Summary
Regulatoren van melanocytenfuncties regelen zichtbare verschillen in de pigmentatie-uitkomst. Het ontcijferen van de moleculaire functie van het kandidaat-pigmentatiegen vormt een uitdaging. Hierin demonstreren we het gebruik van een zebravismodelsysteem om kandidaten te identificeren en in te delen in regulatoren van melaninegehalte en melanocytenaantal.
Abstract
Melanocyten zijn gespecialiseerde neurale top-afgeleide cellen die aanwezig zijn in de epidermale huid. Deze cellen synthetiseren melaninepigment dat het genoom beschermt tegen schadelijke ultraviolette straling. Verstoringen in het functioneren van melanocyten leiden tot pigmentstoornissen zoals piebaldisme, albinisme, vitiligo, melasma en melanoom. Zebravis is een uitstekend modelsysteem om melanocytenfuncties te begrijpen. De aanwezigheid van opvallende gepigmenteerde melanocyten, het gemak van genetische manipulatie en de beschikbaarheid van transgene fluorescerende lijnen vergemakkelijken de studie van pigmentatie. Deze studie maakt gebruik van wild-type en transgene zebravislijnen die groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie aandrijven onder mitfa- en tyrp1-promotors die verschillende stadia van melanocyten markeren.
Morpholino-gebaseerde uitschakeling van kandidaatgenen wordt bereikt om de fenotypische uitkomst op larvale pigmentatie te evalueren en is van toepassing op screening op regulatoren van pigmentatie. Dit protocol demonstreert de methode van micro-injectie tot beeldvorming en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) -gebaseerde dissectie van fenotypes met behulp van twee kandidaatgenen, koolzuuranhydrase 14 (Ca14) en een histonvariant (H2afv), om de pigmentatie-uitkomst uitgebreid te beoordelen. Verder toont dit protocol het scheiden van kandidaatgenen in melanocytenspecificeerders en differentiatoren die respectievelijk selectief het melanocytenaantal en het melaninegehalte per cel veranderen.
Introduction
Hoewel het gebruik van melanine voor fotoprotectie verschillende keren in het dierenrijk is geëvolueerd, hebben gewervelde dieren het proces schijnbaar geperfectioneerd. Speciale pigmentproducerende cellen met een uitgebreide machinerie om melanine te synthetiseren en te bevatten, worden bewaard van vis tot mens1. Het resultaat van pigmentatie is echter dramatisch gevarieerd, variërend in de kleur tot recipience en presenteert zich als levendige patronen op integumenten, de huid en het haar2. Ondanks de diversiteit is het repertoire van genen die betrokken zijn bij pigmentatierespons opvallend bewaard gebleven. De kerncomponenten van de melanine-synthetiserende machinerie, zoals de belangrijkste melanine-synthetiserende enzymen, de componenten van de melanosomen en de stroomopwaartse connectiviteit met de signaalroute, blijven in wezen identiek tussen organismen. Subtiele genetische verschillen veroorzaken dramatische veranderingen in de patronen van pigmentatie die worden waargenomen bij soort3. Vandaar dat een omgekeerde genetische benadering in een lager gewerveld organisme, de zebravis (Danio rerio), een uitstekende gelegenheid biedt om de betrokkenheid van genen bij het weergeven van de gepigmenteerde toestand te ontcijferen4.
Zebravisembryo's ontwikkelen zich van een eencellige bevruchte zygote tot een larve binnen een tijdspanne van ~24 uur na de bevruchting (hpf)5. Opvallend is dat de melanocyt-equivalente cellen - de melanoforen - grote cellen zijn die aanwezig zijn in de dermis en opvallen door het donkere melaninegehalte6. Deze van neurale top afgeleide cellen stralen ~11 hpf uit en beginnen ~24 hpf 6,7 te pigmenteren. Geconserveerde genexpressiemodules hebben de identificatie mogelijk gemaakt van sleutelfactoren die melanocytenfuncties orkestreren en hebben geleid tot de ontwikkeling van transgene fluorescerende reporterlijnen Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) en Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10 die selectieve stadia van melanocytenontwikkeling labelen. Het gebruik van deze transgene vislijnen maakt de ondervraging van celbiologie van melanocyten op organismaalniveau in de weefselcontext mogelijk met geschikte aanwijzingen volgens de ontwikkelingstijdlijnen. Deze reporters vullen pigmentgebaseerde kwantificering van melanocyten aan en maken een duidelijke beoordeling van melanocytenaantallen mogelijk, ongeacht het melaninegehalte.
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het ontcijferen van de biologie van melanocyten door twee kritische parameters te beoordelen, namelijk melaninegehalte en melanocytenaantallen. Terwijl de eerste een veel voorkomende functionele uitlezing is die voortkomt uit een hypopigmentatierespons, wordt de laatste geassocieerd met een vermindering van de specificatie of overleving van melanocyten en wordt vaak geassocieerd met genetische of verworven depigmentatieomstandigheden. De algemene strategie van deze omgekeerde genetische screening is om geselecteerde genen het zwijgen op te leggen met behulp van een morfolino en de melanocyt-specifieke uitkomsten te onderzoeken. Het melaninegehalte wordt geanalyseerd met behulp van beeldgebaseerde kwantificering van gemiddelde grijswaarden, gevolgd door bevestiging met behulp van een melaninegehaltetest. Het aantal melanocyten in verschillende stadia van rijping wordt geanalyseerd met behulp van beeldgebaseerde kwantificering en verder bevestigd met behulp van FACS-analyse. Hier wordt het screeningsprotocol gedemonstreerd met behulp van twee kandidaatgenen, namelijk koolzuuranhydrase 14, betrokken bij melanogenese, en een histonvariant H2AFZ.2 die betrokken is bij de specificatie van melanocyten uit de neurale topvoorloperpopulatie. Terwijl de eerste het melaninegehalte verandert en niet het melanocytenaantal, verandert het laatste het aantal gespecificeerde melanocyten en bijgevolg het melaninegehalte in het embryo. Al met al biedt deze methode een gedetailleerd protocol om de rol van een kandidaat-gen in pigmentatie te identificeren en zijn rol te onderscheiden bij het beheersen van melanocytenaantallen versus melaninegehalte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebravisexperimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele goedkeuring van dierethiek (IAEC) van het CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (voorstel nr. 45a). Alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken.
1. Morpholino injecteren in zebravisembryo's
- Teken met behulp van een standaard naaldtrekker zeer scherpe en gesloten pipetten.
- Laad de oplossing met morfolino in de micropipetten met behulp van een microloaderpunt en steek deze in het micro-injectorapparaat. Draai de schroef goed vast om de micropipet te vergrendelen.
OPMERKING: Doseringsstandaardisatie van morfolinos is noodzakelijk. De juiste dosering heeft een overlevingskans van >70% en een specifiek fenotype bij 24 hpf. - Snijd de punt van de micropipette met een fijne tang en kalibreer deze11.
- Om te kalibreren, injecteert u 1 volume morfolino-oplossing in de capillaire buis van de micropipette, waarbij de injecteertijd op 1 s wordt gehouden. Herhaal dit vijf keer. Gebruik de standaard, 1 mm = 30 nL volume, zoek het volume geïnjecteerd in 5 s door de capillaire buis tegen een meetschaal te houden. Bereken met behulp van de bovenstaande informatie de tijd (in seconden) die nodig is om 1-3 nL per injectie te injecteren12.
OPMERKING: De standaard, 1 mm = 30 nL, is specifiek voor de micro-injectordrukinstellingen en de diameter van het capillair dat wordt gebruikt voor kalibratie. Idealiter moet de injectie worden gemaakt in de dooier-cel interface, die binnen 15-20 minuten na de bevruchting wordt gevormd. Om meerdere injecties mogelijk te maken, kan de ontwikkeling enigszins worden vertraagd door embryo's op een lagere temperatuur (18 °C) te houden. Dit moet echter tot een minimum worden beperkt en niet langer dan 30 minuten worden verlengd vanwege het samengestelde effect van lagere temperatuur op genexpressieveranderingen. - Monteer de embryo's op een in agarose gegoten petrischaaltje (60 mm). Stapel de embryo's stevig in de richels. Gebruik vuurgepolijste glazen pipetten om ze in de juiste richting uit te lijnen voor injectie.
- Gebruik onder een microscoop manipulatoren om de micropipette dichter bij het embryo te brengen en injecteer in de dooiercelinterface door op de voetschakelaar te drukken.
