Мы представляем экспериментальный протокол и рабочий процесс анализа данных для выполнения двухцветной флуоресцентной перекрестной корреляционной спектроскопии живых клеток (FCCS) в сочетании с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) для изучения динамики мембранных рецепторов в живых клетках с использованием современных методов флуоресцентной маркировки.
Мы представляем протокол и рабочий процесс для выполнения двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии живых клеток (FCCS) в сочетании с переносом резонансной энергии Фёрстера (FRET) для изучения динамики мембранных рецепторов в живых клетках с использованием современных методов флуоресцентной маркировки. В двухцветной FCCS, где колебания интенсивности флуоресценции представляют собой динамический «отпечаток» соответствующей флуоресцентной биомолекулы, мы можем исследовать кодиффузию или связывание рецепторов. FRET, с его высокой чувствительностью к молекулярным расстояниям, служит известным «нанорулером» для мониторинга внутримолекулярных изменений. Взятые вместе, конформационные изменения и ключевые параметры, такие как концентрации местных рецепторов и константы подвижности, становятся доступными в клеточных условиях.
Количественные флуоресцентные подходы являются сложными в клетках из-за высокого уровня шума и уязвимости образца. Здесь мы покажем, как выполнить этот эксперимент, включая этапы калибровки с использованием двухцветного меченого β2-адренергического рецептора (β2AR), помеченного eGFP и SNAP-tag-TAMRA. Пошаговая процедура анализа данных предоставляется с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом и шаблонов, которые легко настроить.
Наше руководство позволяет исследователям разгадывать молекулярные взаимодействия биомолекул в живых клетках in situ с высокой надежностью, несмотря на ограниченные уровни сигнал-шум в экспериментах с живыми клетками. Рабочее окно FRET и особенно FCCS при низких концентрациях позволяет проводить количественный анализ в почти физиологических условиях.
Флуоресцентная спектроскопия является одним из основных методов количественной оценки динамики белка и белково-белковых взаимодействий с минимальным возмущением в клеточном контексте. Конфокальная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) является одним из мощных методов анализа молекулярной динамики, поскольку она чувствительна к одной молекуле, очень селективна и совместима с живыми клетками1. По сравнению с другими подходами, ориентированными на динамику, FCS имеет более широкий измеримый диапазон времени, охватывающий от ~ ns до ~ s, что наиболее важно для охвата быстрых временных масштабов, которые часто недоступны методами на основе визуализации. Кроме того, он также обеспечивает пространственную селективность, так что мембранная, цитоплазматическая и молекулярная динамика ядра могут быть легко различимы 2. Таким образом, молекулярное моргание, средняя локальная концентрация и коэффициент диффузии могут быть количественно проанализированы с помощью FCS. Межмолекулярная динамика, такая как связывание, становится легко доступной при прозондировании кодиффузии двух молекулярных видов в флуоресцентной перекрестно-корреляционной спектроскопии (FCCS) анализ3,4,5 в двухцветном подходе.
Основным основополагающим принципом корреляционной спектроскопии является статистический анализ флуктуаций интенсивности, излучаемых флуоресцентно мечеными биомолекулами, диффузными в лазерном фокусе и из него(рисунок 1А). Полученные авто- или кросс-корреляционные функции затем могут быть дополнительно проанализированы путем подгонки кривой, чтобы в конечном итоге получить процентные константы скорости. Другими словами, статистические методы FCS и FCCS обеспечивают не следы одной молекулы, как при отслеживании одной частицы, а динамический паттерн или «отпечаток пальца» исследуемого образца с высоким временным разрешением. В сочетании с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) внутримолекулярная динамика, такая как конформационные изменения, может контролироваться одновременно в общей конфокальной установке5,6. FRET исследует расстояние двух флуорофоров и часто упоминается как молекулярный «нанорулер». Передача энергии происходит только тогда, когда молекулы находятся в непосредственной близости (< 10 нм), спектр излучения донора значительно перекрывается со спектром поглощения молекулы-акцептора, а дипольная ориентация донора и акцептора (достаточно) параллельна. Таким образом, комбинация FRET и FCCS обеспечивает технику с очень высоким пространственно-временным разрешением. Когда требуется пространственная селективность, чувствительность, а также совместимость с живыми клетками, FRET-FCCS имеет очевидное преимущество перед другими методами, такими как изотермическая титрационная калориметрия (ITC)7,поверхностный плазмонный резонанс (SPR)8или ядерный магнитный резонанс (ЯМР)9,10 для измерения динамики и взаимодействий белков.
Несмотря на возможности и перспективность двухцветной флуоресцентной перекрестно-корреляционной спектроскопии (dc-FCCS), выполнение dc-FCCS в живых клетках технически сложно из-за спектрального кровотечения или перекрестных помех между каналами3,4,разницы в конфокальных объемах из-за спектрально четких лазерных линий3,4,11,фонового сигнала и шума или ограниченной фотостабильности образцов12, 13,14,15. Введение импульсного чередующегося возбуждения (PIE) в FCCS было важной настройкой для временного разъежевания различных лазерных возбуждений для уменьшения спектральных перекрестных помех между каналами16. Другие методы коррекции для противодействия спектральному кровотечению17,18,19 и фоновым коррекциям также были хорошо приняты17,18,19. Для получения подробной информации и основ о FCS, PIE или FRET читатель обращается к следующим ссылкам2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Здесь представлены все необходимые калибровочные эксперименты и анализ вместе с экспериментальными результатами прототипа рецептора, связанного с G-белком, β 2-адренергического рецептора (β2AR), для трех различных сценариев: (1) одномаркированные молекулы, несущие либо «зеленый» (eGFP), либо «красный» (маркировка на основе SNAP-метки)25 флуорофор; (2) двойная маркировка, которая несет N-концевую SNAP-метку и внутриклеточный eGFP (NT-SNAP) [в этом случае обе метки находятся на одном и том же белке. Таким образом, ожидается 100% кодиффузия]; и (3) образец с двойной маркировкой, где оба флуорофора находятся на одной стороне клеточной мембраны (CT-SNAP). Он несет C-терминал SNAP-метку и внутриклеточный eGFP. Здесь, опять же, обе метки находятся на одном и том же белке с ожидаемой 100% кодиффузией. Поскольку обе метки находятся очень близко друг к другу, на одной стороне клеточной мембраны, это показывает потенциал для наблюдения FRET и антикоррелированного поведения. Все конструкции были трансфектированы в клетки китайского хомячка (CHO), а затем помечены красной флуоресцентной подложкой, которая является мембранопроницаемой для конструкции NT-SNAP и мембранопроницаемой для конструкции CT-SNAP. Наконец, смоделированные данные иллюстрируют влияние экспериментальных параметров на антикоррелацию, индуцированную FRET, и влияние белково-белковых взаимодействий на амплитуду кодиффузии.
Таким образом, этот протокол предоставляет полное руководство по выполнению комбинированного FRET-FCCS в живых клетках для понимания динамики белка и белково-белковых взаимодействий, а также для ознакомления с техническими / физическими артефактами, проблемами и возможными решениями.
Методы FCS в GPCR позволяют оценить подвижность и взаимодействие рецепторов внутри живых клеток41. Преимущество метода FRET-FCS заключается в том, что наряду с мобильностью можно исследовать конформационную динамику GPCR. Тем не менее, выполнение FRET-FCS в живых клетках является сложной задачей и требует клеток, которые показывают низкую (или максимально умеренную) экспрессию интересующего флуоресцентно меченого белка, хорошо откалиброванную установку и хороший конвейер для анализа данных. Здесь сначала обсуждаются критические точки в подготовке образцов и экспериментальной процедуре, касающиеся биологической, спектроскопической и технической точек зрения.
Критические экспериментальные этапы включают минимизацию фона и автофлуоресценции (путем использования широко очищенных покровных листков и фенол-красных свободных сред), оптимизацию условий трансфекции (например, количество плазмидной ДНК и время после трансфекции) для достижения низких уровней экспрессии и эффективной маркировки. Конечно, также важно убедиться, что функция меченого белка не затруднена. Таким образом, в экспериментах с живыми клетками решение о стратегии маркировки и позиции этикетки часто принимается в пользу флуоресцентных белков или метки SNAP/CLIP, прикрепленной к гибкому N- или C-конце42,43. Альтернативные стратегии маркировки, такие как введение неестественной аминокислоты с реакционноспособной боковой цепью для маркировки органическим флуорофором, появились в последние годы44.
Для двухцветного PIE-FCS, где исследуется только взаимодействие двух молекул, представляющих интерес, флуорофоры могут быть выбраны из большого разнообразия установленных флуоресцентных белков или субстратов SNAP/CLIP. Здесь, с точки зрения спектроскопии, цель должна состоять в том, чтобы выбрать пару таким образом, чтобы возникали небольшие перекрестные помехи или прямое акцепторное возбуждение. Кроме того, выбранные флуорофоры должны быть фотостабильные и практически не отбеливаться в выбранных экспериментальных условиях. Рекомендуется выбирать флуорофоры в красном спектральном диапазоне, так как (1) фон автофлуоресценции из клетки уменьшается и (2) свет возбуждения имеет более длинную длину волны, следовательно, менее фототоксичная14. Фотоотбеливание можно свести к минимуму, проведя сначала так называемый «степенный ряд», в котором мощность лазера увеличивается ступенчато, а молекулярная яркость наблюдается. Оптимальный диапазон интенсивности возбуждения лежит в линейном диапазоне результатов45.
Если предполагается, что эти две метки также сообщают о конформационной динамике белка через FRET, то выбор доступных флуорофоров более ограничен. Здесь возможное минимальное/максимальное расстояние между двумя флуорофорами должно быть оценено заранее, например, на основе имеющихся структур или размера молекул, и пары флуорофоров, выбранной с разумным радиусом Фёрстера R0, так что FRET действительно может встречаться20.
Здесь для маркировки были выбраны eGFP и метка SNAP, а метка SNAP была помечена либо внутриклеточной, либо мембранопроницаемой поверхностной подложкой. Спектры аналогичны тем, которые показаны на рисунке 2C-D. Эта комбинация флуорофоров показывает высокие перекрестные помехи eGFP в красные каналы обнаружения и прямое акцепторное возбуждение субстрата SNAP зеленым возбуждением в окне быстрого времени и приводит к значительному «ложному» сигналу в красных каналах в окне быстрого времени. В идеале оба значения, перекрестный разговор и прямое акцепторное возбуждение, не должны превышать5% 5,6,38. Однако с радиусом Фёрстера 57 Å он идеально подходит для исследования расстояния между метками в конструкции β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, который может быть оценен по закаленному сроку службы eGFP (Дополнительное примечание 5).
Технически, как и для любого эксперимента по флуоресцентной спектроскопии, устройство должно быть хорошо выровнено и должно иметь подходящие источники возбуждения, эмиссионный фильтр и чувствительные детекторы. Чтобы избежать артефактов от послепульсии детектора на временной шкале μs, должно присутствовать, по крайней мере, два детектора каждого цвета, которые могут быть перекрестно коррелированы. В современной электронике для подсчета одиночных фотонов с корреляцией по времени мертвое время карты обнаружения в диапазоне времени ns вряд ли играет роль из-за независимых каналов маршрутизации, однако оно может быть проверено, как предложено Мюллером и др. 16, при условии, что диапазон времени, представляющий интерес, лежит в диапазоне времени ниже мкс / нс. Кроме того, для еще более высоких временных разрешений в диапазоне ps каждый канал обнаружения должен быть удвоен, то есть следует использовать четыре детектора на цвет, чтобы также обойти детектор мертвых раз2,15,29,46. В то время как среднее время жизни флуоресценции может быть оценено с использованием неполяризованного флуоресцентного обнаружения, для анализа расстояния (~ распределения) между флуорофорами излучение должно быть собрано в зависимости от поляризации. Это связано с тем, что эффективность передачи энергии в FRET зависит от ориентации двух флуорофоров. Более подробную информацию можно найти здесь20,28,47. Наконец, в экспериментах PIE расстояние между импульсом подсказки и задержки является критическим и должно быть выбрано таким образом, чтобы интенсивность флуоресценции флуорофоров была в значительной степени распалась(рисунок 1B). Общее правило состоит в том, чтобы поместить два импульса в 5 раз больше времени жизни флуоресценции друг от друга, т.е. для eGFP со сроком службы флуоресценции 2,5 нс расстояние должно составлять 12,5 нс при минимум22.
