Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generation af menneskelige motorenheder med funktionelle neuromuskulære vejkryds i mikrofluidiske enheder

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62959
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 5, 3,4, 1,2, 1,2, 5, 1,2,6, 1,2
1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, 2VIB Center for Brain & Disease Research, Laboratory of Neurobiology, , 3VIB Center for Brain & Disease Research, Research Group Molecular Neurobiology, , 4VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, 5Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, 6Department of Neurology, University Hospitals Leuven

Summary

Vi beskriver en metode til at generere menneskelige motorenheder i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder ved at co-culturing human induceret pluripotente stamcelle-afledte motor neuroner med menneskelige primære mesoangioblast-afledte myotubes resulterer i dannelsen af funktionelt aktive neuromuskulære knudepunkter.

Abstract

Neuromuskulære vejkryds (NMJs) er specialiserede synapser mellem axon af den lavere motoriske neuron og musklen lette engagement muskelsammentrækning. I motoriske neuron lidelser, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og spinal muskelatrofi (SMA), NMJs degenerere, hvilket resulterer i muskelatrofi og progressiv lammelse. Den underliggende mekanisme for NMJ degeneration er ukendt, hovedsagelig på grund af manglen på omsættelige forskningsmodeller. Denne undersøgelse havde til formål at skabe en alsidig og reproducerbar in vitro model af en menneskelig motor enhed med funktionelle NMJs. Derfor blev menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte motornanoner og menneskelige primære mesoangioblast (MAB)-afledte myotubes co-dyrket i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder. Brugen af flydende isolerede mikrorum giver mulighed for vedligeholdelse af cellespecifikke mikromiljø, samtidig med at celle-til-celle kontakt tillades gennem mikrogroove. Ved at anvende en chemotactic og volumetrisk gradient, væksten af motoriske neuron-neurites gennem mikrogroove fremme myotube interaktion og dannelsen af NMJs blev stimuleret. Disse NMJs blev identificeret immunocytokemisk gennem co-lokalisering af motor neuron præsynaptisk markør synaptophysin (SYP) og postsynaptisk acetylcholin receptor (AChR) markør α-bungarotoxin (Btx) på myotubes og karakteriseret morfologisk ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Funktionaliteten af NMJs blev bekræftet ved at måle calcium svar i myotubes ved depolarisering af motoriske neuroner. Den motoriske enhed, der genereres ved hjælp af standard mikrofluidiske enheder og stamcelleteknologi, kan støtte fremtidig forskning med fokus på NMJs inden for sundhed og sygdom.

Introduction

NMJs lette kommunikationen mellem lavere spinal motor neuroner og skeletmuskulaturfibre gennem frigivelse af neurotransmittere1. I motoriske neuron lidelser som ALS og SMA, NMJs degenerere, hvilket forårsager en forstyrrelse i kommunikationen med musklerne2,3,4,5,6,7. Dette resulterer i, at patienter gradvist mister deres muskelfunktion, hvilket får dem til at være kørestolsbundne og i sidste ende afhængige af respiratorisk livsunderstøttelse på grund af progressiv atrofi af vitale muskelgrupper som mellemgulvet. De nøjagtige underliggende mekanismer, der er ansvarlige for dette dybe tab af NMJs i disse lidelser, er ukendte. Mange undersøgelser er blevet udført på transgene dyremodeller, hvilket har givet os en vis indsigt i patogenesen af NMJ degeneration5,6,8,9,10,11. Men for fuldt ud at forstå patologien og modvirke denervation er det vigtigt at have et menneskeligt system, som giver fuld tilgængelighed.

Her beskriver protokollen en relativt enkel måde at generere menneskelige NMJs gennem co-dyrkning af hiPSC-afledte motor neuroner og menneskelige primære MAB-afledte myotubes ved hjælp af kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder. Brugen af mikrofluidics til at polarisere og flydende isolere somaer og axoner af neuroner har været kendt siden den første beskrivelse af 'Campenot' kamre12 i slutningen af 1970'erne. Siden da er flere mikrofluidiske designs blevet fremstillet, herunder kommercielle muligheder. De enheder, der anvendes i denne protokol indeholder to rum, og hvert rum består af to brønde forbundet med en kanal13. De to rum er spejlet og forbundet med flere mikrogroove. Disse mikrogroove har en størrelse, der letter neuritvæksten, samtidig med at den flydende isolation mellem de to rum opretholdes gennem et kapillært hydrostatisk tryk13,14. Ved hjælp af dette system er det muligt at dyrke motoriske neuroner i et rum og muskelceller i det andet, hver i deres specifikke kulturmedium, mens det stadig letter en fysisk forbindelse gennem neuritter, der passerer gennem mikrogrooves og engagerer sig med muskelcellerne. Denne model giver et fuldt tilgængeligt og fleksibelt in vitro-system af en menneskelig motorisk enhed, som kan bruges til at studere tidlig NMJ patologi i sygdomme som ALS og SMA.

Protocol

Skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra alle forsøgspersoner, som leverede deres prøver til iPSC-generering og MAB-høst. Proceduren blev godkendt af den medicinske etiske komité på University Hospital Leuven (n° S5732-ML11268) og af Storbritanniens vigtigste forskningsetiske komité som en del af StemBANCC-projektet. Alle reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol, er opført i materialetabellen og bør anvendes sterilt. Medier skal opvarmes til stuetemperatur (RT) før brug, medmindre andet er angivet. Du kan finde en oversigt over co-culture-protokollen i figur 1.

1. Differentiering af motoriske neuron forfædre fra iPSC'er

  1. Følg den motoriske neurondifferentiering protokol15, tilpasset fra en tidligere undersøgelse16, indtil du når dag 10 neurale stamfader (NPC'er) tilstand. Ifølge protokollens tidsramme indledes differentiering på en mandag (dag 0), hvilket resulterer i dag 10 NPC'er på en torsdag.
  2. Kryopreserve dag 10 NPC'er i knock-out serum udskiftning med 10% dimethyl sulfoxid (DMSO) ved en densitet på 2 x 106- 4 x 106 celler pr hætteglas.
    ADVARSEL: DMSO er giftig: håndtag i en røghætte med personlige værnemidler.
    BEMÆRK: Ca. 50% af dagen 10 NPC'er forventes at være afgørende ved optøning. Stop motor neuron differentiering protokol på denne 'dag 10 NPC' tilstand og cryopreserve NPC'er til at generere et stort antal NPC'er, som kan bankes og anvendes senere, hvilket reducerer længden af den samlede tidslinje for co-kultur protokol fra 28 dage til 19 dage i alt.

2. Afledning og vedligeholdelse af menneskelige MBS

BEMÆRK: MABs er fartøjsforbundne mesenkymale stamceller, som i dette tilfælde er høstet fra biopsier fremstillet af en 58-årig sund donor. Alternative kommercielle kilder er tilgængelige. Protokollen om at opnå MMB'er forklares kort. Yderligere oplysninger finder du i den detaljerede protokol17. Alle MAB-medier skal opvarmes til 37 °C før brug.

  1. Hakke biopsivæv og inkubere på kollagen (fra kalveskind) belagt 6 cm retter i et vækstmedium (tabel 1) i 2 uger. Skift medium hver 4. dag.
    1. For at forberede kollagenbelægning opløses 100 mg kollagen i 20 ml 0,1 M eddikesyre. Kollagen tager tid at opløse, så læg blandingen på en gyngeplatform natten over på RT. Den følgende dag, fylde op med 80 mL ddH2O til et sidste volumen på 100 mL.
      FORSIGTIG: Eddikesyre er giftigt; håndtag i en røghætte med personlige værnemidler.
      BEMÆRK: Kollagen fra kalveskind belægning kan genbruges op til 5x. Opbevares ved 4 °C.
    2. Coat hele overfladen af fadet eller kolben med kollagen, lukke og inkubere i 20 minutter på RT inde i en laminar flow. Efter 20 min, inddrive kollagen i en frisk beholder, lukke den tomme skål / kolbe og lad i 10 min på RT i laminar flow.
    3. Fadet/kolben overføres til inkubatoren for natten over (eller mindst 6 h) inkubation (37 °C, 5% CO2). Vask 5x med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand uden calcium eller magnesium (DPBS) før platingceller.
  2. Efter 14 dage sorterer FACS (fluorescerende aktiveret cellesortering) MAB'erne for human alkalisk fosfatase17 efterfulgt af yderligere ekspansion. Vedligehold MAB'erne på kollagenbelagte T75-kolber i vækstmediet, og skift vækstmediet hver anden dag (10 mL pr. kolbe).
  3. Kryopreserve, passage eller frø-MAB'er i enheder, når de når 70 % sammenløb.
    BEMÆRK: MABs mister deres myogene potentiale på grund af spontane fusioner ved celle-til-celle kontakt. Sørg for ikke at overstige 70% sammenløb, når du udvider MABs. En 70% sammenflydende T75 kolbe indeholder ca. 600.000-800.000 celler, som kan cryopreserved på 100.000 celler pr hætteglas. Hvert hætteglas kan senere optøs og sås i en T75 kolbe til ekspansion.
  4. For at passere MBS skal du forsigtigt vaske dem én gang med 7 mL DPBS og derefter inkubere i 7 mL MAB-dissociationsopløsning i 3 min ved 37 °C i 5% CO2 for at adskille cellerne.
    1. Neutralisere MAB-dissociationsopløsningen med vækstmediets 7 mL, skrab forsigtigt cellerne og overføre celleaffjedringen til et 50 mL centrifugerør. Vask forsigtigt kolben med yderligere 5 mL af vækstmediet for at opsamle potentielt resterende MAB'er.
    2. Centrifuge celleaffjedringen i 3 min ved 300 x g, derefter passage direkte til en ny kollagen-belagt T75 kolbe til ekspansion, cryopreserve i knock-out serum udskiftning med 10% DMSO eller tælle til frø i en mikrofluidisk enhed.
      BEMÆRK: Passager udføres 1x-2x om ugen for celleudvidelse indtil et maksimalt passagertal på 13. Ved dissociation fremstår MAB'er sfæriske og store i form, når de undersøges under mikroskopet.

