Das verfeinerte Tail Vein Transection (TVT) Blutungsmodell bei anästhesierten Mäusen ist eine sensitive in vivo Methode zur Beurteilung hämophiler Blutungen. Dieses optimierte TVT-Blutungsmodell verwendet Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte, verfeinert andere Modelle und vermeidet den Tod als Endpunkt.
Schwanzblutungsmodelle sind wichtige Werkzeuge in der Hämophilieforschung, insbesondere für die Beurteilung von Prokoagulanzienwirkungen. Das Überlebensmodell der Tail Vein Transection (TVT) wurde in vielen Umgebungen aufgrund der Empfindlichkeit gegenüber klinisch relevanten Dosen von FVIII bevorzugt, während andere etablierte Modelle, wie das Tail-Clip-Modell, höhere Konzentrationen von Prokoagulanzienverbindungen erfordern. Um zu vermeiden, dass das Überleben als Endpunkt verwendet wird, haben wir ein TVT-Modell entwickelt, das Blutverlust und Blutungszeit als Endpunkte und Vollnarkose während des gesamten Experiments festlegt. Kurz gesagt, anästhesierte Mäuse werden mit dem Schwanz in gemäßigte Kochsalzlösung (37 ° C) eingetaucht positioniert und mit der Testverbindung in der rechten lateralen Schwanzvene dosiert. Nach 5 Minuten wird die linke seitliche Schwanzvene mit einer Schablonenführung durchblutet, der Schwanz wird zur Kochsalzlösung zurückgeführt und alle Blutungsepisoden werden überwacht und für 40 Minuten aufgezeichnet, während das Blut gesammelt wird. Wenn nach der Verletzung 10 min, 20 min oder 30 min keine Blutung auftritt, wird das Gerinnsel sanft herausgefordert, indem der Schnitt zweimal mit einem nassen Mulltupfer abgewischt wird. Nach 40 min wird der Blutverlust durch die Menge an Hämoglobin quantifiziert, die in die Kochsalzlösung blutet. Dieses schnelle und relativ einfache Verfahren führt zu konsistenten und reproduzierbaren Blutungen. Im Vergleich zum TVT-Überlebensmodell verwendet es ein humaneres Verfahren, ohne die Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Eingriffen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus ist es möglich, beide Geschlechter zu verwenden, wodurch die Gesamtzahl der Tiere, die gezüchtet werden müssen, unter Einhaltung der Prinzipien von 3R reduziert wird. Eine mögliche Einschränkung bei Blutungsmodellen ist die stochastische Natur der Hämostase, die die Reproduzierbarkeit des Modells verringern kann. Um dem entgegenzuwirken, stellt die manuelle Gerinnselstörung sicher, dass das Gerinnsel während der Überwachung herausgefordert wird, wodurch verhindert wird, dass die primäre (Thrombozyten-) Hämostase die Blutung stoppt. Diese Ergänzung des Katalogs der Blutungsverletzungsmodelle bietet die Möglichkeit, prokoagulantische Effekte auf standardisierte und humane Weise zu charakterisieren.
Tiermodelle sind unerlässlich, um die Pathogenese der Hämophilie zu verstehen und Behandlungsschemata und Therapien zu entwickeln und zu testen. Die Faktor-VIII-Knock-out-Maus (F8-KO) ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung von Hämophilie A 1,2. Diese Mäuse rekapitulieren Schlüsselmerkmale der Krankheit und wurden häufig für die Entwicklung von Behandlungen wie rekombinanten FVIII-Produkten 3,4,5 und Gentherapiestrategien 6,7 verwendet.
Es gibt verschiedene Blutungsverletzungsmodelle zur Bewertung der pharmakologischen Wirkungen verschiedener hämostatischer Verbindungen in vivo. Eines dieser Gerinnungsmodelle ist das Überlebensmodell der Schwanzvenentransektion bei Mäusen 8,9,10,11,12,13,14, das die Fähigkeit hämophiler Mäuse misst, Exsanguination nach Schwanztransektion zu überleben. Diese Methode wurde vor mehr als vier Jahrzehnten 15 eingeführt und wird immernoch 9,16,17 verwendet. Das Modell nutzt jedoch das Überleben als Endpunkt und erfordert die Beobachtung der Tiere über einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden, in dem die Tiere bei Bewusstsein sind und daher Schmerzen und Leiden erfahren können.
Blutungsmodelle mit kürzerer Dauer und unter Vollnarkose wurden bereits beschrieben, wie das Heckclip-Modell (auch bekannt als Schwanzspitze)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Für eine vollständige Normalisierung des Blutverlustes nach der Blutungsherausforderung erfordern diese Modelle jedoch Dosen von Prokoagulanzien (z. B. FVIII), die weit höher sind als die klinischverabreichten 29. Ein anderes Verletzungsmodell unter Narkose, die Vena-Saphena-Blutungsmethode, ist empfindlich gegenüber niedrigeren Dosen von Prokoagulanzienverbindungen30, erfordert jedoch ein hohes Maß an Experimentatorintervention, da die Gerinnsel häufig gestört werden müssen (im Gegensatz zu 3 Mal im vorgestellten Modell).
Die Standardisierung hin zu einem gemeinsamen Protokoll zur Prüfung neuer Prokoagulanzienverbindungen würde den Datenvergleich zwischen Laboratorienerheblich erleichtern 31,32,33. In TVT-Modellen gibt es noch keine gemeinsame Übereinstimmung über die untersuchten Endpunkte (Blutverlust 7,26, Blutungszeit9,34 und Überlebensrate35,36), und die experimentelle Länge variiert zwischen den Studien13.
Unser primäres Ziel ist es, ein optimiertes Modell mit hoher Reproduzierbarkeit, der Möglichkeit, On-Demand sowie eine prophylaktische Behandlung zu untersuchen, der Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Interventionen, die dem Überlebensmodell entsprechen, zu beschreiben und zu charakterisieren, jedoch nicht den Tod oder den Nahtod als Endpunkte zu verwenden. Um Schmerzen und Leiden zu lindern, sollten die Tiere während der Blutung nicht bei Bewusstsein sein und ein ethischerer Endpunkt muss implementiertwerden 37.
Heckclip-Modelle werden im Allgemeinen in einer von zwei Varianten durchgeführt, entweder mit Amputation der Schwanzspitze, z. B. Amputation von 1-5 mm18,19,20,21,23,24 oder, in einer schwereren Variante, bei einem Heckdurchmesser um 1-3 mm 8,22,25 . Dies verursacht eine kombinierte arteriovenöse Blutung, da die lateralen und dorsalen Venen und die ventrale Arterie normalerweise durchtrennt sind, und im Allgemeinen gilt: Je größer die Amputation, desto geringer ist die Empfindlichkeit gegenüber einer Prokoagulansverbindung. Da die Schwanzspitze amputiert ist, ist die arteriovenöse Verletzung ohne Gegengewebe freigelegt; Daher ist es, zumindest in der Theorie, den häufigsten hämophilen Blutungen unähnlich.
Wie der Name schon sagt, wird nur die Vene bei Schwanzvenentranssektionsmodellen, wie sie in dieser Arbeit beschrieben sind, verletzt, was zu einer ausschließlich venösen Blutung führt. Da das Gefäß nicht vollständig durchtrennt ist, wird erwartet, dass die Verletzung kleiner ist als bei den Amputationsmodellen, und das Gewebe um den Schnitt, an dem ein Gerinnsel haften kann, bleibt erhalten. Darüber hinaus gibt es einen niedrigeren Blutdruck in der Vene im Gegensatz zur Arterie. Diese Faktoren tragen zu einer erhöhten Sensitivität im Vergleich zu Amputationsmodellen bei, so dass eine Normalisierung der Blutung mit klinisch relevanten Dosen der Ersatztherapie erreicht werden kann, z. B. mit rFVIII bei Hämophilie A, was für die Beurteilung des Ausmaßes und der Haltbarkeit der Wirkungen der Prokoagulanzienbehandlungnützlich ist 26,38,39.
Diese optimierte Methode der Schwanzvenentransektion (TVT) hat mehrere Vorteile gegenüber der TVT-Überlebensmethode. Die Tiere werden während der gesamten Studiendauer vollständig betäubt, was die Handhabung der Maus erleichtert und das Wohlbefinden der Tiere erhöht. Darüber hinaus ist im Gegensatz zum TVT-Überlebensmodell keine Beobachtung über Nacht erforderlich, und dieses optimierte Modell bietet die Möglichkeit, den Blutverlust zu messen und die genaue Blutungszeit über 40 Minuten zu beobachten. Auch län…
The authors have nothing to disclose.
Esther Bloem und Thomas Nygaard sind für ihre Unterstützung bei Messungen von FVIII im Plasma anerkannt. Bo Alsted ist für das Zeichnen und Bearbeiten der Schablonen und Schneidblöcke anerkannt.
#11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
Gauze | |||
Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
Magnifier with lights | Eschenbach | ||
Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
Special tail marker block for TVT tail cut | |||
Tail holder | |||
Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |