Summary
本文介绍了配备MitoTimer生物传感器的星形胶质细胞培养物的线粒体延时成像方法，以及由此产生的线粒体动力学，迁移率，形态，生物发生，氧化还原状态和周转的多参数分析。
Abstract
虽然在神经元水平上对线粒体改变给予了很大的关注，但最近的证据表明，星形胶质细胞中的线粒体动力学和功能与认知有关。本文介绍了配备线粒体生物传感器的星形胶质细胞培养物的延时成像方法：MitoTimer。MitoTimer是一种强大而独特的工具，用于评估线粒体动力学，移动性，形态学，生物发生和氧化还原状态。在这里，介绍了培养，图像采集和随后的线粒体分析的不同程序。
Introduction
星形胶质细胞是维持大脑稳态的关键参与者。它们可能最广为人知的是作为血脑屏障1的一部分以及通过支持整个大脑的神经元和突触2在大脑中具有显着的结构作用。星形胶质细胞对神经元的支持是结构3和代谢4、5，星形胶质细胞促进神经发生和突触发生，同时也为活跃神经元4、6、7提供乳酸等关键代谢物。除了结构支持的作用外，星形胶质细胞是参与Ca2 +信号传导和缓冲（包括自发线粒体Ca2 +流入）8，9，K+缓冲10的活性细胞，并且可以在受伤时适应和反应大脑的需求11，12.作为这样的动态细胞，星形胶质细胞具有强大的能量需求，这需要一个有效的线粒体网络。这些线粒体在缓冲过量活性氧（ROS）13方面也起着至关重要的作用。除了它们的能量产生和ROS缓冲的个体或局部作用外，线粒体还充当网络14。从这个意义上说，它们保持裂变和融合线粒体之间的平衡，分别代表新的/减少的线粒体和旧的/氧化的线粒体15。细胞的整体氧化还原状态可以通过线粒体网络的氧化还原状态来衡量。在病理学中，这是一条关键信息，可以揭示哪些细胞可能功能不佳。
近年来，已经开发了许多传感器来研究细胞中线粒体的动力学和功能。例如，测量能量交换（ATP），氧化还原状态（NADH / NAD+，ROS）和酶功能（cAMP，Ca2+，Zn2 +）的传感器目前用于线粒体功能16的研究。其中，MitoTimer允许跟踪线粒体形态（大小，形状，表面积），移动性（速度，位移）和动力学（融合和裂变事件）的变化，以及整体线粒体周转率和氧化还原状态。MitoTimer是一种突变的红色荧光蛋白drFP58317，具有来自人细胞色素c氧化酶18，19的亚基VIII的线粒体信号，用于可视化新合成的绿色线粒体（488nm）和红色（555nm）的氧化线粒体。使用绿色（488 nm）和红色（555 nm）荧光比可以同时评估单个线粒体，其形态分析，融合/裂变事件和氧化还原状态历史20，21。这种独特的性质可用于研究有关线粒体生理和病理作用的许多科学问题，因此对于揭示许多不同细胞类型中线粒体动力学的潜在机制非常有希望。
我们最近开发了一种新的慢病毒载体（LV-G1-MitoTimer-MiR124T，以下简称LV-G1-MitoTimer）来研究线粒体的动态和功能，特别是在体外和体内的星形胶质细胞22中。LV-G1-MitoTimer使用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子gfaABC1D的截断版本，具有B3增强子（gfaABC1D（B3），以下称为G1）与先前描述的miR124T神经元去靶向系统23相结合。它允许线粒体生物传感器在体外和体内22中的星形胶质细胞中排他性表达。这里介绍的是进行大鼠海马星形胶质细胞培养并为其配备LV-G1-MitoTimer生物传感器的不同步骤，以及跟踪星形胶质细胞线粒体在连续几小时/几天内的行为的不同显微镜步骤。
Protocol
本议定书是在伦理委员会批准下执行的（协议VD3602，瑞士洛桑），并遵循欧洲动物使用指南。
1.大鼠海马星形胶质细胞原代培养
- 在出生后第1-2天通过斩首来牺牲五只大鼠幼崽（Wistar IGS Rat）。
- 取出大脑并将其保存在含有5 mL新鲜星形胶质细胞培养基的培养皿中（含有GlutaMAX的DMEM，补充有1%青霉素/链霉素和10%新鲜马精华素）。
- 隔离海马体。在5 mL星形细胞培养基中，通过21 G针头通过3个通道，通过25 G针头解离3个通道。
- 将解离的细胞转移到15mL离心管中并在血细胞计数器中计数。
- 在多孔培养皿（9.4 mm x10.7 mm x 9.3 mm）中平板20，000-25，000个细胞/ cm2， 并将其储存在37°C下含有5%CO 2的气氛中，用于实验的其余部分。
- 在 体外 3天（DIV3）完全更换培养基。
- 在DIV8中，每细胞添加0.6pg的p24抗原，用于线粒体生物传感器MitoTimer（LV-G1-MitoTimer22）稀释在磷酸盐缓冲盐水（PBS + 0.01%BSA）中稀释。
- 在DIV9中，用预热的1x无菌PBS（37°C）洗涤并加入新鲜的星形胶质细胞培养基。
- 在DIV11中，用预热的1x无菌PBS（37°C）进行2次洗涤，并加入不含酚红的新鲜星形胶质细胞培养基。
注意：涂层的选择取决于预期的测定。作为星形胶质细胞初级培养的标准涂层，建议使用0.2 mg / mL聚-D-赖氨酸或8.7μg/ cm2 基底膜基质（例如基质胶）。为了可视化星形胶质细胞的线粒体系统，必须在扁平和拉伸的细胞上工作。在这种情况下，在IBIDI u-slide上组合基底膜基质是最合适的。同样重要的是不要使用酚红，酚红在反复暴露在光线下对细胞有毒。
2.长期监测线粒体系统。
- 在使用LV-G1-MitoTimer进行慢病毒感染后至少3-5天评估星形细胞线粒体系统（以允许线粒体中足够水平的荧光）。
- 使用由采集和分析软件控制的倒置显微镜以及用于完全自动化采集的模块对细胞进行成像。
注：有关本研究中使用的软件和模块的详细信息，请参阅 材料表 。 - 确保显微镜配有笼式培养箱（ 见材料表），以在整个实验过程中将星形胶质细胞培养保持在5%CO2 和37°C。
- 使用490 nm（绿色通道）和550 nm（红色通道）的顺序激发捕获荧光图像，并检测绿色（绿色通道为500-540 nm）和红色（红色通道为550-600 nm）荧光信号。
- 使用40倍的放大倍率，使用线粒体网络选择每孔5个星形胶质细胞，表达足够水平的LV-G1-MitoTimer。注意选择尽可能平坦和大的星形胶质细胞，而不是位于细胞簇中（以在单个细胞上工作）。
- 将 5 个选定单元格的坐标保存在 xlm 文件 （map.xlm） 中。此 map.xlm 允许用户随着时间的推移返回到相同的单元格。
- 对于每个坐标，使用150倍（100倍油浸物镜，1.5倍中间放大倍率）的放大倍率采集图像序列（1张图像/秒，持续60秒）。
- 治疗后6小时，12小时和24小时对相同的星形胶质细胞重复图像采集（1张图像/ s，持续60秒）。
注：使用配备快速高效自动对焦系统的显微镜。在这种情况下，使用了称为完美对焦系统（PFS）的硬件解决方案。PFS使用近红外870nm LED和CCD线传感器，在长期成像调查期间实时对抗轴向焦点波动。
3. 个体线粒体形态分析及LV-G1-MitoTimer比值
注：在本研究中，尼康的NIS General Analysis 3（GA3）用于自动化形态分析。
- 对于每个图像序列（基线、6 小时、12 小时、24 小时），通过单击 "ND 处理">"选择帧"，为红色和绿色通道选择第一帧。
- 合并红色和绿色频道，方法是选择 "转化次数>合并频道"。
- 若要更正图像底纹，请选择"预处理">"自动底纹校正"。
- 通过选择" 预处理">"滚动球"来应用滚动球算法。
- 要为每个线粒体生成二进制掩码，请选择 分割>阈值。
- 删除被边框截断的任何对象，方法是选择 二进制处理 > 触摸边框。
- 要测量表面积，请选择" 测量>对象面积"。
- 要测量直径，请选择 测量> 等式直径。
- 要测量长度，请选择 测量>长度。
- 要测量宽度，请选择 测量 >宽度。
- 要测量粗糙度，请选择 "测量>粗糙度"。
- 要测量圆度，请选择 "测量>圆度"。
- 要测量伸长率，请选择 测量>伸长率。
- 使用上述测量值组成一个组（右键单击），并将其重命名为MorphoData。
- 通过选择" 测量>平均强度"来测量平均绿色强度。
- 通过选择" 测量>平均强度"来测量平均红色强度。
- 要测量红/绿比，请选择"测量>比"。
- 使用上述度量值组成一个组（右键单击），并将其重命名为 RatioData。
- 通过选择" 将表引用>为 CSV"，将表导出为 CSV 文件。
- 通过选择另存为来保存分析的 GA3 脚本
注： 图 1、表 1和 表 2总结了此过程中使用的标准的非详尽列表。分析GA3脚本文件在补充（补充编码文件1 和 图2）中可用。使用的阈值经过调整，以尽可能多地个性化线粒体（在可能的情况下不包括大型线粒体网络）。只要有可能，线粒体网络要么手动个性化，要么从分析中排除。由于细胞间的变异性，对每种情况至少20-25个细胞进行这些分析（每个细胞至少50个线粒体）。
4. 线粒体运动分析
注意：由于线粒体运动的高度复杂性，手动运动分析是首选。在这里，尼康的NIS Element系统用于手动跟踪线粒体。
- 在 NIS 中打开跟踪模块，选择 "查看>分析>跟踪"。
- 单击 定义 新的投资回报率。
- 使用 自动检测工具，在图像序列的第一张图像上选择25-50个线粒体。
- 单击跟踪 自动检测的ROI分析。
- 如有必要，请删除不正确的 ROI 轨迹。
- 将表导出到 CSV 文件。
注意： 图 1 和表 3总结了此过程中使用的标准的非详尽列表。跟踪分析通常会给出一个路径，描述每个被跟踪对象的中心运动。必须在跟踪选项中设置不同的跟踪选项。倾向于选择彼此相距足够远的孤立线粒体，以便于跟踪。仅保留可以在整个序列中一致跟踪的对象。以相同的方式删除由于质量跟踪质量差而导致的异常值。因此，本节中分析的对象集与静态形态分析中分析的对象集不同，并且通常较小。
5. 数据转换、规范化和统计分析
注意：主要是由于线粒体的高度异质性，生成的数据通常具有非正态分布。
- 在处理之前手动记录并转换测量值。
- 对于每个分析和时间范围，通过参考采集中获得的数据的平均值手动归一化结果数据。
- 此外，考虑对照条件进行第二次/双重归一化，例如，评估治疗效果。
- 然后，使用双向匹配方差分析执行统计分析。这里使用了GraphPad Prism V8。
Representative Results
感染LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞的一期培养显示出典型的线粒体网络。在治疗前，表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞显示出异质线粒体大小和各种绿色/红色荧光强度（图3，图4和视频1）。在H 20 2（10μM）孵育之前和之后监测表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞培养物的线粒体系统。在12小时（每3小时）内计算上述不同的线粒体特征，并归一化（逐个细胞）至其初始状态。在形态水平（图3B）上，H2O2的影响在大约6小时时开始可见。事实上，线粒体是碎片化的（长度，表面积和伸长率的减少）。这种碎片在治疗后12小时更加明显。请注意，直径、宽度和球形度没有减小。关于氧化还原状态和周转（图3C），H2O2处理后3小时，星形胶质细胞中绿色线粒体的比例增加（线粒体生物发生迅速增加的结果）。在6 h时，绿色/红色比值恢复到基线水平，但纯红色线粒体的数量从基础水平显着增加。12小时后，H 2O 2氧化处理的后果可见，并导致红点的比例和数量大幅增加。关于动力学和迁移率（图3D），治疗后3小时，所有标准均暂时增加。从长远来看（12小时），线粒体移动得更慢，距离更短。
图1：表达LV-G1-MitoTimer生物传感器的星形胶质细胞培养物（A）表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞共聚焦照片。（B） 选择具有不同碎片水平的还原（绿色）平衡（橙色）和氧化（红色）线粒体的共聚焦照片。（C） 在表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞中可用于分析的不同标准的摘要图。比例尺： （A） 上图： 50 μm， 下面板： 10 μm， （B） 1 μm.请单击此处查看此图的放大版本。
图2：线粒体形态和比率分析。（A）GA3脚本概述用于分析个体线粒体形态和比例。（B） 用GA3脚本分析的表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞的初始照片。（C） 为星形胶质细胞线粒体系统生成的二进制掩模示例。比例尺：10 μm （B-C）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：H2O2对星形胶质细胞线粒体系统的影响（A）在用PBS（CTRL）和10μM的H 2O2处理后1小时和6小时，24小时表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞的照片。（B）线粒体形态的雷达图，（C）氧化还原状态和周转，以及（D）在基线和H 2O2处理后3小时，6小时和12小时评估星形胶质细胞的迁移率标准。SA：表面积;D： 直径;L：长度;W：宽度;R：圆度;S：球形度;EF： 伸长系数 （=L/W）;G/R：单个红/绿比;Gpuncta：绿色斑点线粒体的百分比;Rpuncta：红色斑点线粒体的百分比;Dis： 位移;Tr： 轨道长度;Sp 和 SpV：速度和速度方差;斯特：直线度。比例尺：20 μm （A） 和 2.5 μm（插图）。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞的照片，并在基线期间显示均匀和平衡的线粒体网络。 比例尺：20 μm 请点击此处查看此图的放大版本。
视频1：H2O2 治疗对培养的星形胶质细胞线粒体系统的影响。 与未处理的对照细胞相比，H2O2 处理（基线）之前的星形细胞线粒体，以及H2O 2处理后的6小时和24 小时。 请点击此处下载此文件。
| 形态学标准 | 范围 | 言论 | ||
| 表面积 （SA） | 0.5–4 μm2 | 这些标准告知线粒体的碎片化 -细长特征。它们通常朝着同一方向发展。碎片化的线粒体的表面积、直径、长度和伸长系数都会降低，而圆度、球形度和宽度可能会保持不变或增加。 | ||
| 直径 （D） | 0.5–1.5 微米 | |||
| 长度 （L） | 0.5–5 μm | |||
| 宽度（W） | 0.5–2 微米 | |||
| 圆度 （R） | 0–1 | |||
| 球形度（S） | 0–1 | |||
| 伸长系数 （EF = L/W） | 1–10 | |||
表1：线粒体形态学的选定参数摘要。
| 氧化还原状态标准 | 范围 | 言论 | ||
| 单项比率（克/劳氏） | 0–10 | 该比率表示氧化还原状态的结果。它告知细胞中线粒体的一般状态和年龄。必须考虑的是，该比率是线粒体的生物发生和降解的平衡，以及氧化线粒体与线粒体减少的裂变/融合。因此，对绿色和红色puncta数量的评估可以有力地帮助解释结果。 绿色点状线粒体是在绿色的强度是红色的10倍时确定的。当红色的强度比绿色的强度大10倍时，确定红色的线粒体。星形胶质细胞的氧化还原状态是该细胞所有线粒体比率的平均值。 | ||
| 绿色点状线粒体（Gpuncta）的百分比 | 0%–100% | |||
| 红点线粒体（Rpuncta）的百分比 | 0%–100% | |||
表2：线粒体氧化还原状态的选定参数摘要。
| 调动标准 | 范围 | 言论 | ||
| 位移（Dis） | 0–10 μm | 这些特征共同为网络的一般运动动态提供了信息。静止的线粒体以低速显示较短的位移和轨道长度。另一方面，振荡粒子可以通过轨道长度和位移之间的差异（导致低直线度）和与静态相比增加的速度来区分。 | ||
| 轨道长度（TR） | 0–10 μm | |||
| 速度和速度差异（Sp 和 SpV） | 0–1.5 μm/s ± 0.2 μm/s | |||
| 直线 | 0–1 | |||
| （Str = 排量/轨道长度） | ||||
表3：线粒体迁移率的选定参数摘要。
补充编码文件1：用于分析单个线粒体形态的GA3脚本文件。 请点击此处下载此文件。
Discussion
在这里，提出了一种纵向跟踪培养的星形胶质细胞中线粒体系统的动力学和周转的新方法。与对一组固定的细胞或一次一个细胞（文献中最常用的）进行延时方法不同24，25，研究人员可以在几天内跟踪线粒体系统在同一单个细胞上的进化。与需要高水平光照的单孔实时成像相比，并且选择许多单个细胞不太可行，所提出的方法利用该显微镜在孔的不同区域对多个不同细胞进行成像的能力，并在不同的时间点返回这些相同的细胞以重新成像它们。由于对每个目标细胞的每个测量标准进行的基线归一化，它考虑了线粒体系统的复杂性，并研究了治疗相对于其自身基线图像对每个细胞的影响。显微镜能够一次在多达16个孔上自主进行这种类型的成像（每孔成像5个细胞），允许在分析过程中正确考虑线粒体系统的异质性，而不会产生不同日期成像各种条件所带来的实验变异性。
培养物的质量，表达LV-G1-MitoTimer生物传感器的病毒感染水平，显微镜和物镜的类型以及合适细胞的选择是关键变量，必须在此方案中尽可能保持一致。细胞密度，载体类型和病毒滴度可以根据问题进行调整。虽然先前的研究表明LV-G1-MitoTimer表达对线粒体功能和动力学21，22，26，27没有有害后果，但必须验证浓度对细胞无毒（例如，检查控制良好的细胞总数）。由于使用单个焦平面，星形胶质细胞应：（1）尽可能平坦，（2）与其他标记细胞分离（以简化培养皿中位移情况下的分析），以及（3）具有高荧光水平。由于培养物中的细胞在形态上可能高度可变，因此线粒体系统可以是高度异质的。在这种情况下，分析ROI（而不是整个细胞）可以补偿一些有问题的区域，例如核周区域，并降低变异性。在相对相似的细胞上进行基线测试并尽可能多地对细胞进行采样至关重要。因此，高内涵采集和分析显微镜是理想的选择。在这种纵向监测期间，同样重要的是不要将细胞过度暴露在光线下，以避免生物传感器漂白。
这种成像方法并非没有复杂性，并且在整个实验方案中，包括几个注释，这些注释考虑了在以前使用显微镜进行测试期间进行的故障排除。例如，所用板包衣的选择取决于预期的测定方法，但已经包括了星形胶质细胞原代培养物最合适选择的建议。此外，由于细胞间变异性，每种条件应至少对5个细胞进行图像采集。更具体地说，在基线成像中选择的一些细胞会死亡，一些会移出指定图像采集区域的框架，还有一些会改变它们的形态，使得线粒体在分析中很难个体化。从一开始就对许多细胞进行成像，增加了在实验结束时分析足够大的细胞样本量的可能性。除了这种成像技术更复杂的方面之外，就谁可以从这种类型的成像和分析中受益而言，还存在一些明显的局限性。为了充分利用图像采集的自动化，所使用的显微镜必须具有自动对焦系统，该系统可以处理图像之间的时间间隔速度（即，本方案中的每3秒），并且可以在拍摄每张图像之前始终如一地聚焦在所讨论的细胞上。此外，如果没有使整个图像采集过程自动化的JOBS软件，这种方法变得艰巨且可能是不可能的，具体取决于要成像的细胞数量，因为它需要在适当的时间点再次手动查找和成像每个细胞。最后，这种成像方法也不能幸免于光漂白的问题。因此，与任何长期采集方法一样，重要的是选择不易受到光漂白影响的荧光标记物，并定制图像采集以尽可能避免此问题。
这种技术与目前以关键方式使用的其他技术不同。与其他延时研究不同，该技术不需要在整个过程中在孔中的相同位置进行成像，也不需要手动移动板以对其他区域进行成像。这使得研究人员能够在一个24小时的时间内对许多条件下的许多细胞进行成像。因此，对每个孔中的许多细胞进行这种成像和分析的能力提供了相同的群体信息，这些信息可以从广泛研究一大组细胞中获得，同时另外提供来自每个成像细胞的特定测量值。虽然这种方法的某些特性可能不适用于其他图像采集方法（如上所述），但其好处超过了采集后分析类型的复杂性。这项技术使研究人员能够看到各种治疗对线粒体系统的确切影响，从而对培养的星形胶质细胞的影响。
此外，该方法可高度定制，以适应有关特定环境中线粒体行为和角色的许多不同科学问题。这里概述的方案专门处理培养的星形胶质细胞。然而，可以使用许多其他细胞类型，并且可以测试的治疗方法仅受所研究问题的限制。这种类型的成像有可能促进对线粒体行为的集体知识和理解，导致线粒体功能障碍的潜在机制，以及许多病理学对不同类型细胞中存在的先天动力学的影响。
Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项研究得到了Synapsis基金会奖学金的支持，该奖学金授予K.R.和洛桑大学医院（CHUV）。作者感谢尼康的帮助，特别是J. Gannevat。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
| 19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
| Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
| Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
| Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
| Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
| Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
| Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
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