После детального рассмотрения всех соображений по экспериментальной процедуре, данные и их анализ обсуждаются более подробно. Как упоминалось в разделе протокола, выравнивание установки должно проверяться ежедневно, включая анализ калибровочных измерений. Данные, показанные на рисунке 2A-C, например, показывают дополнительный компонент релаксации в диапазоне 8-40 мкс. Типичное триплетное мигание зеленого калибровочного флуорофора, как известно, происходит в диапазоне 2-10 мкс13,15,48. Компонент медленной релаксации, необходимый во всех кривых образца ДНК(рисунок 3C),слишком медленный для фактического триплетного мигания, может быть связан с взаимодействием ДНК с флуорофорами39. Однако этот компонент не ожидается в CCFPIEи, скорее всего, связан с остаточными перекрестными помехами. Таким образом, крайне желательно выполнить анализ калибровочных образцов непосредственно перед тем, как приступить к экспериментам с клетками, чтобы судить о качестве выравнивания дня.
Правильная калибровка конфокального перекрывающего объема требует образца со 100% кодиффузией зеленой и красной метки. Здесь используется флуоресцентно меченая двухцепочечная ДНК. Обе нити ДНК могут быть адаптированы так, чтобы иметь желаемые флуорофоры на необходимом расстоянии друг от друга. Разработанные пряди можно отжигать с высокой урожайностью. Тем не менее, Надлежащая лабораторная практика советует проверять целостность и степень маркировки нитей ДНК с помощью электрофореза агарозного геля и измерения спектра поглощения. Кроме того, следует проверить выход двухцепочечной сборки, поскольку это калибровочное измерение критически опирается на предположение о том, что существует 100% совместное распространение зеленого с красной меткой. В случае, если предположение неверно, возможно, придется применить поправочный коэффициент16,22. В калибровочных измерениях, показанных на фиг.2 и фиг.3,был получен объем обнаружения 1,4 л и 1,9 л в зеленом и красном канале соответственно. Эта разница в размерах ожидается для установки с почти дифракционными объемами возбуждения(Дополнительное примечание 2). При этом условии размер объема возбуждения масштабируется с длиной волны возбуждения. Это, в свою очередь, объясняет различные амплитуды корреляции, наблюдаемые на рисунке 3B. Производные поправочный коэффициент r GR = 0,56 и rRG = 0,72 с поправкой на это расхождение размеров и потенциальное неисполнение перекрытия двух объемов возбуждения3,4.
Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6и Рисунок 7 демонстрируют рабочий процесс исследования на основе PIE-F(C)CS, направленного на понимание конформационной динамики белка. Во-первых, две одномаркированные конструкции β2AR-IL3-eGFP и NT-SNAP-β2AR служат элементами управления для характеристики свойств флуорофора в клетках в отсутствие соответствующего другого флуорофора(рисунок 4). Далее, двойная маркировка NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP, несущая SNAP-метку, обращенную к внешней стороне клетки, и eGFP на цитоплазматической стороне, служит в качестве элемента управления «100% кодиффузией»(рисунок 5). Последняя конструкция, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, несет оба флуорофора на цитоплазматической стороне и достаточно близко друг к другу, чтобы пройти FRET. Здесь снова можно было бы ожидать 100% кодиффузии в тандеме с антикоррелированной флуктуациями интенсивности сигнала зеленого и красного каналов в оперативном временном окне, т. е. после возбуждения донора, за счет динамики белка, влияющей на эффективность FRET31,32,33. Эта динамика может проявляться как антикоррелия в КФГ ФРТ (рисунок 6-7).
Все конструкции GPCR β2AR показывают бимодальную диффузию на клеточной мембране(рисунок 4A). В то время как β2AR-IL3-eGFP показывает только ожидаемое триплетное мигание(рисунок 5B)13,15,NT-SNAP-β2AR показывает дополнительное медленное время релаксации(рисунок 5C-D). Вполне вероятно, что tR2 может быть связан с несвязанным субстратом SNAP. Это может быть выяснено дальнейшими экспериментами, например, путем измерения диффузионных и фотофизических свойств используемой подложки SNAP в водном растворе. Следует отметить, что простой эксперимент по различению времени диффузии и релаксации заключается в изменении точечного отверстия конфокальной установки, то есть увеличении эффективного объема: в то время как время диффузии увеличивается с увеличением эффективных объемов, условия релаксации не изменяются13. При определении концентрации флуоресцентного белка (ФП) на основании результатов подгонки следует учитывать, что FP в целом подвергаются процессу созревания, в результате которого в конечном итоге образуетсяхромофор 12. Это время созревания может отличаться от FP к FP в дополнение к фотофизике, которая зависит от локальной химической среды13,15. Таким образом, фактическая концентрация белка, присутствующая в образце, сообщаемом FCS, обычно недооценивается, что может быть скорректировано, если в эксперименте может быть определена доля нефлуоресцентных FP. Наконец, желательно проверить спектры флуорофоров в живых клетках, чтобы скорректировать значения для α и δ, если это необходимо, так как большинство флуорофоров реагируют чувствительно к окружающей среде13,15,48. Фон для вычитания определяется сигналом, собранным в неперепраженные клетки. Кроме того, автокорреляция соответствующего другого цветового канала и CCFPIE должна быть проверена, чтобы иметь возможность идентифицировать ложные сигналы(Дополнительное примечание 4 – Рисунок 30).
Два измерения из NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP(рисунок 5D),где флуорофоры расположены на разных сторонах мембраны, были получены в разные дни и показывают важность статистики в флуоресценции одной молекулы с временным разрешением. Здесь различные результаты могут быть обусловлены различной степенью маркировки: в одной ячейке более высокая степень маркировки и усреднения измерений привела к относительно низкому уровню шума(рисунок 5B),в то время как из другой ячейки можно было собрать только два измерения(рисунок 5A). Помимо сбора достаточного количества данных, крайне важно своевременно оценить результаты и, возможно, оптимизировать стратегию маркировки. При проектировании экспериментов важно помнить, что FRET чувствителен, но ограничен расстояниями до 10 нм и «слеп» в противном случае. В нашем случае на эту «слепоту» указывает неизменный срок службы флуоресценции eGFP (Дополнительное примечание 5). В β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(рисунок 6A)FRET может быть точно определен по закаленному сроку службы eGFP (Дополнительное примечание 5). Однако антикорреляционный термин не наблюдается(рисунок 6B),что означает, что FRET либо не колеблется, либо в масштабе времени медленнее, чем время диффузии. В ACFgp,ACF rp,ACF rdи CCFFRET требуется до трех дополнительных условий релаксации(рисунок 6C). Медленный компонент в ACFrp, ACFrd и CCFFRET может быть обусловлен акцепторным отбеливанием и, конечно же, влияет на полученное значение медленной диффузии, обнаруженной в этих кривых (~ 350 мс по сравнению с 117 мс в ACFgp). tD в красном канале предполагается немного больше, чем в зеленом канале из-за различных размеров конфокальных объемов(рисунок 2)– но только в коэффициенте, сопоставимом с разницей в размерах. Очень быстрое время релаксации 3 мкс отражает триплетное мигание флуорофоров13,15,48,тогда как более медленное время релаксации 37 мкс может быть связано с FRET: аналогично, поскольку FRET индуцирует антикорреляцию в CCFFRET,положительные корреляции ожидаются в автокорреляциях31,32,33. Присутствие этого термина как «позитивного» в КФГ ФРЭ И его присутствие в АКФможно объяснить высоким перекрестным разговором и следует дополнительно прояснить. Обратите внимание, что CCFPIE является плоским при коротком времени корреляции, как и ожидалось.
С другой стороны, следует отметить, что появление FRET в интересууемой системе приводит к нелинейным воздействиям на корреляционные кривые6. Молекулярная яркость, например, молекулы масштабируется в квадратную амплитуду корреляции, и каждое FRET-состояние (и всегда присутствующие молекулы без активного рецептора) показывает различную молекулярную яркость. Действительно, FRET уменьшает видимую концентрацию обнаруженных зеленых молекул (т.е. увеличивает амплитуду ACFgp), а количество красных молекул (определяемых по красному подсказке) завышено5. Оба эффекта влияют на степень взаимодействия, полученного как из CCFFRET, так и из CCFPIE. Однако глобальный анализ, как показано, например, для внутримолекулярной динамики Calmodulin 31,32 или Syntaxin33, может выявить динамику белка. При тщательной калибровке средняя эффективность FRET может быть извлечена из относительных амплитуд22 CCFPIE и ACF, тогда как предельные состояния могут быть определены из анализа распределения33срока службы донорской флуоресценции.
Учитывая тот факт, что в экспериментах с живыми клетками с большими флуорофорами, такими как eGFP, контраст FRET, вероятно, будет даже ниже, чем предполагалось для моделирования, показанного на рисунке 6, и что прямое возбуждение акцептора не было добавлено в моделировании, может объяснить, почему идентификация антикоррелации в экспериментах с живыми клетками очень сложна. Многообещающая альтернатива анализа основана на сборе информации, закодированной в гистограммах времени прибытия фотонов(рисунок 1B),доступных благодаря коррелированному по времени сбору данных подсчета одиночных фотонов29,30. Если время жизни флуоресценции (~паттерны) двух (или более) (FRET) видов внутри образца известно(рисунок 7A),можно выбрать «фильтр» или веса, которые применяются в процессе корреляции(Рисунок 7B)17,18,19. Полученные таким образом корреляционные кривые больше не представляют собой корреляцию каналов обнаружения, а скорее авто- или перекрестные корреляции между двумя различными (FRET) видами, поэтому переименованные в вид-ACF (sACF) или вид-CCF (sCCF). Применение этого подхода к смоделированным данным с умеренной контрастностью FRET, высоким перекрестным помехом и триплетным миганием восстанавливает антикорреляционный термин(рисунок 7C-D). Однако следует отметить, что время релаксации может быть получено, но связь с амплитудой теряется18. Этот подход применялся ранее в экспериментах с живыми клетками, например, для изучения взаимодействия EGFR с его антагонистом49 или для отделения флуоресценции от белков, прикрепленных к вариантам eGFP с исключительно коротким и длительным сроком жизни флуоресценции50.
В то время как измерения FRET на основе PIE в очищенных белках в основном используются для изучения динамики белка3622,в живых клетках они сосредоточены на понимании белково-белковых взаимодействий. Этот подход был применен для изучения регуляции активности киназы MAP в дрожжах51 или для разрешения взаимодействия мембранных белков с их цитозольным партнером по связыванию, как кратко изложено в этой недавней статье52. Здесь осложнения могут возникнуть, когда значительные перекрестные помехи зеленых флуорофоров все еще присутствуют в окне времени задержки красных каналов или красный сигнал в зеленых каналах в окне подсказки времени. Первое может быть вызвано недостаточной задержкой красного импульса по отношению к зеленому импульсу, в то время как оба эффекта проистекают из слишком сильно перекрывающихся спектров возбуждения и излучения выбранных флуорофоров. Рекомендуется тщательно проверять соответствующие одиночные маркированные конструкции и корректировать ложноположительные амплитуды CCFPIE, особенно в ячейках, где автофлуоресценция с очень коротким сроком службы флуоресценции может быть еще одним осложняющим фактором22.
В заключение, описанный здесь подход FRET-FCS имеет большой потенциал для понимания белково-белковых взаимодействий и динамики белка в живых клетках при концентрациях, близких к физиологическим. В этом протоколе основное внимание уделялось требуемым калибровочным измерениям и необходимому количественному анализу, который должен быть выполнен во время измерений живых клеток. С этой целью были показаны различные измерения живых клеток, дополненные моделированием. Моделирование обеспечивает общее понимание здесь, поскольку параметр может систематически изменяться с помощью специализированных моделей соответствия, которые описывают конкретную мобильность и фотофизические свойства соответствующих данных. Анализ проводился с помощью программных средств с открытым исходным кодом с обширным пошаговым протоколом и простыми в адаптации шаблонами. Наконец, технические достижения и, следовательно, наличие готовых к покупке стабильных систем PIE-FCS вместе с распространением программного обеспечения с открытым исходным кодом для анализа данных сделают этот метод все более и более доступным для более широкого исследовательского сообщества, чтобы в конечном итоге разгадать белковое взаимодействие и динамику в живых клетках с самой высокой чувствительностью.
The authors have nothing to disclose.
Этот проект был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, номер проекта 374031971, проект INF) для J.B. и K.G.H.
Мы благодарим Центр Рудольфа Вирхова за финансовую поддержку и Core Unit Fluorescence Imaging за техническую поддержку. Кроме того, мы благодарим Ашвина Балакришнана за тщательную корректуру.
1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | — | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |