hemimetylerade CpG-platser.
Denna analys bygger på en spektroskopisk signal: ökningen av fluorescens när fluoroforen och släckaren separeras. Således kan små molekyler som själva fluorescerar eller släcker fluorescens störa analysen. En anledning att genomföra den Gla I-innehållande kontrollen för varje analystillstånd är att kontrollera denna möjlighet. De spektroskopiska egenskaperna hos den lilla molekylen kan redovisas helt enkelt genom att använda Gla I-kontrolldata (t.ex. om molekylen har en svag fluorescenssignal). Men om molekylen är starkt fluorescerande eller en stark släckare, kan denna analys inte användas för att detektera DNA-metyleringsaktivitet.
Skärmen som beskrivs här är en första analys för att upptäcka potentiella DNMT-hämmare. Föreningar som är "träffar" i den ursprungliga skärmen måste valideras i sekundära analyser för att säkerställa att de är sanna DNMT-hämmare. Eftersom denna analys är en kopplad kinetikanalys, betyder det inte nödvändigtvis att föreningen hämmar metyltransferaset att observera en minskning av fluorescensgenereringen i närvaro av en viss liten molekyl. En liten molekyl som kan hämma kopplingsenzymet Gla I skulle också resultera i en observerad minskning av fluorescensgenerering. En enkel sekundär skärm innebär att man bestämmer aktiviteten hos Gla I i närvaro och frånvaro av de potentiella hämmarna. För denna analys används det helt metylerade internt släckta hårnåls-DNA:t som ett substrat26,41. Ytterligare analyser utformade för att undersöka aggregeringsberoende hämning och DNA-interkalation kan också användas som sekundära analyser för att ytterligare validera potentiella hämmare26,41. I de data som presenteras här identifierades förening 1 och förening 2 som potentiella DNMT1-hämmare. Med hjälp av en mängd sekundära analyser har förening 1 validerats som en direkt hämmare av DNMT141. Detta tidigare publicerade arbete visade att föreningar som innehåller skrymmande substituenter vid C2-positionen av antrakinonkärnan verkade vara mer effektiva hämmare av DNMT1. Emellertid, fler studier behövs för att fullt ut förstå de strukturella determinanterna för DNMT1 hämning.
Den kopplade analysen som beskrivs här har flera potentiella användningsområden. Analysen kan användas för steady-state kinetikexperiment. Eftersom analysen är kontinuerlig är det enkelt att bestämma initialhastigheter. Denna analys har tidigare använts för att undersöka makroskopiska kinetiska parametrar (dvs Km, Vmax och kkatt) av olika stympade DNMT1-proteiner40. Analysen har använts för att undersöka en liten uppsättning molekyler för DNMT1-hämning 41 och bedöma isozymspecificitet hos identifierade hämmare genom att undersöka deras inverkan på DNMT3a-aktivitet26,27,41. Analysen har också använts för att karakterisera hämmare. Mekanismen för hämning och styrka (t.ex. Ki, IC50) för båda hämmande proteindomänerna36,40 och nya små molekyler27,41 har bestämts med hjälp av denna kopplade kinetikanalys. Analysen har också anpassats för användning i en HTS-kampanj. I det här fallet miniatyriserades analysen vidare till ett 384-brunnsformat och användes som en slutpunktsanalys för den ursprungliga skärmen26. Således är den fluorescensbaserade endonukleaskopplade DNA-metyleringsanalysen som beskrivs här en mångsidig analys som kan användas för att undersöka aktiviteten hos DNA-metyltransferaser och möjliggör identifiering och karakterisering av småmolekylära hämmare av dessa viktiga epigenetiska modifierare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Bucknell University och Institutionen för kemi för deras stöd för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 3694 | |
| 96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates | ThermoFisher | 249570 | |
| Bovine Serum Albumin | NEB | B9000S | |
| compound 1 | ChemBridge | 5812086 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 2 | ChemBridge | 6722175 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 3 | ChemBridge | 5249376 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | methyl-sensitive endonuclease |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M0250 | |
| Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | custom synthesized | internally quenched hairpin DNA (substrate) |
| Potassium Glutamate | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | methyl-donating co-factor (substrate) |
| Tris Base | RPI | T60040 |
References
- Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
- Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
- Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
- Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
- Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
- Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
- Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
- MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
- Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
- Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
- MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
- Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
- Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
- Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
- Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
- Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
- Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
- Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
- Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
- Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
- Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
- Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
- Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
- Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
- Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
- Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
- Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
- Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
- Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
- Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
- Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
- Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
- Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
- Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
- Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
- Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
- Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
- Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
- Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
- Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
- Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).