- Injecteer alle embryo's op dezelfde manier; verzamel ze in een petrischaaltje met vers embryowater en incubeer bij 28 °C.
- Controleer de geïnjecteerde embryo's na 6-8 uur. Verwijder alle dode embryo's die identificeerbaar zijn vanwege hun hoge ondoorzichtigheid en blijf het embryowater minstens één keer per dag verversen om infectie te voorkomen.
2. Pigmentatie analyse
- Voorbereiding voor het tellen van laterale middellijn melanoforen in 3 dpf zebravisembryo's
- Behandel embryo's met 0,016% neuro-musculair anestheticum om ze te immobiliseren.
- Om de embryo's te monteren voor beeldvorming, voegt u een paar milliliter 1,5-2% methylcellulose toe in de petrischaal (60 mm) zodat deze een dunne laag vormt. Pluk met behulp van een Pasteur-pipet embryo's en plaats ze voorzichtig in methylcellulose om verdere beweging tijdens de beeldvorming te beperken.
- Pas hun positie aan voor optimale laterale (dorsale streep, ventrale streep, dooierstreep en melanoforen in de middenlijn) of dorsale (melanoforen op het dorsale deel van het hoofd) beeldvorming. Voor een betere resolutie van aangrenzende melanoforen, beeld bij hogere vergroting (>5x)
- Brightfield-beeldvorming
OPMERKING: Brightfield-beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop met 8-10x vergroting.- Leg de petrischaal met de zebravisembryo's onder de microscoop. Stel met behulp van een manipulator de vis in een dergelijke oriëntatie in, zodat alle vijf melanocyt-embryonale strepen tegelijkertijd zichtbaar zijn (dorsaal, ventraal, twee lateraal, dooier) (figuur 1C). Leg snel foto's vast met behulp van de acquisitiesoftware. In het geval dat het dier weer in beweging komt voordat het in beeld wordt gebracht, dompel het dan opnieuw onder in verdoving en ga verder met beeldvorming zodra het voldoende is geïmmobiliseerd.
- Herhaal dit met alle vissen en zorg ervoor dat de vergroting voor elk beeld hetzelfde blijft.
- Gemiddelde grijswaarde berekenen met ImageJ-software
- Maak dorsale en laterale beelden van 2 dpf zebravisembryo's.
- Open de afbeelding die u wilt kwantificeren in ImageJ met het gereedschap Openen . Gebruik het vormgereedschap uit de vrije hand om het gebied voor analyse te schetsen. Ga naar de optie Metingen instellen en selecteer Gemiddelde grijswaarde | gebied. Druk op M (of Analyseren | Meten) om de gemiddelde grijswaarde voor het geselecteerde gebied te berekenen.
- Houd het te analyseren gebied constant en bereken het gemiddelde grijze gebied voor elk dier afzonderlijk.
- Plot een staafdiagram met de verkregen gegevens (figuur 2F).
- Melaninegehalte assay
- Gebruik bij 2 dpf een glazen Pasteur-pipet om ~ 25 zebravisembryo's te verzamelen.
- Voer handmatige dechorionatie uit met behulp van insulinenaalden van 1 ml en voeg ze toe aan microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
- Gooi het embryomedium voorzichtig weg en voeg 1 ml ijskoude lysisbuffer (20 mM natriumfosfaat (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) toe met proteaseremmercocktail en bereid eiwitlysaten door ultrasoonapparaat.
- Los de lysaten op in 1 ml 1 N NaOH en incubeer de monsters bij 100 °C gedurende 50 minuten in een waterbad. Vortex het met tussenpozen om de lysaten volledig te homogeniseren.
- Neem absorptiemetingen van de monsters bij 490 nm met behulp van een spectrofotometer.
- Bereken het melaninegehalte door de absorptie van het monster te vergelijken met een standaardcurve van bekende concentraties synthetische melanine (figuur 2G).
3. Melanofore telling
OPMERKING: Fluorescentieanalyse in transgene zebravisembryo's kan op twee manieren worden uitgevoerd: 1) GFP-positieve cellen tellen; 2) het meten van de fluorescentie-intensiteit.
- Voorbereiding voor FACS-gebaseerde telling van GFP-positieve cellen in vroege zebravisembryo's
- Verzamel 200-250 ftyrp: GFP-embryo's en was ze in een zeef met gewoon embryowater. Als een negatieve controle, verwerken GFP-negatieve, stadium-matched wild-type (Assam Wildtype) embryo's12.
- Breng op basis van het stadium van interesse de embryo's over naar een petrischaal met 0,6 mg / ml pronase. Breng na 5-10 minuten, met behulp van een Pasteur-pipet, de gedechorioneerde embryo's over naar een verse petrischaal met gewoon embryowater. Verzamel met behulp van een glazen Pasteur-pipet ~ 100 embryo's en breng ze over naar een microcentrifugebuis van 2 ml.
- Gooi het medium voorzichtig weg en voeg 200 μL ijskoude Ringer's oplossing (deyolking buffer) toe. Houd de buis op ijs en pipetteer de inhoud ~ 20 keer op en neer totdat de dooier is opgelost. Centrifugeer de buizen gedurende 1 minuut op 100 × g in een tafelcentrifuge bij 4 °C. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Breng met behulp van een pipet van 1 ml de ontdooierde embryo's over naar een petrischaal met 10 ml trypsine-oplossing (celdissociatiebuffer). Voer het uit in meerdere petrischalen om overbevolking van de embryo's en inefficiënte trypsinisatie te voorkomen. Gebruik een pipet van 1 ml, meng de oplossing met de embryolichamen een of twee keer om de aggregatie te verminderen.
- Incubeer de petrischaaltjes bij kamertemperatuur gedurende 15 min (<24 hpf embryo's) of 30 min (24-30 hpf embryo's). Zuig en doseer de suspensie af en toe met behulp van een pipet van 1 ml om de desintegratie van cellen te bevorderen.
- Initialiseer tijdens de incubatieperiode de flowcytometermachine voor celtelling.
- Plaats een 70 μm celzeef boven een conische buis van 50 ml en laat de trypsinized suspensie door de zeef gaan om een eencellige suspensie te verkrijgen. Was de petrischaaltjes een paar keer met dezelfde suspensie om cellen te verwijderen die aan het oppervlak zijn gehecht.
- Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 450 × g en 4 °C in een draaibare bakrotor.
- Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 1 ml ijskoude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Draai opnieuw bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
- Tot slot, resuspensie de pellet in PBS + 5% foetaal runderserum en houd het op ijs totdat de FACS loopt.
- Voorbereiding van de flowcytometer
- Schakel de flowcytometer in en start de opstart.
OPMERKING: Voordat u de machine inschakelt, leegt u de afvalbak en vult u de vloeistoftank van de mantel. - Normaliseer de stroom van de stroom voor een mondstuk van 70 μm (of 85 μm). Laat het 10-15 minuten ongestoord als het onstabiel is.
- Schakel de flowcytometer in en start de opstart.
- Fluorescerend gelabelde cellen tellen met behulp van een flowcytometer
- Initialiseer een nieuwe experimentmap en maak een spreidingsplot van voorwaartse verstrooiing versus zijverstrooiing en een histogram van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) intensiteit.
- Laad eerst de wild-type cellen om de voorwaartse en zijwaartse spreidingspoorten (om doubletten en vuil uit te sluiten) en de FITC-drempel in te stellen.
- Nadat de poorten zijn ingesteld, verwijdert u het monster en laadt u de cellen geïsoleerd uit Tg (ftyrp1: GFP) embryo's om melanocyten te tellen.
OPMERKING: Hier, aangezien ftyrp1:GFP specifiek rijpe melanocyten labelt, komt het aantal GFP-positieve cellen onder de FITC-poort overeen met het aantal melanocyten. - Herhaal de bovenstaande stap met morfolino-geïnjecteerde monsters om het aantal melanocyten met de controle te schatten en te vergelijken.
- Fluorescentie-intensiteit meten in zebravisembryo's
- Verzamel met behulp van een glazen Pasteur-pipet 100-120 embryo's en breng ze over naar een petrischaal met gewoon embryowater.
- Bij ~10-12 hpf, breng de embryo's over naar 0,003% 1-fenyl-2-thioureum om pigmentatie te remmen.
- Voer handmatige dechorionatie uit met behulp van insulinenaalden voor beeldvorming <48 hpf-embryo's.
- Om embryo's te immobiliseren, behandel ze met 0,016% tricaïne.
- Om embryo's te monteren voor beeldvorming, plaatst u een paar ml 1,5-2% methylcellulose in de petrischaal (60 mm) zodat deze een dunne laag vormt. Voeg de embryo's toe aan methylcellulose om verdere bewegingen tijdens de beeldvorming te beperken. Leg de petrischaal met de monsters onder de microscoop. Stel het dier met behulp van een pipetpunt in de gewenste richting in.
- Verkrijg afbeeldingen met behulp van de acquisitiesoftware. Voor embryo's <24 hpf, vang het hele embryo in één keer onder 10x vergroting. Voor >24 hpf-trappen meerdere scanvelden verwerven en vervolgens samenvoegen (naaien).
- Herhaal dit met alle vissen en zorg ervoor dat de instelling voor acquisitie constant blijft gedurende het experiment.
- Kwantificering
- Analyseer de afbeelding verder met behulp van ImageJ-software.
- Open de afbeelding die u wilt kwantificeren in ImageJ met het gereedschap Openen .
- Gebruik het vormgereedschap uit de vrije hand om het gebied voor analyse te schetsen (figuur 3E).
- Druk op M (of Analyseren | Meten) om een geselecteerde gebiedsintensiteitsmeting te verkrijgen.
- Houd het te analyseren gebied constant en bereken de gemiddelde intensiteit per gebied voor elk dier afzonderlijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De workflow beschreven in figuur 1 werd gebruikt om op morfolino gebaseerde genetische verstoring uit te voeren in het eencellige stadium van de zebravis. Pigmentatieanalyse werd uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, zoals hieronder vermeld. Om de representatieve resultaten te illustreren, werden gestandaardiseerde volumes antisense morpholino gericht op h2afv - en ca14-genen geïnjecteerd in het dooier- of eencellige stadium van het zebravisembryo. De initiële fenotypering op basis van brightfield imaging werd uitgevoerd 48 uur na de bevruchting (hpf), toen alle vijf gepigmenteerde melanofoorstrepen (dorsaal, ventraal, dooier, twee lateraal) duidelijk waren.
Figuur 2A,B vertegenwoordigt een benadering om pigmentatie te analyseren door het aantal laterale melanoforen per embryo te berekenen. Laterale melanoforen werden handmatig geteld in het 48 hpf-stadium door in te zoomen op het laterale gebied van de gekantelde zebravis. Een alternatieve methode om de gepigmenteerde melanoforen te kwantificeren (aanvullende figuur S1) omvat het handmatig tellen van de hoofdmelanoforen door het dorsale beeld van de zebravis in beeld te brengen.
Het melaninegehalte per embryo wordt berekend door de gemiddelde grijswaarde te meten, waarbij het interessegebied constant blijft met behulp van ImageJ-software. Figuur 2C-F laat zien dat de gemiddelde grijswaarde van ca14- en h2afv-morfanten hoger was dan in controlemorfanten. Omdat de gemiddelde grijswaarde omgekeerd evenredig is met het melaninegehalte, leidde knockdown van ca14- en h2afv-genen tot een afname van het melaninegehalte per embryo. Een andere robuuste methode om het melaninegehalte te kwantificeren is een op NaOH gebaseerde spectrofotometrische absorptiemethode. Zoals te zien is in figuur 2G, was het totale melaninegehalte in ca14-morfanten minder dan in controlemorfanten.
Fluorescerende beeldvorming onthulde twee verschillende stadia van de ontwikkeling van zebravismelanofoor: vroeg gespecificeerde melanoforen (mitfa: gfp) en differentiërende melanoforen (ftyrp: gfp). De morfolino-gebaseerde verandering werd geëvalueerd door middel van fluorescerende beeldvorming (figuur 3A en figuur 3C). Om deze waarnemingen verder te valideren, werd de frequentie van GFP-positieve cellen berekend met behulp van FACS. De knockdown van h2afv maar niet ca14 verminderde het aantal melanoforen met betrekking tot controle aanzienlijk (figuur 3A-D). Bovendien kan een vermindering van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit / -gebied worden berekend met behulp van ImageJ-software, waardoor het interessegebied constant blijft. H2afv-morfanten vertonen een significante afname van de gemiddelde fluorescerende intensiteit/oppervlakte ten opzichte van controlemorfanten (figuur 3E,F).
Figuur 1: Workflow voor een omgekeerde genetische benadering om regulatoren van melanocytenbiologie te identificeren met behulp van zebravissen. (A) Stroomdiagram met de experimentele workflow vanaf micro-injectie tot het evalueren van pigmentatie door verschillende methoden. (B) Microinjectienaaldhouder en micromanipulator, samen met een ontleedmicroscoop, is een typische opstelling voor micro-injectie van eencellige zebravisembryo's. (C) Embryonale melanocytenpatronen bij zebravissen bij 3 dpf met alle vijf strepen: dorsolateraal, twee laterale middellijnen (aangeduid met vier rode pijlen), ventrale streep en dooierstreep. (D) Om het pigmentatieresultaat bij morfolino-injectie te bestuderen, kunnen laterale melanoforen in de middellijn onder een stereomicroscoop worden geteld. Brightfield-afbeelding van een dorsaal gebied bij 2 dpf; Het melaninegehalte kan worden gekwantificeerd door de gemiddelde grijswaarde te meten. (E) De gemiddelde grijswaarden zijn omgekeerd evenredig met het melaninegehalte van het embryo. Met melanine gevulde melanoforen bij 2 dpf in wild-type embryo's. (F) Melaninegehaltebepaling kan worden uitgevoerd om de melanineproductie binnen deze melanoforen te schatten. Transgene zebravis die de cellen labelt die TYRP1-eiwit tot expressie brengen bij 2 dpf. (G) Fluorescerend gelabelde cellen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van FACS; schaalbalk = 100 μm. Transgene zebravis die de cellen labelt die Mitfa-eiwit tot expressie brengen op 1 dpf. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit per dier kan worden gemeten met behulp van ImageJ-software. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: dpf = dagen na de bevruchting; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het tellen van laterale melanoforen in de middellijn, het meten van de gemiddelde grijswaarde en het melaninegehalte. Brightfield microscopische beelden van het laterale beeld van morfanten werden gebruikt om het melaninegehalte te kwantificeren met behulp van ImageJ-software. (A) Controle- en histonvariant h2afv (h2afv) morfanten bij 3 dpf; Aan de rechterkant zijn ingezoomde rompgebieden van deze embryo's met melanocytenaantallen. (B) Het aantal melanoforen in h2afv-morfanten is drastisch verminderd ten opzichte van controle, n > 10 elk in 3 biologische replicaties. (C) Representatief beeld van controle vs koolzuuranhydrase 14 morfanten bij 2 dpf. (D) Melanine kwantificering van ca14 vs controle morfanten, n > 10 over 3 biologische replicaties. (E) Lateraal beeld van h2afv versus controlemorfanten bij 2 dpf. (F) Melaninegehalte kwantificering van h2afv versus controlemorfanten. Rode rechthoeken vertegenwoordigen de ROI die is gekozen voor op ImageJ gebaseerde analyse. (G) Melaninegehaltebepaling uitgevoerd op met morfolino geïnjecteerde embryo's voor het kwantificeren van het totale melaninegehalte. Gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten ± SEM.; **P < 0,01, **** P < 0,0001. De t-toets van de student; foutbalken zijn gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: MO = morpholino; DPF = dagen na de bevruchting; ROI = regio van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificeren van fluorescerend gelabelde cellen met behulp van FACS en meten van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit. (A) Fluorescentiebeelden van ca14 en controle morfantembryo's bij 2 dpf van Tg (ftyrp1: GFP) lijn, waarbij de differentiërende melanocyten worden gemarkeerd door GFP-expressie. (B) Aantal melanoforen in ca14 en controlemorfantembryo's bij 2 dpf blijft ongewijzigd, n = 3 biologische replicaties. (C) Fluorescentiebeelden bij 2 dpf van h2afv en controlemorfanten van de Tg(ftyrp1:GFP)-lijn. (D) Het aantal melanoforen in h2afv-morfanten is significant verminderd in vergelijking met de controlemorfantembryo's bij 2 dpf, n = 3 biologische replicaties. (E) Fluorescentiebeelden van controle- en h2afv-morfantembryo's bij 36 hpf van Tg (mitfa: GFP) met gelabelde melanocyten. (F) MFI per dier wordt berekend met behulp van ImageJ-software en weergegeven als een staafdiagram met individuele datasets. MFI is significant verminderd in h2afv-morfanten in vergelijking met controle. Rode rechthoek vertegenwoordigt ROI die is gekozen voor imagej-softwaregebaseerde analyse. n = 3 biologische replicaties; P < 0,001, ****P < 0,0001. De t-toets van de student; foutbalken zijn gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM); schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: MO = morpholino; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; GFP = groen fluorescerend eiwit; DPF = dagen na de bevruchting; ROI = regio van belang; MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Kwantificering van hoofdmelanoforen. (A) Dorsale weergave van h2afv en controlemorfanten bij 48 hpf met hoofdmelanoforen. Het rode vak staat voor de ROI. Door het interessegebied constant te houden, kan het aantal hoofdmelanoforen handmatig worden gekwantificeerd. (B) Aantal hoofdmelanoforen aanzienlijk verminderd bij h2afv knockdown. Staven vertegenwoordigen het geometrische gemiddelde met 95% BI van het aantal hoofdmelanoforen per embryo met elk >30 embryo's. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: MO = morpholino; BI = betrouwbaarheidsinterval; HPF = uren na de bevruchting; ROI = regio van belang. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Microarray van menselijke primaire melanocyten behandeld met PTU. Heatmap toont de expressie van pigmentatiegenen (mitf, tyrosinase, dct, mc1r) na behandeling in menselijke primaire melanocyten. Afkortingen: PTU = 1-fenyl-2-thiourea; tyr = tyrosinase. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pigmentatiefenotype manifesteert zich vaak als veranderingen in het gehalte aan melanine of het aantal pigmentdragende melanocyten. De hierin beschreven methode maakt de ontleding van deze dichotomie mogelijk en maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve beoordeling van het melaninegehalte en het aantal melanoforen per embryo mogelijk, ongeacht het melaninegehalte. De hoge vruchtbaarheid van zebravissen, de zichtbare aard van gepigmenteerde melanocyten en het gebrek aan melanosoomoverdracht maken de dissectie van melanocytenbiologie mogelijk met behulp van deze omgekeerde genetische benadering die vatbaar is voor screening met gemiddelde doorvoer.
De keuze voor op morfolino gebaseerde demping komt voort uit het gemak van het uitschakelen en de mogelijkheid om meerdere kandidaten parallel te testen. Er zijn bepaalde beperkingen van het gebruik van een op morfolino gebaseerde geluidsdempingsbenadering, en richtlijnen voor het gebruik en de interpretatie van deze waardevolle hulpmiddelen zijn eerder beschreven13. In wezen biedt de validatie van het fenotype bij knockdown met behulp van meerdere MOs een tastbare oplossing voor dit probleem. Een alternatieve strategie is het gebruik van CRISPR-gebaseerde genetische verstoring. De penetrantie van het fenotype is beperkt vanwege de inherent lagere frequentie van genetische gebeurtenissen en kan worden verergerd door heterogene mutaties. Dat beperkt het gebruik ervan voor omgekeerde genetische screening14.
Fenotypebeoordeling van melanocytselectieve verstoringen resulteert vaak in een verlaagd pigmentgehalte als gevolg van een veranderde melanogene respons. Er zijn echter verschillende genen die de specificatie van melanocyten verstoren en dus een vermindering van pigmentatie veroorzaken als gevolg van een afname van het totale aantal melanocyten. Een systematische dissectie van de twee scenario's is essentieel om de moleculaire functie van het gen in pigmentatie toe te schrijven. De meting van het melaninegehalte wordt verergerd door de complexe aard van melaninepolymeer. Van de twee beschikbare methoden, namelijk melanine-oplosbaarheid door NaOH en HPLC-gebaseerde detectie van stabiele melanine-oxidatieproducten 1H-pyrrool-2,3,5-tricarbonzuur en pyrrool-2,3-dicarbonzuur, kan de eerste methode routinematig worden uitgevoerd in een laboratoriumomgeving, terwijl de laatste specifieke normen en geavanceerde instrumentatie vereist15.
Bovendien is het aantal embryo's dat nodig is voor de NaOH-methode ook hoger vanwege verschillende stappen die betrokken zijn bij de detectie. NaOH-gebaseerde hydrolyse lost melanine op en maakt spectrofotometrische kwantificering mogelijk. Hoewel deze methode robuust is en kan worden gebruikt voor een medium throughput-scherm (10-15 kandidaten tegelijk), is xanthine aanwezig in xanthoforen een potentieel storende stof vanwege de inherente absorptie in het 400-450 nm-bereik16. Daarom moet een concordantie tussen op beeldanalyse gebaseerde gemiddelde grijze waardebepaling en melaninegehaltebepaling worden uitgevoerd om de vermindering van het melaninegehalte te bevestigen.
PTU biedt een eenvoudig hulpmiddel om de pigmentatie te verminderen en het anders transparante embryo te visualiseren. Het gebruik kan mogelijk leiden tot feedbackveranderingen en veranderingen in melanocyten oproepen. We hebben echter minimale veranderingen waargenomen in de expressie van pigmentatiegenen (aanvullende figuur S2).
Het tellen van melanocyten is het gemakkelijkst in de laterale middellijn en het hoofdgebied, omdat de melanocyten relatief duidelijk waarneembaar zijn in deze regio's (aanvullende figuur S1). Laterale lijn melanoforen ontstaan uit de melanocytenstamcelpopulatie die zich dicht bij de dorsale wortelgangliabevindt 18. Het in beeld brengen van deze populatie heeft verschillende voordelen zoals een vast aantal per embryo en een duidelijk onderscheid. De twee contralaterale lijnen moeten echter worden afgebeeld door het embryo iets te kantelen; anders smelten de twee samen vanwege de transparante aard van het embryo, waardoor het moeilijk te tellen is (figuur 1C versus figuur 2C).
Zebravis melanoforen onderscheiden zich van de gepigmenteerde cellen van het oog die zijn afgeleid van neuro-ectoderm. Deze zijn te onderscheiden door hun positionering in het embryo en zijn duidelijk in het oog versus het lichaamspatroon. In het op FACS gebaseerde experiment kunnen de van het oog afgeleide cellen worden onderscheiden door hun grootte, omdat ze aanzienlijk kleiner zijn dan de melanoforen en kunnen worden afgesloten met behulp van grootte- of verstrooiingscriteria.
Schattingen van melanocyten in verschillende rijpingsstadia met behulp van transgene lijnen kunnen eenvoudig worden uitgevoerd met behulp van op afbeeldingen gebaseerde kwantificering. De kwantificering van het aantal laterale melanoforen is robuust omdat hun aantal varieert in een venster tussen 2 dpf en 5 dpf aan elke kant van het embryo17. Het aantal laterale melanoforen wordt echter bepaald door de migratie en vestiging van een dorsale wortelganglion-geassocieerde stamcelpool18. Vandaar dat eventuele veranderingen in deze processen kunnen leiden tot een vergelijkbare waarneming. Om deze verstorende factor te omzeilen, is een op FACS gebaseerde schatting van alle melanoforen een tastbare oplossing.
Als alternatief kan kwantificering van hoofdmelanoforen worden uitgevoerd zoals beschreven in aanvullende figuur S1 als surrogaat voor melanofoorgetallen. Het is interessant om op te merken dat de veranderingen in steady-state niveaus van melanocytenaantallen twee tegenovergestelde functies voor het kandidaat-gen in kwestie kunnen betekenen. Het kan leiden tot een verminderde specificatie van melanocyten uit neurale-topvoorlopers of melanocyt-specifieke dood veroorzaken en moet worden aangepakt met behulp van methoden zoals de tunneltest. Variaties zoals micro-injecties gevolgd door live-cell imaging zouden het mogelijk maken om andere melanocyt-specifieke fenotypes zoals migratie en patronen te volgen. Van belang voor pigmentcelonderzoekers zou het proces van melanosoomoverdracht zijn, dat niet werkzaam is in het vissysteem. Gecoördineerde melanosoombeweging in melanoforen kan echter worden bestudeerd met veranderingen in live-cell imaging die hierin worden beschreven met modificaties. Al met al zou het gedetailleerde protocol dat in dit videoartikel wordt gepresenteerd, onderzoekers van pigmentcelbiologie in staat stellen om kandidaatgenen te bevragen en hun rol in de melanocytenbiologie te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We erkennen de financiële steun van de Council for Scientific and Industrial Research vide project MLP2008 en het Department of Science and Technology voor het project GAP165 voor het ondersteunen van het werk dat in dit manuscript wordt gepresenteerd. We bedanken Jeyashri Rengaraju en Chetan Mishra voor hun hulp bij experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. Fluorescent quantification of melanin. Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