3. Forberedelse af formonterede mikrofluidiske anordninger - Dag 9

BEMÆRK: Protokollen er tilpasset fra mikrofluidisk enhedsproducentens neuronenhedsprotokol og er blevet justeret til brug af både formonterede og silikoneenheder. Her bruges formonterede enheder til immuncytokemi (ICC) og levende celle calciumtransientoptagelser, mens silikoneenheder bruges til SEM. Tidslinjen for protokollen følger tidslinjen for motor neuron differentiering protokol.

  1. Forbered de mikrofluidiske enheder dagen før såning af celler, da belægningen skal inkuberes natten over. Ifølge motor neuron protokol, vil dette være en onsdag. Tilsæt ~ 10 mL af 70%-100% ethanol til en 10 cm Petri fad. Brug kraft til at overføre enheden fra forsendelsesbeholderen til petriskålen til sterilisering.
  2. Dyk enheden ned i ethanol i 10 s og overfør enheden med sammenknak til et stykke papir til lufttørre i laminar flow i ~ 30 min. Vend enheden et par gange for at lade begge sider tørre. Når enheden er tør, skal du bruge kraft til at flytte hver enhed til en individuel 10 cm Petriskål for nem håndtering
    FORSIGTIG: Ethanol er giftigt; håndtag i en røghætte med personlige værnemidler
  3. Anordningen beklædes med Poly-L-ornithine (PLO) (100 μg/mL) i DPBS og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 3 timer.
    1. Brug en P200 pipette til at tilføje 100 μL PLO i DPBS i en top såvel som tæt på kanalåbningen som muligt, og observere væsken, der passerer fra toppen godt gennem kanalen til bunden godt. Derefter tilsættes 100 μL PLO i DPBS til bunden godt.
    2. Gentag på den anden side af mikrogroovene, og afslut ved at tilsætte 100 μL på den ene side af enheden for at skabe en volumengradient mellem de to spejlede sider af enheden for at belægge mikrogroovene (f.eks. højre side 200 μL, venstre side 300 μL). Efter 3 timer skal enheden vaskes 3x i 5 min med DPBS. Brug et sugesystem, hvis det er nødvendigt.
      BEMÆRK: Sørg for at undgå luftbobledannelse i kanalerne på et hvilket som helst tidspunkt under cellernes belægning eller dyrkning. Selv små bobler vil udvide sig over kort tid og derved hæmme belægning, cellesåning eller medieflow over kanalen. Hvis væsken stopper i kanalen under belægningen, skal PLO-opløsningen genbruges direkte ind i kanalen fra begge sider. Hvis der stadig er bobler til stede, skal du bruge 200 μL DPBS til at skylle kanalen og gentage belægningsprocessen som angivet ovenfor i trin 3.3.1-3.3.2. Hvis bobler vises efter cellesåning, er det umuligt at gendanne enheden, da skylning af kanalen vil beskadige cellerne.
  4. Anklen med laminin (20 μg/mL) i et neurobasalt medium, og inkuber natten over ved 37 °C, 5 % CO2. Følg de samme anvisninger for PLO-belægning fra trin 3.3.1-3.3.2.
  5. Den følgende dag skal du bruge en P200 pipette og placere spidsen i brønden modsat kanalåbningen for at fjerne lamininbelægningen fra brøndene. Tilføj DPBS til alle brønde og lad enhederne med DPBS i laminar flow på RT for celle såning.
    BEMÆRK: Fra dette tidspunkt er det vigtigt ikke at fjerne væske (laminin belægning, DPBS, medier, fikseringsopløsning osv.) direkte fra kanalerne, da dette kan forårsage luftbobledannelse. Undersøg altid enhederne under mikroskopet før såning af celler.

4. Forberedelse af mikrofluidiske silikoneapparater til silikone - Dag 9

  1. Forbered silikone mikrofluidiske enheder dagen før såning celler, som belægning skal inkubere natten over. Ifølge motor neuron protokol, vil dette være en onsdag.
    1. Tilsæt ~ 10 mL af 70%-100% ethanol til en 10 cm Petri fad. Brug en kraft til at overføre enheden fra forsendelsesbeholderen til petriskålen til sterilisering. Dyk enheden ned i ethanol i 10 s og overfør med sammenkvepper til en brønd i en 6-brønds plade til lufttørre i laminar flow i ~ 30 min. Placer enheden på siden, så alle sider kan tørre.
    2. Skær SEM-arkene ned til enhedens størrelse (efterlad et par mm på hver side). Steriliseringen gentages som nævnt ovenfor i trin 4.1.1. Overfør derefter med sammenkrerne til en 10 cm petriskål for at tørre. To-tre SEM ark vil passe ind i en skål.
  2. Bekæmp enhederne og SEM-arkene med PLO (100 μg/mL) i DPBS og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 3 timer.
    1. Tilføj 1 mL PLO i DPBS pr. brønd til hver enhed i 6-brøndspladen. Sørg for, at enheden flyder oven på PLO-opløsningen med kanalen og mikrogroovesiden nedad i væsken. Tilsæt 10 mL PLO i DPBS pr. 10 cm Petriskål og brug sammentak til at skubbe SEM-arkene ned i væsken.
      BEMÆRK: SEM-ark vil normalt flyde oven på belægningsopløsningen. Før du samler enheden og arket, skal du dreje SEM-arket rundt, så overfladen, som har været i kontakt med PLO, kontakter enhedens kanal og mikrogrooveoverflade.
    2. Efter 3 timer vaskes enheden og SEM-arkene 2x i 5 min med DPBS efterfulgt af en anden vask i 5 min med sterilt vand. Brug et sugesystem, hvis det er nødvendigt. Overfør hvert SEM-ark til en individuel 10 cm petriskål for nem håndtering.
      BEMÆRK: Både enheder og SEM-ark skal være helt tørre før montering. Den endelige vask med sterilt vand fjerner potentielle saltkrystaller fra DPBS, som ellers kan hæmme samlingen.
  3. Arbejd under et mikroskop i en laminar flow. Brug sammentrækninger til at montere silikoneenheden med kanalen og mikrogroovesiden nedad i en 90° vinkel på SEM-arket, så alle sider er justeret. Tryk let ned på enheden for at sikre, at du ikke kun forsegler yderkanter, men også omkring brønde, kanaler og mikrogroove.
    BEMÆRK: Bindingsområder vises grå, mens de endnu ikke monterede vil fremstå tydelige under mikroskopet. Sørg for, at alle områder er godt forseglet uden luftbobler for at undgå løsrivelse af enheden under dyrkning. I tilfælde af snavs eller saltkrystaller, der blokerer monteringen, skal du vaske både SEM-ark og enhed i sterilt vand og tørre, før monteringsproceduren prøves igen. Hvis mikrogroovene ser forvrængede ud fra at trykke for hårdt på enheden, skal du fjerne enheden helt fra SEM-arket og prøve monteringen igen. Vær forsigtig, når belægning og skift af medier, når enheden er monteret.
  4. Arbejd under et mikroskop i en laminar flow. Anklen med laminin (20 μg/mL) i et neurobasalt medium, og inkuber natten over ved 37 °C, 5 % CO2.
    BEMÆRK: Inkubation hærder silikoneanordningen fra den ene dag til den anden og forsegler den yderligere på SEM-arket.
    1. Brug en P200 pipette til at tilføje 100 μL af lamininopløsningen i en top såvel som tæt på kanalåbningen som muligt, og observere væsken, der passerer fra toppen godt gennem kanalen til bunden godt. Kontroller for lækage omkring brønden og kanalen.
    2. Derefter tilsættes 100 μL laminin opløsning til den nederste brønd og kontrollere for lækage. Gentag på den anden side af mikrogroovene og afslut med yderligere 100 μL på den ene side af enheden for at skabe en volumengradient mellem de to spejlede sider af enheden for at belægge mikrogroovene (f.eks. højre side 200 μL, venstre side 300 μL).
      BEMÆRK: I tilfælde af lækage skal lamininbelægningen fjernes, demonteres enheden og SEM-arkene og vaskes begge i sterilt vand. Lad dem tørre og gentag fra trin 4.3 og fremefter.
    3. Den følgende dag skal belægningen fjernes fra brøndene med en P200-pipette ved at placere spidsen i brønden overfor kanalåbningen. Tilføj DPBS til alle brønde og lad enhederne med DPBS i laminar flow på RT for celle såning.
      BEMÆRK: Fra dette tidspunkt må du ikke fjerne væske (lamininbelægning, DPBS, medier, fikseringsopløsning osv.) direkte fra kanalerne, da dette kan forårsage luftbobledannelse. Undersøg altid enhederne under mikroskopet før såning af celler.

5. Plating af NPC'er i mikrofluidiske enheder - Dag 10

BEMÆRK: Ifølge motor neuron differentiering protokol15, plating af dag 10 NPC'er sker på en torsdag.

  1. Brug frisk dissocierede dag 10 NPC'er15, eller optø 1-2 hætteglas af bankede NPC'er pr. 10 mL dag 10 motor neuron medium (tabel 2 og tabel 3) med ROCK-hæmmer (10 μL/mL) opløsning, og centrifugere celleaffjedringen ved 100 x g i 4 min.
  2. Brug cellepillen igen i 500-1000 μL på dag 10 motorisk neuronmedium med ROCK-hæmmer (10 μL/mL) opløsning, og opdel de levende celler ved hjælp af en foretrukken optællingsmetode.
    BEMÆRK: Som angivet nedenfor skal du sørge for at genbruge NPC'erne i den korrekte mængde medier for at imødekomme en optimal såvolumen.
  3. Fjern DPBS fra to brønde på den ene side af mikrogrooves i enheden med en P200 pipette og frø 250.000 NPC'er pr enhed i 60-100 μL af dag 10 motor neuron medier.
    1. I øverste højre brønd, frø 30-50 μL af celle suspension (125.000 celler) tæt på kanalen åbning i en 45 ° vinkel og trække den resterende væske forsigtigt langs brønden gulvet mod midten af brønden med pipettespidsen.
    2. Hold pause i et par sekunder, så celleaffjedringen kan strømme gennem kanalen, før du gentager dette i den nederste brønd (125.000 celler i 30-50 μL). Brug en pen til at markere den seedede side "NPC" eller tilsvarende for nem orientering af enheden uden et mikroskop.
    3. Inkuber anordningen ved 37 °C, 5 % CO2 i 5 min for at tillade celletilbehør, inden de tosåede brønde fyldes op med yderligere dag 10 motorisk neuronmedium (i alt 200 μL/brønd) og inkuberes igen ved 37 °C, 5 % CO2.
      BEMÆRK: Hver brønd kan indeholde 200 μL. Såceller i både brønde og kanaler sikrer en robust struktur af kulturen, der sænker risikoen for celleadachment under medieændringer. Det er muligt at så færre celler i bare kanalen. Dette vil dog gøre kulturen mere modtagelig for lydstyrken gennem kanalerne under hver medium ændring.
  4. Brug en P200 pipette til at fjerne DPBS fra de to brønde på den anden side af mikrogroove overfor de frisksåede NPC'er. Tilsæt 200 μL/ brønd af dag 10 motoriske neuronmedier og vent et par sekunder mellem top og bund godt for at give medierne mulighed for at strømme gennem kanalen. Derefter tilsættes 6 mL DPBS pr. 10 cm skål omkring enheden for at forhindre fordampning af mediet under inkubation.
    BEMÆRK: Tilføj yderligere DPBS omkring enheden i kulturperioden, hvis det er nødvendigt.
  5. Udfør en fuld motor neuron medium ændring i begge rum i enheden på dag 11 (fredag), dag 14 (mandag) og dag 16 (onsdag) (tabel 2 og tabel 3). Tilføj friske medietilskud på dagen for medium forandring.
    BEMÆRK: Fra dette tidspunkt skal du udføre alle medium ændringer med en P200 pipette. Placer altid pipettespidsen væk fra kanalen ved kanten af brønden, og fjern ikke væske direkte fra kanalen. Pas på ikke at løsne silikoneenhederne. Fjernelse og tilsætning af medium skal gøres langsomt for at forhindre cellefordeling.
    1. Fjern forsigtigt alle medier i begge brønde med NPC'er ved at placere P200 pipettespidsen i den nederste kant af brøndvæggen overfor kanalåbningen. Tilsæt langsomt 50-100 μL frisk motor neuron medium til toppen godt ved at placere P200 pipettespidsen i den øverste kant af brøndvæggen overfor kanalåbningen.
    2. Pause i et par sekunder for at give mediet mulighed for at flyde gennem kanalen, før du tilføjer 50-100 μL motor neuron medium til bunden godt. Gentag denne proces forsigtigt, indtil begge brønde indeholder 200 μL/brønd. Gentag på siden uden celler.

6. Plating af MAB i mikrofluidiske enheder - Dag 17

  1. Ca. 7 dage før såning mabs i mikrofluidiske enheder (dag 10 af motor neuron differentiering), optø MABs og så dem i vækstmedium (tabel 1) i en T75 kolbe belagt med kollagen for at give mulighed for tilstrækkelig celle ekspansion. Se afsnit 2.
  2. På dag 17 af den motoriske neurondifferentiering (torsdag), adskille MABs som forklaret i trin 2.4, genbruge celle pellet i ~ 500 μL af vækstmedium og tælle de levende celler ved hjælp af enhver foretrukken optælling metode.
    BEMÆRK: Som angivet nedenfor skal du sørge for at genbruge MAB'erne i den korrekte mængde medier for at imødekomme optimal såvolumen.
  3. Fjern motor neuron medium på den useedede side af mikrogrooves i enheden med en P200 pipette, vask forsigtigt med DPBS, og frø 200.000 MABs per enhed i 60-100 μL af vækstmedium.
    1. I øverste højre brønd, frø 30-50 μL af celle suspension (100.000 celler) tæt på kanalen åbning i en 45 ° vinkel og trække den resterende væske forsigtigt langs brønden gulvet mod midten af brønden med pipettespidsen. Pause i et par sekunder for at tillade strømmen af celler gennem kanalen, før du gentager i den nederste brønd (100.000 celler i 30-50 μL).
    2. Inkuber enheden ved 37 °C, 5% CO2 i 5 min for at tillade celletilbehør, før du fylder de to frisk MAB-seedede brønde med yderligere vækstmedium (i alt 200 μL/brønd). Inkuber igen ved 37 °C, 5% CO2.
      BEMÆRK: Der kræves ingen medium ændring på dag 17 på enhedens motoriske neuronside. Dag 17 medium ændring i henhold til den tidligere offentliggjorte motor neuron differentiering metode15 udføres i stedet på dag 18 (fredag).

7. Gennemførelse af en volumetrisk og chemotactic gradient for at fremme væksten af motoriske neuron neurites mod MAB-rummet

  1. På dag 18 skal du foretage en fuld medium ændring på motor neuronsiden med dag 18 motorisk neuron medium (200 μL/brønd). Følg vejledningen for mellemstor ændring, der er nævnt i trin 5.5.1-5.5.2. Start MAB-differentiering i enhedens MAB-rum (tabel 2 og tabel 4).
    1. Vask forsigtigt MAB-rummene én gang med DPBS, før der tilsættes forvarmet MAB-differentieringsmedium (tabel 4) suppleret med 0,01 μg/mL human agrin (200 μL/brønd).
      BEMÆRK: MABs vil fusionere og danne multinukleated myotubes i løbet af en uge.
  2. På dag 21, ifølge motor neuron differentiering protokol (mandag), indlede chemotactic og volumetrisk gradient (tabel 2 og tabel 3).
    1. Der tilsættes 200 μL/brønd af motor neuron basal medium med 30 ng/mL hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF), glial cellelinje-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) og ciliary neurotrofisk faktor (CNTF), human agrin (0,01 μg/mL) og laminin (20 μg/mL) til myotube-rummet (tidligere defineret som MAB-rummet). Tilsæt motor neuron basal medium (100 μL/brønd) uden vækstfaktorer til motoren neuron rum.
  3. Gentag trin 7,2 hver anden dag indtil dag 28 af den motoriske neurondifferentiering. Der er ikke behov for medieændringer i weekenden.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over motorenhedens protokol i mikrofluidiske enheder. Differentiering tidslinje og co-kultur oversigt fra dag 0 til dag 28 i henhold til tidslinjen for motor neuron differentiering protokol22. Motor neuron differentiering fra iPSCs er indledt på dag 0 og udføres som tidligere angivet for de følgende 10 dage15. På dag 9 steriliseres og belagt enheden med PLO-laminin. MABs er optøet til ekspansion i T75 kolber. På dag 10 er de motoriske neuron-NPC'er belagt i både brønde og kanalen i et rum (lysegrå) af enheden, hvor deres differentiering i motoriske neuroner fortsættes i en uge. MABs er belagt i både brønde og kanalen i det modsatte rum (mørkegrå) på dag 17. På dag 18, er MABs differentiering i myotubes begyndt. På dag 21 etableres en volumetrisk og chemotactic gradient for at fremme motor neuron-neurit polarisering gennem enhedens mikrogroove. Motor neuronrummet modtog 100 μL/brønd af motor neuron basal medium uden vækstfaktorer (lysegrønt rum), mens myotuberummet modtog 200 μL/brønd af motor neuron basal medium med 30 ng/mL vækstfaktorer (mørkegrønt rum) (tabel 2 og tabel 3). Kulturen fortsættes med volumetrisk og chemotactic gradient i yderligere 7 dage indtil analyse på dag 28. Billeder i lyse felt viser cellemorfologi på dag 0, dag 11, dag 18 og dag 28, der dyrkes i forsamlede mikrofluidiske enheder. Skalastang, 100 μm. Tallet er ændret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Celleillustrationer er blevet ændret fra Smart Server medical Art22. Klik her for at se en større version af dette tal.

8. Fiksering og ICC

BEMÆRK: Alle trin bør gøres omhyggeligt for at forhindre løsrivelse af neuronale kulturer. Fjern ikke væske fra kanalerne under følgende trin.

  1. Udfør fiksering i en røghætte eller laminar flow: Vask forsigtigt alle brønde i enheden en gang med DPBS før fiksering. Fastgør ved hjælp af 4 % paraformaldehyd (PFA) i DPBS i 15-20 min ved RT i laminarstrømmen (100 μL/brønd).
    FORSIGTIG: PFA er giftig: håndtag i en røghætte med personlige værnemidler.
    1. Tilsæt forsigtigt 100 μL til enhedens øverste brønd, og vent et par sekunder, så fikseringsopløsningen kan strømme gennem kanalen, før du tilføjer 100 μL til bunden godt. Gentag på den anden side. Efter inkubation fjernes PFA-opløsningen og vaskes forsigtigt 3x i 5 min med DPBS. Lad i 200 μL/godt DPBS til opbevaring og forsegle 10 cm petriskål med parafilm til opbevaring ved 4 °C indtil ICC eksperiment.
      BEMÆRK: Sørg for, at enhederne ikke tørrer ud under opbevaring.
  2. Inkuber cellerne med en permeabiliseringsopløsning (100 μL/brønd) på 0,1% Triton X-100 i DPBS i 20 min ved RT på dag 1 i ICC-proceduren. Fjern permeabiliseringsopløsningen, og tilsæt 5% normalt æselserum i 0,1% Triton X-100/DPBS-opløsning (100 μL/brønd) i 30 min ved RT.
  3. Fjern den 5 % normale æselserumopløsning, og inkuber anordninger med primære antistoffer (Materialetabel) i 2 % normalt æselserum i 0,1 % Triton X-100/DPBS-opløsning, og inkuber ved 4 °C natten over.
    1. Implementer et lydstyrkeforløb. Der tilsættes 100 μL/brønd antistofopløsning på den ene side af mikrogroovene og 150 μL/brønd på den anden (500 μL i alt pr. enhed).
      BEMÆRK: Det er muligt at bruge forskellige antistoffer på begge sider af mikrogroovene. I dette tilfælde må du ikke implementere en volumengradient med primære eller sekundære antistoffer på tværs af mikrogroove for at opretholde den flydende isolation mellem rum. Neuritterne i mikrogroovene vil ikke blive farvet uden gradienten.
  4. Den følgende dag (dag 2 i ICC-proceduren) fjernes de primære antistoffer og vaskes forsigtigt enheden 3x i 5 min med 0,1% Triton X-100/DPBS-opløsning.
    BEMÆRK: I let aftagelige kulturer kan vask 3x i 5 min udskiftes med 1x i 30 min.
  5. Arbejde i mørke fra nu af, som sekundære antistoffer (Tabel over materialer) er lysfølsomme. Inkuberes celler med sekundære antistoffer i 2% normalt æselserum i 0,1% Triton X-100/DPBS opløsning i 1 time ved RT. Implementer en volumengradient som angivet i trin 8.3.1. Efter inkubation fjernes de sekundære antistoffer og vaskes 3x i 5 min med DPBS.
  6. Mærk det nukleare DNA med DAPI i DPBS (100 μL/brønd) i 20 min ved RT efterfulgt af 3x-4x af 5 min vask med 0,1% Triton X-100/DPBS opløsning. Fjern 0,1% Triton X-100/DPBS opløsning fra alle brønde og lad kulturen tørre i et par sekunder, før du tilføjer en dråbe fluorescerende montering medier i hver brønd til at forsegle.
    BEMÆRK: Hold enhederne vandrette i mindst 24 timer, så monteringsmediet kan indstilles. Efter 24 timer kan enhederne opbevares i et glidekasse ved 4 °C.
  7. Billede i z-stakke med et omvendt mikroskop.
    1. For at billedet NMJs, skal du bruge en 40x mål at finde myotubes markeret med en myotube antistof (Tabel over materialer) og udføre z-stack optagelser for at sikre neuronal og myotube væv imaging. Tag flere billeder, hvis myotube er for stor til at passe ind i en enkelt ramme.
    2. For NMJ kvantificering, manuelt tælle antallet af co-lokaliseringer mellem en neuronal præsynaptisk markør og en AChR markør gennem hver z-stack. Normalisere antallet af co-lokaliseringer til antallet af myotubes til stede i z-stack.

9. Fiksering og forberedelse af enheden til SEM

BEMÆRK: Når du skifter væske, skal du altid holde en lille mængde for at dække kulturen for at undgå cellekollaps. Denne protokol bruger meget giftige stoffer, og det er nødvendigt at arbejde med personlige værnemidler og i en røghætte under hele processen.

  1. Fiksering og demontering: Der fremstilles frisk 2,5 % glutaraldehyd (GA) i 0,1 M natriumkakodylatbuffer (pH 7,6), filter med et 0,2 μm filter og opvarm op til 37 °C.
    FORSIGTIG: GA og natriumkakodylat er giftige: håndtag i en røghætte med personlige værnemidler.
    1. Vask forsigtigt enheden én gang med DPBS for at fjerne medie- og cellerester og derefter præfikset med GA-opløsning i 15 min på RT.
    2. Brug en skalpel til forsigtigt at skære SEM-arket til enhedens omkreds, mens du stabiliserer enheden med sammentrækninger. Sørg for ikke at løsne enheden, mens du skærer. Flyt enheden og SEM-arket ved hjælp af sammenkr vilne til en 3 cm petriskål og læg 3 cm fadet i en 10 cm skål for nem håndtering.
    3. Efter 15 minutters præfiksering skal enheden forsigtigt fjernes fra SEM-arket ved hjælp af sammenkædninger. Tag enheden af i det ene hjørne, og fjern den langsomt i diagonal retning mod det modsatte hjørne. Vær opmærksom på, at cellerne løsnes fra enheden.
    4. Der tilføjes yderligere GA-opløsning til at dække hele SEM-arket i 3 cm fadet og fortsætte fikseringen i alt 2 timer ved RT eller natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Skub forsigtigt SEM-arket under GA-opløsningen med sammentrulninger ved at undgå celledækkede overflader.
  2. Fortsæt med en standardprotokol for SEM. Kort sagt inkuberes i osmium tetroxid efterfulgt af dehydrering med en gradueret serie ethanol. Sæt SEM-arket i en coverslipholder for kritisk punkttørring, og monter på støttestuer til kulklistermærker og belægning. Brug et scanningselektronmikroskop til at afbilde ved en accelererende spænding på 5 kV og en arbejdsafstand på 7 mm.

10. Vurdering af NMJ-funktionalitet ved hjælp af calciumbilleddannelse i liveceller

  1. Klargør enheder: Opdater myotuberummet med 200 μL/brønd af dag 18 motor neuron basal medium med 30 ng/mL BDNF, GDNF og CNTF og motor neuronrummet med 200 μL/brønd af motor neuron basal medium uden vækstfaktorer (tabel 2 og tabel 3).
    1. Fluo-4 AM farvestof fortyndet i Fluo-4 farvestof opløsningsmiddel til myotube rummet i en endelig koncentration på 5 μM og inkubere enheden i mørke ved 37 °C, 5% CO2 i 25 min. Mens enheden er under inkubation, fortyndes kaliumchlorid i motor neuron basal medium uden vækstfaktorer ved en endelig koncentration på 450 mM.
      BEMÆRK: Fluo-4 AM er en calciumindikator, som udviser en stigning i fluorescens ved calciumbinding. Arbejd i mørket fra nu af, da farvestoffet er lysfølsomt.
    2. Efter 25 min, opdatere myotube rum med 200 μL/brønd af dag 18 motor neuron basal medium med 30 ng/mL af BDNF, GDNF, og CNTF og motor neuron rum med 100 μL/brønd af motor neuron basal medium uden vækstfaktorer til at genetablere chemotactic og volumetrisk gradient.
    3. For at blokere NMJs skal du supplere myotuberumsmediet med 19 μM af AChR-konkurrenceantagonisten tubocurarine hydrochlorid pentahydrat.
      FORSIGTIG: Tubocurarine hydrochlorid pentahydrat er giftigt: håndtag i en røghætte med personlige værnemidler.
  2. Udfør optagelser med et omvendt konfokalt mikroskop udstyret med en inkubator justeret til 37 °C, 5% CO2.
    1. Med et 10x-mål skal du bruge den lyse feltkanal til at finde myotubes i myotube-rummet. Juster laserkraften, gain og offset for 488-kanalen til et niveau, hvor Fluo-4 fluorescens markerer de enkelte myotubes.
      BEMÆRK: Repræsentative resultater blev opnået ved at justere rullepanelerne i softwarens A1-indstillinger til en lasereffekt på 5%, en gevinst på 60 (HV) og en offset på 0.
  3. Indstil optagetiden til 1 min med 1 s intervaller. Optag for 5-10 s at have en baseline, efterfulgt af straks stimulere motoriske neuroner med kaliumchloridopløsningen.
    1. Efter 5-10 s i optagelsen tilsættes langsomt 25 μL kaliumchloridopløsning til en brønd i motor neuronrummet for at nå en endelig koncentration på 50 mM.
      BEMÆRK: Undgå at tilføje kaliumchloridopløsningen for hurtigt, da dette vil skabe en bølge gennem kanalen, hvilket forårsager artefakter på optagelsen.
  4. Optag myotuberummet med motor neuron stimulation to gange med en 2 minutters pause, efterfulgt af direkte stimulering med 25 μL kaliumchloridopløsning af myotuberummet for at vurdere direkte myotubeaktivitet uafhængigt af motor neurondepolarisering.
  5. For kvantificeringer, cirkel hver myotube manuelt med optagelsen software og analysere Fluo-4 fluorescerende intensitet i løbet af 1-min periode. For at bestemme stigningen i calciumtilstrømningen trækkes den gennemsnitlige baselineværdi (dvs. gennemsnit fra de første 10 s før kaliumchloridstimulering) fra topværdien efter stimulering med kaliumchlorid. De repræsentative resultater blev erhvervet ved hjælp af softwarens tidsmålingsværktøj.

Representative Results

Generering af NMJs i mikrofluidiske enheder
For at generere en menneskelig motorenhed med funktionelle NMJs i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder blev der brugt menneskelige iPSC-afledte motornanoner og menneskelige MAB-afledte myotubes. Kvaliteten af udgangscellematerialet er vigtig, og især de finansielle centralbankers fusionskapacitet i myotubes er afgørende for et vellykket resultat af denne protokol. MBS er nemme at holde i kultur. Det er dog vigtigt at vurdere fusionskapaciteten for hvert parti, før de anvendes på de mikrofluidiske anordninger (supplerende figur 1A, B)18. Partier, der ikke viser myotube-dannelse efter 10 dages differentiering, bør ikke anvendes. Fusionsindekset i supplerende figur 1B blev bestemt ved at beregne procentdelen af kerner inden for myotubes positiv for hver myotube-markør for det samlede antal kerner pr. Billede. Vi konstaterede, at et fusionsindeks på ca. 8% var tilstrækkeligt til vores co-kultur i at generere NMJs.

Det er altid vigtigt at påbegynde en motor neuron differentiering fra en ren kultur af iPSCs. Jo renere input - jo renere resultatet. Den motoriske neurondifferentiering protokol genererer motor neuron kulturer, som typisk er 85%-95% positive for motoriske neuron markører (Supplerende Figur 1C,D)18. De resterende celler vil normalt være udifferentierede prækursorer celler, som i nogle tilfælde vil gennemgå omfattende spredning og hermed har en negativ indvirkning på kvaliteten af kulturen. For at få det bedste resultat af denne protokol, den motoriske neuron differentiering effektivitet bør evalueres, før du anvender dag 10 motor neuron-NPC'er i enheden. Derudover kan der udføres et NPC-kvalitetskontrol på dag 11 for at evaluere udtrykket af NPC-markør Olig2 (supplerende figur 1E, F).

I første omgang blev de motoriske neuron-NPC'er og MABs forgyldt på samme tid på dag 10. Her blev MAB-differentieringet indledt på dag 11. Volumen- og vækstfaktorgradienten implementeret på dag 14 gjorde det muligt for os at evaluere NMJ-formationen på dag 21 og derved forkorte protokollen med en uge. Interessant nok kunne vi observere karakteristisk NMJ-formation af ICC (supplerende figur 2A). Vi var dog ikke i stand til at erhverve en funktionel udgang via de levende celle calciumoptagelser så tidligt i den motoriske neurondifferentiering (data, der ikke er vist). Vi konkluderede, at de motoriske neuroner endnu ikke var modne nok til at danne funktionelle NMJ-forbindelser med myotubes, selvom NMJ morfologi så lovende ud. Dette er i tråd med vores tidligere observationer, at spontane handlingspotentialer i motoriske neuroner, registreret gennem patch-clamp elektrofysiologisk analyse, kun forekommer på dag 35 af motor neurondifferentiering15.

Derudover forsøgte vi at forlænge motorisk neuronmodning samt co-culture bæredygtighed ved at modne de motoriske neuroner i enheden i 2 uger (dag 24), før de plating MABs. Desværre blev der observeret en stor mængde spontan motor neuron-neurit passage gennem mikrogroove, hvilket resulterede i hæmning af MAB-fastgørelse (supplerende figur 2B). På grund af manglen på myotube-dannelse i kanalen lykkedes det os ikke at identificere NMJs på dag 36 og anvendte derfor 28-dages protokollen (figur 1).

Identifikation, kvantificering og morfologisk karakterisering af in vitro NMJs
Efter at have fulgt 28-dages protokollen (figur 1) kunne der opnås fuldt funktionsdygtige NMJs. Både in vivo og in vitro, NMJs er karakteriseret immunohisto- eller immunocytokemisk gennem co-lokalisering af en præsynaptisk markør og en postsynaptisk markør. I denne undersøgelse blev der anvendt en kombination af neurofilament tung kæde (NEFH) og SYP som en præsynaptisk markørkombination, som tillod følgende af en enkelt neurit fra soma af motor neuronen mod den mest distale proces. På muskelsiden, Btx er meget udbredt som en postsynaptisk markør for AChRs, og blev ligeledes brugt i denne undersøgelse. Tilskud af agrin og laminin fremmer klyngedannelsen af AChRs på sarcolemma19,20,21, hvilket gør det lettere at identificere AChRs in vitro og ligeledes øger antallet af ACHR'er og NMJs nuværende18.

For at finde og beregne NMJs på en upartisk måde, hver myotube er identificeret gennem myosin tung kæde (MyHC)-positivitet og afbildet i z-stakke på 40x forstørrelse ved hjælp af en omvendt confocal mikroskop. For meget længe myotubes, flere z-stakke blev erhvervet. Til billedanalyse tælles antallet af co-lokaliseringer mellem NEFH/SYP og Btx manuelt gennem hver z-stack, og antallet af co-lokaliseringer normaliseres til antallet af myotubes, der er til stede i z-stack (Figur 2A-C)18. Ikke alle myotubes vil have NMJs, som det ses i kvantificeringen af innervated myotubes (Figur 2D). Derfor er det vigtigt at udføre en upartisk optagelse tilgang, hvor alle myotubes er afbildet, uafhængig af Btx tilstedeværelse.

Det er muligt at identificere to typer morfologier i dette in vitro-system . NMJs enten vises som enkelt kontaktpunkt NMJs, hvor en neurite berører en klynge af AChRs på et interaktionspunkt, eller flere kontaktpunkt NMJs, hvor en neurite vil vifte ud og engagere sig med AChR klynge over en større overflade. Disse to morfologier kan identificeres både immunocytokemisk (figur 2A)18 og med SEM (figur 2B)18 og kan ligeledes kvantificeres (figur 2C)18. Samlet set letter de mange kontaktpunkter en bredere forbindelse gennem en stor muskelindlejring, som peger i retning af en mere moden NMJ-formation. I modsætning hertil betragtes det enkelte kontaktpunkt NMJs som mindre modne på grund af kulturens tidlige udviklingstilstand.

Funktionel evaluering af in vitro NMJs
For at evaluere NMJs' funktionalitet blev der anvendt transientoptagelser af calcium i liveceller (figur 3)18. Ved at drage fordel af det flydende isolerede system af de mikrofluidiske enheder blev motor neuron soma-siden stimuleret med en høj koncentration (50 mM) kaliumchlorid, samtidig med at der blev registreret en tilstrømning af calcium i myotuberne, som var fyldt med det calciumfølsomme Fluo-4-farvestof (figur 3A). Næsten umiddelbart efter motor neuron aktivering, kunne vi observere en calcium tilstrømning i myotubes gennem en karakteristisk bølge dannelse, som bekræfter en funktionel forbindelse gennem motor neuron-neurite og myotube (Figur 3A-C) 18. Ingen spontane calciumbølger eller spontane myotubesammentrækninger blev observeret, selvom myotube sammentrækning ved direkte stimulering med kaliumchlorid blev observeret. Forbindelsens specificitet blev yderligere bekræftet ved at tilføje den konkurrencedygtige AChR-antagonist, tubocurarine hydrochloridpentahydrat (DTC) til myotube-rummet (figur 3A), hvilket resulterede i en hæmning af calciumtilstrømning (figur 3C). Denne effekt bekræftede, at forbindelsen mellem motoriske neuroner og myotubes resulterede i fuldt funktionelle NMJs. For at evaluere antallet af aktive myotubes gennem NMJ stimulation blev myotuberummet stimuleret direkte med kaliumchlorid for at identificere det samlede antal aktive myotubes i dette rum. Ca. 70% af myotuberne var aktive gennem motorisk neuronstimulerende aktivering med kaliumchlorid (figur 3D)18.

Disse resultater bekræfter den optimale NMJ dannelse, antal, morfologi og funktionalitet gennem co-culturing af iPSC-afledte motor neuroner og MAB-afledte myotubes i løbet af en 28-dages protokol.

Figure 2
Figur 2: NMJ-dannelse i mikrofluidiske anordninger. (A) Confokale mikrografer af NMJ-dannelse i formonterede mikrofluidiske anordninger på dag 28. NMJs er identificeret gennem co-lokalisering (pilespidser) af præsynaptiske markører (NEFH og SYP) og postsynaptisk AChR markør (Btx) på MyHC-farvede myotubes. NMJs identificeres morfologisk gennem enkelt eller flere kontaktpunkt dannelse mellem neurites og AChR klynger. DAPI label kerner. Skalastang, 25 μm. Indsat viser en forstørrelse af en NMJ. Inset skalastang, 10 μm. (B) SEM af NMJ morfologi i silikone mikrofluidiske enheder på dag 28. Pilespidser skildrer neurit indlejring i myotube. Skalastang, 2 μm. Indsat viser en forstørrelse af NMJ. Indsat skala bar, 1 μm. (C) Kvantificering af det samlede antal NMJs per myotube samt antallet af enkelt og flere kontaktpunkt NMJs per myotube. Grafen er vist som middel ± standardfejl i middelværdien fra fire biologiske replikater. Statistisk signifikans bestemmes med Mann-Whitney test med * p < 0,05. (D) Kvantificering af procentdelen af innerverede myotubes. Grafen er vist som middel ± standardfejl i middelværdien fra fire biologiske replikater. Tallet er ændret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Bekræftelse af NMJ-funktionalitet. (A) Skematisk illustration af transient calciumoptagelser af NMJ-funktionalitet i formonterede mikrofluidiske enheder på dag 28 før og efter NMJ-blokering med tubocurarine (DTC)22. Motoriske neuroner i det lysegrønne rum stimuleres med 50 mM kaliumchlorid (KCl), hvilket forårsager en intracellulær motor neuronrespons gennem neuritterne. Dette fremkalder en tilstrømning af calcium (Ca2 +) i myotubes, som er mærket med calcium-følsomme Fluo-4 farvestof (mørkegrønt rum). (B) Fluo-4 fluorescens mikrografer af præ-stimulation, intensitet peak og post-stimulation af en myotube skildrer en bølge af intracellulær calcium stigning på motor neuron stimulation med KCl. Indsat viser en forstørrelse af en innerveret aktiv myotube. Skalastænger, 100 μm. Indsat skala bar, 200 μm. (C) Repræsentative calcium tilstrømning kurver i myotubes efter motor neuron stimulation med KCl (pil) bekræfter NMJ funktionalitet. Myotube 1-3 viser karakteristiske calciumkurver gennem motorisk neuron-myotube innervation, mens myotube A-C DTC skildrer kurver efter NMJ blokering med DTC. (D) Forholdet mellem motor neuron-stimuleret aktive myotubes på det samlede antal aktive myotubes. Tallet er ændret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Celleillustrationer er blevet ændret fra Smart Server medical Art22. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Motor neuron verifikation, MAB fusion indeks, og NPC kvalitetskontrol. (A) Confocal billeder af MAB-afledte myotubes 10 dage efter indledningen af differentiering. Myotubes er mærket med myotube markører: desmin, MyHC, myogenin (MyoG) og titin. Kerner er plettet med DAPI. Skalastang, 100 μm. (B) Kvantificering af MAB fusionsindeks 10 dage efter indledningen af differentiering. Efter sult smelter MABs sig sammen i multinukleated myotubes, som blev kvantificeret for myotube-markør positivitet (AB +). Graf skildrer betyde ± standard fejl af middelværdien fra tre biologiske replikater. (C) Confocal billeder af iPSC-afledte motoriske neuroner på dag 28 af differentiering, som er mærket med motoriske neuron markører NEFH, cholin acetyltransferase (ChAT) og Islet-1 ud over pan-neuronal markør βIII-tubulin (Tubulin). Kerner er plettet med DAPI. Skalastænger, 75 μm. (D) Kvantificering af antallet af celler, som er positive for motoriske neuron- og pan-neuronale markører (AB+). Graf skildrer betyde ± standard fejl af middelværdien fra tre biologiske replikater. (E) Confocal billeder af iPSC-afledte NPC'er på dag 11 af motor neuron differentiering, som er mærket med NPC markør Olig2 og pan-neuronal markør βIII-tubulin (Tubulin). Kerner er plettet med DAPI. Skalastænger, 50 μm. (F) Kvantificering af antallet af NPC'er, som er positive for Olig2 og βIII-tubulin (AB+). Graf skildrer betyde ± standard fejl af middelværdien fra tre biologiske replikater. Tallet er ændret fra Stoklund Dittlau, K. et al.18. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Optimering af co-kultur protokol (A) Confocal billeder af NMJ dannelse på dag 21 af motor neuron differentiering, når MABs er seedet på samme tid som NPC'er på dag 10. NMJs er identificeret gennem co-lokalisering (pilespidser) af præsynaptiske markører (NEFH og SYP) og postsynaptisk AChR markør (Btx) på MyHC-farvede myotubes. Skalastang (venstre), 10 μm. Skalastang (højre), 5 μm. (B) Bright-field billede af myotube-kanalen på dag 24, der skildrer spontan motor neuron-neurit passage hæmmer fastgørelsen af MABs. Skalalinje, 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Reagens Aktiekoncentration Endelig koncentration
IMDM 1x 80%
Føtalt kvægserum 15%
Penicillin/Streptomycin 5000 U/mL 0.5%
L-glutamin 50x 1%
Natrium pyruvat 100 mM 1%
Ikke-essentielle aminosyrer 100x 1%
Insulinoverførselrin selen 100x 1%
bFGF (tilføjet frisk) 50 μg/mL 5 ng/mL

Tabel 1: MAB vækstmedium. Medium kan vare 2 uger ved 4 °C. bFGF tilsættes frisk på brugsdagen.

Reagens Aktiekoncentration Endelig koncentration
DMEM/F12 50%
Neurobasalt medium 50%
Penicillin/Streptomycin 5000 U/mL 1%
L-glutamin 50x 0.5 %
N-2 supplement 100x 1%
B-27 uden vitamin A 50x 2%
β-mercaptoethanol 50 mM 0.1%
Askorbinsyre 200 μM 0,5 μM

Tabel 2: Motor neuron basal medium. Medium kan vare 4 uger ved 4 °C.

Dag Reagens Aktiekoncentration Endelig koncentration Kupé
Dag 10/11 Udglattet agonist 10 mM 500 nM Begge
Retinsyre 1 mM 0,1 μM
DAPT 100 mM 10 μM
BDNF 0,1 mg/mL 10 ng/mL
DDR 0,1 mg/mL 10 ng/mL
Dag 14 DAPT 100 mM 20 μM Begge
BDNF 0,1 mg/mL 10 ng/mL
DDR 0,1 mg/mL 10 ng/mL
Dag 16 DAPT 100 mM 20 μM Begge
BDNF 0,1 mg/mL 10 ng/mL
DDR 0,1 mg/mL 10 ng/mL
CNTF 0,1 mg/mL 10 ng/mL
Dag 18 BDNF 0,1 mg/mL 10 ng/mL Motor neuron
DDR 0,1 mg/mL 10 ng/mL
CNTF 0,1 mg/mL 10 ng/mL
Dag 21+ BDNF 0,1 mg/mL 30 ng/mL Myotube
DDR 0,1 mg/mL 30 ng/mL
CNTF 0,1 mg/mL 30 ng/mL
Agrin 50 μg/mL 0,01 μg/mL
Laminin 1 mg/mL 20 μg/mL
Dag 21+ Ingen tillæg Motor neuron

Tabel 3: Motor neuron medium kosttilskud. Kosttilskud tilsættes frisk på brugsdagen til motor neuron basal medium.

Dag Reagens Aktiekoncentration Endelig koncentration Kupé
Dag 18 DMEM/F12 97% MAB
Natrium pyruvat 100 mM 1%
Hesteserum 2%
Agrin 50 μg/mL 0,01 μg/mL

Tabel 4: MAB differentiering medium. Medium kan vare 2 uger ved 4 °C. Agrin tilsættes frisk på brugsdagen.

Discussion

Protokollen beskriver en relativt brugervenlig metode, som genererer menneskelige motorenheder med funktionelle NMJs i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder på mindre end 30 dage. Det beskrives, hvordan NMJs kan vurderes morfologisk gennem standard teknikker såsom ICC og SEM og funktionelt gennem live-celle calcium optagelser.

En stor fordel ved denne protokol er brugen af stamcelleteknologi. Dette giver mulighed for fuld tilpasningsevne, hvor NMJs kan evalueres i både sundhed og sygdom, uafhængigt af donorprofilen. Modellen har vist sig allerede vellykket og gavnlig i ALS forskning, hvor vi identificerede værdiforringelser i neurit udvækst, genvækst, og NMJ numre som nye fænotyper på grund af mutationer i FUS genet18. Med denne model er det muligt at udvide forskningen til at omfatte sporadiske former for ALS, hvor ætiologien er ukendt, ved hjælp af iPSCs fra sporadiske ALS-patienter. Dette giver en fordel i forhold til traditionelle dyremodeller, som er afhængige af transgen overekspression af muterede gener for at generobre menneskers sygdom23,24. Derudover giver vores fuldt menneskelige system mulighed for potentiel rekapitulation af menneskespecifik fysiologi og sygdom. Tidligere undersøgelser viste forskellene mellem gnaver og human NMJ morfologi25, hvilket tyder på, at forsigtighed skal gennemføres, når man bruger gnavere til at løse menneskelige NMJ patologi. Selv om dette system er en relativ simpel in vitro setup, som mangler kompleksiteten af en in vivo model, var det muligt at påvise, at NMJ morfologi vises i mikrofluidiske enheder lignede NMJs af menneskelige amputater25. Desuden giver denne model mulighed for NMJ evaluering under NMJ dannelse og modning, potentielt afslørende tidlige sygdom fænotyper, som er fraværende, uidentificerbare, eller overset i menneskelige post mortem prøver.

MABs giver en gyldig mulighed for at generere myotubes, selv om deres begrænsede overlevelse på 10 dage er en ulempe for systemet. Myotube overlevelse afhænger af deres tilknytning til overfladen, som sandsynligvis er kompromitteret af spontane sammentrækninger af myofibers. Efter mere end 10 dage, vil de fleste myotubes have løsrevet, hvilket gør NMJ kultur ubrugelig. Ideelt set ville myotubes også blive genereret fra iPSCs. De nuværende protokoller har imidlertid vist sig vanskelige at reproducere26 på grund af variation i fusionsindekset27,28,29,30.

Ved at bruge kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder genererede vi et standardiseret system, som er fuldt tilgængeligt. Andre NMJ-modeller findes31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Men de er typisk afhængige af enkelte rum, som mangler opdeling og flydende isolation mellem celletyper eller på skræddersyede kulturfartøjer, hvilket sænker tilgængeligheden og potentielt også reproducerbarheden. De mikrofluidiske enheder, der anvendes til denne protokol, kan købes med mikrogroove af forskellig længde, hvilket giver mulighed for yderligere analyse såsom axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersøgelser. Den fluidiske isolation mellem rum muliggør yderligere opdelt lægemiddelbehandling af enten motoriske neuroner eller myotubes, som kan være gunstig i terapiudvikling. Flere virksomheder med speciale i mikrofluidics er opstået, som har åbnet op for et stort udvalg af enhed design og funktioner, yderligere fremme tilgængeligheden for in vitro forskning.

Afslutningsvis har vi udviklet en protokol, der giver en pålidelig, alsidig og nem metode til at dyrke menneskelige motorenheder med funktionelle NMJs.

Disclosures

L.V.D.B. har patent på brugen af HDAC-hæmmere i Charcot-Marie-Tooth sygdom (USA-2013227717-A1), er en videnskabelig medstifter af Augustine Therapeutics og medlem af dets videnskabelige advisory board. De andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Nikky Corthout og Sebastian Munck fra LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) for deres råd om levende celle calcium forbigående fluorescens optagelser. Denne forskning blev støttet af Fulbright-kommissionen til Belgien og Luxembourg, KU Leuven (C1 og "Opening the Future"-fonden), VIB, Agenturet for Innovation af Videnskab og Teknologi (IWT; SBO-iPSCAF), "Fonden for Videnskabelig Forskning Flandern" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiske regering (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 iværksat af den belgiske Federal Science Policy Office), Thierry Latran Foundation og "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. og J.B. støttes af ph.d.-stipendier tildelt af FWO-Vlaanderen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 Thermo Fisher Scientific B35451 Antibody (1:1000)
Acetic Acid CHEM-Lab NV CL00.0116.1000 Coating component. H226, H314. P280
Aclar 33C sheet (SEM sheet) Electron Microscopy Sciences 50425-25 Thickness: 7.8 mil
Agrin (recombinant human protein) R&D systems 6624-AG-050 Media supplement
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit Thermo Fisher Scientific A21206 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat Thermo Fisher Scientific A21432 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31570 Antibody (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse Thermo Fisher Scientific A31571 Antibody (1:1000)
Ascorbic acid Sigma A4403 Media component
βIII-tubulin (Tubulin) Abcam ab7751 Antibody (1:500)
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010 Media component. H317. P280.
B-27 without vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010 Media component
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-02B Growth factor
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) Peprotech 100-18B Growth factor
Choline acetyltransferase (ChAT) Millipore ab144P Antibody (1:500)
Collagen from calfskin Thermo Fisher Scientific 17104019 Coating component
CNTF (ciliary neurotrophic factor) Peprotech 450-13B Growth factor
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent Thermo Fisher Scientific R37605 Immunocytochemistry component
DAPT Tocris Bioscience 2634 Media supplement
Desmin Abcam Ab15200 Antibody (1:200)
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330032 Media component
DMSO Sigma D2650-100ML Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190250 no calcium, no magnesium
Ethanol VWR 20.821.296 Sterilization. H225. P280
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270106 Media component
Fluo-4 AM live cell dye Thermo Fisher Scientific F14201 Calcium imaging dye
Fluorescence Mounting Medium Dako S3023 Immunocytochemistry component
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) Peprotech 450-10B Growth factor
Glutaraldehyde Agar Scientific R1020 Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.
Horse serum Thermo Fisher Scientific 16050122 Media component
Human alkaline phosphatase R&D systems MAB1448 Antibody
ImageJ software NIH ICC analysis
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440053 Media component
Insulin transferrin selenium Thermo Fisher Scientific 41400045 Media component
Islet-1 Millipore ab4326 Antibody (1:400)
Knockout serum replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028 Cryopreservation component
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma L2020-1MG Coating component and media supplement
Leica SP8 DMI8 confocal microscope Leica ICC confocal microscopy
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-024 Media component
Myogenin (MyoG) Abcam Ab124800 Antibody (1:500)
Myosin heavy chain (MyHC) In-house, SCIL Antibody (1:20)
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048 Media component
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Coating and media component
Neurofilament heavy chain (NEFH) Abcam AB8135 Antibody (1:1000)
Nikon A1R confocal microscope Nikon Live-cell calcium imaging microscopy
NIS-Elements AR 4.30.02 software Nikon Live-cell calcium imaging analysis
Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140050 Media component
Normal donkey serum Sigma D9663-10ML Immunocytochemistry component
Olig2 IBL 18953 Antibody (1:1000)
Parafilm M Sigma P7793-1EA Storing equipment
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15070063 Media component
Petri dish (3 cm) nunc 153066 Diameter: 3 cm
Petri dish (10 cm) Sarstedt 833.902 Diameter: 10 cm
Plate (6-well) Cellstar Greiner bio-one 657160 Culture plate
Pluronic F-127 Thermo Fisher Scientific P3000MP Fluo-4 dye solvent
Poly-L-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Coating component
Potassium chloride CHEM-Lab NV CL00.1133.1000 Calcium imaging reagent
Retinoic acid Sigma R2625 Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.
RevitaCell supplement Thermo Fisher Scientific A2644501 ROCK inhibitor solution
Smoothened agonist Merch Millipore 566660 Media supplement
Sodium cacodylate buffer Sigma C0250 Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Media component
Synaptophysin (SYP) Cell Signaling 5461S Antibody (1:1000)
T75 flask Sigma CLS3276 Culture plate
Titin Developmental Studies Hybridoma Bank 9D10 Antibody (1:300)
Triton X-100 Sigma T8787-250ML Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280
TrypLE express Thermo Fisher Scientific 12605010 MAB dissociation solution
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate Sigma T2379-100G Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.
XonaChips pre-assembled microfluidic device Xona Microfluidics XC150 Microgroove length: 150 μm
Xona Silicone microfluidics device Xona Microfluidics SND75 Microgroove length: 75 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plomp, J. J. Neuromuscular junction physiology and pathophysiology. Myasthenia Gravis and Related Disorders. Kaminski, H. J., Kusner, L. L. , Springer International Publishing. 1-12 (2018).
  2. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The 'dying-back' phenomenon of motor neurons in ALS. Journal of Molecular Neuroscience. 43 (3), 470-477 (2010).
  3. Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathology and Applied Neurobiology. 36 (2), 133-156 (2010).
  4. Rowland, L. P., Shneider, N. A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1688-1700 (2001).
  5. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  6. Martineau, É, Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. eLife. 7, 41973 (2018).
  7. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models and Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  8. Nair, G., et al. Diffusion tensor imaging reveals regional differences in the cervical spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. NeuroImage. 53 (2), 576-583 (2010).
  9. So, E., et al. Mitochondrial abnormalities and disruption of the neuromuscular junction precede the clinical phenotype and motor neuron loss in hFUSWT transgenic mice. Human Molecular Genetics. 27 (3), 463-474 (2018).
  10. Tallon, C., Russell, K. A., Sakhalkar, S., Andrapallayal, N., Farah, M. H. Length-dependent axo-terminal degeneration at the neuromuscular synapses of type II muscle in SOD1 mice. Neuroscience. 312, 179-189 (2016).
  11. Walker, A. K., et al. Functional recovery in new mouse models of ALS/FTLD after clearance of pathological cytoplasmic TDP-43. Acta Neuropathologica. 130 (5), 643-660 (2015).
  12. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4516-4519 (1977).
  13. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  14. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
  15. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861 (2017).
  16. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2014).
  17. Giacomazzi, G., et al. Isolation of mesoangioblasts: A subset of pericytes with myogenic potential. Pericytes: Methods and Protocols. Péault, B. M. , Springer, US. 155-167 (2021).
  18. Stoklund Dittlau, K., et al. Human motor units in microfluidic devices are impaired by FUS mutations and improved by HDAC6 inhibition. Stem Cell Reports. , (2021).
  19. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 44530 (2019).
  20. Burkin, D. J., Kim, J. E., Gu, M., Kaufman, S. J. Laminin and alpha 7 beta 1 integrin regulate agrin-induced clustering of acetylcholine receptors. Journal of Cell Science. 113 (16), 2877-2886 (2000).
  21. Zhang, B. G. X., et al. Combination of agrin and laminin increase acetylcholine receptor clustering and enhance functional neuromuscular junction formation In vitro. Developmental Neurobiology. 76 (5), 551-565 (2016).
  22. Smart Servier Medical Art. , Available from: https://smart.servier.com/ (2021).
  23. Morrice, J. R., Gregory-Evans, C. Y., Shaw, C. A. Animal models of amyotrophic lateral sclerosis: A comparison of model validity. Neural Regeneration Research. 13 (12), 2050-2054 (2018).
  24. Greek, R., Hansen, L. A. Questions regarding the predictive value of one evolved complex adaptive system for a second: Exemplified by the SOD1 mouse. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 113 (2), 231-253 (2013).
  25. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  26. Jiwlawat, N., Lynch, E., Jeffrey, J., Van Dyke, J. M., Suzuki, M. Current progress and challenges for skeletal muscle differentiation from human pluripotent stem cells using transgene-free approaches. Stem Cells International. , 6241681 (2018).
  27. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  28. vander Wal, E., et al. Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Reports. 10 (6), 1975-1990 (2018).
  29. Choi, I. Y., et al. Concordant but varied phenotypes among duchenne muscular dystrophy patient-specific myoblasts derived using a human iPSC-based model. Cell Reports. 15 (10), 2301-2312 (2016).
  30. Choi, I. Y., Lim, H. T., Che, Y. H., Lee, G., Kim, Y. J. Inhibition of the combinatorial signaling of transforming growth factor-beta and NOTCH promotes myotube formation progenitor cells. Cells. 10 (7), 1649 (2021).
  31. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  32. Guo, X., Gonzalez, M., Stancescu, M., Vandenburgh, H. H., Hickman, J. J. Neuromuscular junction formation between human stem cell-derived motoneurons and human skeletal muscle in a defined system. Biomaterials. 32 (36), 9602-9611 (2011).
  33. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128 (6), 1241-1252 (2015).
  34. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  35. Lin, C. Y., et al. IPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), 124299 (2019).
  36. Puttonen, K. A., et al. Generation of functional neuromuscular junctions from human pluripotent stem cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 473 (2015).
  37. Umbach, J. A., Adams, K. L., Gundersen, C. B., Novitch, B. G. Functional neuromuscular junctions formed by embryonic stem cell-derived motor neurons. PLoS ONE. 7, 36049 (2012).
  38. Bellmann, J., et al. A customizable microfluidic platform for medium-throughput modeling of neuromuscular circuits. Biomaterials. 225, 119537 (2019).
  39. Mills, R., et al. Neurturin is a PGC-1α1-controlled myokine that promotes motor neuron recruitment and neuromuscular junction formation. Molecular Metabolism. 7, 12-22 (2018).
  40. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  41. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose-response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  42. Southam, K. A., King, A. E., Blizzard, C. A., McCormack, G. H., Dickson, T. C. Microfluidic primary culture model of the lower motor neuron-neuromuscular junction circuit. Journal of Neuroscience Methods. 218 (2), 164-169 (2013).
  43. Naumann, M., et al. Impaired DNA damage response signaling by FUS-NLS mutations leads to neurodegeneration and FUS aggregate formation. Nature Communications. 9 (1), 335 (2018).
  44. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments. (159), e60993 (2020).
  45. Nijssen, J., Aguila, J., Hoogstraaten, R., Kee, N., Hedlund, E. Axon-seq decodes the motor axon transcriptome and its modulation in response to ALS. Stem Cell Reports. 11 (6), 1565-1578 (2018).
  46. Melamed, Z., et al. Premature polyadenylation-mediated loss of stathmin-2 is a hallmark of TDP-43-dependent neurodegeneration. Nature Neuroscience. 22 (2), 180-190 (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 175
Generation af menneskelige motorenheder med funktionelle neuromuskulære vejkryds i mikrofluidiske enheder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E.… More

Stoklund Dittlau, K., Krasnow, E. N., Fumagalli, L., Vandoorne, T., Baatsen, P., Kerstens, A., Giacomazzi, G., Pavie, B., Rossaert, E., Beckers, J., Sampaolesi, M., Van Damme, P., Van Den Bosch, L. Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (175), e62959, doi:10.3791/62959 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter